Summary
Her foreslår vi en systematiseret, tilgængelig og reproducerbar protokol til påvisning af cellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetersonde (DCFH-DA) i Müller glialceller (MMC'er). Denne metode kvantificerer de samlede cellulære ROS-niveauer med et flowcytometer. Denne protokol er meget nem at bruge, egnet og reproducerbar.
Abstract
Redoxbalancen har en vigtig rolle i opretholdelsen af cellulær homeostase. Den øgede generation af reaktive iltarter (ROS) fremmer modifikationen af proteiner, lipider og DNA, hvilket endelig kan føre til ændring i cellulær funktion og celledød. Derfor er det gavnligt for celler at øge deres antioxidantforsvar som reaktion på skadelige fornærmelser, enten ved at aktivere en antioxidantvej som Keap1 / Nrf2 eller ved at forbedre redox-ådselædere (vitaminerne A, C og E, β-caroten og polyfenoler, blandt andre). Inflammation og oxidativ stress er involveret i patogenesen og progressionen af retinopatier, såsom diabetisk retinopati (DR) og retinopati af præmaturitet (ROP). Da Müller gliaceller (MMC'er) spiller en nøglerolle i homeostase af neuralt retinalvæv, betragtes de som en ideel model til at studere disse cellulære beskyttelsesmekanismer. I denne forstand er kvantificering af ROS-niveauer med en reproducerbar og enkel metode afgørende for at vurdere bidraget fra veje eller molekyler, der deltager i antioxidantcelleforsvarsmekanismen. I denne artikel giver vi en komplet beskrivelse af de procedurer, der kræves til måling af ROS med DCFH-DA-sonde og flowcytometri i MMC'er. Nøgletrin til flowcytometri databehandling med softwaren leveres her, så læserne vil være i stand til at måle ROS-niveauer (geometriske midler til FITC) og analysere fluorescenshistogrammer. Disse værktøjer er yderst nyttige til at evaluere ikke kun stigningen i ROS efter en cellulær fornærmelse, men også til at studere antioxidantvirkningen af visse molekyler, der kan give en beskyttende virkning på cellerne.
Introduction
Den neurale nethinde er et meget organiseret væv, der præsenterer veldefinerede neuronale lag. I disse er neuroner (ganglion, amakrine, bipolære, vandrette og fotoreceptorceller) forbundet med hinanden og også med Müller glialceller (MMC'er) og astrocytter, hvilket fører til tilstrækkelig fototransduktion og behandling af visuel information 1,2. MMC'er er kendt for at have en vigtig rolle i opretholdelsen af retinal homeostase, fordi de krydser hele retinalsektionen, og dermed kan de interagere med alle celletyper, der modulerer flere beskyttelsesprocesser. Det er blevet rapporteret, at MMC'er har flere vigtige funktioner til vedligeholdelse og overlevelse af retinale neuroner, herunder glykolyse for at give energi til neuroner, fjernelse af neuronalt affald, genbrug af neurotransmittere og frigivelse af neurotrofiske faktorer, blandt andre 3,4,5.
På den anden side er inflammation, oxidativ og nitrosativ stress involveret i patogenesen og progressionen af mange menneskelige sygdomme, herunder retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoxbalancen i celler afhænger af tæt regulering af ROS-niveauer. ROS genereres konstant under fysiologiske forhold som følge af aerob respiration hovedsageligt. De vigtigste medlemmer af ROS-familien omfatter reaktive frie radikaler såsom superoxidanionen (O2͘͘͘͘•−), hydroxylradikaler (•OH), forskellige peroxider (ROOR′), hydroperoxider (ROOH) og det ikke-radikale hydrogenperoxid (H202)12,13. I de senere år er det blevet tydeligt, at ROS spiller en vigtig signalrolle i cellerne ved at kontrollere væsentlige processer. MMC'er har et stærkt antioxidantforsvar ved aktivering af den transkriptionelle nukleare faktor erythroid-2-relateret faktor 2 (Nrf2) og den efterfølgende ekspression af antioxidantproteiner for at eliminere overdreven produktion af ROS under patologiske forhold 14,15,16. Når cellerne mister deres redoxbalance på grund af en overdreven produktion af ROS eller en defekt evne til at fjerne ROS, fremmer akkumuleringen af oxidativ stress skadelige modifikationer i proteiner, lipider og DNA, hvilket fører til cellulær stress eller død. Forøgelsen af retinal antioxidantforsvarssystemet forbedrer opløsningen og forebyggelsen af retinopatier, såsom ROP og RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Derfor er måling af ROS-produktion i realtid et kraftfuldt og nyttigt værktøj.
