Summary
Her foreslår vi en systematisert, tilgjengelig og reproduserbar protokoll for å oppdage cellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2′,7′-diklorfluorescein diacetat sonde (DCFH-DA) i Müller glialceller (MGCs). Denne metoden kvantifiserer totale cellulære ROS-nivåer med et strømningscytometer. Denne protokollen er veldig enkel å bruke, egnet og reproduserbar.
Abstract
Redoksbalansen har en viktig rolle i å opprettholde cellulær homeostase. Den økte generasjonen reaktive oksygenarter (ROS) fremmer modifikasjon av proteiner, lipider og DNA, noe som til slutt kan føre til endring i cellulær funksjon og celledød. Derfor er det gunstig for celler å øke sitt antioksidantforsvar som svar på skadelige fornærmelser, enten ved å aktivere en antioksidantvei som Keap1 / Nrf2 eller ved å forbedre redoks scavengers (vitamin A, C og E, β-karoten og polyfenoler, blant andre). Betennelse og oksidativt stress er involvert i patogenese og progresjon av retinopatier, som diabetisk retinopati (DR) og retinopati av prematuritet (ROP). Siden Müller glialceller (MGCer) spiller en nøkkelrolle i homeostase av nevralt netthinnevev, anses de som en ideell modell for å studere disse cellulære beskyttelsesmekanismene. I denne forstand er kvantifisering av ROS-nivåer med en reproduserbar og enkel metode viktig for å vurdere bidraget av veier eller molekyler som deltar i antioksidantcelleforsvarsmekanismen. I denne artikkelen gir vi en fullstendig beskrivelse av prosedyrene som kreves for måling av ROS med DCFH-DA-sonde og strømningscytometri i MGCer. Viktige trinn for strømningscytometridatabehandling med programvaren er gitt her, slik at leserne vil kunne måle ROS-nivåer (geometriske midler til FITC) og analysere fluorescens histogrammer. Disse verktøyene er svært nyttige for å evaluere ikke bare økningen i ROS etter en cellulær fornærmelse, men også for å studere antioksidanteffekten av visse molekyler som kan gi en beskyttende effekt på cellene.
Introduction
Den nevrale netthinnen er et veldig organisert vev som presenterer veldefinerte nevronale lag. I disse er nevroner (ganglion, amacrine, bipolare, horisontale og fotoreseptorceller) koblet sammen med hverandre og også med Müller glialceller (MGCer) og astrocytter, noe som fører til tilstrekkelig fototransduksjon og behandling av visuell informasjon 1,2. MGCer er kjent for å ha en viktig rolle i vedlikehold av retinal homeostase fordi de krysser hele netthinnedelen, og dermed kan de samhandle med alle celletyper som modulerer flere beskyttende prosesser. Det har blitt rapportert at MGCer har flere viktige funksjoner for vedlikehold og overlevelse av retinal nevroner, inkludert glykolyse for å gi energi til nevroner, fjerning av nevronalt avfall, resirkulering av nevrotransmittere og frigjøring av nevrotrofiske faktorer, blant annet 3,4,5.
På den annen side er betennelse, oksidativt og nitrosativt stress involvert i patogenese og progresjon av mange menneskelige sykdommer, inkludert retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoksbalansen i celler avhenger av stram regulering av ROS-nivåer. ROS genereres stadig under fysiologiske forhold som følge av aerob åndedrett hovedsakelig. De viktigste medlemmene av ROS-familien inkluderer reaktive frie radikaler som superoksid-anionen (O2͘͘͘͘•−), hydroksylradikaler (•OH), ulike peroksider (ROOR′), hydroperoksider (ROOH) og ingen radikal hydrogenperoksid (H2O2)12,13. De siste årene har det blitt tydelig at ROS spiller en viktig signalrolle i cellene ved å kontrollere viktige prosesser. MGC har et sterkt antioksidantforsvar ved aktivering av transkripsjonell kjernefysisk faktor erythroid-2-relatert faktor 2 (Nrf2) og det påfølgende uttrykket av antioksidantproteiner for å eliminere overdreven produksjon av ROS under patologiske forhold 14,15,16. Når cellene mister sin redoksbalanse på grunn av en overdrevet produksjon av ROS eller en defekt evne til å fjerne ROS, fremmer opphopning av oksidativt stress skadelige modifikasjoner i proteiner, lipider og DNA, noe som fører til cellulær stress eller død. Økningen av retinal antioksidantforsvaret forbedrer oppløsningen og forebyggingen av retinopatier, som ROP og RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Derfor er måling av ROS-produksjon i sanntid et kraftig og nyttig verktøy.
