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Biochemistry

Masarimycin का संश्लेषण, ग्राम सकारात्मक जीवाणु विकास का एक छोटा अणु अवरोधक

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

बैक्टीरियोस्टेटिक डायामाइड मासारिमाइसिन को तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, एक छोटा अणु जांच जो सेल की दीवार गिरावट को लक्षित करके बैसिलस सबटिलिस और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया के विकास को रोकता है। एक रासायनिक जांच के रूप में इसके आवेदन को तालमेल / विरोध assays और बी subtilis और एस निमोनिया के साथ रूपात्मक अध्ययन में प्रदर्शित किया जाता है।

Abstract

बैक्टीरिया की कोशिका की दीवार में पेप्टिडोग्लाइकन (पीजी) एक अद्वितीय मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना है जो आसपास के वातावरण से आकार और सुरक्षा प्रदान करती है। सेल विकास और विभाजन को समझने के लिए केंद्रीय यह ज्ञान है कि पीजी गिरावट जैवसंश्लेषण और सेल दीवार असेंबली को कैसे प्रभावित करती है। हाल ही में, संशोधित शर्करा या अमीनो एसिड की शुरूआत के माध्यम से पीजी के चयापचय लेबलिंग की सूचना दी गई है। जबकि छोटे अणु अवरोधकों के साथ बायोसिंथेटिक चरणों की रासायनिक पूछताछ संभव है, ऑटोलिसिन द्वारा पीजी गिरावट का अध्ययन करने के लिए रासायनिक जीव विज्ञान उपकरण अविकसित हैं। बैक्टीरियल ऑटोलिसिन एंजाइमों का एक व्यापक वर्ग है जो पीजी के कसकर समन्वित गिरावट में शामिल हैं। यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक छोटे अणु जांच, मासारिसिन तैयार करने के लिए प्रस्तुत किया गया है, जो बेसिलस सबटिलिस में एन-एसिटाइलग्लूकोसामिनिडेस लिटजी का एक अवरोधक है, और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया में सेल दीवार चयापचय। माइक्रोवेव-सहायता प्राप्त और शास्त्रीय कार्बनिक संश्लेषण के माध्यम से अवरोधक की तैयारी प्रदान की जाती है। जैविक assays में ग्राम सकारात्मक शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इसकी प्रयोज्यता प्रस्तुत की जाती है।

Introduction

Peptidoglycan (PG) एक जाल की तरह बहुलक है जो ग्राम-सकारात्मक और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया 1,2 दोनों में सेल आकार और संरचना को चित्रित करता है। यह हेटरोपॉलिमर अमीनो शर्करा का एक मैट्रिक्स है जो छोटे पेप्टाइड्स 3,4,5,6 द्वारा क्रॉस-लिंक किया गया है, जिसमें β-(1,4) से बना बैकबोन है- लिंक्ड अल्टरनेटिंग एन-एसिटाइलग्लूकोसामाइन (जीएलसीएनएसी) और एन-एसिटाइलमुरमिक एसिड (MurNAc) अवशेष (चित्रा 1)1। MurNAc के C-3 लैक्टिल समूह से जुड़ा स्टेम पेप्टाइड है। पीजी के चयापचय में सेल की दीवार 7,8 में नई सामग्री को शामिल करने के लिए बायोसिंथेटिक और डिग्रेडेटिव एंजाइमों की एक कसकर समन्वित प्रणाली शामिल है। पीजी का क्षरण एंजाइमों द्वारा सामूहिक रूप से ऑटोलिसिन9 के रूप में संदर्भित किया जाता है और आगे बांड क्लीव्ड की विशिष्टता के आधार पर वर्गीकृत किया जाता है। ऑटोलिसिन कोशिका विकास, सेल विभाजन, गतिशीलता, पीजी परिपक्वता, केमोटैक्सिस, प्रोटीन स्राव, आनुवंशिक क्षमता, भेदभाव और रोगजनकता10,11 सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं। व्यक्तिगत ऑटोलिसिन के विशिष्ट जैविक कार्यों को उजागर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो कार्यात्मक अतिरेक के कारण भाग में हो सकता है। हालांकि, हाल ही में बायोफिजिकल 8,12,13 और कम्प्यूटेशनल अध्ययन 12 ने पीजी चयापचय में उनकी भूमिकाओं में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की है। इसके अलावा, हाल की रिपोर्टों ने पीजी चयापचय में संश्लेषण14 और झिल्ली-मध्यस्थता 15,16,17 चरणों में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है। पीजी चयापचय के डिग्रेडेटिव और सिंथेटिक मार्गों के बीच संबंधों की पूरी तरह से समझ पहले अप्रयुक्त एंटीबायोटिक लक्ष्यों को जन्म दे सकती है।

जबकि यूकेरियोट्स में ग्लाइकोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए पद्धति में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, बैक्टीरियल ग्लाइकोबायोलॉजी और विशेष रूप से, पीजी चयापचय एक समान दर से उन्नत नहीं हुआ है। पीजी चयापचय का अध्ययन करने के लिए वर्तमान रासायनिक दृष्टिकोण में फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबायोटिक्स18, फ्लोरोसेंट जांच19,20 और चयापचय लेबलिंग21,22,23,24 शामिल हैं। ये नए दृष्टिकोण बैक्टीरिया सेल दीवार चयापचय से पूछताछ करने के नए तरीके प्रदान कर रहे हैं। जबकि इनमें से कुछ रणनीतियां विवो में पीजी को लेबल करने में सक्षम हैं, वे प्रजाति-विशिष्ट19 हो सकती हैं, या केवल एक विशेष ऑटोलिसिन25 की कमी वाले उपभेदों में काम करती हैं। कई पीजी लेबलिंग रणनीतियों का उद्देश्य अलग-थलग सेल दीवारोंके साथ उपयोग के लिए 26 या इन विट्रो पुनर्गठित पीजी बायोसिंथेसिसमार्गों 20,27,28 के साथ किया जाता है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग वर्तमान में बायोसिंथेटिक चरणों और ट्रांसपेप्टिडेशन18 तक सीमित है।