Der er flere metoder til måling af ROS-produktion eller oxidativ stress i celler. Blandt disse er 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetate (DCFH-DA) sonde en af de mest anvendte teknikker til direkte kvantificering af redoxtilstanden for en celle 25,26,27,28. Denne sonde er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusion af denne sonde over cellemembranen tillader dens spaltning ved intracellulære esteraser ved de to esterbindinger, hvilket producerer et relativt polært og cellemembran-uigennemtrængeligt produkt, 2′,7′-dichlorfluorescein (H2DCF). Dette ikke-fluorescerende molekyle akkumuleres intracellulært, og efterfølgende oxidation med ROS giver det stærkt fluorescerende produkt DCF. Oxidationen af sonden er produktet af virkningen af flere typer ROS (peroxynitrit, hydroxylradikaler, nitrogenoxid eller peroxider), som kan detekteres ved flowcytometri eller konfokalmikroskopi (emission ved 530 nm og excitation ved 485 nm). Begrænsningen af denne teknik er, at superoxid og hydrogenperoxid ikke reagerer stærkt medH2DCF 25,29. I denne artikel bruger vi DCFH-DA-sonde til at måle og kvantificere ROS ved flowcytometri. Af den grund inducerer vi ROS-produktion ved at stimulere MMC'er med ROS-induktor, A eller B, inden cellerne fyldes med den fluorescerende sonde. Derudover bruger vi en antioxidantforbindelse. Endelig viser vi repræsentative og pålidelige data opnået ved hjælp af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: For buffersammensætninger se tabel 1.
1. Forberedelse af cellekultur
BEMÆRK: Beskrevet her er kulturpræparatet af MIO-M1-celler, en spontant udødeliggjort human Müller glialcellelinje (Moorfields / Institut for Oftalmologi - Müller 1). Brug altid korrekt aseptisk teknik og arbejd i en laminær flowhætte.
- Forbered Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) komplette medium. Til DMEM indeholdende 4,5 g/l D-glucose og 110 mg/l natriumpyruvat tilsættes 10 % varmeinaktiveret FBS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES), 2 mM L-glutamin og 50 U/ml penicillin/streptomycin. Forbered det friske medium, på dagen vil MIO-M1-cellerne blive optøet.
- Tø de frosne MIO-M1-celler op på dag 1.
- For at gøre dette skal du fjerne kryovialet indeholdende 5 x 105 MIO-M1 celler i FBS med 10% DMSO fra flydende nitrogenlagring og straks placere det i et 37 ° C vandbad.
BEMÆRK: Brug altid mundbind eller sikkerhedsbriller, da kryoiraler opbevaret i flydende nitrogen udgør en eksplosionsrisiko, når de optøes. - Tø MIO-M1-cellerne hurtigt op (på mindre end 1 minut) ved at opvarme hætteglasset i vandbadet på 37 °C, indtil der kun er en lille smule is tilbage i hætteglasset.
- Tør ydersiden af hætteglasset af med 70% ethanol og overfør det til en laminær flowhætte.
- Overfør de optøede celler fra hætteglasset til et sterilt 15 ml rør, og tilsæt derefter 6 ml forvarmet komplet DMEM-medium dråbevis.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved ca. 600 x g i 5 min. Efter centrifugeringen visualiseres en klar supernatant og en komplet pellet. Kassér supernatanten med en pipette uden at forstyrre cellepillen.
- Dissocier forsigtigt pelleten og resuspend cellerne i 10 ml komplet DMEM-medium. Overfør denne cellesuspension til en vævskulturplade med en diameter på 100 mm, og inkuber pladen i ca. 2 dage ved 37 °C, 5 % CO2.
- For at gøre dette skal du fjerne kryovialet indeholdende 5 x 105 MIO-M1 celler i FBS med 10% DMSO fra flydende nitrogenlagring og straks placere det i et 37 ° C vandbad.
- Når MIO-M1-cellerne bliver 80%-90% sammenflydende på dag 4, skal du udføre følgende trin.
- Overfør pladen til en laminær strømningshætte fra inkubatoren. Fjern forsigtigt supernatanten og vask 2x med 5 ml steril og forvarmet PBS. Aspirer PBS.
- Dispenser 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA-opløsning og inkuber ved 37 °C i CO 2-inkubatoren i 3-5 minutter for at løsne cellerne.
- Tilsæt 7 ml af det komplette DMEM-medium for at hæmme trypsinvirkningen. Opdel klyngede trypsiniserede MGA'er ved langsomt at pipettere op og ned (P1000). Saml cellesuspensionen i et 15 ml rør.
