Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Syntes av masarimycin, en liten molekylhämmare av grampositiv bakterietillväxt

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

Ett detaljerat protokoll presenteras för beredning av den bakteriostatiska diamidmasarimycin, en liten molekylsond som hämmar tillväxten av Bacillus subtilis och Streptococcus pneumoniae genom att rikta in sig på nedbrytning av cellväggen. Dess tillämpning som en kemisk sond demonstreras i synergi/antagonismanalyser och morfologiska studier med B. subtilis och S. pneumoniae.

Abstract

Peptidoglykan (PG) i bakteriens cellvägg är en unik makromolekylär struktur som ger form och skydd mot den omgivande miljön. Centralt för att förstå celltillväxt och delning är kunskapen om hur PG-nedbrytning påverkar biosyntes och cellväggsmontering. Nyligen har den metaboliska märkningen av PG genom införandet av modifierade sockerarter eller aminosyror rapporterats. Medan kemisk förhör av biosyntetiska steg med småmolekylära hämmare är möjliga, är kemiska biologiska verktyg för att studera PG-nedbrytning av autolysiner underutvecklade. Bakteriella autolysiner är en bred klass av enzymer som är involverade i den tätt samordnade nedbrytningen av PG. Här presenteras ett detaljerat protokoll för framställning av en liten molekylsond, masarimycin, som är en hämmare av N-acetylglukosaminidas LytG i Bacillus subtilis och cellväggsmetabolism i Streptococcus pneumoniae. Framställning av hämmaren via mikrovågsassisterad och klassisk organisk syntes tillhandahålls. Dess tillämplighet som ett verktyg för att studera grampositiv fysiologi i biologiska analyser presenteras.

Introduction

Peptidoglykan (PG) är en nätliknande polymer som avgränsar cellform och struktur i både grampositiva och gramnegativa bakterier 1,2. Denna heteropolymer är en matris av aminosocker som är tvärbunden av korta peptider 3,4,5,6 med en ryggrad bestående av β-(1,4)-länkade alternerande N-acetylglukosamin (GlcNAc) och N-acetylmuraminsyra (MurNAc) rester (Figur 1)1. Fäst vid C-3-laktyldelen av MurNAc är stampeptiden. Metabolismen av PG involverar ett tätt samordnat system av biosyntetiska och nedbrytande enzymer för att införliva nytt material i cellväggen 7,8. Nedbrytning av PG utförs av enzymer som kollektivt kallas autolysiner9 och klassificeras vidare baserat på specificiteten hos den kluvna bindningen. Autolysiner deltar i många cellulära processer inklusive celltillväxt, celldelning, rörlighet, PG-mognad, kemotaxis, proteinsekretion, genetisk kompetens, differentiering och patogenicitet 10,11. Att riva upp de specifika biologiska funktionerna hos enskilda autolysiner kan vara skrämmande, delvis på grund av funktionell redundans. Nyligen genomförda biofysiska 8,12,13 och beräkningsstudier12 har dock gett ny inblick i deras roller i PG-metabolismen. Dessutom har de senaste rapporterna gett ytterligare inblick i syntesen14 och membranmedierade 15,16,17 steg i PG-metabolismen. En grundlig förståelse av förhållandet mellan nedbrytande och syntetiska vägar för PG-metabolism kan ge upphov till tidigare outnyttjade antibiotikamål.

Även om det har skett betydande framsteg i metodiken för att studera glykobiologi i eukaryoter, har bakteriell glykobiologi och i synnerhet PG-metabolism inte avancerat i samma takt. Nuvarande kemiska metoder för att studera PG-metabolism inkluderar fluorescerande märkta antibiotika18, fluorescerande sonder19,20 och metabolisk märkning 21,22,23,24. Dessa nya tillvägagångssätt ger nya sätt att förhöra bakteriell cellväggsmetabolism. Medan vissa av dessa strategier kan märka PG in vivo, kan de vara artspecifika19, eller bara fungera i stammar som saknar ett visst autolysin25. Många PG-märkningsstrategier är avsedda att användas med isolerade cellväggar26 eller med in vitro-rekonstituerade PG-biosyntesvägar 20,27,28. Användningen av fluorescerande märkta antibiotika är för närvarande begränsad till biosyntetiska steg och transpeptidering18.

