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Biochemistry

Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

Viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione della diamide batteriostatica masarimicina, una sonda a piccola molecola che inibisce la crescita di Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando alla degradazione della parete cellulare. La sua applicazione come sonda chimica è dimostrata in saggi di sinergia/antagonismo e studi morfologici con B. subtilis e S. pneumoniae.

Abstract

Il peptidoglicano (PG) nella parete cellulare dei batteri è una struttura macromolecolare unica che conferisce forma e protezione dall'ambiente circostante. Fondamentale per comprendere la crescita e la divisione cellulare è la conoscenza di come la degradazione del PG influenza la biosintesi e l'assemblaggio della parete cellulare. Recentemente, è stata riportata l'etichettatura metabolica di PG attraverso l'introduzione di zuccheri o amminoacidi modificati. Mentre l'interrogazione chimica dei passaggi biosintetici con inibitori di piccole molecole è possibile, gli strumenti di biologia chimica per studiare la degradazione del PG da parte delle autolisine sono sottosviluppati. Le autolisine batteriche sono un'ampia classe di enzimi coinvolti nella degradazione strettamente coordinata del PG. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione di una sonda a piccola molecola, masarimycin, che è un inibitore della N-acetilglucosaminidasi LytG nel Bacillus subtilis e del metabolismo della parete cellulare nello Streptococcus pneumoniae. Viene fornita la preparazione dell'inibitore tramite sintesi organica classica e assistita da microonde. Viene presentata la sua applicabilità come strumento per studiare la fisiologia Gram-positiva nei saggi biologici.

Introduction

Il peptidoglicano (PG) è un polimero a maglie che delinea la forma e la struttura cellulare nei batteri Gram-positivi e Gram-negativi 1,2. Questo eteropolimero è una matrice di amminozuccheri reticolati da peptidi corti 3,4,5,6 con una spina dorsale composta da residui alternati di N-acetilglucosamina (GlcNAc) e acido N-acetilmuramico (MurNAc) legati a β-(1,4) (Figura 1)1. Attaccato alla porzione di lattilo C-3 di MurNAc è il peptide dello stelo. Il metabolismo della PG coinvolge un sistema strettamente coordinato di enzimi biosintetici e degradativi per incorporare nuovo materiale nella parete cellulare 7,8. La degradazione del PG viene effettuata da enzimi collettivamente denominati autolisine9 e ulteriormente classificati in base alla specificità del legame scisso. Le autolisine partecipano a molti processi cellulari tra cui la crescita cellulare, la divisione cellulare, la motilità, la maturazione PG, la chemiotassi, la secrezione proteica, la competenza genetica, la differenziazione e la patogenicità10,11. Svelare le funzioni biologiche specifiche delle singole autolisine può essere scoraggiante, in parte a causa della ridondanza funzionale. Tuttavia, recenti studi biofisici 8,12,13 e computazionali12 hanno fornito nuove informazioni sui loro ruoli nel metabolismo pg. Inoltre, recenti rapporti hanno fornito ulteriori informazioni sulla sintesi14 e sui 15,16,17 passaggi mediati dalla membrana nel metabolismo pg. Una conoscenza approfondita della relazione tra vie degradative e sintetiche del metabolismo pg potrebbe dare origine a bersagli antibiotici precedentemente non sfruttati.

Mentre ci sono stati progressi significativi nella metodologia per studiare la glicobiologia negli eucarioti, la glicobiologia batterica e, in particolare, il metabolismo PG non è avanzato a un ritmo simile. Gli attuali approcci chimici per studiare il metabolismo pg includono antibiotici marcati fluorescentemente18, sonde fluorescenti 19,20 e etichettatura metabolica 21,22,23,24. Questi nuovi approcci stanno fornendo nuovi modi per interrogare il metabolismo della parete cellulare batterica. Mentre alcune di queste strategie sono in grado di etichettare PG in vivo, possono essere specie-specifiche19, o funzionare solo in ceppi privi di una particolare autolisina25. Molte strategie di marcatura PG sono destinate all'uso con pareti cellulari isolate26 o con vie di biosintesi PG ricostituite in vitro 20,27,28. L'uso di antibiotici marcati con fluorescenza è attualmente limitato alle fasi biosintetiche e alla transpeptidazione18.

