Summary
Här föreslår vi ett systematiserat, tillgängligt och reproducerbart protokoll för att detektera cellulära reaktiva syrearter (ROS) med användning av 2′,7′-diklorfluoresceindiacetatsond (DCFH-DA) i Müller glialceller (MGC). Denna metod kvantifierar totala cellulära ROS-nivåer med en flödescytometer. Detta protokoll är mycket lätt att använda, lämpligt och reproducerbart.
Abstract
Redoxbalansen har en viktig roll för att upprätthålla cellulär homeostas. Den ökade generationen av reaktiva syrearter (ROS) främjar modifieringen av proteiner, lipider och DNA, vilket slutligen kan leda till förändring i cellulär funktion och celldöd. Därför är det fördelaktigt för celler att öka sitt antioxidantförsvar som svar på skadliga förolämpningar, antingen genom att aktivera en antioxidantväg som Keap1 / Nrf2 eller genom att förbättra redoxrensare (vitaminerna A, C och E, β-karoten och polyfenoler, bland andra). Inflammation och oxidativ stress är involverade i patogenesen och progressionen av retinopatier, såsom diabetisk retinopati (DR) och retinopati av prematuritet (ROP). Eftersom Müller glialceller (MFC) spelar en nyckelroll i homeostasen av neural retinal vävnad, anses de vara en idealisk modell för att studera dessa cellulära skyddsmekanismer. I den meningen är kvantifiering av ROS-nivåer med en reproducerbar och enkel metod avgörande för att bedöma bidraget från vägar eller molekyler som deltar i antioxidantcellförsvarsmekanismen. I den här artikeln ger vi en fullständig beskrivning av de procedurer som krävs för mätning av ROS med DCFH-DA-sond och flödescytometri i MGC. Viktiga steg för flödescytometridatabehandling med programvaran finns här, så läsarna kommer att kunna mäta ROS-nivåer (geometriska medel för FITC) och analysera fluorescens histogram. Dessa verktyg är till stor hjälp för att utvärdera inte bara ökningen av ROS efter en cellulär förolämpning utan också för att studera antioxidanteffekten av vissa molekyler som kan ge en skyddande effekt på cellerna.
Introduction
Den neurala näthinnan är en mycket organiserad vävnad som presenterar väldefinierade neuronala lager. I dessa är neuroner (ganglion, amakrin, bipolär, horisontell och fotoreceptorceller) sammankopplade med varandra och även med Müller-glialceller (MGC) och astrocyter, vilket leder till adekvat fototransduktion och bearbetning av visuell information 1,2. MGC är kända för att ha en viktig roll i underhållet av retinal homeostas eftersom de passerar hela retinalsektionen och därmed kan de interagera med alla celltyper som modulerar flera skyddsprocesser. Det har rapporterats att MGC har flera viktiga funktioner för underhåll och överlevnad av retinala neuroner, inklusive glykolys för att ge energi till neuroner, avlägsnande av neuronalt avfall, återvinning av neurotransmittorer och frisättning av neurotrofa faktorer, bland annat 3,4,5.
Å andra sidan är inflammation, oxidativ och nitrosativ stress involverad i patogenesen och utvecklingen av många mänskliga sjukdomar, inklusive retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoxbalansen i celler beror på tät reglering av ROS-nivåer. ROS genereras ständigt under fysiologiska förhållanden som ett resultat av aerob andning huvudsakligen. De viktigaste medlemmarna i ROS-familjen inkluderar reaktiva fria radikaler såsom superoxidanjonen (O2͘͘͘͘•−), hydroxylradikaler (•OH), olika peroxider (ROOR′), hydroperoxider (ROOH) och den icke-radikala väteperoxiden (H2O2)12,13. Under de senaste åren har det blivit uppenbart att ROS spelar en viktig signalroll i cellerna genom att styra väsentliga processer. MGC har ett starkt antioxidantförsvar genom aktivering av den transkriptionella kärnfaktorn erytroid-2-relaterad faktor 2 (Nrf2) och det efterföljande uttrycket av antioxidantproteiner för att eliminera överdriven produktion av ROS under patologiska förhållanden 14,15,16. När cellerna förlorar sin redoxbalans på grund av en överdriven produktion av ROS eller en defekt förmåga att ta bort ROS, främjar ackumuleringen av oxidativ stress skadliga modifieringar i proteiner, lipider och DNA, vilket leder till cellulär stress eller död. Ökningen av det retinala antioxidantförsvarssystemet förbättrar upplösningen och förebyggandet av retinopatier, såsom ROP och RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Därför är mätningen av ROS-produktion i realtid ett kraftfullt och användbart verktyg.