Det finnes flere metoder for måling av ROS-produksjon eller oksidativt stress i celler. Blant disse er 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) sonde en av de mest brukte teknikkene for direkte kvantifisering av redokstilstanden til en celle 25,26,27,28. Denne sonden er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusjon av denne sonden over cellemembranen tillater spalting av intracellulære esteraser ved de to esterbindingene, og produserer et relativt polart og cellemembran-ugjennomtrengelig produkt, 2′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). Dette ikke-fluorescerende molekylet akkumuleres intracellulært, og etterfølgende oksidasjon av ROS gir det svært fluorescerende produktet DCF. Oksidasjonen av sonden er produktet av virkningen av flere typer ROS (peroksynitritt, hydroksylradikaler, nitrogenoksid eller peroksider), som kan påvises ved strømningscytometri eller konfokal mikroskopi (utslipp ved 530 nm og eksitasjon ved 485 nm). Begrensningen av denne teknikken er at superoksid og hydrogenperoksid ikke reagerer sterkt med H2DCF25,29. I denne artikkelen bruker vi DCFH-DA-sonde for å måle og kvantifisere ROS ved strømningscytometri. Av den grunn induserer vi ROS-produksjon ved å stimulere MGCer med ROS-induser, A eller B, før vi laster cellene med fluorescerende sonde. I tillegg bruker vi en antioksidantforbindelse. Til slutt viser vi representative og pålitelige data innhentet ved hjelp av denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: For buffersammensetninger, se tabell 1.
1. Forberedelse av cellekultur
MERK: Her beskrives kulturforberedelsene av MIO-M1-celler, en spontant udødeliggjort human Müller glialcellelinje (Moorfields/Institutt for oftalmologi- Müller 1). Bruk alltid riktig aseptisk teknikk og arbeid i en laminær strømningshette.
- Forbered Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) komplett medium. Til DMEM som inneholder 4,5 g/L D-glukose og 110 mg/L natriumpyminert, tilsett 10 % varmeinaktivert FBS, 10 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES), 2 mM L-glutamin og 50 U/ml penicillin/streptomymin. Forbered det friske mediet, den dagen MIO-M1-cellene blir tint.
- Tine de frosne MIO-M1-cellene på dag 1.
- For å gjøre dette, fjern kryoogen som inneholder 5 x 105 MIO-M1-celler i FBS med 10% DMSO fra lagring av flytende nitrogen og legg det umiddelbart i et 37 °C vannbad.
MERK: Bruk alltid munnbind eller vernebriller, siden kryonaler lagret i flytende nitrogen utgjør en eksplosjonsfare når de tines. - Tine MIO-M1-cellene raskt (på mindre enn 1 min) ved å varme opp hetteglasset i vannbadet på 37 °C til det bare er litt is igjen i hetteglasset.
- Tørk av utsiden av hetteglasset med 70% etanol og overfør det til en laminær strømningshette.
- Overfør de tinte cellene fra hetteglasset til et sterilt 15 ml rør og tilsett deretter 6 ml forvarmet komplett DMEM medium dropwise.
- Sentrifuger cellefjæringen ved ca. 600 x g i 5 minutter. Etter sentrifugeringen vil en klar supernatant og en komplett pellet visualiseres. Kast supernatanten med en pipette uten å forstyrre cellepelleten.
- Fjern pelletsen forsiktig og resuspender cellene i 10 ml komplett DMEM-medium. Overfør denne cellefjæringen til en vevskulturplate med en diameter på 100 mm og inkuber platen i ca. 2 dager ved 37 °C, 5 % CO2.
- For å gjøre dette, fjern kryoogen som inneholder 5 x 105 MIO-M1-celler i FBS med 10% DMSO fra lagring av flytende nitrogen og legg det umiddelbart i et 37 °C vannbad.
- Når MIO-M1-cellene blir 80% -90% sammenfallende på dag 4, utfør følgende trinn.
- Overfør platen til en laminær strømningshette fra inkubatoren. Fjern forsiktig supernatanten og vask 2x med 5 ml steril og forvarmet PBS. Aspirer PBS.
- Dispenser 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA-oppløsning og inkuber ved 37 °C i CO 2-inkubatoren i 3-5 minutter for å løsne cellene.
- Tilsett 7 ml av det komplette DMEM-mediet for å hemme trypsin-handlingen. Disaggregate grupperte trypsiniserte MGCer ved å pipetter sakte opp og ned (P1000). Samle celleopphenget i et 15 ml rør.
- Sentrifuge ved 600 x g i 5 min. Kast supernatanten. Resuspend cellepellet forsiktig i 2 ml komplette DMEM-medier. Overfør 1 ml av denne cellefjæringen til en 100 mm plate som inneholder 9 ml forvarmet komplett DMEM-medium.
- Gjenta handlingen med en annen 100 mm plate. Inkuber platen i ca. 1 dag ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator.
- Når begge platene blir 80% -90% konfluensa (på dag 6), overfør platen til en laminær strømningshette. Følg trinn 1.3. for å få en cellepellet.
- Fjern pelletsen forsiktig og resuspender cellene i 5 ml komplette DMEM-medier. Tell MIO-M1-cellene ved hjelp av et hemocytometer (Neubauer-kammer) og prøv den blå løsningen ved å følge trinnene nedenfor.
- Sett glassdekselet på Neubauer-kammerets sentrale område. Plasser kammeret på et flatt underlag (f.eks. et bord eller en arbeidsbenk).