बैक्टीरियल ऑटोलिसिन का वर्तमान ज्ञान और सेल की दीवार चयापचय में उनकी भूमिका आनुवंशिक और इन विट्रो जैव रासायनिक विश्लेषण 11,29,30,31,32 से आती है। जबकि इन दृष्टिकोणों ने एंजाइमों के इस महत्वपूर्ण वर्ग पर जानकारी का खजाना प्रदान किया है, उनकी जैविक भूमिका को समझना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक अतिरेक33 के कारण, ज्यादातर मामलों में एक ऑटोलिसिन को हटाने के परिणामस्वरूप जीवाणु विकास को रोकना नहीं पड़ता है। यह सेल विकास और विभाजन 7,12 में उनकी निहित भूमिका के बावजूद है। एक और जटिलता यह है कि बैक्टीरियल ऑटोलिसिन का आनुवंशिक विलोपन मेटा-फेनोटाइप को जन्म दे सकता है34। मेटा-फेनोटाइप आनुवंशिक विलोपन और अन्य परस्पर जुड़े मार्गों से प्रभावित मार्ग के बीच जटिल इंटरप्ले से उत्पन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, एक मेटा-फेनोटाइप एक प्रत्यक्ष प्रभाव के माध्यम से उत्पन्न हो सकता है जैसे कि एंजाइम की कमी, या नियामकों के व्यवधान जैसे अप्रत्यक्ष प्रभाव।

वर्तमान में, ग्लाइकोसिडेस ऑटोलिसिन के केवल कुछ अवरोधक हैं जैसे कि एन-एसिटाइलग्लुकोसामिनिडेस (जीएलसीएनएकेस) और एन-एसिटाइलमुरामिडेस, जिन्हें पीजी के क्षरण का अध्ययन करने के लिए रासायनिक जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसे संबोधित करने के लिए, डायमाइड मासारिमाइसिन (जिसे पहले एफजीकेसी के रूप में जाना जाता था) की पहचान की गई है और35 को बेसिलस सबटिलिस विकास के बैक्टीरियोस्टेटिक अवरोधक के रूप में चिह्नित किया गया है जो GlcNacase LytG32 (चित्रा 1) को लक्षित करता है। LytG एक एक्सो-अभिनय GlcNacase36 है, जो ग्लाइकोसिल हाइड्रोलेस परिवार 73 (GH73) के भीतर क्लस्टर 2 का एक सदस्य है। यह वानस्पतिक विकास32 के दौरान प्रमुख सक्रिय GlcNacase है। हमारे ज्ञान के लिए, masarimycin एक पीजी-अभिनय GlcNacase का पहला अवरोधक है जो सेलुलर विकास को रोकता है। स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया के साथ मासारिमाइसिन के अतिरिक्त अध्ययनों में पाया गया कि मासारिमाइसिन संभवतः इस जीव में सेल की दीवार चयापचय को रोकताहै। यहां, मासारिसिन की तैयारी को ग्राम-पॉजिटिव जीवों बी सबटिलिस और एस निमोनिया में शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए रासायनिक जीव विज्ञान जांच के रूप में उपयोग के लिए सूचित किया गया है। Masarimycin के साथ उप-न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता उपचार के रूपात्मक विश्लेषण के उदाहरण, साथ ही साथ एक तालमेल / विरोध परख प्रस्तुत कर रहे हैं। कार्रवाई के अच्छी तरह से परिभाषित तरीकों के साथ एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके तालमेल और विरोध assays सेलुलर प्रक्रियाओं 38,39,40 के बीच कनेक्शन का पता लगाने का एक उपयोगी तरीका हो सकता है।

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Protocol

1. सामान्य तरीके

नोट: सभी यौगिकों को मानक आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा गया था और आगे शुद्धिकरण के बिना उपयोग किया गया था।

  1. सिलिका जेल XG F254 के साथ precoated एक एल्यूमीनियम प्लेट पर पतली परत क्रोमैटोग्राफी (TLC) बाहर ले लो. एक यूवी लैंप के नीचे धब्बों का पता लगाएं, पी-एनिसाल्डिहाइड दाग में विसर्जन करके, या मैं2 वाष्प के संपर्क में आकर।
  2. एक 400 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर पर सभी परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करें।
    नोट: 1एच- एनएमआर और 13सी-एनएमआर स्पेक्ट्रा को अवशिष्ट विलायक चोटियों के लिए संदर्भित किया गया था। युग्मन स्थिरांक [हर्ट्ज] में दिए गए हैं और रासायनिक बदलाव [पीपीएम] में हैं।
  3. रिकॉर्ड वायुमंडलीय दबाव रासायनिक आयनीकरण (APCI) एक कॉम्पैक्ट द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर masarimycin के मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्पेक्ट्रा एक वायुमंडलीय ठोस विश्लेषण जांच के साथ सुसज्जित.