Det finns flera metoder för att mäta ROS-produktion eller oxidativ stress i celler. Bland dessa är 2′,7′-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) sond en av de mest använda teknikerna för att direkt kvantifiera redoxtillståndet för en cell 25,26,27,28. Denna sond är lipofil och icke-fluorescerande. Diffusion av denna sond över cellmembranet möjliggör dess klyvning genom intracellulära esteraser vid de två esterbindningarna, vilket ger en relativt polär och cellmembranogenomtränglig produkt, 2′,7′-diklorfluorescein (H2DCF). Denna icke-fluorescerande molekyl ackumuleras intracellulärt, och efterföljande oxidation av ROS ger den högfluorescerande produkten DCF. Oxidationen av sonden är produkten av verkan av flera typer av ROS (peroxinitrit, hydroxylradikaler, kväveoxid eller peroxider), som kan detekteras genom flödescytometri eller konfokalmikroskopi (emission vid 530 nm och excitation vid 485 nm). Begränsningen av denna teknik är att superoxid och väteperoxid inte reagerar starkt medH2DCF 25,29. I den här artikeln använder vi DCFH-DA-sond för att mäta och kvantifiera ROS med flödescytometri. Av den anledningen inducerar vi ROS-produktion genom att stimulera MGC med ROS-inducerare, A eller B, innan vi laddar cellerna med den fluorescerande sonden. Dessutom använder vi en antioxidantförening. Slutligen visar vi representativa och tillförlitliga data som erhållits med hjälp av detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: För buffertkompositioner se tabell 1.
1. Beredning av cellodling
OBS: Här beskrivs odlingsberedningen av MIO-M1-celler, en spontant odödliggjord mänsklig Müller-glialcellinje (Moorfields / Institute of Ophthalmology- Müller 1). Använd alltid korrekt aseptisk teknik och arbeta i en laminär flödeshuva.
- Förbered Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletta medium. Till DMEM innehållande 4,5 g/l D-glukos och 110 mg/l natriumpyruvat tillsätt 10 % värmeinaktiverad FBS, 10 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), 2 mM L-glutamin och 50 U/ml penicillin/streptomycin. Förbered det färska mediet, den dag MIO-M1-cellerna tinas.
- Tina de frysta MIO-M1-cellerna på dag 1.
- För att göra detta, ta bort kryovialen som innehåller 5 x 105 MIO-M1-celler i FBS med 10% DMSO från flytande kvävelagring och placera den omedelbart i ett 37 ° C vattenbad.
OBS: Använd alltid ansiktsmask eller skyddsglasögon, eftersom kryovialer lagrade i flytande kväve utgör en risk för explosion vid upptining. - Tina MIO-M1-cellerna snabbt (på mindre än 1 min) genom att värma injektionsflaskan i 37 ° C vattenbadet tills det bara finns en liten bit is kvar i flaskan.
- Torka av flaskans utsida med 70% etanol och överför den till en laminär flödeshuva.
- Överför de tinade cellerna från injektionsflaskan till ett sterilt 15 ml rör och tillsätt sedan 6 ml förvärmt komplett DMEM-medium droppvis.
- Centrifugera cellsuspensionen vid cirka 600 x g i 5 min. Efter centrifugeringen visualiseras en klar supernatant och en komplett pellets. Kassera supernatanten med en pipett utan att störa cellpelleten.
- Dissociera försiktigt pelletsen och resuspendera cellerna i 10 ml komplett DMEM-medium. Överför denna cellsuspension till en vävnadsodlingsplatta med en diameter på 100 mm och inkubera plattan i cirka 2 dagar vid 37 °C, 5 % CO2.
- För att göra detta, ta bort kryovialen som innehåller 5 x 105 MIO-M1-celler i FBS med 10% DMSO från flytande kvävelagring och placera den omedelbart i ett 37 ° C vattenbad.
- När MIO-M1-cellerna blir 80% -90% sammanflytande på dag 4, utför följande steg.
- Överför plattan till en laminär flödeshuva från inkubatorn. Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta 2x med 5 ml steril och förvärmd PBS. Aspirera PBS.
- Dispensera 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA-lösning och inkubera vid 37 ° C iCO2-inkubatorn i 3-5 minuter för att lossa cellerna.