Le attuali conoscenze sulle autolisine batteriche e sul loro ruolo nel metabolismo della parete cellulare provengono da analisi genetiche e biochimiche in vitro 11,29,30,31,32. Mentre questi approcci hanno fornito una ricchezza di informazioni su questa importante classe di enzimi, decifrare il loro ruolo biologico può essere difficile. Ad esempio, a causa della ridondanza funzionale33, la cancellazione di un'autolisina nella maggior parte dei casi non comporta l'arresto della crescita batterica. Questo nonostante il loro ruolo implicito nella crescita e divisione cellulare 7,12. Un'altra complicazione è che la delezione genetica delle autolisine batteriche può dare origine a meta-fenotipi34. I metafenotipi derivano dalla complessa interazione tra la via interessata dalla delezione genetica e altre vie interconnesse. Ad esempio, un meta-fenotipo può insorgere attraverso un effetto diretto come la mancanza di un enzima o un effetto indiretto come un'interruzione dei regolatori.

Attualmente, ci sono solo pochi inibitori delle autolisine della glicosidasi come N-acetilglucosaminidasi (GlcNAcase) e N-acetilmuramidasi, che possono essere utilizzati come sonde chimiche per studiare la degradazione del PG. Per risolvere questo problema, la diamide masarimicina (precedentemente definita come fgkc) è stata identificata e caratterizzatacon 35 come inibitore batteriostatico della crescita del Bacillus subtilis che prende di mira il GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG è un GlcNAcase36 eso-agente, membro del cluster 2 all'interno della famiglia 73 della glicosil idrolasi (GH73). È il principale GlcNAcase attivo durante la crescita vegetativa32. Per quanto ne sappiamo, la masarimicina è il primo inibitore di un GlcNAcase ad azione PG che inibisce la crescita cellulare. Ulteriori studi sulla masarimicina con Streptococcus pneumoniae hanno scoperto che la masarimicina probabilmente inibisce il metabolismo della parete cellulare in questo organismo37. Qui, la preparazione di masarimicina è segnalata per l'uso come sonda di biologia chimica per studiare la fisiologia negli organismi Gram-positivi B. subtilis e S. pneumoniae. Vengono presentati esempi di analisi morfologica del trattamento con concentrazione inibitoria sub-minima con masarimicina, nonché un test di sinergia/antagonismo. I saggi di sinergia e antagonismo con antibiotici con modalità d'azione ben definite possono essere un modo utile per esplorare le connessioni tra i processi cellulari 38,39,40.

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Protocol

1. Metodi generali

NOTA: Tutti i composti sono stati acquistati da fornitori standard e utilizzati senza ulteriore purificazione.

  1. Eseguire la cromatografia a strato sottile (TLC) su una piastra di alluminio prefigurata con gel di silice XG F254. Rileva le macchie sotto una lampada UV, immergendoti nella macchia di p-anisaldeide o esponendo al vapore I2 .
  2. Registra tutti gli spettri di risonanza magnetica nucleare (NMR) su uno spettrometro a 400 MHz.
    NOTA: 1H-NMR e 13spettri C-NMR sono stati riferiti ai picchi di solvente residuo. Le costanti di accoppiamento sono date in [Hz] e gli spostamenti chimici in [ppm].
  3. Registrare gli spettri di spettrometria di massa a ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) di masarimicina su uno spettrometro di massa compatto dotato di una sonda di analisi dei solidi atmosferici.

2. Procedura generale per la preparazione della masarimicina

NOTA: eseguire i passaggi seguenti in una cappa aspirante.