Den nuvarande kunskapen om bakteriella autolysiner och deras roll i cellväggsmetabolismen kommer från genetisk och in vitro biokemisk analys 11,29,30,31,32. Även om dessa tillvägagångssätt har gett en mängd information om denna viktiga klass av enzymer, kan det vara utmanande att dechiffrera deras biologiska roll. Till exempel, på grund av funktionell redundans33, leder radering av ett autolysin i de flesta fall inte till att bakterietillväxten stoppas. Detta trots deras underförstådda roll i celltillväxt och division 7,12. En annan komplikation är att genetisk deletion av bakteriella autolysiner kan ge upphov till metafenotyper34. Metafenotyper uppstår från det komplexa samspelet mellan den väg som påverkas av den genetiska deletionen och andra sammankopplade vägar. Till exempel kan en metafenotyp uppstå via en direkt effekt som bristen på ett enzym eller en indirekt effekt såsom en störning av regulatorer.

För närvarande finns det bara ett fåtal hämmare av glykosidasautolysiner såsom N-acetylglukosaminidaser (GlcNAcase) och N-acetylmuramidaser, som kan användas som kemiska sonder för att studera nedbrytningen av PG. För att ta itu med detta har diamidmasarimycin (tidigare kallat fgkc) identifierats och karakteriserats35 som en bakteriostatisk hämmare av Bacillus subtilis tillväxt som riktar sig mot GlcNAcase LytG32 (Figur 1). LytG är en exoverkande GlcNAcase36, en medlem av kluster 2 inom glykosylhydrolasfamilj 73 (GH73). Det är den viktigaste aktiva GlcNAcase under vegetativ tillväxt32. Såvitt vi vet är masarimycin den första hämmaren av ett PG-verkande GlcNAcase som hämmar cellulär tillväxt. Ytterligare studier av masarimycin med Streptococcus pneumoniae fann att masarimycin sannolikt hämmar cellväggsmetabolismen i denna organism37. Här rapporteras beredningen av masarimycin för användning som en kemisk biologisond för att studera fysiologi i de grampositiva organismerna B. subtilis och S. pneumoniae. Exempel på morfologisk analys av subminimum hämmande koncentrationsbehandling med masarimycin, samt en synergi/antagonismanalys presenteras. Synergi- och antagonismanalyser med antibiotika med väldefinierade verkningssätt kan vara ett användbart sätt att utforska kopplingar mellan cellulära processer 38,39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Allmänna metoder

OBS: Alla föreningar köptes från standardleverantörer och användes utan ytterligare rening.

  1. Utför tunnskiktskromatografi (TLC) på en aluminiumplatta förbelagd med kiselgel XG F254. Upptäck fläckar under en UV-lampa, genom nedsänkning i p-anisaldehydfläck eller genom att utsätta för I2-ånga.
  2. Registrera alla kärnmagnetiska resonansspektra (NMR) på en 400 MHz spektrometer.
    OBS: 1H-NMR och 13C-NMR-spektra refererades till kvarvarande lösningsmedelstoppar. Kopplingskonstanter anges i [Hz] och kemiska skiftningar i [ppm].
  3. Registrera masspektrometrispektra för masarimycin (atmospheric pressure chemical ionization) på en kompakt masspektrometer utrustad med en atmosfärisk analyssond för fasta ämnen.

2. Allmänt förfarande för beredning av masarimycin

OBS: Utför stegen nedan i en dragskåpa.