- Tillsätt 7 ml av det kompletta DMEM-mediet för att hämma trypsinverkan. Disaggregera klusterade trypsiniserade MGC:er genom att långsamt pipettera upp och ner (P1000). Samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör.
- Centrifug vid 600 x g i 5 min. Kassera supernatanten. Återsuspendera försiktigt cellpelleten i 2 ml komplett DMEM-media. Överför 1 ml av denna cellsuspension till en 100 mm platta innehållande 9 ml förvärmt komplett DMEM-medium.
- Upprepa åtgärden med en annan 100 mm platta. Inkubera plattan i cirka 1 dag vid 37 °C i en 5 %CO2-inkubator.
- När båda plattorna blir 80% -90% sammanflytande (på dag 6), överför plattan till en laminär flödeshuva. Följ steg 1.3. för att erhålla en cellpellet.
- Dissociera försiktigt pelletsen och återsuspendera cellerna i 5 ml komplett DMEM-media. Räkna MIO-M1-cellerna med hjälp av en hemocytometer (Neubauer-kammare) och trypanblå lösning genom att följa stegen nedan.
- Sätt glasskyddet på Neubauer-kammarens centrala område. Placera kammaren på en plan yta (t.ex. ett bord eller en arbetsbänk).
- Blanda en lika stor volym trypanblå fläck med cellerna. Blanda till exempel 60 μL trypanblått med 60 μL celler för en 1: 2-utspädning.
- Från denna blandning ladda 10 μL med en mikropipett i en Neubauer-kammare.
- Placera den laddade Neubauer-kammaren på mikroskopsteget. Slå sedan på ljuset och justera ljusstyrkan.
- Flytta mikroskopsteget till ett optimalt läge och justera fokus tills en skarp bild av cellerna erhålls.
- Räkna cellerna inuti de fyra rutorna (indelade i 16) som ligger i hörnet av hemocytometern (volym: 0, 1 mm3 vardera ).
- Beräkna cellkoncentrationen med hjälp av ekvationerna nedan.
Koncentration = (Antal celler x 10.000)/Antal kvadrater
Koncentration = (Antal celler x 10.000)/4
Koncentration = Antal celler x 2500
OBS: Om cellutspädning utförs, bör den erhållna koncentrationen omvandlas till den ursprungliga koncentrationen före utspädningen.
Koncentration = (Antal celler x 2500 x 2) = (Antal celler x 5000 celler/ml) - Justera cellsuspensionen till 1 x 105 celler/ml i komplett DMEM-medium och platta 2 ml av denna cellsuspension till en 6-brunnsplatta (2 x 105 celler/brunn). Skaka plattan försiktigt för att fördela cellerna homogent. Inkubera 6-brunnsplattan över natten vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
2. Villkor och kontroller för analysen
- Inkludera följande experimentella kontroller för varje experiment:
- Autofluorescenskontroll (celler utan DCFH-DA-sond, kontroll för inställning av flödescytometerparametrarna).
- Basal kontroll (ostimulerade celler).
- Positiv kontroll (celler behandlade med en ROS-inducerare, A eller B).
- Negativ kontroll (celler behandlade med antioxidantförening)
- Prov (celler behandlade med antioxidantförening och ROS-inducerare, A eller B).
3. Utföra analysen
OBS: Analysen utförs på dag 7. Använd alltid korrekt aseptisk teknik och arbeta i en laminär flödeshuv om inte annat anges.
- Förbered DMEM med lågt serum. Tillägg DMEM innehållande 4,5 g / L D-glukos och 110 mg / L natriumpyruvat med 0,5% värmeinaktiverad FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin och 50 U / ml penicillin / streptomycin. Förbered det färska mediet den dag MIO-M1 kommer att behandlas.
- Överför 6-brunnsplattan (60%-70% sammanflöde) till en laminär flödeshuv från inkubatorn. Aspirera supernatanten och tvätta cellerna 1x med PBS. Tillsätt 2 ml AV DMEM med lågt serum per brunn och inkubera 6-brunnsplattan i 2 timmar vid 37 °C, 5 % CO2. Detta görs för att svälta cellerna.
- Efter serumsvält, behandla cellerna med antioxidantföreningen i 6 timmar.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 2 ml av det utspädda beståndet till följande villkor: negativ kontroll (celler behandlade med antioxidantförening) och prov (celler behandlade med antioxidantförening och ROS-inducerare, A eller B).
- Inkubera 6-brunnsplattan i 6 timmar vid 37 ° C, 5% CO2.