- Centrifuge ved 600 x g i 5 min. Kassér supernatanten. Forsigtigt resuspend cellepillen i 2 ml komplet DMEM-medier. Overfør 1 ml af denne cellesuspension til en 100 mm plade indeholdende 9 ml forvarmet komplet DMEM-medium.
- Gentag handlingen med en anden 100 mm plade. Inkuber pladen i ca. 1 dag ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator.
- Når begge plader bliver 80% -90% sammenflydende (på dag 6), skal du overføre pladen til en laminær strømningshætte. Følg trin 1.3. for at opnå en cellepille.
- Dissocier forsigtigt pelleten og resuspend cellerne i 5 ml komplet DMEM-medier. Tæl MIO-M1-cellerne ved hjælp af et hæmocytometer (Neubauer-kammer) og trypanblå opløsning ved at følge nedenstående trin.
- Sæt glasdækslet på Neubauer-kammerets centrale område. Placer kammeret på en plan overflade (f.eks. Et bord eller et arbejdsbord).
- Bland et lige stort volumen trypanblå plet med cellerne. Bland for eksempel 60 μL trypanblå med 60 μL celler til en 1: 2 fortynding.
- Fra denne blanding fyldes 10 μL med en mikropipette i et Neubauer-kammer.
- Placer det belastede Neubauer-kammer på mikroskoptrinnet. Tænd derefter lyset og juster lysstyrken.
- Flyt mikroskoptrinnet til en optimal position, og juster fokus, indtil der opnås et skarpt billede af cellerne.
- Tæl cellerne inde i de fire firkanter (opdelt i 16) placeret i hjørnet af hæmocytometeret (volumen: 0,1 mm3 hver ).
- Beregn cellekoncentrationen ved hjælp af ligningerne nedenfor.
Koncentration = (Antal celler x 10.000)/Antal kvadrater
Koncentration = (Antal celler x 10.000)/4
Koncentration = Antal celler x 2500
BEMÆRK: Hvis der udføres cellefortynding, skal den opnåede koncentration omdannes til den oprindelige koncentration før fortyndingen.
Koncentration = (Antal celler x 2500 x 2) = (Antal celler x 5000 celler/ml) - Juster cellesuspensionen til 1 x 105 celler /ml i komplet DMEM-medium og plade 2 ml af denne cellesuspension i en 6-brønds plade (2 x 105 celler / brønd). Ryst pladen forsigtigt for at fordele cellerne homogent. Inkubere 6-brøndspladen natten over ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator.
2. Analysebetingelser og -kontroller
- Medtag følgende eksperimentelle kontroller for hvert eksperiment:
- Autofluorescenskontrol (celler uden DCFH-DA-sonde, kontrol til indstilling af flowcytometerparametrene).
- Basal kontrol (ustimulerede celler).
- Positiv kontrol (celler behandlet med en ROS-inducer, A eller B).
- Negativ kontrol (celler behandlet med antioxidantforbindelse)
- Prøve (celler behandlet med antioxidantforbindelse og ROS-induktor, A eller B).
3. Udførelse af analysen
BEMÆRK: Analysen udføres på dag 7. Brug altid korrekt aseptisk teknik og arbejd i en laminær flowhætte, medmindre andet er angivet.
- Forbered DMEM med lavt serum. Supplement DMEM indeholdende 4,5 g / L D-glucose og 110 mg / l natriumpyruvat med 0,5% varmeinaktiveret FBS,10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin og 50 U / ml penicillin / streptomycin. Forbered det friske medium på den dag, mio-M1 vil blive behandlet.
- Overfør pladen med 6 brønde (60%-70% sammenløb) til en laminær flowhætte fra inkubatoren. Aspirer supernatanten og vask cellerne 1x med PBS. Tilsæt 2 ml DMEM med lavt serum pr. brønd og inkuber 6-brøndspladen i 2 timer ved 37 °C, 5 % CO2. Dette gøres for at sulte cellerne.
- Efter serum sult, behandle cellerne med antioxidantforbindelsen i 6 timer.
- Aspirer supernatanten og tilsæt 2 ml af den fortyndede bestand til følgende betingelser: negativ kontrol (celler behandlet med antioxidantforbindelse) og prøve (celler behandlet med antioxidantforbindelse og ROS-induktor, A eller B).
- Inkubere 6-brøndspladen i 6 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
BEMÆRK: Hvis du bruger en anden antioxidantforbindelse eller ROS-hæmmer, skal du standardisere den optimale tid og koncentration for stimuli.