  1. Förbered en 0,1 M lösning i metanol av varje reaktant: cyklohexylamin, cyklohexylkarboxaldehyd, o-jodobensoesyra och cyklohexylisocyanid35.
    FÖRSIKTIGHET: Cyklohexylamin, cyklohexylesocyanid och cyklohexylkarboxaldehyd är brandfarliga. De kan orsaka hudkorrosion och inducera oral, dermal, andnings- eller reproduktionstoxicitet. Håll föreningar borta från öppna lågor, heta ytor och antändningskällor. Använd lämpligt hud- och ögonskydd, arbeta i ett väl ventilerat område och undvik inandning av ångor eller dimma. För förvaring, håll flaskorna tätt stängda och förvara dem på en sval, torr plats. Förvara cyklohexylkarboxaldehyd i en uttorkare under enN2-atmosfär .
  2. Blanda 5 ml cyklohexylamin (0,1 M lösning i metanol) och 5 ml cyklohexylkarboxaldehyd (0,1 M i metanol) i en täckt rund bottenkolv och rör om lösningen med en magnetisk omrörningsstång på en omrörningsplatta i 30 minuter vid 40 °C i ett sandbad. Övervaka temperaturen med en termometer placerad ca 1 cm under sandytan.
  3. Efter 30 minuter tillsätt 5 ml cyklohexylezocylid (0,1 M lösning i metanol) till lösningen från steg 2.2 och rör om i ytterligare 20 minuter vid 50 °C. Slutligen tillsätt 5 ml o-jodobensoesyra (0,1 M lösning i metanol) till reaktionsblandningen och fortsätt omrörningen vid 55 °C i 3–5 timmar.
  4. Övervaka reaktionens framsteg regelbundet med TLC ungefär varje timme efter att ovanstående reaktionsblandning hade omrörts i 3 timmar.
  5. Skär en 3 cm x 6 cm remsa av aluminiumbackad TLC-platta. Rita en linje ca 1 cm från botten med en penna #2. Använd en glasmikrokapillär och spot cirka 5 μL av reaktionsblandningen på TLC-plattan och låt den torka.
  6. Till en 150 ml bägare, lägg till tillräckligt med mobilfas (90:10 hexan: isopropanol) för att täcka botten av bägaren. Använd en pincett och placera försiktigt ovanstående TLC-platta i bägaren så att TLC-plattan går in i mobilfasen jämnt. Täck toppen av bägaren med en bit tinfoil.
    OBS: Se till att den mobila fasen inte täcker linjen och det prickade provet.
  7. Låt den mobila fasen färdas upp på TLC-plattan tills den är cirka 1 cm under toppen av plattan. Ta bort TLC-plattan och rita en linje med en penna som anger avståndet som den mobila fasen reste. Låt TLC-plattan torka i en dragskåpa.
  8. När du har torkat, placera TLC-plattan i en bägare som innehåller en liten mängd fast I2 och täck bägaren med en bit tennfolie. Övervaka TLC för utveckling av gula / bruna fläckar. När du har utvecklat tar du bort TLC-plattan och markerar placeringen av fläckarna med en penna (kompletterande figur 1).
    OBS: Om I2 fläckar inte är markerade kommer fläcken att försvinna med tiden. Fläckar kan också visualiseras på TLC-plattan genom UV-ljus, p-anisaldehydfärgning eller kaliumpermanganatfärgning (se Kompletterande information).
  9. Beräkna Rf-värden för alla visualiserade fläckar med hjälp av följande formel:
    Rf = Equation 1
  10. Tänk på reaktionen komplett när endast en fläck med Rf = 0,3 är synlig på TLC-plattan. Avlägsna lösningsmedlet i en roterande förångare under reducerat tryck och torka råprodukten (erhållen som en gulbrun olja) under ett högt vakuum tills all metanol har avdunstats.
  11. Lös upp den torkade råprodukten i 30 ml etylacetat och överför den till en separatorstratt. Extrahera etylacetat sekventiellt med 1 M HCl (2 x 30 ml),H2O(30 ml), mättad NaHCO3-lösning (2 x 30 ml),H2O(30 ml) och mättad NaCl-lösning (2 x 30 ml). Kassera de vattenhaltiga skikten.
    OBS: Etylacetatskiktet är det översta lagret i var och en av extraktioner. För varje extraktion, skaka kraftigt separatorstratten som innehåller etylacetatet och vattenlösningen (HCl,H2O,NaHCO3 eller NaCl) och låt skikten separeras helt.
  12. Ta bort etylacetatskiktet från separatorstratten och samla det i en Erlenmeyerkolv. Tillsätt en spatel full avNa2SO4(vattenfri) för att avlägsna kvarvarande vatten från etylacetat.
    OBS: Etylacetatlösningen anses vara torr närNa2SO4i kolven går fritt och inte klumpar sig. OmNa2SO4 klumpar sig kan en extra spatel avNa2SO4 tillsättas.
  13. Filtrera den torkade etylacetatlösningen genom filterpapper nr 1 för att avlägsnaNa2SO4. Tvätta filterpapperet med en liten mängd etylacetat. Placera den filtrerade etylacetatlösningen i en rund bottenkolv och ta bort lösningsmedlet på en roterande förångare under reducerat tryck för att erhålla masarimycin som olja när allt etylacetat har avlägsnats.
  14. Lös upp masarimycinoljan erhållen ovan i en minimal mängd (1-2 ml) av 9:1 hexan: isopropanol och rör om på en magnetisk omrörningsplatta tills all förening är upplöst.
  15. Rena det upplösta masarimycinet genom blixtkromatografi med hjälp av en 12 g normalfas kiseldioxidblixtkolonn.
    1. Balansera blixtkolonnen med 10 kolonnvolymer av mobil fas (99:1 hexan: isopropanol) med instrumentet inställt på en flödeshastighet på 15 ml/min.
      OBS: När jämvikten är klar, stoppa flödet och koppla bort toppen av kolonnen från systemet.
    2. Rita upp upplöst masarimycin med en 5 ml spruta. Anslut sprutan direkt till toppen av den jämviktade blixtkolonnen och injicera lösningen i kolonnen. Anslut den laddade kolonnen till blixtkromatografisystemet igen och initiera gradientelueringen.
    3. Elut masarimycin från kolonnen med gradienteluering till en slutlig mobil faskoncentration på 10:90 hexan: isopropanol över 12 kolonnvolymer. Övervaka elueringen av masarimycin via absorption vid 230 och 254 nm.
    4. Samla föreningarna eluerade från kolonnen med en fraktionsuppsamlare som samlar 20 ml lösningsmedel per fraktion.
      OBS: Om ett blixtkromatografisystem inte är tillgängligt kan rening av masarimycin utföras via en gravitationskiselkolonn med en 3: 1 (hexan: etylacetat) mobil fas. Fraktioner som innehåller masarimycin kan identifieras med TLC med samma mobila fas. Visualisering av TLC-fläckar gjordes med antingen UV-ljus, I2-ånga eller kaliumpermanganatfärgning.
    5. Identifiera fraktioner som innehåller masarimycin med TLC (steg 2.5-2.9) eller masspektrometri på en kompakt masspektrometer utrustad med en atmosfärisk analyssond för fasta ämnen. Torka slutprodukten under vakuum (~ 0,3 mbar).
      OBS: Masarimycin erhålls rutinmässigt som en färglös olja eller fast ämne med ett utbyte av 55% -70% med avseende på mmol cyklohexylkarboxaldehyd tillsatt till reaktionen. Beräkna det slutliga utbytet av masarimycin genom att erhålla massan av det renade masarimycinet och beräkna det teoretiska utbytet av reaktionen med hjälp av följande formel:
      % utbyte = Equation 2 x 100%
  16. Bekräfta strukturen av masarimycin av NMR.
    1. Lös upp ~ 10 mg masarimycinprov i 0,5 mlCDCl3. Överför lösningen till ett 5 mm NMR-rör med en Pasteur-pipett och täck röret. Placera NMR-röret i spektrometern.
    2. Skaffa 1H och 13C NMR-spektra med hjälp av tillverkarens förinställda experiment. Kemiska skiftuppdrag och representativa spektra finns i tilläggsfigurerna 3-4.
  17. Förvara masarimycin torrt eller upplöst i DMSO (25 mM slutlig koncentration) vid -20 °C tills användning.