  1. Preparare una soluzione di 0,1 M in metanolo di ciascun reagente: cicloesilammina, cicloesil carbossildeide, acido o-iodobenzoico e cicloesil isocianuro35.
    ATTENZIONE: La cicloesilammina, l'isocianuro di cicloesile e la carbossaldeide cicloesile sono infiammabili. Possono causare corrosione cutanea e indurre tossicità orale, cutanea, respiratoria o riproduttiva. Tenere i composti lontani da fiamme libere, superfici calde e fonti di accensione. Indossare un'adeguata protezione della pelle e degli occhi, lavorare in un'area ben ventilata ed evitare l'inalazione di vapori o nebbia. Per la conservazione, tenere le bottiglie ben chiuse e conservarle in un luogo fresco e asciutto. Conservare cicloesil carbossialdeide in un essiccatore in un'atmosfera N2 .
  2. Mescolare 5 mL di cicloesilammina (0,1 M di soluzione in metanolo) e 5 mL di cicloesil carbossilaldeide (0,1 M in metanolo) in un matraccio a fondo tondo tappato e mescolare la soluzione utilizzando una barra magnetica su una piastra agitata/calda per 30 minuti a 40 °C in un bagno di sabbia. Monitorare la temperatura utilizzando un termometro posto a circa 1 cm sotto la superficie della sabbia.
  3. Dopo 30 minuti, aggiungere 5 mL di isocianuro di cicloesile (soluzione da 0,1 M in metanolo) alla soluzione dal punto 2.2 e mescolare per altri 20 minuti a 50 °C. Infine, aggiungere 5 mL di acido o-iodobenzoico (soluzione da 0,1 M in metanolo) alla miscela di reazione e continuare a mescolare a 55 °C per 3-5 ore.
  4. Monitorare periodicamente l'andamento della reazione da parte di TLC circa ogni ora dopo che la miscela di reazione di cui sopra è stata agitata per 3 ore.
  5. Tagliare una striscia di 3 cm x 6 cm di piastra TLC con supporto in alluminio. Usando una matita #2, disegna una linea a circa 1 cm dal basso. Utilizzando un microcapillare di vetro, individuare circa 5 μL della miscela di reazione sulla piastra TLC e lasciarla asciugare.
  6. A un becher da 150 ml, aggiungere abbastanza fase mobile (esano 90:10: isopropanolo) per coprire il fondo del becher. Utilizzando un paio di pinzette, posizionare con attenzione la piastra TLC sopra nel becher assicurandosi che la piastra TLC entri nella fase mobile in modo uniforme. Coprire la parte superiore del becher con un pezzo di carta stagnola.
    NOTA: assicurarsi che la fase mobile non copra la linea e il campione individuato.
  7. Lasciare che la fase mobile risalga la piastra TLC fino a quando non si trova a circa 1 cm sotto la parte superiore della piastra. Rimuovere la piastra TLC e, utilizzando una matita, disegnare una linea che indichi la distanza percorsa dalla fase mobile. Lasciare asciugare la piastra TLC in una cappa aspirante.
  8. Una volta essiccato, posizionare la piastra TLC in un becher contenente una piccola quantità di solido I2 e coprire il becher con un pezzo di stagnola. Monitorare la TLC per lo sviluppo di macchie gialle/marroni. Una volta sviluppato, rimuovere la piastra TLC e contrassegnare la posizione delle macchie con una matita (Figura supplementare 1).
    NOTA: Se2 macchie non sono contrassegnate, la macchia si dissiperà nel tempo. Le macchie possono anche essere visualizzate sulla piastra TLC mediante luce UV, colorazione di p-anisaldeide o colorazione del permanganato di potassio (vedere Informazioni supplementari).
  9. Calcolate i valori Rf per tutti i punti visualizzati utilizzando la seguente formula:
    Rf = Equation 1
  10. Considerare la reazione completa quando solo un punto con Rf = 0,3 è visibile sulla piastra TLC. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotativo a pressione ridotta e asciugare il prodotto grezzo (ottenuto come olio bruno-giallastro) sotto un alto vuoto fino a quando tutto il metanolo è evaporato.
  11. Sciogliere il prodotto greggio essiccato in 30 ml di acetato di etile e trasferirlo in un imbuto separatore. Estrarre l'acetato di etile in sequenza con 1 M HCl (2 x 30 mL), H2O (30 mL), soluzione satura di NaHCO3 (2 x 30 mL), H2O (30 mL) e soluzione di NaCl saturo (2 x 30 mL). Scartare gli strati acquosi.
    NOTA: Lo strato di acetato di etile è lo strato superiore in ciascuna delle estrazioni. Per ogni estrazione, agitare vigorosamente l'imbuto separatore contenente l'acetato di etile e la soluzione acquosa (HCl, H2O, NaHCO3 o NaCl) e lasciare che gli strati si separino completamente.
  12. Rimuovere lo strato di acetato di etile dall'imbuto separatore e raccoglierlo in un matraccio Erlenmeyer. Aggiungere una spatola piena di Na2SO4 (anidra) per rimuovere l'acqua residua dall'acetato di etile.
    NOTA: La soluzione di acetato di etile è considerata secca quando Na2SO4 nel matraccio scorre liberamente e non si aggrega. Se Na2SO4 si aggrega, è possibile aggiungere una spatola aggiuntiva di Na2SO4 .
  13. Filtrare la soluzione essiccata di acetato di etile attraverso la carta da filtro #1 per rimuovere Na2SO4. Lavare la carta da filtro con una piccola quantità di acetato di etile. Posizionare la soluzione filtrata di acetato di etile in un matraccio a fondo tondo e rimuovere il solvente su un evaporatore rotatorio a pressione ridotta per ottenere masarimicina come olio una volta rimosso tutto l'acetato di etile.
  14. Sciogliere l'olio di masarimicina ottenuto sopra in una quantità minima (1-2 ml) di esano 9:1: isopropanolo e mescolare su una piastra magnetica fino a quando tutto il composto è sciolto.
  15. Purificare la masarimicina disciolta mediante cromatografia flash utilizzando una colonna flash di silice in fase normale da 12 g.
    1. Equilibrare la colonna flash con 10 volumi di colonna di fase mobile (esano 99:1: isopropanolo) con lo strumento impostato ad una portata di 15 mL/min.
      NOTA: al termine dell'equilibrio, arrestare il flusso e scollegare la parte superiore della colonna dal sistema.
    2. Aspirare la masarimicina disciolta usando una siringa da 5 ml. Collegare la siringa direttamente alla parte superiore della colonna flash bilanciata e iniettare la soluzione nella colonna. Ricollegare la colonna caricata al sistema di cromatografia flash e avviare l'eluizione del gradiente.
    3. Elute masarimycin dalla colonna utilizzando l'eluizione gradiente ad una concentrazione di fase mobile finale di 10:90 esano: isopropanolo su 12 volumi di colonna. Monitorare l'eluizione di masarimicina attraverso l'assorbimento a 230 e 254 nm.
    4. Raccogliere i composti eluiti dalla colonna da un collettore di frazioni che raccoglie 20 ml di solvente per frazione.
      NOTA: Se non è disponibile un sistema di cromatografia flash, la purificazione della masarimicina può essere eseguita tramite una colonna di silice gravitazionale con una fase mobile 3:1 (esano: acetato di etile). Le frazioni contenenti masarimicina possono essere identificate da TLC utilizzando la stessa fase mobile. La visualizzazione delle macchie TLC è stata effettuata con luce UV, vapore I2 o colorazione del permanganato di potassio.
    5. Identificare le frazioni contenenti masarimicina mediante TLC (fasi 2.5-2.9) o spettrometria di massa su uno spettrometro di massa compatto dotato di una sonda di analisi dei solidi atmosferici. Asciugare il prodotto finale sotto vuoto (~0,3 mbar).
      NOTA: La masarimicina è abitualmente ottenuta come olio incolore o solido con una resa del 55%-70% rispetto al mmol di cicloesil carbossialdeide aggiunto alla reazione. Calcola la resa finale della masarimicina ottenendo la massa della masarimicina purificata e calcolando la resa teorica della reazione usando la seguente formula:
      % resa = Equation 2 x 100%
  16. Confermare la struttura della masarimicina mediante NMR.
    1. Sciogliere ~10 mg di campione di masarimicina in 0,5 ml di CDCl3. Utilizzando un pipetto Pasteur, trasferire la soluzione su un tubo NMR da 5 mm e tappare il tubo. Posizionare il tubo NMR nello spettrometro.
    2. Acquisisci spettri NMR 1H e 13C utilizzando esperimenti preimpostati dal produttore. Le assegnazioni dei turni chimici e gli spettri rappresentativi sono forniti nelle figure supplementari 3-4.
  17. Conservare la masarimicina asciutta o disciolta in DMSO (concentrazione finale di 25 mM) a -20 °C fino all'uso.