OBS: Om du använder en annan antioxidantförening eller ROS-hämmare, standardisera den optimala tiden och koncentrationen för stimuli.
- Efter 6 timmars inkubation, behandla cellerna med ROS-inducerare, A eller B, i 30 min.
- Lägg till stimuli till följande villkor: positiv kontroll (celler behandlade med en ROS-inducerare, A eller B) och provbrunnar (celler behandlade med antioxidantförening och ROS-inducerare, A eller B).
OBS: Håll stamlösningarna på is. - Inkubera 6-brunnsplattan i 30 min vid 37 ° C, 5% CO2.
OBS: Om du använder en annan ROS-inducerare, standardisera korrekt den optimala tiden och koncentrationen för stimuli.
- Lägg till stimuli till följande villkor: positiv kontroll (celler behandlade med en ROS-inducerare, A eller B) och provbrunnar (celler behandlade med antioxidantförening och ROS-inducerare, A eller B).
- Ladda cellerna med DCFH-DA-sonden.
- Aspirera supernatanten och tvätta cellerna i 6-brunnsplattan 3x med PBS för att ta bort alla stimuli.
- Stäng av ljuset på den laminära flödeshuven och arbeta i mörkret. Förbered en spädning på 1:1000 av 5 mM DCFH-DA-sondsubstocklösningen för att erhålla en slutlig koncentration av 5 μM DCFH-DA i DMEM utan fenolrött i ett 15 ml rör.
- Blanda försiktigt med en virvel och tillsätt 1 ml av denna lösning till följande brunnar: basal kontroll (ostimulerade celler), positiv kontroll (celler behandlade med en ROS-inducerare), negativ kontroll (celler behandlade med antioxidantförening) och provbrunnar (celler behandlade med antioxidantförening och ROS-inducerare, A eller B).
- Tillsätt 1 ml DMEM utan fenolrött till autofluorescenskontrollcellerna.
- Inkubera 6-brunnsplattan i 30 min vid 37 ° C, 5% CO2.
OBS: Sonden är ljuskänslig. Kassera all oanvänd sondlösning.
4. Cellberedning för flödescytometri
- Håll plattan på is efter 6 timmar. Från detta steg framåt är det inte nödvändigt att använda korrekt aseptisk teknik och arbeta i en laminär flödeshuva.
- Tvätta cellerna 3x med 2 ml kall PBS per brunn. Tillsätt 0,5 ml kallavlastande buffert till varje brunn. Skörda cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner med en P1000-pipett.
- Samla dem i märkta 1,5 ml rör och centrifug vid 600 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: När du skördar cellerna, undvik bubbelbildning genom att ställa in P1000-pipetten till 0,4 ml. Från detta steg och framåt, arbeta snabbt. - När centrifugeringen slutar, sätt märkta 1,5 ml rör med cellerna på is. Kassera supernatanten försiktigt och försiktigt dissociera cellpelleten med tappning.
- Tillsätt 1 ml FACS-buffert till varje märkt 1,5 ml rör för att tvätta cellerna. Använd vid behov en virvel vid sin lägsta intensitet för fullständig dissociation av cellpelleten. Centrifugera dem vid 600 x g i 5 min vid 4 °C. Upprepa dessa steg 2x mer. (Utför totalt tre tvättar).
- När den sista tvätten är slut, märk 5 ml rundbottnade polystyrenrör (flödescytometrirör) för alla experimentella förhållanden (se steg 2.).
- När centrifugeringen slutar, återsuspendera cellpelletsna i 200 μL FACS-buffert. Dissociera försiktigt pelletsen i varje 1,5 ml rör med hjälp av en virvel. Överför till märkta 5 ml rundbottenrör. Håll rören på is tills de analyseras på flödescytometern.
5. Datainsamling i en flödescytometer
- Använd flödescytometriprogramvaran och skapa ett nytt experiment. Det gör du genom att gå till Experiment i menyraden och klicka på Nytt experiment (Ctrl + E).
- I menyraden går du också till Visa och klickar på följande alternativ: Verktygsfält, Statusfält, Webbläsare, Cytometer, Granskare, Kalkylblad, Förvärvsinstrumentpanel och Biexponential Editor för att se dessa fönster på arbetsytan.
- Klicka på Specimen_001 till vänster om programvaran . Detta öppnar en lista över rör (Tube_001, Tube_002, etc.). För att märka rören för kontrollerna och olika experimentella förhållanden, dubbelklicka på Tube_001, Tube_002 etc. och byt namn på dem (se steg 2.).