3. Mikrovågsförfarande för beredning av masarimycin

  1. Förbered 0,6 M lösningar av cyklohexylamin, cyklohexylkarboxaldehyd, cyklohexylisocyanid och o-jodobensoesyra i acetonitril.
  2. Tillsätt en omrörningsstång och 10 ml acetonitril till en mikrovågsreaktionsflaska i glas.
  3. Tillsätt 2 ml cyklohexylamin (0,6 M i acetonitril), 2 ml cyklohexylkarboxaldehyd (0,6 M i acetonitril) och 7 ml acetonitril till injektionsflaskan.
  4. Placera mikrovågsreaktionsflaskan i mikrovågskarusellen. Rör om blandningen, värm den i 30 min vid 50 ° C vid en effektinställning på 400 W och låt den svalna till rumstemperatur.
  5. Tillsätt 2 ml o-jodobensoesyra (0,6 M i metanol) och 2 ml cyklohexylisocyanid (0,6 M i acetonitril) till injektionsflaskan. Rör om blandningen, värm den till 100 °C i mikrovågsugnen i 40 min vid en effektinställning på 400 W och låt den svalna till rumstemperatur.
  6. Övervaka reaktionens framsteg med TLC (90:10 hexan: isopropanol) med användning avI2-ånga efter slutförandet av steg 3.5.
    OBS: Om TLC visar att reaktionen är ofullständig (dvs. flera fläckar på TLC), placera reaktionsflaskan tillbaka i mikrovågsugnen och ställ in mikrovågsförhållandena som beskrivs i steg 3.5.
  7. När reaktionen är klar, häll lösningen i en 100 ml rundbottnad kolv och avdunsta den till torrhet med hjälp av en roterande förångare.
  8. Följ steg 2.6-2.16 ovan för att slutföra den vattenhaltiga upparbetningen, reningen och karakteriseringen av masarimycin.