3. Procedura a microonde per la preparazione di masarimycin

  1. Preparare soluzioni 0,6 M di cicloesilammina, cicloesile carbossildeide, isocianuro di cicloesile e acido o-iodobenzoico in acetonitrile.
  2. Aggiungere una barra di agitazione e 10 ml di acetonitrile a un flaconcino di reazione a microonde di vetro.
  3. Aggiungere 2 mL di cicloesilammina (0,6 M in acetonitrile), 2 mL di cicloesil carbossildeide (0,6 M in acetonitrile) e 7 ml di acetonitrile al flaconcino.
  4. Posizionare il flaconcino di reazione a microonde nel carosello del microonde. Mescolare la miscela, riscaldarla per 30 minuti a 50°C con una potenza di 400 W e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere 2 mL di acido o-iodobenzoico (0,6 M in metanolo) e 2 mL di isocianuro di cicloesile (0,6 M in acetonitrile) al flaconcino. Mescolare la miscela, riscaldarla a 100 °C nel microonde per 40 minuti con una potenza di 400 W e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
  6. Monitorare l'avanzamento della reazione mediante TLC (esano 90:10: isopropanolo) utilizzando il vapore I2 dopo il completamento del passaggio 3.5.
    NOTA: se la TLC mostra che la reazione è incompleta (cioè più punti sulla TLC), riposizionare il flaconcino di reazione nel microonde e impostare le condizioni del microonde descritte al punto 3.5.
  7. Una volta completata la reazione, versare la soluzione in un matraccio a fondo tondo da 100 ml ed evaporarla a secco utilizzando un evaporatore rotante.
  8. Seguire i passaggi 2.6-2.16 sopra per completare il workup acquoso, la purificazione e la caratterizzazione della masarimicina.

4. Analisi di sinergia e antagonismo

  1. Coltivare Streptococcus pneumoniae R6 su piastre di agar Mueller-Hinton (MH) contenenti il 5% (v/v) di sangue di pecora a 37 °C in condizioni anaerobiche. In tutti gli esperimenti, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in 5 ml di brodo MH a 37 °C in condizioni anaerobiche fino a quando OD600 è ~ 0,4.
  2. Sottoporre gli inibitori masarimicina e optochina a diluizioni seriali 1:2 nei rispettivi solventi, con le concentrazioni risultanti che affiancano i valori minimi di concentrazione inibitoria (MIC) di ciascun inibitore.
    1. Effettuare la diluizione iniziale di masarimicina in dimetilsolfossido (DMSO) fino a raggiungere una concentrazione di 100 μM. Da questo punto, fare diluizioni di masarimicina in brodo MH. Preparare la soluzione madre di optochin (3,5 mM) sciogliendo l'optochina disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) in brodo MH sterile.
      NOTA: le soluzioni stock di Masarimycin sono state realizzate a 25 mM in DMSO.
  3. Su una piastra sterile di microtitolazione a 96 pozzetti, aggiungere aliquote da 2 μL di ciascuna diluizione optochina a ciascuna fila della piastra. Alla stessa piastra, aggiungere 2 aliquote μL di ogni diluizione di masarimicina a ciascuna colonna per creare una serie di concentrazioni di optochin e masarimycin sulla piastra (Figura 2).
  4. Aggiungere brodo MH sterile (93 μL) a ciascun pozzetto contenente gli inibitori di cui sopra. Inoculare le piastre di microtitolazione con 5 μL di coltura (OD600 ~ 0,4) dal punto 4.1.
    NOTA: l'inoculazione della piastra a 96 pozzetti viene in genere eseguita in condizioni anaerobiche in una workstation anaerobica. Il volume finale nel pozzo è di 100 μL.
  5. Coltivare colture per 18 ore a 37 °C in condizioni anaerobiche, seguite dall'aggiunta di 30 μL di soluzione allo 0,01% (m/v) di sale sodico di resazurina. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la formazione e la stabilizzazione del colore.
    NOTA: La soluzione di resazurina viene preparata sciogliendo il composto in acqua distillata e può essere conservata a 4 °C per un massimo di due settimane.
  6. Leggere direttamente i valori di concentrazione dalla piastra e assegnare la più bassa concentrazione di inibitori per la quale non si osserva alcuna crescita batterica (colore blu) come [X] (vedere il punto 4.7.1), cioè la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in presenza del co-farmaco.
    NOTA: La crescita batterica positiva è identificata nei pozzetti dal colorante resazurina che diventa rosa. I valori di MIC per ciascun farmaco da solo (cioè in assenza di co-farmaco) sono determinati in modo simile utilizzando il test resazurin MIC35 con ciascun farmaco separatamente (Figura supplementare 5). I MIC in S. pneumoniae sono 7,8 μM e 15,85 μM per masarimycin e optochin, rispettivamente.
  7. Determinare la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) e l'indice FIC (FICI) utilizzando le seguenti equazioni.
    1. FIC= [X]/MICx, dove [X] (dal passo 4.6) è la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in presenza del co-farmaco, e MICx è la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in assenza del co-farmaco.
    2. FICI= FICmasarimicina +antibiotico FIC
      NOTA: FICI < 0,5 = sinergico, 0,5 < FICI < 1 = additivo, 1 < FICI < 4 = indifferente, FICI > 4 = antagonista.

5. Studio morfologico

  1. Coltivare Bacillus subtilis 11774 su piastre di agar Luria-Bertani (LB) (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L di NaCl) contenenti l'1,5% di Bacto agar a 37 °C. In tutti gli esperimenti, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in 5 ml di brodo LB a 37 °C fino a OD600 = 1. Coltivare S.pneumoniae nello stesso modo del passaggio 4.1.
  2. Dopo aver ottenuto una densità di coltura cellulare con OD600nm = 1 per B. subtilis, o OD600nm = 0,4 per S. pneumoniae, aggiungere masarimycin usando una pipetta al tubo di coltura etichettato "trattato" ad una concentrazione finale di 3,8 μM (0,75x MIC per B.subtilis), o 5,85 μM (0,75x MIC per S.pneumoniae). Al secondo tubo di coltura etichettato "controllo", aggiungere un volume equivalente di DMSO.
  3. Per B.subtilis, posizionare i campioni in un incubatore a 37 °C per 90 minuti con agitazione a 150 giri/min. Per S. pneumoniae, incubare le cellule senza scuotere in condizioni anaerobiche.
  4. Dopo 90 minuti, fissare chimicamente le colture in una miscela 1:10 (v/v) di terreno di coltura e tampone di fissaggio (20 mM HEPES, 1% formaldeide (pH 6,8)) a 4 °C durante la notte. Al termine del fissaggio, applicare 10-20 μL di campioni su vetrini per microscopio di vetro utilizzando una pipetta e lasciarli asciugare all'aria. Fissare i campioni essiccati all'aria riscaldando i vetrini utilizzando un bruciatore Bunsen.
  5. Dopo il fissaggio a caldo, i campioni di colorazione con l'aggiunta di 100 μL di blu di metilene allo 0,1% (m/v) (soluzione in etanolo al 20% (v/v). Incubare i vetrini macchiati per 10 minuti e lavare via il colorante in eccesso con dH2O. Quindi, riscaldare delicatamente i vetrini macchiati a 60 ° C in un forno per 15-20 minuti per portare le celle su un piano focale comune.
  6. Sigillare i campioni macchiati posizionando un coprimicroscopio sulle cellule macchiate. Quindi, sigillare i bordi usando il cemento del vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino del microscopio sigillato sul palco del microscopio e mettere a fuoco l'immagine con un ingrandimento di 100x utilizzando la microscopia a campo luminoso.
  7. Posizionare una goccia di olio per immersione sul vetrino del microscopio e mettere a fuoco il campo visivo utilizzando un ingrandimento di 1000x. Acquisire micrografie utilizzando una fotocamera collegata al microscopio e il relativo software associato. Acquisisci immagini utilizzando le impostazioni di bilanciamento automatico del bianco e apertura sul software.
    NOTA: in alternativa, le immagini possono essere elaborate utilizzando il software open source ImageJ.

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Representative Results

Masarimycin è un inibitore batteriostatico a piccola molecola di B. subtilis e S. pneumoniae e ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG eso-agente in B. subtilis35,37 e di colpire la parete cellulare in S. pneumoniae37. La masarimicina può essere preparata in modo efficiente sia dalla sintesi organica classica che da quella assistita da microonde con rese nell'intervallo 55%-70%. La sintesi assistita da microonde ha il vantaggio di una significativa riduzione del tempo di sintesi del composto. La sintesi assistita da microonde accorcia la sintesi da 5-6 h (sintesi tradizionale) a 2-3 h mantenendo rese comparabili. La cromatografia flash fornisce una rapida purificazione della masarimicina in elevata purezza (Figure supplementari 1-2). Le assegnazioni strutturali deglispettri NMR 1 H e 13C insieme agli spettri rappresentativi sono fornite nelle figure supplementari 3-4.

Gli schermi di sinergia e antagonismo possono essere uno strumento utile per rivelare connessioni funzionali tra componenti cellulari (sinergia) e per indagare reti genetiche e meccanismi di azione del farmaco (antagonismo)40. La valutazione della sinergia/antagonismo con l'optochina dell'inibitore dell'ATPasi in S. pneumoniae è presentata in Figura 2. Resazurin microtitre plate assay41 fornisce una facile lettura della crescita / non crescita dell'organismo. La più bassa concentrazione di composto per inibire la crescita batterica (colore blu) è presa come valore MIC in presenza di un co-farmaco. I pozzetti con crescita batterica saranno di colore rosa. La relazione tra masarimicina e optochina è stata determinata calcolando l'indice di concentrazione dell'inibitore frazionario (FICI) utilizzando le equazioni nella fase di protocollo 4.7. Il valore FICI per l'interazione masarimicina-optochina è calcolato in 1,5, indicando una relazione indifferente basata sugli standard pubblicati42. I saggi fenotipici che utilizzavano masarimicina in B. subtilis a concentrazioni sub-MIC presentavano un fenotipo simile a una salsiccia (Figura 3B) che differisce dai fenotipi riportati del mutante ΔlytG nella letteratura32 e più da vicino assomiglia a più knockout di autolisina29. L'analisi fenotipica di S. pneumoniae con masarimicina a concentrazioni sub-MIC ha presentato un fenotipo aggregante (Figura 3D). Questo fenotipo aggregante è distinto da quelli riportati per S. pneumoniae cell-wall-acting GlcNAcases 43,44,45.

Figure 1
Figura 1: Struttura del peptidoglicano che mostra il sito di scissione della N-acetil glucosaminidasi LytG eso-agente da Bacillus subtilis. L'inserto mostra la struttura dell'inibitore LytG masarimycin. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Saggio di sinergia/antagonismo per esplorare le relazioni antagoniste/sinergiche con masarimicina e optochina in S. pneumoniae. Il colore blu o viola indica nessuna crescita batterica, mentre il colore rosa indica la crescita batterica. Il MIC in presenza di co-farmaco è preso come la concentrazione più bassa che non mostra crescita batterica (colore blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Analisi morfologica. Cambiamenti morfologici di B. subtilis (A,B) e S. pneumoniae (C,D) quando trattati con 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 μM e MICS.pneumoniae = 7,8 μM) masarimicina. Le cellule sono state fissate e colorate con blu di metilene allo 0,1% (m / v) e visualizzate mediante microscopia a campo luminoso sotto immersione in olio con ingrandimento 1000x. Questa cifra è stata modificata da 35. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Cromatografia rappresentativa a strato sottile di masarimicina post workup acquoso. La fase mobile è 90:10 esano: il vapore di isopropanolo e iodio viene utilizzato per la colorazione delle macchie. Rf = 0,3 per la masarimicina. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Cromatogramma flash rappresentativo per la purificazione della masarimicina. Il picco a circa 1,2 volumi di colonne contiene masarimicina. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: NMR rappresentativa 1H di masarimicina disciolta in CDCl3 e registrata su uno spettrometro NMR a 400 MHz. Lo spettro si riferisce al picco residuo del solvente CHCl3 a δ = 7,26. I numeri in verde sopra gli spostamenti chimici indicano assegnazioni di protoni nelle posizioni corrispondenti nella struttura della masarimicina (vedi inserto). Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Spettro NMR rappresentativo 13C di masarimicina disciolta in CDCl3 a 100 MHz. Spettro riferito al picco del solvente chCl3 residuo a δ = 77,36. I numeri in verde sopra gli spostamenti chimici indicano assegnazioni di atomi di carbonio nelle posizioni nella struttura della masarimicina (vedi inserto). Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Saggio rappresentativo di resazurina MIC di masarimicina contro B. subtilis. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Masarimycin è un singolo inibitore batteriostatico micromolare della crescita di B. subtilis35 e S. pneumoniae37 . In B. subtilis, masarimycin ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG35, mentre il bersaglio molecolare preciso nella parete cellulare di S. pneumoniae non è stato identificato37. La sintesi di masarimicina utilizzando la classica sintesi organica o la procedura a microonde fornisce l'inibitore in buona resa e alta purezza. Basse rese di masarimicina possono essere tipicamente attribuite all'ossidazione della cicloesil carbossildeide. Per ovviare a questo, si consiglia di conservare la cicloesil carbossialdeide in un'atmosfera inerte in un essiccatore. L'ossidazione dell'aldeide al corrispondente acido carbossilico può essere vista come un solido bianco nella bottiglia. L'acquisto di piccole quantità di cicloesil carbossialdeide senza conservarla per periodi prolungati riduce notevolmente questo problema.

L'assegnazione NMR della struttura della masarimicina è complicata dalla presenza di una miscela di forme cis e trans del legame ammidico e atropisomeri attorno all'anello o-iodofenile che si traduce in picchi multipli. Ciò può comportare uno spostamento chimico del protone distribuito su 1 ppm, complicando così le assegnazioni35. Di conseguenza, l'assegnazione parziale dei cambiamenti chimici NMR perspettri NMR sia per 1 H che 13C insieme a spettri rappresentativi sono forniti nelle figure supplementari 3-4. Se c'è difficoltà nell'assegnarespostamenti chimici 1 H e 13C per masarimicina a causa della miscela di isomeri, è possibile utilizzare esperimenti NMR a 2 dimensioni. La spettroscopia correlata (COSY) può essere utilizzata per identificare i sistemi di spin protonico, mentre gli esperimenti NMR di spettroscopia a coerenza quantistica singola eteronucleare (HSQC) possono essere utilizzati per identificare correlazioni protone-carbonio a singolo legame. Una volta purificata, la masarimicina può essere conservata a -20 °C come olio o disciolta in DMSO ad una concentrazione di 25 mM fino al bisogno. Si raccomanda di conservare in piccole aliquote per ridurre il numero di cicli di congelamento-disgelo. Dopo ripetuti cicli di congelamento-scongelamento del composto, la soluzione madre di masarimicina deve essere controllata da TLC per monitorare eventuali degradazioni.

Gli schermi di sinergia e antagonismo possono essere una strategia efficace per identificare le interazioni del percorso e possono essere utilizzati per comprendere la modalità d'azione delle piccole molecole. La Figura 2 mostra un esempio di un test di sinergia/antagonismo con S. pneumonia R6 utilizzando masarimicina e l'optochina dell'inibitore dell'ATPasi (si noti che lo screening sinergico/antagonismo in B. subtilis è ancora un'indagine in corso). Per la riproducibilità, sono state utilizzate cellule di secondo passaggio e sono cresciute fino a un OD600nm di non più di 0,4. Un FICI di 1,5 è stato osservato per l'interazione tra masarimicina e optochina, indicando una relazione indifferente tra la coppia di antibiotici. La relazione indifferente tra masarimicina e optochina non indica alcuna interazione apparente tra i percorsi bersaglio di questi antibiotici. Mentre questi saggi possono fornire informazioni utili sulle interazioni farmacologiche, è importante notare che i saggi di sinergia / antagonismo dovrebbero essere eseguiti con repliche biologiche e l'uso dei cutoff più conservativi come descritto da Odds42. Ciò aiuta a prevenire l'interpretazione eccessiva delle relazioni sinergiche o antagoniste minori osservate.

L'analisi fenotipica di cellule di B. subtilis trattate con masarimicina sub-MIC (Figura 3B) indica un fenotipo che differisce dai fenotipi riportati per la delezione genetica di lytG32 e più da vicino assomiglia ai fenotipi dei ceppi di B. subtilis con delezioni multiple di autolisina29. Questa discrepanza nel fenotipo è intrigante perché mentre l'inibizione in vitro di LytG è stata demontata35, un mutante ΔlytG non ha fenotipoosservabile 32. Questa discrepanza può essere in parte spiegata da differenze nell'inattivazione genetica e chimica 46,47. Le differenze osservate nell'inattivazione chimica o genetica di LytG sono una domanda intrigante che è attualmente in fase di studio. Le cellule di S. pneumoniae trattate con masarimicina hanno presentato un fenotipo (Figura 3D) distinto dalla delezione genetica del corrispondente GlcNAcase (GH73, cluster 2) LytB 37,43,44,48. Questa discrepanza morfologica evidenzia le sfide nell'assegnazione della modalità d'azione o nell'attribuzione del bersaglio biologico degli inibitori di piccole molecole. I fenotipi morfologici possono derivare da un insieme più complesso di interazioni diverse da una singola delezione genetica o inattivazione chimica di un enzima che agisce sulla parete cellulare. Questi meta-fenotipi34 possono derivare da interazioni complesse attraverso meccanismi diretti (mancanza di un enzima(i)) o indiretti (perdita di regolatori).

Per quanto ne sappiamo, la masarimicina è il primo inibitore di un'autolisina batterica che dimostra l'inibizione della crescita batterica (Figura supplementare 5). È un inibitore batteriostatico a spettro ristretto della crescita in B. subtilis e S.pneumoniae. Questo spettro ristretto è una limitazione per gli studi comparativi multi-specie del metabolismo della parete cellulare tra organismi Gram-positivi e Gram-negativi. Questo spettro ristretto è in parte dovuto alle differenze in alcune delle autolisine glicosil idrolasi utilizzate durante la crescita vegetativa tra organismi Gram-positivi (GlcNAcase) e Gram-negativi (transglicosilasi litica). Utilizzando inibitori di piccole molecole come la masarimicina per inibire le autolisine PG, in particolare, GlcNAcases può fornire un approccio ortogonale alla genetica tradizionale per chiarire la funzione dell'autolisina. La masarimicina ha un netto vantaggio rispetto ad alcuni metodi di biologia chimica, in quanto può essere utilizzata in più di una specie (B. subtilis e S. pneumoniae). Può consentire studi comparativi del metabolismo della parete cellulare tra a forma di bastoncello (B. subtilis) e coccoidi (S. pneumoniae). Il metabolismo e la divisione della parete cellulare meno coregolati in S. pneumoniae forniscono un contrappunto nel sistema più strettamente regolato delle specie a forma di bastoncello49,50. Le applicazioni future di questa tecnica saranno l'identificazione del bersaglio molecolare in S.pneumoniae ed esplorare le differenze tra inattivazione genetica e chimica delle autolisine in S.pneumoniae e B. subtilis.

Passaggi critici nel protocollo
È importante prestare attenzione alla concentrazione efficace di masarimicina nei saggi biologici e biochimici. A causa della sua natura idrofobica, concentrazioni superiori a 250 μM (65x MIC in B. subtilis) possono causare problemi di solubilità e aggregazione che possono influire sull'interpretazione dei dati biologici. È essenziale controllare correttamente l'effetto del veicolo (ad esempio, DMSO) in tutti gli esperimenti.

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Disclosures

Reid, C. W. ha proprietà intellettuale che coinvolge applicazioni specifiche di masarimycin.

Acknowledgments

La ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation con il numero di sovvenzioni 2009522. L'analisi NMR della masarimicina è stata supportata dal premio del programma di strumentazione di ricerca della National Science Foundation con il numero di sovvenzione 1919644. Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

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Biochimica Numero 179 Peptidoglycan metabolismo autolisina biologia chimica inibitore parete cellulare
Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva
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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

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