- Efter 6 timers inkubation behandles cellerne med ROS-induktor, A eller B, i 30 minutter.
- Tilføj stimuli til følgende betingelser: positiv kontrol (celler behandlet med en ROS-induktor, A eller B) og prøvebrønde (celler behandlet med antioxidantforbindelse og ROS-induktor, A eller B).
BEMÆRK: Opbevar stamopløsningerne på is. - Inkuber 6-brøndspladen i 30 minutter ved 37 °C, 5 % CO2.
BEMÆRK: Hvis du bruger en anden ROS-inducer, skal du standardisere den optimale tid og koncentration for stimuli korrekt.
- Tilføj stimuli til følgende betingelser: positiv kontrol (celler behandlet med en ROS-induktor, A eller B) og prøvebrønde (celler behandlet med antioxidantforbindelse og ROS-induktor, A eller B).
- Ilæg cellerne med DCFH-DA-sonden.
- Aspirer supernatanten og vask cellerne i 6-brøndspladen 3x med PBS for at fjerne alle stimuli.
- Sluk lyset på den laminære flowhætte og arbejd i mørket. Der forberedes en fortynding af 1:1000 af 5 mM DCFH-DA-sondestudsætningen for at opnå en endelig koncentration på 5 μM DCFH-DA i DMEM uden phenolrød i et 15 ml rør.
- Bland forsigtigt ved hjælp af en hvirvel og tilsæt 1 ml af denne opløsning til følgende brønde: basal kontrol (ustimulerede celler), positiv kontrol (celler behandlet med en ROS-induktor), negativ kontrol (celler behandlet med antioxidantforbindelse) og prøvebrønde (celler behandlet med antioxidantforbindelse og ROS-induktor, A eller B).
- Tilsæt 1 ml DMEM uden phenolrød til autofluorescenskontrolcellerne.
- Inkuber 6-brøndspladen i 30 minutter ved 37 °C, 5 % CO2.
BEMÆRK: Sonden er lysfølsom. Kassér al den ubrugte sondeopløsning.
4. Celleforberedelse til flowcytometri
- Efter 6 timer skal du holde pladen på is. Fra dette trin og fremefter er det ikke nødvendigt at anvende korrekt aseptisk teknik og arbejde i en laminær flowhætte.
- Vask cellerne 3x med 2 ml kold PBS pr. Brønd. Tilsæt 0,5 ml kold afskedsbuffer til hver brønd. Høst cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned ved hjælp af en P1000-pipette.
- Saml dem i mærkede 1,5 ml rør og centrifuge ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Når du høster cellerne, skal du undgå bobledannelse ved at indstille P1000-pipetten til 0,4 ml. Fra dette trin og fremefter skal du arbejde hurtigt. - Når centrifugering slutter, sættes mærket 1,5 ml rør med cellerne på is. Kassér supernatanten forsigtigt og dissocier forsigtigt cellepillen med tapping.
- Tilsæt 1 ml FACS-buffer til hvert mærket 1,5 ml rør for at vaske cellerne. Brug om nødvendigt en hvirvel ved sin laveste intensitet til fuldstændig dissociation af cellepillen. Centrifuger dem ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Gentag disse trin 2x mere. (Udfør tre vaske i alt).
- Når den sidste vask slutter, skal du mærke 5 ml polystyrenrør med rund bund (flowcytometrirør) til alle eksperimentelle forhold (se trin 2.).
- Når centrifugering slutter, skal cellepillerne suspenderes igen i 200 μL FACS-buffer. Dissocier forsigtigt pelleten i hvert 1,5 ml rør ved hjælp af en hvirvel. Overfør til mærkede 5 ml rundbundede rør. Hold rørene på is, indtil de analyseres på flowcytometeret.
5. Dataindsamling i et flowcytometer
- Brug flowcytometrisoftwaren til at oprette et nyt eksperiment. For at gøre dette skal du gå til Eksperiment i menulinjen og klikke på Nyt eksperiment (Ctrl + E).
- Gå også til Vis på menulinjen, og klik på følgende indstillinger: Værktøjslinje, Statuslinje, Browser, Cytometer, Info, Regneark, Anskaffelsesdashboard og Bieksponentiel editor for at se disse vinduer i arbejdsområdet.
- Klik på Specimen_001 til venstre for softwaren . Dette åbner en liste over rør (Tube_001, Tube_002 osv.). For at mærke rørene til kontrollerne og forskellige eksperimentelle forhold skal du dobbeltklikke på Tube_001, Tube_002 osv. Og omdøbe dem (se trin 2.).