4. Analys av synergi och antagonism

  1. Odla Streptococcus pneumoniae R6 på Mueller-Hinton (MH) agarplattor innehållande 5% (v/v) fårblod vid 37 °C under anaeroba förhållanden. I alla experiment, använd andra passageceller odlade i 5 ml MH-buljong vid 37 ° C under anaeroba förhållanden tills OD600 är ~ 0,4.
  2. Utsätt hämmarna masarimycin och optochin för seriella 1:2-utspädningar i respektive lösningsmedel, med de resulterande koncentrationerna som flankerar värdena för minsta hämmande koncentration (MIC) för varje hämmare.
    1. Gör den initiala utspädningen av masarimycin i dimetylsulfoxid (DMSO) tills en koncentration av 100 μM uppnås. Från denna punkt, gör masarimycinutspädningar i MH-buljong. Bered optochin stamlösning (3,5 mM) genom upplösning av kommersiellt tillgänglig optokin (se materialtabell) i steril MH-buljong.
      OBS: Masarimycin lagerlösningar tillverkades vid 25 mM i DMSO.
  3. Till en steril 96-brunns mikrotiterplatta, tillsätt 2 μL alikvoter av varje optokinutspädning till varje rad på plattan. Till samma platta, tillsätt 2 μL alikvoter av varje masarimycinutspädning till varje kolonn för att skapa en rad optochin- och masarimycinkoncentrationer på plattan (Figur 2).
  4. Tillsätt steril MH-buljong (93 μL) till varje brunn som innehåller ovanstående hämmare. Inokulera mikrotiterplattorna med 5 μL odling (OD600 ~ 0,4) från steg 4.1.
    OBS: Inokulering av 96-brunnsplattan görs vanligtvis under anaeroba förhållanden i en anaerob arbetsstation. Den slutliga volymen i brunnen är 100 μL.
  5. Odla kulturer i 18 timmar vid 37 °C under anaeroba förhållanden, följt av tillsats av 30 μL 0,01 % (m/v) lösning av resazurinnatriumsalt. Inkubera plattan vid rumstemperatur i 15 minuter för att möjliggöra bildning och stabilisering av färg.
    OBS: Resazurinlösningen framställs genom upplösning av föreningen i destillerat vatten och kan förvaras vid 4 °C i upp till två veckor.
  6. Direkt avläsa koncentrationsvärdena från plattan och tilldela den lägsta hämmarkoncentrationen för vilken ingen bakterietillväxt observeras (blå färg) som [X] (se steg 4.7.1), dvs. den lägsta hämmande koncentrationen av läkemedlet i närvaro av samläkemedlet.
    OBS: Positiv bakterietillväxt identifieras i brunnarna genom att resazurinfärgämnet blir rosa. MIC-värden för varje läkemedel ensamt (dvs. i frånvaro av samläkemedel) bestäms på ett liknande sätt med användning av resazurin MIC-analysen35 med varje läkemedel separat (kompletterande figur 5). MIC i S. pneumoniae är 7,8 μM och 15,85 μM för masarimycin respektive optokin.
  7. Bestäm fraktionerad hämmande koncentration (FIC) och FIC-index (FICI) med hjälp av följande ekvationer.
    1. FIC= [X]/MICx, där [X] (från steg 4.6) är den lägsta hämmande koncentrationen av läkemedlet i närvaro av samläkemedlet, och MICx är den lägsta hämmande koncentrationen av läkemedlet i frånvaro av samläkemedlet.
    2. FICI = FICmasarimycin + FICantibiotikum
      OBS: FICI < 0,5 = synergistisk, 0,5 < FICI < 1 = additiv, 1 < FICI < 4 = likgiltig, FICI > 4 = antagonistisk.