2. masarimycin की तैयारी के लिए सामान्य प्रक्रिया

नोट:: एक धुएं हुड में नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।

  1. प्रत्येक अभिकारक के मेथनॉल में एक 0.1 एम समाधान तैयार करें: साइक्लोहेक्सिलामाइन, साइक्लोहेक्सिल कार्बोक्सेल्डिहाइड, ओ-आयोडोबेंज़ोइक एसिड, और साइक्लोहेक्सिल आइसोसाइनाइड35।
    चेतावनी: Cyclohexylamine, cyclohexyl isocyanide, और cyclohexyl carboxaldehyde ज्वलनशील हैं। वे त्वचा के क्षरण का कारण बन सकते हैं और मौखिक, त्वचीय, श्वसन या प्रजनन विषाक्तता को प्रेरित कर सकते हैं। यौगिकों को खुली लपटों, गर्म सतहों और इग्निशन स्रोतों से दूर रखें। उपयुक्त त्वचा और आंखों की सुरक्षा पहनें, एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में काम करें और वाष्प या धुंध के साँस लेने से बचें। भंडारण के लिए, बोतलों को कसकर बंद रखें और उन्हें एक ठंडी, सूखी जगह पर स्टोर करें। एक एन2 वातावरण के तहत एक desiccator में cyclohexyl carboxaldehyde स्टोर।
  2. साइक्लोहेक्सिलामाइन के 5 एमएल (मेथनॉल में 0.1 एम समाधान) और साइक्लोहेक्सिल कार्बोक्सेल्डिहाइड (मेथनॉल में 0.1 एम) के 5 मिलीलीटर को एक कैप्ड गोल तल फ्लास्क में मिलाएं और रेत स्नान में 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हलचल / गर्म प्लेट पर एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करके समाधान को हिलाएं। रेत की सतह से लगभग 1 सेमी नीचे रखे गए थर्मामीटर का उपयोग करके तापमान की निगरानी करें।
  3. 30 मिनट के बाद, चरण 2.2 से समाधान के लिए साइक्लोहेक्सिल आइसोसाइनाइड (मेथनॉल में 0.1 एम समाधान) के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 50 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 20 मिनट के लिए हलचल करें। अंत में, प्रतिक्रिया मिश्रण में ओ-आयोडोबेंजोइक एसिड (मेथनॉल में 0.1 एम समाधान) के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 3-5 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी जारी रखें।
  4. उपरोक्त प्रतिक्रिया मिश्रण को 3 घंटे के लिए उत्तेजित किए जाने के बाद लगभग हर घंटे टीएलसी द्वारा समय-समय पर प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी करें।
  5. एल्यूमीनियम समर्थित टीएलसी प्लेट की एक 3 सेमी x 6 सेमी पट्टी काटें। # 2 पेंसिल का उपयोग करके, नीचे से लगभग 1 सेमी की दूरी पर एक रेखा खींचें। एक ग्लास माइक्रोकेशिका का उपयोग करते हुए, टीएलसी प्लेट पर प्रतिक्रिया मिश्रण के लगभग 5 μL को स्पॉट करें और इसे सूखने की अनुमति दें।
  6. एक 150 एमएल बीकर के लिए, बीकर के नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त मोबाइल चरण (90: 10 हेक्सेन: आइसोप्रोपेनॉल) जोड़ें। चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, उपरोक्त टीएलसी प्लेट को बीकर में सावधानीपूर्वक रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि टीएलसी प्लेट मोबाइल चरण में समान रूप से प्रवेश करती है। टिनफोइल के एक टुकड़े के साथ बीकर के शीर्ष को कवर करें।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि मोबाइल चरण लाइन और स्पॉटेड नमूना को कवर नहीं करता है।
  7. मोबाइल चरण को टीएलसी प्लेट की यात्रा करने की अनुमति दें जब तक कि यह प्लेट के शीर्ष से लगभग 1 सेमी नीचे न हो। टीएलसी प्लेट को हटा दें और पेंसिल का उपयोग करके, मोबाइल चरण द्वारा तय की गई दूरी को इंगित करते हुए एक रेखा खींचें। टीएलसी प्लेट को धुएं के हुड में सूखने की अनुमति दें।
  8. एक बार सूखने के बाद, टीएलसी प्लेट को एक बीकर में रखें जिसमें ठोस आई 2 की थोड़ी मात्रा होती है औरबीकर को टिन पन्नी के टुकड़े के साथ कवर करें। पीले / भूरे रंग के धब्बों के विकास के लिए टीएलसी की निगरानी करें। एक बार विकसित होने के बाद, टीएलसी प्लेट को हटा दें और पेंसिल का उपयोग करके धब्बों के स्थान को चिह्नित करें (पूरक चित्रा 1)।
    नोट: यदि मैं2 धब्बे चिह्नित नहीं हैं, तो दाग समय के साथ फैल जाएगा। धब्बे भी यूवी-प्रकाश, पी-एनिसाल्डिहाइड धुंधला, या पोटेशियम परमैंगनेट धुंधला (अनुपूरक जानकारी देखें) द्वारा टीएलसी प्लेट पर कल्पना की जा सकती है।
  9. निम्न सूत्र का उपयोग करके सभी विज़ुअलाइज़ किए गए स्पॉट के लिए Rf मानों की गणना करें:
    Rf = Equation 1
  10. प्रतिक्रिया को पूरा करने पर विचार करें जब टीएलसी प्लेट पर Rf = 0.3 के साथ केवल एक स्थान दिखाई देता है। कम दबाव के तहत एक रोटेटरी बाष्पीकरणकर्ता में विलायक को हटा दें और कच्चे उत्पाद (पीले-भूरे रंग के तेल के रूप में प्राप्त) को एक उच्च निर्वात के तहत तब तक सूखा दें जब तक कि सभी मेथनॉल वाष्पित न हो जाएं।
  11. एथिल एसीटेट के 30 मिलीलीटर में सूखे कच्चे उत्पाद को भंग करें और इसे एक विभाजक फ़नल में स्थानांतरित करें। 1 M HCl (2 x 30 mL), H 2 O (30 mL), संतृप्त NaHCO 3 समाधान (2x30 mL), H 2 O (30 mL) और संतृप्त NaCl समाधान (2x 30 mL) के साथ क्रमिक रूप से एथिल एसीटेट निकालें। जलीय परतों को छोड़ दें।
    नोट: एथिल एसीटेट परत निष्कर्षण में से प्रत्येक में शीर्ष परत है। प्रत्येक निष्कर्षण के लिए, एथिल एसीटेट और जलीय समाधान (HCl, H2O, NaHCO3, या NaCl) युक्त विभाजक फ़नल को सख्ती से हिलाएं और परतों को पूरी तरह से अलग करने की अनुमति दें।
  12. विभाजक फ़नल से एथिल एसीटेट परत को हटा दें और इसे एक एर्लेनमेयर फ्लास्क में इकट्ठा करें। एथिल एसीटेट से अवशिष्ट पानी को हटाने के लिए Na2SO4 (निर्जल) से भरा एक स्पैटुला जोड़ें।
    नोट: एथिल एसीटेट समाधान सूखी माना जाता है जब फ्लास्क में Na2SO4 स्वतंत्र रूप से चलता है और clump नहीं करता है। यदि Na2SO4 clumping है, तो Na2SO4 का एक अतिरिक्त स्पैटुला जोड़ा जा सकता है।
  13. Na2SO4 को हटाने के लिए # 1 फ़िल्टर पेपर के माध्यम से सूखे एथिल एसीटेट समाधान को फ़िल्टर करें। एथिल एसीटेट की एक छोटी राशि के साथ फिल्टर पेपर धोएं। फ़िल्टर किए गए एथिल एसीटेट समाधान को एक गोल नीचे फ्लास्क में रखें और सभी एथिल एसीटेट को हटाने के बाद तेल के रूप में मासारिसिन प्राप्त करने के लिए कम दबाव के तहत एक रोटेटरी बाष्पीकरणकर्ता पर विलायक को हटा दें।
  14. 9: 1 हेक्सेन की न्यूनतम मात्रा (1-2 मिलीलीटर) में ऊपर प्राप्त मासारिमाइसिन तेल को भंग करें: आइसोप्रोपेनॉल और एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर तब तक हलचल करें जब तक कि सभी यौगिक भंग न हो जाएं।
  15. एक 12 ग्राम सामान्य चरण सिलिका फ्लैश कॉलम का उपयोग कर फ्लैश क्रोमैटोग्राफी द्वारा भंग masarimycin शुद्ध.
    1. मोबाइल चरण के 10 कॉलम वॉल्यूम (99: 1 हेक्सेन: आइसोप्रोपेनॉल) के साथ फ्लैश कॉलम को 15 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर सेट किए गए उपकरण के साथ संतुलित करें।
      नोट:: संतुलन पूर्ण होने के बाद, प्रवाह रोकें और सिस्टम से स्तंभ के शीर्ष को डिस्कनेक्ट करें।
    2. एक 5 एमएल सिरिंज का उपयोग कर भंग masarimycin ड्रा. सिरिंज को सीधे संतुलित फ़्लैश स्तंभ के शीर्ष से कनेक्ट करें और समाधान को स्तंभ में इंजेक्ट करें। फ़्लैश क्रोमैटोग्राफी सिस्टम के लिए लोड किए गए कॉलम को फिर से कनेक्ट करें और ग्रेडिएंट क्षालन शुरू करें।
    3. 10:90 हेक्सेन के अंतिम मोबाइल चरण एकाग्रता के लिए ग्रेडिएंट क्षालन का उपयोग करके कॉलम से एल्यूट मासारिमाइसिन: 12 कॉलम वॉल्यूम पर आइसोप्रोपेनॉल। 230 और 254 एनएम पर अवशोषण के माध्यम से masarimycin के क्षालन की निगरानी।
    4. एक अंश संग्राहक द्वारा स्तंभ से निकाले गए यौगिकों को इकट्ठा करें जो प्रति अंश विलायक के 20 मिलीलीटर एकत्र करता है।
      नोट: यदि एक फ्लैश क्रोमैटोग्राफी सिस्टम उपलब्ध नहीं है, तो मासारिसिन का शुद्धिकरण 3: 1 (हेक्सेन: एथिल एसीटेट) मोबाइल चरण के साथ गुरुत्वाकर्षण सिलिका कॉलम के माध्यम से किया जा सकता है। मासारिसिन युक्त अंशों को एक ही मोबाइल चरण का उपयोग करके टीएलसी द्वारा पहचाना जा सकता है। टीएलसी स्पॉट का विज़ुअलाइज़ेशन या तो यूवी प्रकाश, मैं2 वाष्प, या पोटेशियम परमैंगनेट स्टेनिंग के साथ किया गया था।
    5. टीएलसी (चरण 2.5-2.9) या एक वायुमंडलीय ठोस विश्लेषण जांच से सुसज्जित कॉम्पैक्ट द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मासारिसिन युक्त अंशों की पहचान करें। वैक्यूम (~ 0.3 mbar) के तहत अंतिम उत्पाद सूखी.
      नोट: Masarimycin नियमित रूप से एक रंगहीन तेल या ठोस के रूप में प्राप्त किया जाता है जिसमें 55% -70% की उपज होती है, जो प्रतिक्रिया में जोड़े गए साइक्लोहेक्सिल कार्बोक्सेल्डिहाइड के mmol के संबंध में होती है। शुद्ध मासारिसिन के द्रव्यमान को प्राप्त करके और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके प्रतिक्रिया की सैद्धांतिक उपज की गणना करके मासारिमाइसिन की अंतिम उपज की गणना करें:
      % उपज = Equation 2 x 100%
  16. एनएमआर द्वारा मासारिमाइसिन की संरचना की पुष्टि करें।
    1. भंग ~ CDCl3 के 0.5 mL में masarimycin नमूने के 10 मिलीग्राम. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, समाधान को 5 मिमी एनएमआर ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब को कैप करें। स्पेक्ट्रोमीटर में एनएमआर ट्यूब रखें।
    2. निर्माता पूर्व निर्धारित प्रयोगों का उपयोग करके 1 एच और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करें। रासायनिक शिफ्ट असाइनमेंट और प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा अनुपूरक आंकड़े 3-4 में प्रदान किए गए हैं।
  17. स्टोर masarimycin सूखी या DMSO (25 mM अंतिम एकाग्रता) में भंग -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने तक.