- Vælg de kanaler / parametre, der skal analyseres (FSC, SSC, FITC og APC eller enhver anden fluorokrom for at se kvadranten) i det første rør fra Cytometer-indstillinger i eksperimentet.
- Klik på ikonet Aktuel rørmarkør for at vælge røret, og ikonet skifter til grønt. Placer røret "autofluorescenskontrol" på aspiratorarmen, og flyt basen forsigtigt kun til venstre.
- Hvis du vil køre eksemplet "autofluorescenskontrol", skal du gå til vinduet Dashboard for anskaffelse og klikke på Hent data. Åbn et dot plot for FSC (på x-aksen) versus SSC (på y-aksen).
- Juster spredningsspændingen fremad og på siden hurtigt for at sikre, at hændelserne vises på grafen. Klik på Stop anskaffelse i vinduet Dashboard for anskaffelse. I dette eksperiment blev følgende spændingsindstillinger anvendt: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
- For at indstille FITC-spændingen skal du køre den "positive kontrol (celler behandlet med en ROS-inducer, A eller B)". Juster spændingen, så alle begivenhederne vises på et histogram af FITC. I dette tilfælde skal du bruge en spænding på 280 V. Klik på Stop anskaffelse i vinduet Dashboard for anskaffelse.
- Placer igen "autofluorescenskontrol" -røret på aspiratorarmen. I vinduet Dashboard til anskaffelse skal du klikke på Hent data, derefter på Optag data og vælge de ønskede stopbetingelser (f.eks. 50.000 hændelser). Tegn en port omkring cellerne af interesse, undtagen døde celler og snavs.
BEMÆRK: Disse observeres som meget mindre begivenheder end hovedcellepopulationen og vises nederst til venstre i plottet. - Når erhvervelsen slutter, skal du fjerne røret fra aspiratorarmen. Udstyret vasker sig selv. I vinduet Dashboard til anskaffelse skal du klikke på Næste rør og køre basalkontrolelementet (ustimulerede celler). Klik på Hent data , og klik derefter på Optag data.
- Fra den oprindelige port (port, der udelukker de døde celler og snavs), skal du oprette et andet dot plot af FITC (på x-aksen) versus APC (på y-aksen). Tegn en kvadrantport, og juster koordinaterne for at visualisere begivenhederne nederst til venstre i FITC versus APC-plottet.
- For at optage de næste prøver skal du fjerne røret og klikke på Næste rør > Hent data > Optage data.
BEMÆRK: Flowcytometeret, der anvendes her (se materialetabellen), registrerer maksimalt 1 x 106 hændelser pr. Rør. - Når optagelsen af alle rør slutter, skal du eksportere dataene til disk D. For at gøre dette skal du klikke på > Eksporter > FCS-filer > Vælg 3.0 eller 3.1 version.
BEMÆRK: Selvom dataindsamling ved hjælp af en software (se Tabel over materialer) er beskrevet detaljeret i denne protokol, kan enhver anden flowcytometrisoftware bruges. Anskaffelsesparametrene (FSC, SSC og FITC) kan indstilles på samme måde for at opnå resultaterne.
6. Analyse af de erhvervede data
- Åbn softwaren, og tilføj prøverne ved hjælp af handlingsknappen Tilføj prøver ; den er placeret på proceslinjen eller i Naviger-båndet.
- Klik på Tilføj eksempler.
- Brug filbrowseren til at navigere til mappen Eksperimentel.
- Vælg mappen Eksperimentel, og klik på Vælg.
BEMÆRK: Eksempelfilerne indlæses som en del af gruppen "Alle eksempler" i arbejdsområdet.
- Dobbeltklik på det første eksempel i arbejdsområdet: Autofluorescenskontrol.
BEMÆRK: Denne handling åbner et grafvindue, der afbilder hændelser langs fremadgående scatter (FSC-A på x-aksen) versus side scatter (SSC-A på y-aksen) parametre. - Tegn en polygonport for at isolere cellerne af interesse, undtagen døde celler og snavs.
- Klik på værktøjet Polygon Gate .
- Klik inden for plottet for at udgøre polygonporten. Lav så mange sider som nødvendigt.
- Dobbeltklik på det sidste punkt for at lukke polygonen og oprette den ønskede port.
- Angiv et navn til porten, f.eks. "MIO-M1-celler", og tryk på OK.
BEMÆRK: Der vises et nyt grafdiagramvindue, der kun viser MIO-M1-hændelserne uden døde celler og snavs. - Gentag med alle de prøver, der skal analyseres.