5. Morfologisk studie

  1. Odla Bacillus subtilis 11774 på Luria-Bertani (LB) agarplattor (10 g / L trypton, 5 g / L jästextrakt och 5 g / L NaCl) innehållande 1,5% Bacto agar vid 37 ° C. I alla experiment, använd andra passageceller odlade i 5 ml LB-buljong vid 37 ° C tills OD600 = 1. Odla S.pneumoniae på samma sätt som i steg 4.1.
  2. Efter att ha erhållit en cellodlingstäthet med OD600nm = 1 för B. subtilis, eller OD600nm = 0,4 för S. pneumoniae, tillsätt masarimycin med hjälp av en pipett till odlingsröret märkt "behandlat" till en slutlig koncentration av 3,8 μM (0,75x MIC för B.subtilis) eller 5,85 μM (0,75x MIC för S.pneumoniae). Till det andra odlingsröret märkt "kontroll", lägg till en motsvarande volym DMSO.
  3. För B.subtilis, placera proverna i en inkubator vid 37 °C i 90 min med skakning vid 150 rpm. För S. pneumoniae, inkubera cellerna utan att skaka under anaeroba förhållanden.
  4. Efter 90 minuter fixeras odlingarna kemiskt i en 1:10-blandning (v/v) av odlingsmedier och fixeringsbuffert (20 mM HEPES, 1 % formaldehyd (pH 6,8)) vid 4 °C över natten. När fixeringen är klar, applicera 10-20 μL prover på glasmikroskopglas med en pipett och låt dem lufttorka. Fäst de lufttorkade proverna genom att värma glasglasen med en Bunsen-brännare.
  5. Efter värmefixering, fläckprover med tillsats av 100 μL av 0,1% (m / v) metylenblå (lösning i 20% (v / v) etanol). Inkubera de färgade bilderna i 10 minuter och tvätta bort överflödigt färgämne med dH2O. Värm sedan försiktigt de färgade bilderna till 60 ° C i en ugn i 15-20 minuter för att föra cellerna till ett gemensamt fokalplan.
  6. Försegla de färgade proverna genom att placera ett mikroskopöverdrag över de färgade cellerna. Försegla sedan kanterna med mikroskopglidcement. Placera den förseglade mikroskopbilden på mikroskopsteget och sätt bilden i fokus vid 100x förstoring med hjälp av ljusfältsmikroskopi.
  7. Placera en droppe nedsänkningsolja på mikroskopbilden och få synfältet att fokusera med 1000x förstoring. Skaffa mikrografer med hjälp av en kamera som är ansluten till mikroskopet och dess tillhörande programvara. Hämta bilder med inställningarna för automatisk vitbalans och bländare på programvaran.
    OBS: Alternativt kan bilder bearbetas med hjälp av ImageJ-programvaran med öppen källkod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Masarimycin är en liten molekyl bakteriostatisk hämmare av B. subtilis och S. pneumoniae och har visat sig hämma den exoverkande GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 och rikta cellväggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan effektivt framställas antingen genom den klassiska eller mikrovågsassisterade organiska syntesen med utbyten i intervallet 55% -70%. Mikrovågsassisterad syntes har fördelen av en signifikant minskning av tiden för att syntetisera föreningen. Mikrovågsassisterad syntes förkortar syntesen från 5-6 h (traditionell syntes) till 2-3 h samtidigt som jämförbara utbyten bibehålls. Blixtkromatografi ger en snabb rening av masarimycin i hög renhet (kompletterande figurer 1-2). Strukturella uppdrag från 1H och 13C NMR-spektra tillsammans med representativa spektra finns i tilläggsfigurerna 3-4.

Synergi och antagonismskärmar kan vara ett användbart verktyg för att avslöja funktionella kopplingar mellan cellulära komponenter (synergi) och för att undersöka genetiska nätverk och mekanismer för läkemedelsverkan (antagonism)40. Utvärdering av synergi/antagonism med ATPashämmaren optochin i S. pneumoniae presenteras i figur 2. Resazurin mikrotitrplattaanalys 41 ger en enkel avläsning av organismens tillväxt / icke-tillväxt. Den lägsta koncentrationen av förening för att hämma bakterietillväxt (blå färg) tas som MIC-värdet i närvaro av ett samläkemedel. Brunnar med bakterietillväxt kommer att vara rosa i färg. Förhållandet mellan masarimycin och optokin bestämdes genom att beräkna koncentrationsindexet för fraktionerade hämmare (FICI) med hjälp av ekvationer i protokollsteg 4.7. FICI-värdet för masarimycin-optochin-interaktionen beräknas till 1,5, vilket indikerar ett likgiltigt förhållande baserat på publicerade standarder42. Fenotypiska analyser med användning av masarimycin i B. subtilis vid sub-MIC-koncentrationer presenterade en korvliknande fenotyp (figur 3B) som skiljer sig från rapporterade fenotyper av ΔlytG-mutanten i litteraturen32 och liknar närmare flera autolysinknockouts29. Fenotypisk analys av S. pneumoniae med masarimycin vid sub-MIC-koncentrationer presenterade en klumpande fenotyp (figur 3D). Denna klumpande fenotyp skiljer sig från de som rapporterats för S. pneumoniae cellväggverkande GlcNAcases 43,44,45.