- Välj de kanaler /parametrar som ska analyseras (FSC, SSC, FITC och APC eller något annat fluorokrom för att se kvadranten) i det första röret från experimentets cytometerinställningar .
- Klicka på ikonen Aktuell rörpekare för att välja röret så ändras ikonen till grönt. Placera röret "autofluorescenskontroll" på andningsarmen och flytta basen försiktigt endast till vänster.
- Om du vill köra exemplet "autofluorescenskontroll" går du till fönstret Instrumentpanel för förvärv och klickar på Hämta data. Öppna ett punktdiagram för FSC (på x-axeln) jämfört med SSC (på y-axeln).
- Justera spridningsspänningen framåt och på sidan snabbt för att säkerställa att händelserna visas i diagrammet. I fönstret Instrumentpanel för förvärv klickar du på Sluta förvärva. I detta experiment användes följande spänningsinställningar: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
- För att ställa in FITC-spänningen, kör "positiv kontroll (celler behandlade med en ROS-inducerare, A eller B)". Justera spänningen så att alla händelser visas på ett histogram av FITC. Använd i så fall en spänning på 280 V. Klicka på Sluta förvärva i fönstret Instrumentpanel för förvärv.
- Placera igen röret "autofluorescenskontroll" på andningsarmen. I fönstret Instrumentpanel för förvärv klickar du på Hämta data, sedan på Registrera data och väljer önskade stoppvillkor (till exempel 50 000 händelser). Rita en grind runt cellerna av intresse, exklusive döda celler och skräp.
OBS: Dessa observeras som mycket mindre händelser än huvudcellpopulationen och visas längst ner till vänster i diagrammet. - När förvärvet slutar, ta bort röret från andningsarmen. Utrustningen kommer att tvätta sig själv. I fönstret Instrumentpanel för förvärv klickar du på Nästa rör och kör basalkontrollen (ostimulerade celler). Klicka på Hämta data och sedan på Spela in data.
- Från den ursprungliga porten (grind som utesluter döda celler och skräp) skapar du ett annat punktdiagram för FITC (på x-axeln) kontra APC (på y-axeln). Rita en kvadrantport och justera koordinaterna för att visualisera händelserna i den nedre vänstra kvadranten i FITC kontra APC-diagrammet.
- För att spela in nästa prover, ta bort röret och klicka på Nästa rör > Skaffa data > Spela in data.
OBS: Flödescytometern som används här (se Materialtabell) registrerar högst 1 x 106 händelser per rör. - När inspelningen av alla rör slutar, exportera data till disk D. Det gör du genom att klicka på Arkiv > Exportera > FCS-filer > Välj 3.0- eller 3.1-version.
OBS: Även om datainsamling med hjälp av en programvara (se Materialtabell) beskrivs i detalj i detta protokoll, kan alla andra flödescytometriprogram användas. Förvärvsparametrarna (FSC, SSC och FITC) kan ställas in på samma sätt för att få resultaten.
6. Analys av de förvärvade uppgifterna
- Öppna programvaran och lägg till exemplen med åtgärdsknappen Lägg till exempel . den finns i aktivitetsfältet eller i navigeringsbandet.
- Klicka på Lägg till exempel.
- Använd filblädderläsaren och navigera till mappen Experimentell.
- Välj mappen Experimentell och klicka på Välj.
Exempelfilerna läses in som en del av gruppen "Alla exempel" till arbetsytan.
- Dubbelklicka på det första exemplet på arbetsytan: Autofluorescenskontroll.
Obs!: Den här åtgärden öppnar ett diagramfönster som ritar händelser längs framåtriktad spridning (FSC-A på x-axeln) kontra sidospridning (SSC-A på y-axeln) parametrar. - Rita en polygonport för att isolera cellerna av intresse, exklusive döda celler och skräp.
- Klicka på Polygon Gate-verktyget .
- Klicka i diagrammet för att göra upp polygonporten. Gör så många sidor som behövs.
- Dubbelklicka på den sista punkten för att stänga polygonen och skapa önskad grind.
- Ange ett namn för porten, till exempel "MIO-M1-celler" och tryck på OK.
OBS: Ett nytt diagramdiagramfönster visas som endast visar MIO-M1-händelserna utan döda celler och skräp. - Upprepa med alla prover för att analysera.
- Ändra diagrammet till ett histogram. Det gör du genom att klicka på parameteretiketten X-axel och välja FITC-A. Klicka på parameteretiketten Y-axel och välj Histogram. Detta ändrar handlingen till ett endimensionellt histogram.
- Lägg till statistik med hjälp av fönstret Lägg till statistik.
- Klicka på Lägg till statistik nedan i histogramdiagrammet. Programmet öppnar ett nytt statistikfönster.
- Till vänster om det nya fönstret väljer du statistiken Geometrisk medelvärde.
- Välj Population MIO-M 1-cellerna.
- I listan över tillgängliga parametrar väljer du FIT-C.
- Klicka på knappen Lägg till för att tillämpa dem på analysen.
OBS: Detta skapar den nya statistiken "geometriskt medelvärde: FITC" i exempelträdet och deras värden visas på din arbetsyta.
- Sätt dessa geometriska medelvärden i ett statistikprogram och analysera.
- Klicka på L-ikonen för att öppna layoutredigeraren; den här ikonen finns på fliken Meny på arbetsytan. Placera arbetsytefönstret och layoutredigeraren sida vid sida.
OBS: Layoutredigeraren är ett separat arbetsytefönster med verktyg för att visa flera diagramdiagram och statistik i en enkel grafisk rapport. Detta kan exporteras med den tilläggsfil du föredrar, som PDF eller JPG, bland andra.- Från gating-trädet i ett exempel i fönstret Arbetsyta drar du MIO-M 1 cells population till layoutredigeraren.
- Kontrollera att ett histogramdiagram som innehåller händelserna i porten visas i layoutredigeraren. Ytterligare grundläggande information kommer att beskrivas i en textruta nedan.
- Dra alla exempel för att jämföra dem i samma diagram. Programmet kommer att överlappa dem.
- Högerklicka på histogramdiagrammet och välj Egenskaper. Programmet öppnar ett nytt Graph Definition-fönster. Det här fönstret har fyra flikar (Kommentera, Teckensnitt, Förklaring och Ange). Klicka på fliken Ange och ändra y-axeln från Auto till Modal. Klicka på Använd.
- Högerklicka på exemplet och ändra Färgläggning, Linjestil, Linjevikt osv. för att anpassa diagrammet.
- Om du vill exportera bilden klickar du på fliken Arkiv och väljer spara bild i dokumentbandet direkt efter. Välj önskad typ av bildfil (t.ex. PDF).
Obs!: En dialogruta för att spara öppnas där du uppmanas att välja en sparplats. Klicka på Spara.
- Spara analysen som en arbetsytefil (.wsp).
- I det övre vänstra hörnet klickar du på ikonen Cytometrianalys och väljer Spara som.
- Välj Spara som arbetsyta (WSP) för att spara dokumentet med data och analys.
- Ange ett namn för arbetsytefilen.
- Klicka på Spara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrivs i protokollavsnittet har vi visat representativa och kvantitativa data som visar flödescytometridetektering av ROS-produktion med fluorescenssonden DCFH-DA från MIO-M1-celler stimulerade med ROS-inducerare, A eller B. Som förväntat observerade vi förändringar i FITC-fluorescens i ostimulerade celler över autofluorescensnivåerna (Figur 1A, jämför "basal kontroll" kontra "autofluorescenskontroll", dot plots graph). Detta inträffade på grund av en basal produktion av ROS i MIO-M1-cellerna. (Figur 1B, jämför "basal control" med "autofluorescence control", histogramdiagram).
Intressant nog observerades en signifikant ökning av FITC-fluorescens när cellerna stimulerades med ROS-inducerare, A eller B (Figur 1B, jämför "ROS-inducerare A" -prover mot "basalkontroll" och "ROS-inducerare B" -prover kontra "basalkontroll", histogramdiagram). Dessutom, när celler behandlades med antioxidantföreningen före ROS-induceraren, A eller B, minskade fluorescensnivån nära basala nivåer (Figur 1B, jämför "ROS-inducerare A" mot "förbehandling med antioxidantförening 6 h + ROS-inducerare A 30 min" och "ROS-inducerare B" kontra "förbehandling med antioxidantförening 6 h + ROS-inducerare B 30 min", respektive histogramgraf). Observera att inga skillnader i fluorescenssignal observerades i celler behandlade med antioxidantförening (6 timmar) med avseende på basal kontroll. (Figur 1B, jämför "6h antioxidantförening" med "basal kontroll").
Dessa resultat var också tydligt tydliga när data presenterades som det geometriska medelvärdet av FITC (figur 1C). Som framgår av diagrammet anges medelvärdena och motsvarande standardfel för medelvärdet (SEM).
En viktig fördel med detta protokoll är dess tillämpning för att följa förändringar i ROS över tiden. I detta avseende har vi kunnat observera en signifikant och tidsberoende ökning av ROS när vi behandlade MIO-M1-celler med ROS-inducerare C i 2 timmar, 4 timmar och 6 timmar (Figur 2).
För optimering av detta protokoll har vi försökt tre olika strategier för att skörda cellerna (0,5% trypsin-EDTA, Accutase cell detachment solution och lossa buffert) med jämförbara resultat (data visas inte).
Figur 1: Mätning av ROS som svar på ROS-inducerare, A eller B, med DCFH-DA-sond i MIO-M1-celler: (A) Jämförelse av "basal control" kontra "autofluorescens control" -förhållanden, representativ punktplot FL1 (519 nm) vs. FL2 (660 nm). (B) Representativa histogram för fluorescens inducerad av DCFH-DA-sond vid stimulering av MIO-M1-celler med ROS-inducerare, A eller B, i 30 min, eller förbehandlad med antioxidantförening i 6 timmar och 30 min av ROS-induceraren A, B eller fordon. (C) Geometriskt medelvärde av FITC-fluorescensen för alla stimuli i MIO-M1-celler. Data presenteras som medelvärde ± SEM och analyseras av envägs ANOVA följt av Dunnetts eftertest; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mätning av ROS-övertid som svar på ROS-inducerare C-behandling med DCFH-DA-sond i MIO-M1-celler: MIO-M1-celler behandlade med ROS-inducerare C i 2 timmar, 4 timmar och 6 timmar och laddade med DCFH-DA-sond för att bestämma ROS-nivåer. Representativt histogram för fluorescensintensitet inducerad av DCFH-DA-sond vid stimulering av MIO-M1-celler med ROS-inducerare C i 2 timmar, 4 timmar och 6 timmar. Geometriskt medelvärde av FITC-fluorescens för de stimuli som beskrivs ovan. Data presenteras som medelvärde ± SEM och analyseras av envägs ANOVA följt av Dunnetts eftertest; ns, inte signifikant, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Lösning | Förvaringsförhållanden | Not | |||||
| Natriumhydroxid (NaOH) 10 m, 1 l | 400 g NaOH-pellets | destillerat vatten till 1 L | RT | "VARNING": Beredningen av en koncentrerad NaOH-lösning orsakar en exoterm reaktion. Extrem försiktighet måste vidtas för att undvika kemiska brännskador och brott på glasbägare. Använd om möjligt tunga plast bägare. | |||
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 10 x, 1 l | 80 g NaCl | destillerat vatten till 1 L | RT | Justera pH till 7,4 och filtrera lösningen. | |||
| 2 g KCl | |||||||
| 11,5 gNa2HPO4· 7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| Etylenediamintetraättiksyra (EDTA), 0,5 M pH 8,0, 1 L | 186,1 gNa2EDTA· 2H2O | destillerat vatten till 1 L | RT | Dinatriumsaltet av EDTA är inte lösligt i neutralt vatten eller lösning förrän lösningens pH justeras till cirka 8,0 genom tillsats av NaOH. Justera pH till 8,0 och sterilisera lösningen. | |||
| 10 % viktprocent natriumazid (NaN3), 100 ml | 10 g NaN3 | destillerat vatten till 100 ml | RT | ||||
| Lösgörande buffert, 100 ml | 180 mg glukos | PBS 1X till 100 ml | 4 °C | ||||
| 0,6 ml 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| Flödescytometrifärgningsbuffert (FACS-buffert), 100 ml | 2 ml serum från nötkreatur (FBS) | PBS 1X till 100 ml | 4 °C | NaN3 tillsätts som konserveringsmedel. | |||
| 1 ml 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| 1 ml 10 % med natriumazid | |||||||
| 5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 ml | 2,4 mg DCFH-DA | dimetylsulfoxid till 1 ml | -20 °C skyddad från ljus | Blanda försiktigt och alikvot 20 μL i 1,5 ml rör. Undvik flera upptinings- / fryscykler. Vår rekommendation är att kassera all oanvänd sondlösning från experimentdagen. | |||
| 0,4 % med trypanblå 10 X, 50 ml | 0,2 g trypan blå | PBS 1X till 50 ml | 4 °C | ||||
Tabell 1: Buffertrecept
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera patologiska tillstånd, såsom cancer, inflammatoriska sjukdomar, ischemi / reperfusion, ischemisk hjärtsjukdom, diabetes och retinopatier, och även fysiologiska situationer som åldrande, leder till ROS-överproduktion 6,7,8,9,10,11. Därför är detektion, mätning och förståelse av vägen som är involverad i moduleringen av ROS viktiga mål för många sjukdomar. Användningen av sonder för att mäta ROS-nivåer, som DCFH-DA, är tillgänglig, allmänt beskriven och accepterad i den vetenskapliga litteraturen 26,27,28. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat och reproducerbart protokoll för att mäta och kvantifiera ROS-nivåer genom flödescytometri i MGC.