3. masarimycin की तैयारी के लिए माइक्रोवेव प्रक्रिया

  1. cyclohexylamine, cyclohexyl carboxaldehyde, cyclohexyl isocyanide, और एसिटोनिट्राइल में o-iodobenzoic एसिड के 0.6 एम समाधान तैयार करें।
  2. एक हलचल पट्टी और एक ग्लास माइक्रोवेव प्रतिक्रिया शीशी के लिए acetonitrile के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. Cyclohexylamine के 2 मिलीलीटर (एसिटोनिट्राइल में 0.6 एम), साइक्लोहेक्सिल कार्बोक्सेल्डिहाइड के 2 मिलीलीटर (एसिटोनिट्राइल में 0.6 एम), और शीशी में एसिटोनिट्राइल के 7 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. माइक्रोवेव हिंडोला में माइक्रोवेव रिएक्शन शीशी रखें। मिश्रण को हिलाएं, इसे 400 डब्ल्यू की बिजली सेटिंग पर 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए गर्म करें, और इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें।
  5. शीशी में ओ-आयोडोबेंजोइक एसिड (मेथनॉल में 0.6 एम) के 2 एमएल और साइक्लोहेक्सिल आइसोसाइनाइड (एसिटोनिट्राइल में 0.6 एम) के 2 एमएल जोड़ें। मिश्रण को हिलाएं, इसे 400 डब्ल्यू की पावर सेटिंग पर 40 मिनट के लिए माइक्रोवेव में 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें।
  6. चरण 3.5 के पूरा होने के बाद मैं2 वाष्प का उपयोग करके टीएलसी (90: 10 हेक्सेन: आइसोप्रोपेनॉल) द्वारा प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी करें।
    नोट: यदि TLC दिखाता है कि प्रतिक्रिया अपूर्ण है (यानी, TLC पर एकाधिक धब्बे), प्रतिक्रिया शीशी वापस माइक्रोवेव में रखें और चरण 3.5 में वर्णित माइक्रोवेव शर्तों को सेट करें।
  7. एक बार प्रतिक्रिया पूरी हो जाने के बाद, समाधान को 100 मिलीलीटर राउंड-बॉटम फ्लास्क में डालें और रोटरी बाष्पीकरणकर्ता का उपयोग करके इसे सूखापन के लिए वाष्पित करें।
  8. जलीय वर्कअप, शुद्धिकरण, और masarimycin के लक्षण वर्णन को पूरा करने के लिए ऊपर दिए गए चरणों 2.6-2.16 का पालन करें।