Figure 1
Figur 1: Struktur av peptidoglykan som visar klyvningsstället för det exoverkande N-acetylglukosaminidaset LytG från Bacillus subtilis. Infälld visar strukturen hos LytG-hämmaren masarimycin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Synergi/ antagonismanalys för att utforska antagonistiska/synergistiska relationer med masarimycin och optochin i S. pneumoniae. Blå eller lila färg indikerar ingen bakterietillväxt, medan rosa färg indikerar bakterietillväxt. MIC i närvaro av co-drug tas som den lägsta koncentrationen som inte visar någon bakterietillväxt (blå färg). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Morfologisk analys. Morfologiska förändringar av B. subtilis (A,B) och S. pneumoniae (C,D) vid behandling med 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 μM och MICS.pneumoniae = 7,8 μM) masarimycin. Cellerna fixerades och färgades med 0,1% (m / v) metylenblått och visualiserades med ljusfältmikroskopi under oljenedsänkning vid 1000x förstoring. Denna siffra har ändrats från 35. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Representativ tunnskiktskromatografi av masarimycin efter vattenhaltig upparbetning. Den mobila fasen är 90:10 hexan: isopropanol och jodånga används för färgning av fläckar. Rf = 0,3 för masarimycin. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Representativt blixtkromatogram för rening av masarimycin. Toppen vid cirka 1,2 kolonnvolymer innehåller masarimycin. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Representativ 1H NMR av masarimycin upplöst i CDCl3 och inspelat på en 400 MHz NMR-spektrometer. Spektrum refereras till kvarvarandeCHCl3-lösningsmedelstopp vid δ = 7,26. Siffror i grönt ovanför kemiska skift indikerar protontilldelningar vid motsvarande positioner i masarimycinstrukturen (se infälld). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Representativt 13C NMR-spektrum av masarimycin upplöst i CDCl3 vid 100 MHz. Spektrum som refereras till kvarvarandeCHCl3-lösningsmedelstopp vid δ = 77,36. Siffror i grönt ovanför kemiska skift indikerar kolatomtilldelningar vid positionerna i masarimycinstrukturen (se infälld). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Representativ resazurin MIC-analys av masarimycin mot B. subtilis. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Masarimycin är en enda mikromolär bakteriostatisk hämmare av B. subtilis35 och S. pneumoniae37 tillväxt. I B. subtilis har masarimycin visat sig hämma GlcNAcase LytG35, medan det exakta molekylära målet i cellväggen hos S. pneumoniae inte har identifierats37. Syntes av masarimycin med användning av antingen den klassiska organiska syntesen eller mikrovågsproceduren ger hämmaren i gott utbyte och hög renhet. Låga utbyten av masarimycin kan typiskt hänföras till oxidationen av cyklohexylkarboxaldehyden. För att övervinna detta rekommenderas att cyklohexylkarboxaldehyd lagras under en inert atmosfär i en tolkare. Oxidation av aldehyden till motsvarande karboxylsyra kan ses som ett vitt fast ämne i flaskan. Att köpa små mängder cyklohexylkarboxaldehyd utan att lagra den under längre perioder minskar kraftigt detta problem.

NMR-tilldelning av masarimycinstruktur kompliceras av närvaron av en blandning av cis- och transformer av amidbindningen samt atropisomerer runt o-jodofenylringen som resulterar i flera toppar. Detta kan resultera i ett protonkemiskt skift fördelat över 1 ppm och därmed komplicera tilldelningar35. Som ett resultat av detta ges partiell tilldelning av NMR-kemiska skift för både 1H och 13C NMR-spektra tillsammans med representativa spektra i tilläggsfigurerna 3-4. Om det finns svårigheter att tilldela 1H och 13C kemiska skift för masarimycin på grund av blandningen av isomerer, kan 2-dimensionella NMR-experiment användas. Korrelerad spektroskopi (COSY) kan användas för att identifiera protonspinnsystem, medan heteronukleära nmr-experiment med enkel kvantkoherensspektroskopi (HSQC) kan användas för att identifiera proton-kol-enbindningskorrelationer. När masarimycin har renats kan det lagras vid -20 °C som olja eller lösas i DMSO till en koncentration av 25 mM tills det behövs. Det rekommenderas att lagra i små alikvoter för att minska antalet frys-tina cykler. Efter upprepade frys-upptiningscykler av föreningen bör masarimycins stamlösningen kontrolleras av TLC för att övervaka eventuell nedbrytning.