- Skift plottet til et histogram. Det gør du ved at klikke på parameteretiketten X-akse og vælge FITC-A. Klik på parameteretiketten Y-akse, og vælg Histogram. Dette ændrer plottet til et endimensionelt histogram.
- Tilføj statistik ved hjælp af vinduet Tilføj statistik.
- Klik på Tilføj statistik under histogramgrafen. Programmet åbner et nyt statistikvindue.
- Til venstre for det nye vindue skal du vælge statistikken Geometrisk middelværdi.
- Vælg populationen mio-M 1-celler.
- Vælg FIT-C på listen over tilgængelige parametre.
- Klik på knappen Tilføj for at anvende dem på analysen.
BEMÆRK: Dette opretter den nye statistik "geometrisk middelværdi: FITC" i prøvegatingtræet, og deres værdier vises i dit arbejdsområde.
- Sæt disse geometriske middelværdier i et statistikprogram og analyser.
- Klik på ikonet L for at åbne Layout Editor; dette ikon findes under fanen Menu i arbejdsområdet. Placer vinduet Arbejdsområde og Layouteditor side om side.
BEMÆRK: Layouteditoren er et separat arbejdsområdevindue med værktøjer til visning af flere grafdiagrammer og statistikker i en simpel grafisk rapport. Dette kan eksporteres med den udvidelsesfil, du foretrækker, som PDF eller JPG, blandt andre.- Fra gatingtræet i et eksempel i vinduet Arbejdsområde skal du trække MIO-M 1-cellepopulationen til layouteditoren.
- Sørg for, at der vises et histogramdiagram, der indeholder hændelserne i porten, i layouteditoren. Yderligere grundlæggende oplysninger vil blive beskrevet i et tekstfelt nedenfor.
- Træk alle eksemplerne for at sammenligne dem i den samme graf. Programmet overlapper dem.
- Højreklik på histogrammediagrammet, og vælg Egenskaber. Programmet åbner et nyt Graph Definition-vindue. Dette vindue har fire faner (Kommenter, Skrifttyper, Forklaring og Angiv). Klik på fanen Angiv , og skift y-aksen fra Auto til Modal. Klik på Anvend.
- Højreklik på eksemplet, og skift farve, linjestil, linjevægt osv. for at tilpasse grafen.
- Hvis du vil eksportere billedet, skal du klikke på fanen Filer og straks efter vælge Gem billede i dokumentbåndet. Vælg den foretrukne type billedfil (f.eks. PDF).
BEMÆRK: Der åbnes en dialogboks Gem, hvor du bliver bedt om at vælge en gemt placering. Klik på Gem.
- Gem analysen som en arbejdsområdefil (.wsp).
- Klik på ikonet Cytometrianalyse i øverste venstre hjørne, og vælg Gem som.
- Vælg Gem som arbejdsområde (WSP) for at gemme dokumentet med data og analyser.
- Angiv et navn til arbejdsområdefilen.
- Klik på Gem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i protokolafsnittet har vi vist repræsentative og kvantitative data, der demonstrerer flowcytometridetektion af ROS-produktion med fluorescenssonden DCFH-DA fra MIO-M1-celler stimuleret med ROS-induktor, A eller B. Som forventet observerede vi ændringer i FITC-fluorescens i ustimulerede celler over autofluorescensniveauer (figur 1A, sammenlign "basal kontrol" vs. "autofluorescenskontrol", prakplotgraf). Dette skete på grund af en basal produktion af ROS i MIO-M1-cellerne. (Figur 1B, sammenlign "basal kontrol" vs. "autofluorescenskontrol", histogramgraf).
Interessant nok blev der observeret en signifikant stigning i FITC-fluorescens, når cellerne blev stimuleret med ROS-inducer, A eller B (figur 1B, sammenlign "ROS-inducer A" -prøver vs. "basal kontrol" og "ROS-inducer B" -prøver vs. "basal kontrol", histogramgraf). Desuden, når celler blev behandlet med antioxidantforbindelsen før ROS-induktor, A eller B, blev fluorescensniveauet formindsket tæt på basale niveauer (figur 1B, sammenlign "ROS-inducer A" vs. "forbehandling med antioxidantforbindelse 6 timer + ROS-induktor A 30 min" og "ROS-inducerer B" vs. "forbehandling med antioxidantforbindelse 6 timer + ROS-induktor B 30 min", henholdsvis histogramgraf). Bemærk, at der ikke blev observeret forskelle i fluorescenssignal i celler behandlet med antioxidantforbindelse (6 timer) med hensyn til basal kontrol. (Figur 1B, sammenlign "6h antioxidantforbindelse" vs. "basal kontrol").