4. सिनर्जी और विरोध परख

  1. मूलर-हिंटन (एमएच) आगर प्लेटों पर स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया आर 6 विकसित करें जिसमें अवायवीय परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% (वी / वी) भेड़ रक्त होता है। सभी प्रयोगों में, 37 डिग्री सेल्सियस पर एमएच शोरबा के 5 मिलीलीटर में उगाए गए दूसरे मार्ग कोशिकाओं का उपयोग एनारोबिक परिस्थितियों में जब तककि ओडी 600 ~ 0.4 नहीं है।
  2. इनहिबिटर masarimycin और optochin को संबंधित सॉल्वैंट्स में सीरियल 1: 2 dilutions के अधीन करें, जिसके परिणामस्वरूप सांद्रता प्रत्येक अवरोधक के न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) मूल्यों को फ्लैंक करती है।
    1. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में मासारिसिन का प्रारंभिक कमजोर पड़ने जब तक कि 100 μM की एकाग्रता तक नहीं पहुंच जाता है। इस बिंदु से, एमएच शोरबा में मासारिसिन कमजोर पड़ने का निर्माण करें। बाँझ एमएच शोरबा में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑप्टोचिन ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करके ऑप्टोचिन स्टॉक समाधान (3.5 mM) तैयार करें।
      नोट: Masarimycin स्टॉक समाधान DMSO में 25 mM पर किए गए थे।
  3. एक बाँझ 96-अच्छी तरह से माइक्रोटाइटर प्लेट के लिए, प्लेट की प्रत्येक पंक्ति में प्रत्येक ऑप्टोचिन कमजोर पड़ने के 2 μL एलीकोट जोड़ें। एक ही प्लेट के लिए, प्लेट पर ऑप्टोचिन और मासारिमाइसिन सांद्रता की एक सरणी बनाने के लिए प्रत्येक कॉलम में प्रत्येक मासारिमाइसिन कमजोर पड़ने के 2 μL एलीकोट जोड़ें (चित्रा 2)।
  4. उपर्युक्त अवरोधकों वाले प्रत्येक अच्छी तरह से बाँझ एमएच शोरबा (93 μL) जोड़ें। चरण 4.1 से संस्कृति के 5 μL (OD600 ~ 0.4 ) के साथ माइक्रोटिटर प्लेटों को संक्रमित करें।
    नोट: 96-वेल प्लेट का इनोक्यूलेशन आमतौर पर एक एनारोबिक वर्कस्टेशन में एनारोबिक परिस्थितियों में किया जाता है। कुएं में अंतिम आयतन 100 μL है।
  5. अवायवीय परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए संस्कृतियों को विकसित करें, इसके बाद रेसाज़ुरिन सोडियम नमक के 0.01% (एम / वी) समाधान के 30 μL के अलावा। रंग के गठन और स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: Resazurin समाधान आसुत पानी में यौगिक को भंग करके तैयार किया जाता है और दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. सीधे प्लेट से एकाग्रता मूल्यों को पढ़ें और सबसे कम अवरोधक एकाग्रता को असाइन करें जिसके लिए कोई जीवाणु वृद्धि नहीं देखी जाती है (नीला रंग) [एक्स] के रूप में (चरण 4.7.1 देखें), यानी, सह-दवा की उपस्थिति में दवा की सबसे कम निरोधात्मक एकाग्रता।
    नोट: सकारात्मक जीवाणु विकास resazurin डाई गुलाबी मोड़ द्वारा कुओं में पहचाना जाता है. अकेले प्रत्येक दवा के लिए एमआईसी मूल्यों (यानी, सह-दवा की अनुपस्थिति में) प्रत्येक दवा के साथ अलग से resazurin MIC परख35 का उपयोग करके एक समान तरीके से निर्धारित किया जाता है (पूरक चित्रा 5)। एस निमोनिया में एमआईसी क्रमशः मासारिमाइसिन और ऑप्टोचिन के लिए 7.8 μM और 15.85 μM हैं।
  7. निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके भिन्नात्मक निरोधात्मक एकाग्रता (FIC) और FIC सूचकांक (FICI) निर्धारित करें।
    1. एफआईसी = [एक्स] / एमआईसीएक्स, जहां [एक्स] (चरण 4.6 से) सह-दवा की उपस्थिति में दवा की सबसे कम निरोधात्मक एकाग्रता है, और एमआईसीएक्स सह-दवा की अनुपस्थिति में दवा की सबसे कम निरोधात्मक एकाग्रता है।
    2. FICI = FICmasarimycin + FICएंटीबायोटिक
      नोट: FICI < 0.5 = synergistic, 0.5 < FICI < 1 = additive, 1 < FICI < 4 = उदासीन, FICI > 4 = विरोधी।

5. रूपात्मक अध्ययन

  1. Luria-Bertani (LB) आगर प्लेटों (10 g / L tryptone, 5 g / L खमीर निकालने, और 5 g / L NaCl) पर बैसिलस सबटिलिस 11774 बढ़ो जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5% बैक्टो आगर शामिल है। सभी प्रयोगों में, 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी शोरबा के 5 मिलीलीटर में उगाए गए दूसरे मार्ग कोशिकाओं का उपयोग करें जब तक कि ओडी600 = 1 न हो। चरण 4.1 के रूप में उसी तरह से S.pneumoniae विकसित करें।
  2. OD600nm = 1 के साथ एक सेल संस्कृति घनत्व प्राप्त करने के बाद B. subtilis के लिए, या OD600nm = 0.4 S. निमोनिया के लिए, 3.8 μM ( B.subtilis के लिए 0.75x MIC) की अंतिम एकाग्रता के लिए "इलाज" लेबल वाली संस्कृति ट्यूब में एक पिपेट का उपयोग करके masarimycin जोड़ें, या 5.85 μM ( S.pneumoniae के लिए 0.75x MIC)। "नियंत्रण" लेबल वाली दूसरी संस्कृति ट्यूब के लिए, DMSO की एक समतुल्य मात्रा जोड़ें।
  3. B.subtilis के लिए, 150 rpm पर मिलाते हुए 90 मिनट के लिए 37 °C पर एक इनक्यूबेटर में नमूनों को रखें। एस निमोनिया के लिए, एनारोबिक परिस्थितियों में हिलाए बिना कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. 90 मिनट के बाद, रासायनिक रूप से संस्कृति मीडिया के 1: 10 मिश्रण (वी / वी) में संस्कृतियों को ठीक करें और बफर (20 एमएम एचईपीईएस, 1% फॉर्मेल्डिहाइड (पीएच 6.8)) को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। फिक्सिंग के पूरा होने के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 10-20 μL नमूनों को लागू करें और उन्हें सूखने की अनुमति दें। एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर कांच स्लाइड गर्म करके हवा से सूखे नमूनों को ठीक करें।
  5. गर्मी फिक्सिंग के बाद, 0.1% (एम / वी) मेथिलीन ब्लू (20% (वी / वी) इथेनॉल में समाधान) के 100 μL के अलावा के साथ दाग के नमूने। दाग स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और डीएच2ओ के साथ अतिरिक्त डाई को धो लें। फिर, कोशिकाओं को एक सामान्य फोकल प्लेन में लाने के लिए 15-20 मिनट के लिए ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस तक धीरे से दाग स्लाइड को गर्म करें।
  6. दाग कोशिकाओं पर एक माइक्रोस्कोप coverslip रखकर दाग नमूनों सील. फिर, माइक्रोस्कोप स्लाइड सीमेंट का उपयोग करके किनारों को सील करें। माइक्रोस्कोप चरण पर सील माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें और उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवि को 100x आवर्धन पर ध्यान में लाएं।
  7. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें और 1000x आवर्धन का उपयोग करके ध्यान केंद्रित करने के लिए दृश्य के क्षेत्र को लाएं। माइक्रोस्कोप और इसके संबंधित सॉफ़्टवेयर से जुड़े कैमरे का उपयोग करके माइक्रोग्राफ प्राप्त करें। सॉफ़्टवेयर पर ऑटो व्हाइट बैलेंस और एपर्चर सेटिंग्स का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।
    नोट:: वैकल्पिक रूप से, छवियों को ओपन-सोर्स ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है।

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Representative Results

Masarimycin बी subtilis और एस निमोनिया का एक छोटा अणु बैक्टीरियोस्टेटिक अवरोधक है और बी subtilis35,37 में एक्सो-अभिनय GlcNacase LytG को बाधित करने और एस निमोनिया37 में सेल की दीवार को लक्षित करने के लिए दिखाया गया है। Masarimycin कुशलतापूर्वक या तो शास्त्रीय या माइक्रोवेव की सहायता से कार्बनिक संश्लेषण द्वारा 55% -70% सीमा में पैदावार के साथ तैयार किया जा सकता है। माइक्रोवेव-सहायता प्राप्त संश्लेषण में यौगिक को संश्लेषित करने के लिए समय में महत्वपूर्ण कमी का लाभ होता है। माइक्रोवेव-सहायता प्राप्त संश्लेषण तुलनीय पैदावार को बनाए रखते हुए संश्लेषण को 5-6 एच (पारंपरिक संश्लेषण) से 2-3 घंटे तक कम कर देता है। फ़्लैश क्रोमैटोग्राफी उच्च शुद्धता में masarimycin की तेजी से शुद्धि प्रदान करता है (पूरक आंकड़े 1-2). प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा के साथ 1एच और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रा से संरचनात्मक असाइनमेंट अनुपूरक आंकड़े 3-4 में प्रदान किए गए हैं।

सिनर्जी और विरोध स्क्रीन सेलुलर घटकों (तालमेल) के बीच कार्यात्मक कनेक्शन को प्रकट करने और आनुवंशिक नेटवर्क और दवा कार्रवाई के तंत्र (विरोध) 40 की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। एस निमोनिया में ATPase अवरोधक optochin के साथ तालमेल / विरोध का मूल्यांकन चित्र 2 में प्रस्तुत किया गया है। Resazurin microtitre प्लेट परख41 जीव के विकास / जीवाणु विकास (नीले रंग) को बाधित करने के लिए यौगिक की सबसे कम एकाग्रता को एक सह-दवा की उपस्थिति में एमआईसी मूल्य के रूप में लिया जाता है। बैक्टीरियल ग्रोथ वाले कुएं गुलाबी रंग के होंगे। Masarimycin और optochin के बीच संबंध प्रोटोकॉल चरण 4.7 में समीकरणों का उपयोग करके भिन्नात्मक अवरोधक एकाग्रता सूचकांक (FICI) की गणना करके निर्धारित किया गया था। Masarimycin-optochin इंटरैक्शन के लिए FICI मान की गणना 1.5 होने के लिए की जाती है, जो प्रकाशित मानकों42 के आधार पर एक उदासीन संबंध का संकेत देती है। उप-एमआईसी सांद्रता में बी सबटिलिस में मासारिमाइसिन का उपयोग करके फेनोटाइपिक assays ने एक सॉसेज-जैसे फेनोटाइप (चित्रा 3 बी) को प्रस्तुत किया, जो साहित्य32 में ΠlytG उत्परिवर्ती के रिपोर्ट किए गए फेनोटाइप से अलग है और अधिक बारीकी से कई ऑटोलिसिन नॉकआउट29 जैसा दिखता है। उप-एमआईसी सांद्रता में मासारिमाइसिन के साथ एस निमोनिया के फेनोटाइपिक विश्लेषण ने एक क्लम्पिंग फेनोटाइप (चित्रा 3 डी) प्रस्तुत किया। यह clumping phenotype एस निमोनिया सेल-दीवार-अभिनय GlcNAcases43,44,45 के लिए रिपोर्ट किए गए लोगों से अलग है।

Figure 1
चित्रा 1: पेप्टिडोग्लाइकन की संरचना बैसिलस सबटिलिस से एक्सो-अभिनय एन-एसिटाइल ग्लूकोसामिनिडेस लिटजी की दरार साइट को दर्शाती है। इनसेट LytG अवरोधक masarimycin की संरचना से पता चलता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सिनर्जी / विरोध परख एस निमोनिया में masarimycin और optochin के साथ विरोधी / synergistic संबंधों का पता लगाने के लिए। नीला या बैंगनी रंग कोई जीवाणु विकास को इंगित नहीं करता है, जबकि गुलाबी रंग जीवाणु विकास को इंगित करता है। सह-दवा की उपस्थिति में एमआईसी को सबसे कम एकाग्रता के रूप में लिया जाता है जो कोई जीवाणु विकास (नीला रंग) नहीं दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रूपात्मक विश्लेषण। बी सबटिलिस (ए, बी) और एस निमोनिया (सी, डी) में रूपात्मक परिवर्तन जब 0.75x एमआईसी (एमआईसीबी.सबटिलिस = 3.8 μM और एमआईसीएस.निमोनिया = 7.8 μM) मासारिमाइसिन के साथ इलाज किया जाता है। कोशिकाओं को 0.1% (एम / वी) मेथिलीन नीले रंग के साथ तय और दाग दिया गया था और 1000x आवर्धन पर तेल विसर्जन के तहत उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई थी। इस आंकड़े को 35 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: जलीय वर्कअप के बाद masarimycin के प्रतिनिधि पतली परत क्रोमैटोग्राफी. मोबाइल चरण 90: 10 हेक्सेन है: आइसोप्रोपेनॉल और आयोडीन वाष्प का उपयोग धब्बों को धुंधला करने के लिए किया जाता है। मासारिसिन के लिए आरएफ = 0.3। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: masarimycin के शुद्धिकरण के लिए प्रतिनिधि फ़्लैश क्रोमैटोग्राम. लगभग 1.2 कॉलम वॉल्यूम पर चोटी में मासारिमाइसिन होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: प्रतिनिधि 1MASARImycin के एच एनएमआर CDCl 3 में भंग कर दिया और एक 400 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर दर्ज किया गया। स्पेक्ट्रम को δ = 7.26 पर अवशिष्ट CHCl3 विलायक शिखर के लिए संदर्भित किया जाता है। रासायनिक बदलावों के ऊपर हरे रंग में संख्याएं मासारिमाइसिन की संरचना में संबंधित पदों पर प्रोटॉन असाइनमेंट का संकेत देती हैं (इनसेट देखें)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 4: 100 मेगाहर्ट्ज पर CDCl 3 में भंग masarimycin के प्रतिनिधि 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम। δ =77.36 पर अवशिष्ट CHCl 3 विलायक चोटी के लिए संदर्भित स्पेक्ट्रम। रासायनिक बदलावों के ऊपर हरे रंग में संख्याएं मासारिमाइसिन की संरचना में पदों पर कार्बन परमाणु असाइनमेंट का संकेत देती हैं (इनसेट देखें)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 5: B. subtilis के खिलाफ masarimycin के प्रतिनिधि resazurin MIC परख. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

Masarimycin बी subtilis35 और एस निमोनिया37 विकास का एक एकल माइक्रोमोलर बैक्टीरियोस्टेटिक अवरोधक है। बी सबटिलिस में, मासारिमाइसिन को GlcNacase LytG35 को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि एस निमोनिया की सेल दीवार में सटीक आणविक लक्ष्य की पहचान नहीं की गई है। शास्त्रीय कार्बनिक संश्लेषण या माइक्रोवेव प्रक्रिया का उपयोग करके मासारिसिन का संश्लेषण अच्छी उपज और उच्च शुद्धता में अवरोधक प्रदान करता है। मासारिसिन की कम पैदावार को आमतौर पर साइक्लोहेक्सिल कार्बोक्सेल्डिहाइड के ऑक्सीकरण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसे दूर करने के लिए, एक निष्क्रिय वातावरण के तहत साइक्लोहेक्सिल कार्बोक्सेल्डिहाइड को एक डेसिकेटर में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। इसी कार्बोक्जिलिक एसिड के लिए एल्डिहाइड के ऑक्सीकरण को बोतल में एक सफेद ठोस के रूप में देखा जा सकता है। विस्तारित अवधि के लिए इसे संग्रहीत किए बिना साइक्लोहेक्सिल कार्बोक्सेल्डिहाइड की छोटी मात्रा में खरीदना इस समस्या को बहुत कम कर देता है।

Masarimycin संरचना के एनएमआर असाइनमेंट एमाइड बांड के सीआईएस और ट्रांस रूपों के मिश्रण के साथ-साथ ओ-आयोडोफिनाइल रिंग के चारों ओर एट्रोपिसोमर्स की उपस्थिति से जटिल है जिसके परिणामस्वरूप कई चोटियां होती हैं। इसके परिणामस्वरूप एक प्रोटॉन रासायनिक बदलाव 1 पीपीएम पर फैल सकता है जिससे असाइनमेंट35 जटिल हो सकते हैं। नतीजतन, प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा के साथ 1 एच और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रा दोनों के लिए एनएमआर रासायनिक बदलावों का आंशिक असाइनमेंट अनुपूरक आंकड़े 3-4 में प्रदान किया गया है। यदि आइसोमर्स के मिश्रण के कारण मासारिमाइसिन के लिए 1एच और 13सी रासायनिक बदलावों को निर्दिष्ट करने में कठिनाई होती है, तो 2-आयामी एनएमआर प्रयोगों का उपयोग किया जा सकता है। सहसंबद्ध स्पेक्ट्रोस्कोपी (COSY) का उपयोग प्रोटॉन स्पिन सिस्टम की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जबकि हेटरोन्यूक्लियर सिंगल क्वांटम सुसंगतता स्पेक्ट्रोस्कोपी (HSQC) एनएमआर प्रयोगों का उपयोग प्रोटॉन-कार्बन एकल बंधन सहसंबंधों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। एक बार शुद्ध होने के बाद, मासारिसिन को तेल के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या आवश्यकता होने तक 25 एमएम की एकाग्रता के लिए डीएमएसओ में भंग किया जा सकता है। फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों की संख्या को कम करने के लिए छोटे ऐलीकोट में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। यौगिक के बार-बार फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों के बाद, मासारिसिन स्टॉक समाधान को टीएलसी द्वारा किसी भी गिरावट की निगरानी के लिए जांचा जाना चाहिए।

सिनर्जी और विरोध स्क्रीन मार्ग इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए एक प्रभावी रणनीति हो सकती है और इसका उपयोग छोटे अणुओं की कार्रवाई के तरीके को समझने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 2 Masarimycin और ATPase अवरोधक optochin का उपयोग कर एस निमोनिया R6 के साथ एक तालमेल / विरोध परख का एक उदाहरण दिखाता है (ध्यान दें कि बी subtilis में तालमेल / विरोध स्क्रीनिंग अभी भी एक चल रही जांच है)। पुनरुत्पादन के लिए, दूसरे मार्ग कोशिकाओं का उपयोग किया गया था और 0.4 से अधिक नहीं के ओडी600एनएम तक उगाया गया था। मासारिमाइसिन और ऑप्टोचिन के बीच बातचीत के लिए 1.5 का एक एफआईसीI देखा गया था, जो एंटीबायोटिक जोड़ी के बीच एक उदासीन संबंध का संकेत देता है। मासारिमाइसिन और ऑप्टोचिन के बीच उदासीन संबंध इन एंटीबायोटिक दवाओं को लक्षित करने वाले मार्गों के बीच कोई स्पष्ट बातचीत को इंगित नहीं करता है। जबकि ये assays दवा इंटरैक्शन के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि तालमेल / विरोध assays को जैविक प्रतिकृतियों और ऑड्स42 द्वारा वर्णित अधिक रूढ़िवादी कटऑफ के उपयोग के साथ चलाया जाना चाहिए। यह मनाया मामूली synergistic या विरोधी संबंधों की अति-व्याख्या को रोकने में मदद करता है।

उप-एमआईसी मासारिमाइसिन (चित्रा 3 बी) के साथ इलाज की गई बी सबटिलिस कोशिकाओं का फेनोटाइपिक विश्लेषण एक फेनोटाइप को इंगित करता है जो लिटजी32 के आनुवंशिक विलोपन के लिए रिपोर्ट किए गए फेनोटाइप से अलग होता है और अधिक बारीकी से कई ऑटोलिसिन विलोपन29 के साथ बी सबटिलिस उपभेदों के फेनोटाइप जैसा दिखता है। फेनोटाइप में यह विसंगति पेचीदा है क्योंकि जबकि लिटजी के इन विट्रो निषेधको 35 से विमुद्रीकृत किया गया है, एक ΠlytG उत्परिवर्ती में कोई अवलोकन योग्य फेनोटाइप32 नहीं है। इस विसंगति को आंशिक रूप से आनुवंशिक और रासायनिक निष्क्रियता46,47 में अंतर से समझाया जा सकता है। LytG के रासायनिक या आनुवंशिक निष्क्रियता में मनाया अंतर एक पेचीदा सवाल है जो वर्तमान में जांच के अधीन है। Masarimycin के साथ इलाज एस निमोनिया कोशिकाओं ने एक फेनोटाइप (चित्रा 3 डी) प्रस्तुत किया जो संबंधित GlcNacase (GH73, क्लस्टर 2) LytB37,43,44,48 के आनुवंशिक विलोपन से अलग है। यह रूपात्मक विसंगति कार्रवाई के मोड को असाइन करने या छोटे अणु अवरोधकों के जैविक लक्ष्य को जिम्मेदार ठहराने में चुनौतियों पर प्रकाश डालती है। रूपात्मक फेनोटाइप एक एकल आनुवंशिक विलोपन या सेल-दीवार अभिनय एंजाइम के रासायनिक निष्क्रियता के अलावा अन्य इंटरैक्शन के अधिक जटिल सेट से उत्पन्न हो सकते हैं। ये मेटा-फेनोटाइप्स34 प्रत्यक्ष (एंजाइम (ओं) की कमी) या अप्रत्यक्ष (नियामकों की हानि) तंत्र के माध्यम से जटिल इंटरैक्शन से उत्पन्न हो सकते हैं।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, masarimycin एक जीवाणु autolysin का पहला अवरोधक है कि जीवाणु विकास के निषेध को दर्शाता है (पूरक चित्रा 5). यह बी सबटिलिस और एस निमोनिया में वृद्धि का एक संकीर्ण स्पेक्ट्रम बैक्टीरियोस्टेटिक अवरोधक है। यह संकीर्ण स्पेक्ट्रम ग्राम-सकारात्मक और ग्राम-नकारात्मक जीवों के बीच सेल-दीवार चयापचय के बहु-प्रजातियों के तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक सीमा है। यह संकीर्ण स्पेक्ट्रम ग्राम-पॉजिटिव (GlcNacase) और ग्राम-नकारात्मक (लाइटिक ट्रांसग्लाइकोसिलेज़) जीवों के बीच वनस्पति विकास के दौरान उपयोग किए जाने वाले कुछ ग्लाइकोसिल हाइड्रोलेस ऑटोलिसिन में अंतर के कारण भाग में है। पीजी ऑटोलिसिन को बाधित करने के लिए मासारिसिन जैसे छोटे-अणु अवरोधकों का उपयोग करना, विशेष रूप से, GlcNacases ऑटोलिसिन फ़ंक्शन को स्पष्ट करने के लिए पारंपरिक आनुवंशिकी के लिए एक ओर्थोगोनल दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं। कुछ रासायनिक जीव विज्ञान विधियों पर मासारिमाइसिन का एक अलग लाभ है, जिसमें इसका उपयोग एक से अधिक प्रजातियों (बी सब्टिलिस और एस निमोनिया) में किया जा सकता है। यह रॉड के आकार के बीच सेल दीवार चयापचय के तुलनात्मक अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता है (बी। subtilis) और coccoid (एस निमोनिया) प्रजातियों. एस निमोनिया में कम coregulated सेल दीवार चयापचय और विभाजन रॉड के आकार की प्रजातियों49,50 की अधिक कसकर विनियमित प्रणाली में एक काउंटर-पॉइंट प्रदान करता है। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों को एस निमोनिया में आणविक लक्ष्य की पहचान करने और एस निमोनिया और बी सबटिलिस में ऑटोलिसिन के आनुवंशिक और रासायनिक निष्क्रियता के बीच अंतर का पता लगाने के लिए होगा।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
जैविक और जैव रासायनिक assays में masarimycin की प्रभावी एकाग्रता पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। इसकी हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण, 250 μM ( B. subtilis में 65x MIC) से ऊपर की सांद्रता के परिणामस्वरूप घुलनशीलता और एकत्रीकरण के मुद्दे हो सकते हैं जो जैविक डेटा की व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं। सभी प्रयोगों में वाहन (यानी, डीएमएसओ) के प्रभाव के लिए ठीक से नियंत्रित करना आवश्यक है।

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Disclosures

रीड, सी डब्ल्यू में बौद्धिक संपदा है जिसमें मासारिमाइसिन के विशिष्ट अनुप्रयोग शामिल हैं।

Acknowledgments

अनुसंधान को अनुदान संख्या 2009522 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। मासारिमाइसिन के एनएमआर विश्लेषण को 1919644 अनुदान संख्या के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन प्रमुख अनुसंधान इंस्ट्रूमेंटेशन कार्यक्रम पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष, या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

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References

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जैव रसायन अंक 179 Peptidoglycan चयापचय autolysin रासायनिक जीव विज्ञान अवरोधक सेल दीवार
Masarimycin का संश्लेषण, ग्राम सकारात्मक जीवाणु विकास का एक छोटा अणु अवरोधक
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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

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