En fördel med användningen av denna metod är att när DCFH-DA-sonden oxideras av ROS och genererar en fluorescerande DCF-produkt; detta kan mätas i en plattläsare, konfokalmikroskop eller flödescytometer. Nackdelen med plattläsaren är att den mäter total fluorescens. Följaktligen skiljer plattläsaren inte den intracellulära fluorescensen från den extracellulära som genereras av kemiska reaktioner i odlingsmediet. Konfokalmikroskopi är ett användbart verktyg eftersom celler kan laddas med DCFH-DA-sond och ses i realtid i odlingskammare vid 37 ° C. Morfologin och placeringen av ROS i cellen kan detekteras med denna metodik, men ROS-nivåer saknar en kvantitativ mätning. Styrkan hos flödescytometri ligger i dess förmåga att mäta den intracellulära fluorescensen i levande celler. Kvantitativa data om antalet celler som avger fluorescens, liksom de geometriska medel för fluorescens, kan erhållas25.
Det är viktigt att ta hänsyn till vad som faktiskt mäts vid användning av DCFH-DA-sond. Som vi tidigare nämnde mäter DCFH-DA flera ROS-arter, så fluorescens som härrör från den gröna sonden kan inte användas för att diskriminera mellan typer av ROS-arter29. I detta avseende är det känt att olika sonder kan urskilja typen av ROS. Till exempel oxideras dihydroetidiumsonden (DHE) av superoxid för att ge den fluorescerande produkten 2-hydroxietidium (excitation vid 518 nm och utsläpp vid 605 nm), men denna produkt kan inte särskiljas utan användning av mer tidskrävande tekniker, såsom HPLC30,31. En annan sond är en mitokondriell superoxidindikator (se Materialtabell), som är en ny fluorogen sond för mycket selektiv detektion av superoxid i mitokondrierna hos levande celler31,32. För mätning av totala ROS-nivåer och ökningar i ROS efter en förolämpning eller utvärdering av antioxidantförmågan hos olika produkter är användningen av DCFH-DA-sond tillsammans med lämpliga kontroller emellertid bekväm och acceptabel 25,28,29.
En mycket viktig fråga är valet och användningen av korrekta experimentella kontroller: autofluorescenskontroll (celler utan DCFH-DA-sond), basal kontroll (ostimulerade celler), positiv kontroll (celler behandlade med en ROS-inducerare), negativ kontroll (celler behandlade med antioxidantförening) och provproblem (celler behandlade med antioxidantförening och ROS-inducerare). Ett användbart tips är att använda medium utan fenolrött för att minska störningar med fluorescerande sonder.
Vi rekommenderar också att du laddar celler med DCFH-DA-sonden 30 minuter innan du avslutar den experimentella behandlingen. Standardisering av koncentrationen av DCFH-DA, i vårt fall 5 μM, är bekväm och kan variera beroende på celltyp och cellaktiveringsstatus. Vårt råd är att ställa in sondkoncentrationerna, från 5 μM och 10 μM, och kontrollera effekten av färgningen i experimenten.
Sammanfattningsvis är analys av redoxbalansen i hälsa eller sjukdom avgörande för att fastställa tillförlitliga metoder för att mäta det oxidativa stressresponsen. Därför är detta protokoll ett enkelt, snabbt och kraftfullt verktyg för att kvantifiera ROS-nivåer i levande MGC genom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka María Pilar Crespo och Paula Alejandra Abadie från CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) för hjälp med flödescytometri och Gabriela Furlan och Noelia Maldonado för cellodlingshjälp. Vi tackar också Victor Diaz (pro-secretary of institutional communication of FCQ) för videoproduktion och redigering.
Denna artikel finansierades av bidrag från Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) och Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alla till M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