Disse resultater var også tydelige, da data blev præsenteret som det geometriske gennemsnit af FITC (figur 1C). Som det fremgår af grafen, er gennemsnitsværdierne og den tilsvarende standardfejl i gennemsnittet (SEM) angivet.
En vigtig fordel ved denne protokol er dens anvendelse til at følge ændringer i ROS over tid. I den forbindelse har vi været i stand til at observere en signifikant og tidsafhængig stigning i ROS, når vi behandlede MIO-M1-celler med ROS-induktor C i 2 timer, 4 timer og 6 timer (figur 2).
Til optimering af denne protokol har vi forsøgt tre forskellige strategier til at høste cellerne (0,5% trypsin-EDTA, Accutase celleløsningsopløsning og løsrivelsesbuffer) med sammenlignelige resultater (data ikke vist).
Figur 1: Måling af ROS som reaktion på ROS-inducer, A eller B, ved hjælp af DCFH-DA-sonde i MIO-M1-celler: (A) Sammenligning af "basal kontrol" vs. "autofluorescenskontrol" -betingelser, repræsentativt pralplot FL1 (519 nm) vs. FL2 (660 nm). (B) Repræsentative histogrammer for fluorescens induceret af DCFH-DA-sonde ved stimulering af MIO-M1-celler med ROS-induktor, A eller B, i 30 minutter eller forbehandlet med antioxidantforbindelse i 6 timer og 30 minutter ROS-induktor A, B eller køretøj. C) Geometrisk middelværdi af FITC-fluorescensen for alle stimuli i MIO-M1-celler. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SEM og analyseres af envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts post-test; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Måling af ROS-overarbejde som reaktion på ROS-inducer C-behandling ved hjælp af DCFH-DA-sonde i MIO-M1-celler: MIO-M1-celler behandlet med ROS-induktor C i 2 timer, 4 timer og 6 timer og fyldt med DCFH-DA-sonde for at bestemme ROS-niveauer. Repræsentativt histogram for fluorescensintensitet induceret af DCFH-DA-sonde ved stimulering af MIO-M1-celler med ROS-inducer C i 2 timer, 4 timer og 6 timer. Geometrisk middelværdi af FITC-fluorescens for de stimuli, der er beskrevet ovenfor. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SEM og analyseres af envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts post-test; ns, ikke signifikant, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning | Opbevaringsforhold | Seddel | |||||
| Natriumhydroxid (NaOH) 10 M, 1 L | 400 g NaOH pellets | destilleret vand til 1 l | RT | "FORSIGTIG": Fremstillingen af en koncentreret NaOH-opløsning forårsager en eksoterm reaktion. Der skal udvises stor forsigtighed for at undgå kemiske forbrændinger og brud på glasbægerglas. Hvis det er muligt, skal du bruge tunge plastbægre. | |||
| Fosfatbufret saltvand (PBS) 10 x, 1 l | 80 g NaCl | destilleret vand til 1 l | RT | Juster pH til 7,4 og filtrer opløsningen. | |||
| 2 g KCl | |||||||
| 11,5 g Na2HPO4· 7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,5 M pH 8,0, 1 L | 186,1 g Na2EDTA· 2H2O | destilleret vand til 1 l | RT | Dinatriumsaltet i EDTA er ikke opløseligt i neutralt vand eller opløsning, før opløsningens pH er justeret til ca. 8,0 ved tilsætning af NaOH. Juster pH til 8,0 og steriliser opløsningen. | |||
| 10% m/v natriumazid (NaN3), 100 ml | 10 g NaN3 | destilleret vand til 100 ml | RT | ||||
| Afskærmning af buffer, 100 ml | 180 mg glukose | PBS 1X til 100 ml | 4 °C | ||||
| 0,6 ml 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| Flowcytometrifarvningsbuffer (FACS-buffer), 100 ml | 2 ml føtalt kvægserum (FBS) | PBS 1X til 100 ml | 4 °C | NaN3 tilsættes som konserveringsmiddel. | |||
| 1 ml 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| 1 ml 10% m/v natriumazid | |||||||
| 5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 ml | 2,4 mg DCFH-DA | dimethylsulfoxid til 1 ml | -20 °C beskyttet mod lys | Bland forsigtigt og aliquot 20 μL i 1,5 ml rør. Undgå flere optønings-/frysecyklusser. Vores anbefaling er at kassere al ubrugt sondeopløsning fra forsøgsdagen. | |||
| 0,4% m/v trypan blå 10 X, 50 ml | 0,2 g trypan blå | PBS 1X til 50 ml | 4 °C | ||||
Tabel 1: Bufferopskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere patologiske tilstande, såsom kræft, inflammatoriske sygdomme, iskæmi / reperfusion, iskæmisk hjertesygdom, diabetes og retinopatier og også fysiologiske situationer som aldring, fører til ROS-overproduktion 6,7,8,9,10,11. Derfor er detektion, måling og forståelse af den vej, der er involveret i moduleringen af ROS, vigtige mål for mange sygdomme. Brugen af sonder til at måle ROS-niveauer, som DCFH-DA, er tilgængelig, bredt beskrevet og accepteret i den videnskabelige litteratur 26,27,28. I denne artikel beskriver vi en detaljeret og reproducerbar protokol til måling og kvantificering af ROS-niveauer ved flowcytometri i MMC'er.