Synergi- och antagonismskärmar kan vara en effektiv strategi för att identifiera väginteraktioner och kan användas för att förstå verkningssättet för små molekyler. Figur 2 visar ett exempel på en synergi/antagonismanalys med S. lunginflammation R6 med masarimycin och ATPashämmaren optochin (observera att synergi/antagonismscreeningen vid B. subtilis fortfarande är en pågående undersökning). För reproducerbarhet användes andra passageceller och odlades till en OD600nm av högst 0,4. En FICI på 1,5 observerades för interaktionen mellan masarimycin och optokin, vilket indikerar ett likgiltigt förhållande mellan antibiotikaparet. Det likgiltiga förhållandet mellan masarimycin och optokin indikerar ingen uppenbar interaktion mellan de vägar som dessa antibiotika riktar sig mot. Även om dessa analyser kan ge användbar information om läkemedelsinteraktioner, är det viktigt att notera att synergi/antagonismanalyser bör köras med biologiska replikat och användning av de mer konservativa cutoffs som beskrivs av Odds42. Detta bidrar till att förhindra övertolkning av observerade mindre synergistiska eller antagonistiska relationer.

Fenotypisk analys av B. subtilis-celler behandlade med sub-MIC masarimycin (figur 3B) indikerar en fenotyp som skiljer sig från fenotyper som rapporterats för genetisk deletion av lytG32 och mer liknar fenotyper av B. subtilis-stammar med flera autolysinradetioner29. Denna skillnad i fenotyp är spännande eftersom medan in vitro-hämning av LytG har demonterats35, har en ΔlytG-mutant ingen observerbar fenotyp32. Denna skillnad kan delvis förklaras av skillnader i genetisk och kemisk inaktivering46,47. De observerade skillnaderna i kemisk eller genetisk inaktivering av LytG är en spännande fråga som för närvarande undersöks. S. pneumoniae-celler behandlade med masarimycin presenterade en fenotyp (figur 3D) som skiljer sig från den genetiska deletionen av motsvarande GlcNAcase (GH73, kluster 2) LytB 37,43,44,48. Denna morfologiska skillnad belyser utmaningarna med att tilldela verkningssättet eller tillskriva det biologiska målet för småmolekylära hämmare. Morfologiska fenotyper kan uppstå från en mer komplex uppsättning interaktioner andra än en enda genetisk deletion eller kemisk inaktivering av ett cellväggverkande enzym. Dessa metafenotyper34 kan uppstå genom komplexa interaktioner via direkta (brist på ett enzym(er)) eller indirekta (förlust av regulatorer) mekanismer.

Såvitt vi vet är masarimycin den första hämmaren av ett bakteriellt autolysin som visar hämning av bakterietillväxt (kompletterande figur 5). Det är en smalspektrum bakteriostatisk hämmare av tillväxt i B. subtilis och S.pneumoniae. Detta smala spektrum är en begränsning för jämförande studier av cellväggsmetabolism mellan grampositiva och gramnegativa organismer. Detta smala spektrum beror delvis på skillnader i några av de glykosylhydrolasautolysiner som används under vegetativ tillväxt mellan grampositiva (GlcNAcase) och gramnegativa (lytiska transglykosylas) organismer. Genom att använda småmolekylära hämmare såsom masarimycin för att hämma PG-autolysiner, i synnerhet, kan GlcNA-fall ge ett ortogonalt tillvägagångssätt för traditionell genetik för att belysa autolysinfunktionen. Masarimycin har en distinkt fördel jämfört med vissa kemiska biologiska metoder, eftersom det kan användas i mer än en art (B. subtilis och S. pneumoniae). Det kan möjliggöra jämförande studier av cellväggsmetabolism mellan stavformade (B. subtilis) och coccoid (S. pneumoniae) arter. Den mindre centralreglerade cellväggsmetabolismen och delningen i S. pneumoniae ger en motpunkt i det hårdare reglerade systemet av stavformade arter49,50. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer att vara att identifiera det molekylära målet i S.pneumoniae och utforska skillnaderna mellan genetisk och kemisk inaktivering av autolysiner i S.pneumoniae och B. subtilis.

Kritiska steg i protokollet
Det är viktigt att vara uppmärksam på den effektiva koncentrationen av masarimycin i biologiska och biokemiska analyser. På grund av sin hydrofoba natur kan koncentrationer över 250 μM (65x MIC i B. subtilis) leda till löslighets- och aggregeringsproblem som kan påverka tolkningen av biologiska data. Korrekt kontroll av effekten av fordonet (dvs. DMSO) i alla experiment är viktigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Reid, C. W. har immateriella rättigheter som involverar specifika tillämpningar av masarimycin.

Acknowledgments

Forskningen stöddes av National Science Foundation under anslagsnummer 2009522. NMR-analys av masarimycin stöddes av National Science Foundations stora forskningsinstrumentprogramtilldelning under bidragsnummer 1919644. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Tags

Biokemi utgåva 179 Peptidoglykan metabolism autolysin kemisk biologi hämmare cellvägg
Syntes av masarimycin, en liten molekylhämmare av grampositiv bakterietillväxt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter