Summary
Здесь мы предлагаем систематизированный, доступный и воспроизводимый протокол для обнаружения клеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда (DCFH-DA) в глиальных клетках Мюллера (MMC). Этот метод количественно оценивает общие клеточные уровни АФК с помощью проточного цитометра. Этот протокол очень прост в использовании, подходит и воспроизводим.
Abstract
Окислительно-восстановительный баланс играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза. Увеличение генерации активных форм кислорода (АФК) способствует модификации белков, липидов и ДНК, что, в конечном итоге, может привести к изменению клеточной функции и гибели клеток. Поэтому клеткам полезно повышать свою антиоксидантную защиту в ответ на вредные оскорбления, либо активируя антиоксидантный путь, такой как Keap1 / Nrf2, либо улучшая окислительно-восстановительные поглотители (витамины A, C и E, β-каротин и полифенолы, среди прочих). Воспаление и окислительный стресс участвуют в патогенезе и прогрессировании ретинопатий, таких как диабетическая ретинопатия (ДР) и ретинопатия недоношенных (РН). Поскольку глиальные клетки Мюллера (MMC) играют ключевую роль в гомеостазе нервной ткани сетчатки, они считаются идеальной моделью для изучения этих клеточных защитных механизмов. В этом смысле количественная оценка уровней АФК с помощью воспроизводимого и простого метода имеет важное значение для оценки вклада путей или молекул, которые участвуют в механизме защиты антиоксидантных клеток. В этой статье мы приводим полное описание процедур, необходимых для измерения АФК с помощью зонда DCFH-DA и проточной цитометрии в МГК. Ключевые этапы обработки данных проточной цитометрии с помощью программного обеспечения приведены здесь, поэтому читатели смогут измерять уровни АФК (геометрические средства FITC) и анализировать флуоресцентные гистограммы. Эти инструменты очень полезны для оценки не только увеличения АФК после клеточного инсульта, но и для изучения антиоксидантного эффекта определенных молекул, которые могут обеспечить защитный эффект на клетки.
Introduction
Нервная сетчатка представляет собой очень организованную ткань, которая представляет собой четко определенные нейронные слои. В них нейроны (ганглиозные, амакриновые, биполярные, горизонтальные и фоторецепторные клетки) взаимосвязаны друг с другом, а также с глиальными клетками Мюллера (MGC) и астроцитами, что приводит к адекватной фототрансдукции и обработке визуальной информации 1,2. Известно, что MMC играют важную роль в поддержании гомеостаза сетчатки, потому что они пересекают весь отдел сетчатки и, таким образом, могут взаимодействовать со всеми типами клеток, которые модулируют несколько защитных процессов. Сообщалось, что MMC имеют несколько важных функций для поддержания и выживания нейронов сетчатки, включая гликолиз для обеспечения энергией нейронов, удаление нейронных отходов, рециркуляцию нейротрансмиттеров и высвобождение нейротрофических факторов, среди прочих 3,4,5.
С другой стороны, воспаление, окислительный и нитрозативный стресс участвуют в патогенезе и прогрессировании многих заболеваний человека, включая ретинопатии 6,7,8,9,10,11. Окислительно-восстановительный баланс в клетках зависит от жесткой регуляции уровней АФК. АФК постоянно вырабатываются в физиологических условиях в результате в основном аэробного дыхания. Основные члены семейства АФК включают реакционноспособные свободные радикалы, такие как супероксидный анион (O2͘͘͘͘•-), гидроксильные радикалы (•OH), различные пероксиды (ROOR'), гидропероксиды (ROOH) и безрадикальный перекись водорода (H2O2)12,13. В последние годы стало очевидно, что АФК играет важную сигнальную роль в клетках, контролируя основные процессы. МГК обладают сильной антиоксидантной защитой за счет активации транскрипционного ядерного фактора эритроид-2, связанного с фактором 2 (Nrf2) и последующей экспрессии антиоксидантных белков для устранения избыточной продукции АФК при патологических состояниях 14,15,16. Когда клетки теряют свой окислительно-восстановительный баланс из-за преувеличенной выработки АФК или дефектной способности удалять АФК, накопление окислительного стресса способствует вредным модификациям в белках, липидах и ДНК, что приводит к клеточному стрессу или смерти. Увеличение системы антиоксидантной защиты сетчатки улучшает разрешение и профилактику ретинопатий, таких как РН и РД 17,18,19,20,21,22,23,24. Поэтому измерение производства АФК в режиме реального времени является мощным и полезным инструментом.
Существует несколько методов измерения продукции АФК или окислительного стресса в клетках. Среди них зонд 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетата (DCFH-DA) является одним из наиболее широко используемых методов прямой количественной оценки окислительно-восстановительного состояния клетки 25,26,27,28. Этот зонд является липофильным и нефлуоресцентным. Диффузия этого зонда через клеточную мембрану позволяет его расщепляться внутриклеточными эстеразами на двух эфирных связях, производя относительно полярный и непроницаемый клеточной мембраной продукт, 2',7'-дихлорфлуоресцеин (H2DCF). Эта нефлуоресцентная молекула накапливается внутриклеточным путем, и последующее окисление АФК дает высокофлуоресцентный продукт DCF. Окисление зонда является продуктом действия нескольких типов АФК (пероксинитрит, гидроксильные радикалы, оксид азота или пероксиды), которые могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии (эмиссия при 530 нм и возбуждение при 485 нм). Ограничение этого метода заключается в том, что супероксид и перекись водорода не сильно реагируют с H2DCF25,29. В этой статье мы используем зонд DCFH-DA для измерения и количественной оценки АФК с помощью проточной цитометрии. По этой причине мы индуцируем производство АФК, стимулируя MMC индуктором АФК, А или В, перед загрузкой ячеек флуоресцентным зондом. Кроме того, мы используем антиоксидантное соединение. Наконец, мы показываем репрезентативные и достоверные данные, полученные с помощью этого протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Буферные композиции см. в таблице 1.
1. Подготовка клеточной культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описана культуральная подготовка клеток MIO-M1, спонтанно увековеченной глиальной клеточной линии Мюллера человека (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Всегда используйте правильную асептическую технику и работайте в ламинарной вытяжке.
- Подготовьте модифицированную среду Dulbecco Eagle's medium (DMEM) в комплекте. К ДМЭМ, содержащим 4,5 г/л D-глюкозы и 110 мг/л пирувата натрия, добавляют 10% термоинактивированного ФБС, 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), 2 мМ L-глутамина и 50 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина. Подготовьте свежую среду, в день клетки MIO-M1 будут разморожены.
- Разморозьте замороженные клетки MIO-M1 на 1-й день.
- Для этого удалите криовиал, содержащий 5 х 105 клеток MIO-M1 в FBS с 10% DMSO из хранилища жидкого азота и немедленно поместите его в водяную баню с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда носите маску для лица или защитные очки, так как криовиалы, хранящиеся в жидком азоте, представляют риск взрыва при размораживании. - Быстро разморозьте клетки MIO-M1 (менее чем за 1 мин), нагревая флакон на водяной бане 37 °C, пока во флаконе не останется только небольшой кусочек льда.
- Протрите внешнюю сторону флакона 70% этанолом и переложите его в ламинарный вытяжку.
- Перенесите размороженные клетки из флакона во стерильную трубку объемом 15 мл, а затем добавьте 6 мл предварительно нагретой полной среды DMEM по каплям.
- Центрифугируйте клеточную суспензию приблизительно 600 х г в течение 5 мин. После центрифугирования будет визуализирован прозрачный супернатант и полная гранула. Выбросьте супернатант пипеткой, не нарушая гранулу клетки.
- Осторожно диссоциируют гранулу и повторно суспендируют клетки в 10 мл полной среды DMEM. Переложите эту клеточную суспензию в тканевую культуральную пластину диаметром 100 мм и инкубируйте пластину в течение приблизительно 2 дней при 37 °C, 5% CO2.
- Для этого удалите криовиал, содержащий 5 х 105 клеток MIO-M1 в FBS с 10% DMSO из хранилища жидкого азота и немедленно поместите его в водяную баню с температурой 37 °C.
- Когда клетки MIO-M1 станут 80%-90% сливающимися на 4-й день, выполните следующие действия.
- Переложите пластину в ламинарный вытяжку из инкубатора. Осторожно удалите супернатант и промыть 2 раза 5 мл стерильного и предварительно подогретого ПБС. Аспирировать PBS.
- Дозируют 1 мл 0,5% раствора трипсина-ЭДТА и инкубируют при 37 °C в инкубатореCO2 в течение 3-5 мин для отделения клеток.
- Добавьте 7 мл полной среды DMEM, чтобы ингибировать действие трипсина. Дезагрегирование кластеризованных трипсинизированных MMC путем медленного пипетирования вверх и вниз (P1000). Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин. Выбросьте супернатант. Осторожно повторно суспендируйте гранулу ячейки в 2 мл полной среды DMEM. Переложите 1 мл этой клеточной суспензии в пластину толщиной 100 мм, содержащую 9 мл предварительно нагретой полной DMEM-среды.
- Повторите действие с другой пластиной толщиной 100 мм. Инкубируйте пластину в течение примерно 1 дня при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе.
- Когда обе пластины станут сливающимися на 80%-90% (на 6-й день), переложите пластину в ламинарный вытяжку. Выполните шаг 1.3. для получения ячейки гранулы.
- Осторожно диссоциируют гранулу и повторно суспендируют клетки в 5 мл полной среды DMEM. Подсчитайте клетки MIO-M1 с помощью гемоцитометра (камера Нойбауэра) и раствора трипан синего цвета, выполнив следующие действия.
- Поместите стеклянную крышку на центральную зону камеры Нойбауэра. Поместите камеру на ровную поверхность (например, стол или верстак).
- Смешайте с клетками равный объем синего пятна трипана. Например, смешайте 60 мкл трипан-синего с 60 мкл клеток для разведения 1:2.
- Из этой смеси загрузите 10 мкл с микропипеткой в камеру Нойбауэра.
- Поместите загруженную камеру Нойбауэра на ступень микроскопа. Затем включите свет и отрегулируйте яркость.
- Переместите ступень микроскопа в оптимальное положение и отрегулируйте фокус до получения четкого изображения клеток.
- Подсчитайте ячейки внутри четырех квадратов (разделенных на 16), расположенных в углу гемоцитометра (объем: 0,1 мм3 в каждом).
- Рассчитайте концентрацию ячеек, используя приведенные ниже уравнения.
Концентрация = (Количество ячеек x 10.000)/Количество квадратов
Концентрация = (Количество ячеек x 10.000)/4
Концентрация = Количество ячеек x 2500
ПРИМЕЧАНИЕ: Если проводится разбавление клеток, полученная концентрация должна быть преобразована в первоначальную концентрацию до разбавления.
Концентрация = (Количество ячеек x 2500 x 2) = (Количество ячеек x 5000 клеток/мл) - Отрегулируйте клеточную суспензию до 1 x 105 ячеек/мл в полной среде DMEM и пластину 2 мл этой клеточной суспензии в 6-луночную пластину (2 x 105 ячеек/лунку). Аккуратно встряхните тарелку, чтобы равномерно распределить клетки. Инкубируйте 6-луночную плиту в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2.
2. Условия анализа и контроль
- Включите следующие экспериментальные элементы управления для каждого эксперимента:
- Управление автофлуоресценцией (ячейки без зонда DCFH-DA, управление настройкой параметров проточного цитометра).
- Базальный контроль (нестимулированные клетки).
- Положительный контроль (клетки, обработанные индуктором АФК, А или В).
- Отрицательный контроль (клетки, обработанные антиоксидантным соединением)
- Образец (клетки, обработанные антиоксидантным соединением и индуктором АФК, А или В).
3. Выполнение анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проводится на 7 день. Всегда используйте правильную асептическую технику и работайте в ламинарной вытяжке, если не указано иное.
- Готовят с низким содержанием сывороточного DMEM. Добавка DMEM, содержащая 4,5 г/л D-глюкозы и 110 мг/л пирувата натрия с 0,5% термоинактивированным FBS,10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина и 50 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина. Приготовьте свежую среду в день, когда MIO-M1 будет обработан.
- Перенесите 6-луночную плиту (слияние 60%-70%) на ламинарный проточной вытяжке из инкубатора. Аспирируйте супернатант и промывайте клетки в 1 раз PBS. Добавьте 2 мл низкого сывороточного DMEM на лунку и инкубируйте 6-луночную пластину в течение 2 ч при 37 °C, 5% CO2. Это делается для того, чтобы уморить клетки голодом.
- После голодания сыворотки обрабатывают клетки антиоксидантным соединением в течение 6 ч.
- Аспирировать супернатант и добавить 2 мл разбавленного вещества к следующим состояниям: отрицательный контроль (клетки, обработанные антиоксидантным соединением) и образец (клетки, обработанные антиоксидантным соединением и индуктором АФК, А или В).
- Инкубировать плиту из 6 скважин в течение 6 ч при 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другого антиоксидантного соединения или ингибитора АФК стандартизируйте оптимальное время и концентрацию для стимулов.
- После 6 ч инкубации обрабатывают клетки индуктором АФК, А или В, в течение 30 мин.
- Добавьте стимулы к следующим состояниям: положительный контроль (клетки, обработанные индуктором АФК, А или В) и пробные колодцы (клетки, обработанные антиоксидантным соединением и индуктором АФК, А или В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите запасы растворов на льду. - Инкубировать 6-луночную плиту в течение 30 мин при 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другого индуктора АФК правильно стандартизируйте оптимальное время и концентрацию для стимулов.
- Добавьте стимулы к следующим состояниям: положительный контроль (клетки, обработанные индуктором АФК, А или В) и пробные колодцы (клетки, обработанные антиоксидантным соединением и индуктором АФК, А или В).
- Загрузите ячейки с помощью зонда DCFH-DA.
- Аспирируйте супернатант и промывайте клетки в 6-луночной пластине 3x с PBS, чтобы удалить все раздражители.
- Выключите свет ламинарного проточного капюшона и работайте в темноте. Приготовьте разбавление 1:1000 5 мМ раствора зонда DCFH-DA для получения конечной концентрации 5 мкМ DCFH-DA в DMEM без фенол-красного цвета в пробирке 15 мл.
- Осторожно перемешайте с помощью вихря и добавьте 1 мл этого раствора в следующие скважины: базальный контроль (нестимулированные клетки), положительный контроль (клетки, обработанные индуктором АФК), отрицательный контроль (клетки, обработанные антиоксидантным соединением) и пробные колодцы (клетки, обработанные антиоксидантным соединением и индуктором АФК, А или В).
- Добавьте 1 мл DMEM без фенольного красного цвета в контрольные ячейки автофлуоресценции.
- Инкубировать 6-луночную плиту в течение 30 мин при 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд светочувствительный. Выбросьте весь неиспользованный раствор зонда.
4. Подготовка клеток к проточной цитометрии
- Через 6 ч держите тарелку на льду. Начиная с этого шага, нет необходимости использовать правильную асептическую технику и работать в ламинарной вытяжке.
- Промыть ячейки 3 раза 2 мл холодного ПБС на лунку. Добавьте 0,5 мл буфера холодного отсоединения в каждую скважину. Соберите клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки P1000.
- Собирают их в меченые пробирки по 1,5 мл и центрифугу при 600 х г в течение 5 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе клеток избегайте образования пузырьков, установив пипетку P1000 на 0,4 мл. Начиная с этого шага, работайте быстро. - Когда центрифугирование закончится, положите на лед меченые трубки объемом 1,5 мл с ячейками. Осторожно отбросьте надосадочный материал и осторожно диссоциируйте гранулу клетки постукиванием.
- Добавьте 1 мл буфера FACS в каждую маркированную трубку объемом 1,5 мл для промывки клеток. При необходимости используют вихрь при его наименьшей интенсивности для полной диссоциации клеточной гранулы. Центрифугируйте их при 600 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторите эти шаги еще в 2 раза. (Всего три стирки).
- Когда последняя промывка заканчивается, маркируют 5 мл полистирольных трубок круглого дна (проточные цитометрические трубки) для всех экспериментальных условий (см. этап 2.).
- Когда центрифугирование закончится, повторно суспендируйте гранулы ячейки в 200 мкл буфера FACS. Осторожно диссоциируют гранулу в каждой трубке объемом 1,5 мл с помощью вихря. Переложить на маркированные трубки круглого дна объемом 5 мл. Держите трубки на льду до тех пор, пока они не будут проанализированы на проточном цитометре.
5. Сбор данных в проточном цитометре
- Используя программное обеспечение для проточной цитометрии, создайте новый эксперимент. Для этого в строке меню перейдите в раздел Эксперимент и нажмите Новый эксперимент (Ctrl+E).
- Кроме того, в строке меню перейдите в раздел Вид и щелкните следующие параметры: Панель инструментов, Строка состояния, Браузер, Цитометр, Инспектор, Лист, Панель мониторинга получения и Двухконферентный редактор , чтобы увидеть эти окна в рабочей области.
- Слева от программного обеспечения щелкните Specimen_001 . Откроется список трубок (Tube_001, Tube_002 и т.д.). Чтобы пометить трубки для элементов управления и различных экспериментальных условий, дважды щелкните Tube_001, Tube_002 и т. д. и переименуйте их (см. шаг 2.).
- Выберите каналы/параметры для анализа (FSC, SSC, FITC и APC или любой другой фторхром, чтобы увидеть квадрант) в первой трубке из настроек цитометра эксперимента.
- Щелкните значок Текущий указатель трубки , чтобы выбрать трубку, и значок изменится на зеленый. Поместите трубку «управления автофлуоресценцией» на рычаг аспиратора, осторожно перемещая основание только влево.
- Чтобы запустить образец "Элемент управления автофлуоресценцией", перейдите в окно Панель мониторинга сбора и щелкните Получить данные. Откройте точечный график для FSC (по оси X) и SSC (по оси Y).
- Быстро отрегулируйте прямое и боковое напряжение рассеяния, чтобы события отображались на графике. В окне Панель мониторинга приобретения нажмите кнопку Остановить получение. В данном эксперименте использовались следующие настройки напряжения: FSC – 200 В, SSC – 423 В.
- Чтобы установить напряжение FITC, запустите «положительный контроль (клетки, обработанные индуктором АФК, A или B)». Отрегулируйте напряжение так, чтобы все события отображались на гистограмме FITC. В этом случае используют напряжение 280 В. В окне Панель мониторинга приобретения нажмите кнопку Остановить получение.
- Снова поместите трубку «управления автофлуоресценцией» на рычаг аспиратора. В окне Панель мониторинга сбора щелкните Получить данные, затем Записать данные и выберите требуемые условия остановки (например, 50 000 событий). Нарисуйте ворота вокруг интересующих клеток, исключив мертвые клетки и мусор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Они наблюдаются как гораздо меньшие события, чем основная клеточная популяция, и появляются в левом нижнем углу графика. - Когда сбор закончится, снимите трубку с рычага аспиратора. Оборудование будет мыться само. В окне Панель мониторинга приобретения щелкните Next Tube и запустите базальный элемент управления (нестимулированные ячейки). Щелкните Получить данные, а затем Записать данные.
- Из начального затвора (затвора, который исключает мертвые ячейки и мусор) создайте еще один точечный график FITC (по оси X) против APC (по оси Y). Нарисуйте затвор квадранта и отрегулируйте координаты, чтобы визуализировать события в левом нижнем квадранте графика FITC против APC.
- Для записи следующих образцов извлеките трубку и нажмите кнопку Следующая трубка > Получить данные > Запись данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный цитометр, используемый здесь (см. Таблицу материалов), регистрирует максимум 1 x 106 событий на трубку. - Когда запись всех трубок закончится, экспортируйте данные на диск D. Для этого щелкните Файл > Экспорт > файлы FCS > Выберите версию 3.0 или 3.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя сбор данных с помощью одного программного обеспечения (см. Таблицу материалов) подробно описан в этом протоколе, может быть использовано любое другое программное обеспечение для проточной цитометрии. Параметры сбора (FSC, SSC и FITC) могут быть установлены таким же образом для получения результатов.
6. Анализ полученных данных
- Откройте программное обеспечение и добавьте образцы с помощью кнопки действия Добавить образцы ; он расположен на панели задач или в группе навигации.
- Нажмите кнопку Добавить образцы.
- С помощью файлового обозревателя перейдите в папку Experimental.
- Выберите экспериментальную папку и нажмите кнопку Выбрать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы образцов загружаются как часть группы "Все образцы" в рабочую область.
- Дважды щелкните первый образец в рабочей области: Управление автофлуоресценцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие открывает окно Графика, отображающее события вдоль параметров прямого рассеяния (FSC-A по оси X) и бокового рассеяния (SSC-A по оси Y). - Нарисуйте полигональные ворота, чтобы изолировать интересующие клетки, исключив мертвые клетки и мусор.
- Щелкните инструмент «Полигональные ворота ».
- Щелкните внутри участка, чтобы составить ворота полигона. Сделайте столько сторон, сколько необходимо.
- Дважды щелкните в последней точке, чтобы закрыть полигон и создать нужные ворота.
- Укажите имя шлюза, например "Ячейки MIO-M1", и нажмите ok.
ПРИМЕЧАНИЕ: Появится новое окно графика, отображающее только события MIO-M1 без мертвых клеток и мусора. - Повторите со всеми образцами для анализа.
- Измените график на гистограмму. Для этого щелкните метку параметра оси X и выберите FITC-A. Щелкните метку параметра оси Y и выберите Гистограмма. Это изменяет график на одномерную гистограмму.
- Добавьте статистику с помощью окна Добавить статистику.
- Ниже графика гистограммы нажмите добавить статистику. Программа откроет новое окно статистики.
- В левой части нового окна выберите статистику Геометрическое Среднее.
- Выберите ячейки популяции MIO-M 1.
- Из списка доступных параметров выберите FIT-C.
- Нажмите кнопку Добавить , чтобы применить их к анализу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это создает новую статистику "геометрическое среднее: FITC" в дереве выборки, и их значения отображаются в вашей рабочей области.
- Поместите эти геометрические средние значения в статистическую программу и проанализируйте.
- Щелкните значок L , чтобы открыть редактор макетов; этот значок находится на вкладке Меню в рабочей области. Расположите окно рабочей области и редактор макета рядом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Редактор макетов представляет собой отдельное окно рабочей области с инструментами для отображения нескольких графиков и статистики в простом графическом отчете. Это может быть экспортировано с файлом расширения, который вы предпочитаете, например, PDF или JPG, среди прочих.- Из дерева захвата образца в окне Рабочая область перетащите популяцию ячеек MIO-M 1 в редактор макета.
- Убедитесь, что график гистограммы, содержащий события в шлюзе, отображается в редакторе макетов. Дополнительная основная информация будет подробно описана в текстовом поле ниже.
- Перетащите все образцы, чтобы сравнить их на одном графике. Программа будет перекрывать их.
- Щелкните правой кнопкой мыши график гистограммы и выберите Свойства. Программа откроет новое окно Определение графа. Это окно имеет четыре вкладки (Аннотация, Шрифты, Легенда и Указать). Перейдите на вкладку Указать и измените ось Y с Автоматической на Модальную. Нажмите кнопку Применить.
- Щелкните образец правой кнопкой мыши и измените раскраску, стиль линии, вес линии и т. д., чтобы персонализировать график.
- Чтобы экспортировать изображение, перейдите на вкладку Файл и сразу после этого выберите Сохранить изображение в группе Документ. Выберите предпочтительный тип файла изображения (например, PDF).
ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется диалоговое окно сохранения с предложением выбрать место сохранения. Нажмите кнопку Сохранить.
- Сохраните анализ в виде файла рабочей области (WSP-файла).
- В левом верхнем углу щелкните значок Анализ цитометрии и выберите Сохранить как.
- Выберите Сохранить как рабочую область (WSP), чтобы сохранить документ с данными и анализом.
- Введите имя файла рабочей области.
- Нажмите кнопку Сохранить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как описано в разделе протокола, мы показали репрезентативные и количественные данные, демонстрирующие обнаружение продуцирования АФК с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA из клеток MIO-M1, стимулируемых индуктором АФК, А или В. Как и ожидалось, мы наблюдали изменения флуоресценции FITC в нестимулированных клетках выше уровней автофлуоресценции (рисунок 1A, сравните «базальный контроль» и «контроль автофлуоресценции», график точечных графиков). Это произошло из-за базальной продукции АФК в клетках MIO-M1. (Рисунок 1B, сравните «базальный контроль» и «автофлуоресцентный контроль», график гистограммы).
Интересно, что значительное увеличение флуоресценции FITC наблюдалось, когда клетки стимулировали индуктором АФК, A или B (Рисунок 1B, сравните образцы «Индуктора АФК А» с образцами «базального контроля» и «Индуктора АФК В» с образцами «базального контроля», график гистограммы). Более того, когда клетки обрабатывали антиоксидантным соединением до индуктора АФК, А или В, уровень флуоресценции снижался вблизи базальных уровней (Рисунок 1В, сравните «Индуктор АФК А» с «предварительной обработкой антиоксидантным соединением 6 ч + Индуктор АФК А 30 мин» и «Индуктор АФК В» против «предварительной обработки антиоксидантным соединением 6 ч + Индуктор АФК В 30 мин», соответственно, график гистограммы). Следует отметить, что никаких различий в флуоресцентном сигнале не наблюдалось в клетках, получавших антиоксидантное соединение (6 ч) в отношении базального контроля. (Рисунок 1B, сравните «6-часовое антиоксидантное соединение» с «базальным контролем»).
Эти результаты также были четко очевидны, когда данные были представлены в виде геометрического среднего FITC (рисунок 1C). Как видно на графике, указываются средние значения и соответствующая стандартная погрешность среднего значения (SEM).
Ключевым преимуществом этого протокола является его применение для отслеживания изменений в ROS с течением времени. В связи с этим мы смогли наблюдать значительное и зависящее от времени увеличение АФК при лечении клеток MIO-M1 индуктором АФК С в течение 2 ч, 4 ч и 6 ч (рисунок 2).
Для оптимизации этого протокола мы предприняли три различные стратегии сбора клеток (0,5% трипсин-ЭДТА, раствор для отсоединения клеток Accutase и буфер отсоединения) с сопоставимыми результатами (данные не показаны).
Рисунок 1: Измерение АФК в ответ на индуктор АФК, А или В, с использованием зонда DCFH-DA в ячейках MIO-M1: (A) Сравнение условий "базального контроля" и "управления автофлуоресценцией", репрезентативный точечный график FL1 (519 нм) против FL2 (660 нм). (B) Репрезентативные гистограммы для флуоресценции, индуцированной зондом DCFH-DA при стимуляции клеток MIO-M1 индуктором АФК, А или В, в течение 30 мин или предварительно обработанной антиоксидантным соединением в течение 6 ч и 30 мин индуктором АФК А, В или транспортным средством. (C) Геометрическое среднее флуоресценции FITC для всех стимулов в клетках MIO-M1. Данные представляются в виде среднего ± SEM и анализируются односторонней ANOVA, за которой следует пост-тест Даннетта; **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Измерение сверхурочной работы АФК в ответ на лечение индуктором АФК С с использованием зонда DCFH-DA в клетках MIO-M1: клетки MIO-M1, обработанные индуктором АФК С в течение 2 ч, 4 ч и 6 ч и загруженные зондом DCFH-DA для определения уровней АФК. Репрезентативная гистограмма интенсивности флуоресценции, индуцированная зондом DCFH-DA при стимуляции клеток MIO-M1 индуктором АФК С в течение 2 ч, 4 ч и 6 ч. Геометрическое среднее флуоресценции FITC для стимулов, описанных выше. Данные представляются в виде среднего ± SEM и анализируются односторонней ANOVA, за которой следует пост-тест Даннетта; ns, незначительно, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение | Условия хранения | Заметка | |||||
| Гидроксид натрия (NaOH) 10 М, 1 л | 400 г гранул NaOH | дистиллированная вода до 1 л | РТ | «ОСТОРОЖНО»: Приготовление концентрированного раствора NaOH вызывает экзотермическую реакцию. Необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы избежать химических ожогов и поломки стеклянных стаканов. По возможности используйте тяжелые пластиковые стаканы. | |||
| Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) 10 X, 1 л | 80 г NaCl | дистиллированная вода до 1 л | РТ | Отрегулируйте pH до 7,4 и отфильтруйте раствор. | |||
| 2 г KCl | |||||||
| 11,5 г Na2HPO4· 7Н2О | |||||||
| 2 г KH2PO4 | |||||||
| Этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,5 М рН 8,0, 1 л | 186,1 г Na2ЭДТА· 2Ч2О | дистиллированная вода до 1 л | РТ | Динатриевая соль ЭДТА не растворяется в нейтральной воде или растворе до тех пор, пока рН раствора не будет скорректирован примерно до 8,0 путем добавления NaOH. Отрегулируйте pH до 8,0 и стерилизуйте раствор. | |||
| 10% мас./об.азида натрия (NaN3), 100 мл | 10 г NaN3 | дистиллированная вода до 100 мл | РТ | ||||
| Буфер отсоединения, 100 мл | 180 мг глюкозы | PBS от 1X до 100 мл | 4 °С | ||||
| 0,6 мл 0,5 М рН 8,0 ЭДТА | |||||||
| Буфер окрашивания проточной цитометрии (FACS Buffer), 100 мл | 2 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) | PBS от 1X до 100 мл | 4 °С | NaN3 добавляют в качестве консерванта. | |||
| 1 мл 0,5 М рН 8,0 ЭДТА | |||||||
| 1 мл 10% мас./об.азида натрия | |||||||
| 5 мМ 2′,7′-DCFH-DA, 1 мл | 2,4 мг DCFH-DA | диметилсульфоксид до 1 мл | -20 °C защищен от света | Аккуратно перемешать и аликвот по 20 мкл в тубах по 1,5 мл. Избегайте многократных циклов оттаивания/замораживания. Мы рекомендуем отказаться от всего неиспользованного зондового раствора с экспериментального дня. | |||
| 0,4% масс./об. трипан синий 10 X, 50 мл | 0,2 г трипан синего | PBS от 1X до 50 мл | 4 °С | ||||
Таблица 1: Буферные рецепты
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Некоторые патологические состояния, такие как рак, воспалительные заболевания, ишемия / реперфузия, ишемическая болезнь сердца, диабет и ретинопатии, а также физиологические ситуации, такие как старение, приводят к перепроизводству АФК 6,7,8,9,10,11. Поэтому обнаружение, измерение и понимание пути, участвующего в модуляции АФК, являются важными целями для многих заболеваний. Использование зондов для измерения уровней АФК, таких как DCFH-DA, доступно, широко описано и принято в научной литературе 26,27,28. В этой статье мы описываем подробный и воспроизводимый протокол для измерения и количественной оценки уровней АФК с помощью проточной цитометрии в MMC.
Преимущество использования этого метода заключается в том, что после того, как зонд DCFH-DA окисляется АФК и генерирует флуоресцентный продукт DCF; это может быть измерено в пластинчатом считывателе, конфокальном микроскопе или проточном цитометре. Недостатком пластинчатого считывателя является то, что он измеряет полную флуоресценцию. Следовательно, считыватель пластин не отличает внутриклеточную флуоресценцию от внеклеточной, генерируемой химическими реакциями в культуральной среде. Конфокальная микроскопия является полезным инструментом, поскольку клетки могут быть загружены зондом DCFH-DA и просматриваться в режиме реального времени в культуральных камерах при 37 ° C. Морфология и расположение АФК в клетке могут быть обнаружены с помощью этой методологии, но уровни АФК не имеют количественного измерения. Сила проточной цитометрии заключается в ее способности измерять внутриклеточную флуоресценцию в живых клетках. Количественные данные о количестве ячеек, испускающих флуоресценцию, а также геометрические средние флуоресценции могут быть получены25.
Важно учитывать, что фактически измеряется при использовании зонда DCFH-DA. Как мы упоминали ранее, DCFH-DA измеряет несколько видов АФК, и поэтому флуоресценция, полученная в результате зеленого зонда, не может быть использована для различения типов видов АФК29. В связи с этим известно, что разные зонды могут различать тип АФК. Например, дигидроэтидиевый (DHE) зонд окисляют супероксидом с получением флуоресцентного продукта 2-гидроксиэтидия (возбуждение при 518 нм и излучение при 605 нм), но этот продукт нельзя отличить без использования более трудоемких методов, таких как ВЭЖХ30,31. Другим зондом является индикатор митохондриального супероксида (см. Таблицу материалов), который является новым фторогенным зондом для высокоселективного обнаружения супероксида в митохондриях живых клеток31,32. Однако для целей измерения общих уровней АФК и повышения АФК после инсульта или оценки антиоксидантной способности различных продуктов использование зонда DCFH-DA наряду с соответствующими средствами контроля является удобным и приемлемым 25,28,29.
Очень важным вопросом является выбор и использование надлежащего экспериментального контроля: контроль автофлуоресценции (клетки без зонда DCFH-DA), базальный контроль (нестимулированные клетки), положительный контроль (клетки, обработанные индуктором АФК), отрицательный контроль (клетки, обработанные антиоксидантным соединением) и проблема с образцом (клетки, обработанные антиоксидантным соединением и индуктором АФК). Полезным советом является использование среды без фенольного красного цвета для уменьшения помех флуоресцентным зондам.
Мы также рекомендуем нагрузочные ячейки с помощью зонда DCFH-DA за 30 минут до завершения экспериментальной обработки. Стандартизация концентрации DCFH-DA, в нашем случае 5 мкМ, удобна и может отличаться в зависимости от типа клетки и статуса активации клетки. Мы советуем установить зондовые концентрации, начиная с 5 мкМ и 10 мкМ, и проверить эффективность окрашивания в экспериментах.
Таким образом, анализ окислительно-восстановительного баланса в здоровье или заболевании имеет решающее значение для создания надежных методов измерения реакции на окислительный стресс. Таким образом, этот протокол является простым, быстрым и мощным инструментом для количественной оценки уровней АФК в живых MGC с помощью проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Марию Пилар Креспо и Паулу Алехандру Абади из CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Кордова, Аргентина) за помощь в проточной цитометрии и Габриэлу Фурлан и Ноэлию Мальдонадо за помощь в культивировании клеток. Мы также благодарим Виктора Диаса (просекретаря по институциональным коммуникациям FCQ) за производство и редактирование видео.
Эта статья финансировалась за счет грантов Секретариата по вопросам науки и технологии, Национального университета Кордовы (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Фонда научных исследований и технологий (FONCyT) и Проекта исследований в области науки и технологии (PICT) 2015 N° 1314 (все до M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