En fordel ved brugen af denne metode er, at når DCFH-DA-sonden oxideres af ROS og genererer et fluorescerende DCF-produkt; dette kan måles i en pladelæser, konfokalmikroskop eller flowcytometer. Ulempen ved pladelæseren er, at den måler total fluorescens. Følgelig skelner pladelæseren ikke den intracellulære fluorescens fra den ekstracellulære, der genereres af kemiske reaktioner i kulturmediet. Konfokal mikroskopi er et nyttigt værktøj, fordi celler kan indlæses med DCFH-DA-sonde og ses i realtid i kulturkamre ved 37 ° C. Morfologien og placeringen af ROS i cellen kan detekteres med denne metode, men ROS-niveauer mangler en kvantitativ måling. Styrken af flowcytometri ligger i dets evne til at måle den intracellulære fluorescens i levende celler. Kvantitative data om antallet af celler, der udsender fluorescens, såvel som de geometriske midler til fluorescens, kan opnås25.
Det er vigtigt at tage højde for, hvad der faktisk måles, når du bruger DCFH-DA-sonde. Som vi tidligere har nævnt, måler DCFH-DA flere ROS-arter, og derfor kan fluorescens som følge af den grønne sonde ikke bruges til at skelne mellem typer af ROS-art29. I den henseende er det kendt, at forskellige sonder kan skelne typen af ROS. For eksempel oxideres dihydroethidium (DHE) sonde med superoxid for at give det fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (excitation ved 518 nm og emission ved 605 nm), men dette produkt kan ikke skelnes uden brug af mere tidskrævende teknikker, såsom HPLC30,31. En anden sonde er en mitokondriel superoxidindikator (se Table of Materials), som er en ny fluorogen sonde til meget selektiv påvisning af superoxid i mitokondrierne i levende celler31,32. Med henblik på måling af de samlede ROS-niveauer og stigninger i ROS efter en fornærmelse eller evaluering af forskellige produkters antioxidantevne er brugen af DCFH-DA-sonde sammen med de relevante kontroller imidlertid praktisk og acceptabel 25,28,29.
Et meget vigtigt spørgsmål er udvælgelsen og brugen af korrekt eksperimentel kontrol: autofluorescenskontrol (celler uden DCFH-DA-sonde), basal kontrol (ustimulerede celler), positiv kontrol (celler behandlet med en ROS-induktor), negativ kontrol (celler behandlet med antioxidantforbindelse) og prøveproblem (celler behandlet med antioxidantforbindelse og ROS-inducer). Et nyttigt tip er at bruge medium uden phenolrød for at reducere interferens med fluorescerende sonder.
Vi anbefaler også, at du indlæser celler med DCFH-DA-sonden 30 minutter, før den eksperimentelle behandling afsluttes. Standardisering af koncentrationen af DCFH-DA, i vores tilfælde 5 μM, er praktisk og kan variere afhængigt af celletypen og celleaktiveringsstatus. Vores råd er at opsætte sondekoncentrationerne, startende fra 5μM og 10 μM, og kontrollere effektiviteten af farvningen i forsøgene.
Sammenfattende er analyse af redoxbalance i sundhed eller sygdom afgørende for at etablere pålidelige metoder til måling af det oxidative stressrespons. Derfor er denne protokol et simpelt, hurtigt og kraftfuldt værktøj til at kvantificere ROS-niveauer i levende MGLC'er ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke María Pilar Crespo og Paula Alejandra Abadie fra CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjælp til flowcytometri og Gabriela Furlan og Noelia Maldonado for hjælp til cellekultur. Vi takker også Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) for videoproduktion og redigering.
Denne artikel blev finansieret af tilskud fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) og Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle til M.C S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