- Bland et likt volum trypan blå flekk med cellene. Bland for eksempel 60 μL trypanblå med 60 μL celler for en 1:2 fortynning.
- Fra denne blandingen, last 10 μL med en mikropipette inn i et Neubauer-kammer.
- Plasser det lastede Neubauer-kammeret på mikroskopstadiet. Slå deretter på lyset og juster lysstyrken.
- Flytt mikroskopstadiet til en optimal posisjon og juster fokuset til et skarpt bilde av cellene er oppnådd.
- Tell cellene inne i de fire rutene (delt inn i 16) som ligger i hjørnet av hemocytometeret (volum: 0,1 mm3 hver ).
- Beregn cellekonsentrasjonen ved hjelp av ligningene nedenfor.
Konsentrasjon = (Antall celler x 10.000)/Antall kvadrater
Konsentrasjon = (Antall celler x 10.000)/4
Konsentrasjon = Antall celler x 2500
MERK: Hvis cellefortynning utføres, bør konsentrasjonen som oppnås konverteres til den opprinnelige konsentrasjonen før fortynning.
Konsentrasjon = (Antall celler x 2500 x 2) = (Antall celler x 5000 celler/ml) - Juster celleopphenget til 1 x 105 celler/ml i komplett DMEM-medium og plate 2 ml av denne celleopphenget til en 6-brønnsplate (2 x 105 celler/brønn). Rist platen forsiktig for å fordele cellene homogent. Inkuber 6-brønnsplaten over natten ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator.
2. Analyseforhold og kontroller
- Inkluder følgende eksperimentelle kontroller for hvert eksperiment:
- Autofluorescence kontroll (celler uten DCFH-DA sonde, kontroll for innstilling av strømning cytometer parametere).
- Basal kontroll (ustimulerte celler).
- Positiv kontroll (celler behandlet med en ROS-induser, A eller B).
- Negativ kontroll (celler behandlet med antioksidantforbindelse)
- Prøve (celler behandlet med antioksidantforbindelse og ROS-induser, A eller B).
3. Utføre analysen
MERK: Analysen utføres på dag 7. Bruk alltid riktig aseptisk teknikk og arbeid i en laminær strømningshette med mindre annet er instruert.
- Forbered lav serum DMEM. Supplement DMEM som inneholder 4,5 g/L D-glukose og 110 mg/L natriumpyromin med 0,5 % varmeinaktivert FBS,10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin og 50 U/ml penicillin/streptomycin. Forbered det friske mediet den dagen MIO-M1 vil bli behandlet.
- Overfør 6-brønnsplaten (60%-70% samløp) til en laminær strømningshette fra inkubatoren. Aspirer supernatanten og vask cellene 1x med PBS. Tilsett 2 ml av det lave serumet DMEM per brønn og inkuber 6-brønnsplaten i 2 timer ved 37 °C, 5 % CO2. Dette gjøres for å sulte cellene.
- Etter serum sulting, behandle cellene med antioksidantforbindelsen i 6 timer.
- Aspirer supernatanten og tilsett 2 ml av den fortynnede bestanden til følgende forhold: negativ kontroll (celler behandlet med antioksidantforbindelse) og prøve (celler behandlet med antioksidantforbindelse og ROS-induser, A eller B).
- Inkuber 6-brønnsplaten i 6 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Hvis du bruker en annen antioksidantforbindelse eller ROS-hemmer, standardiser den optimale tiden og konsentrasjonen for stimuliene.
- Etter 6 timers inkubasjon, behandle cellene med ROS-induser, A eller B, i 30 min.
- Legg stimuliene til følgende forhold: positiv kontroll (celler behandlet med en ROS-induser, A eller B) og prøvebrønner (celler behandlet med antioksidantforbindelse og ROS-induser, A eller B).
MERK: Hold lagerløsningene på is. - Inkuber 6-brønnsplaten i 30 min ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Hvis du bruker en annen ROS-induser, må du standardisere den optimale tiden og konsentrasjonen for stimuliene på riktig måte.
- Legg stimuliene til følgende forhold: positiv kontroll (celler behandlet med en ROS-induser, A eller B) og prøvebrønner (celler behandlet med antioksidantforbindelse og ROS-induser, A eller B).
- Last inn cellene med DCFH-DA-sonden.
- Aspirer supernatanten og vask cellene i 6-brønnsplaten 3x med PBS for å fjerne alle stimuliene.
- Slå av lyset på laminær strømningshette og arbeid i mørket. Forbered en fortynning av 1:1000 av 5 mM DCFH-DA sondelagerløsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 μM DCFH-DA i DMEM uten fenolrød i et 15 ml rør.
- Bland forsiktig ved hjelp av en virvel og tilsett 1 ml av denne løsningen til følgende brønner: basal kontroll (ustimulerte celler), positiv kontroll (celler behandlet med en ROS-induser), negativ kontroll (celler behandlet med antioksidantforbindelse) og prøvebrønner (celler behandlet med antioksidantforbindelse og ROS-induser, A eller B).
- Tilsett 1 ml DMEM uten fenolrød i autofluorescence kontrollceller.
- Inkuber 6-brønnsplaten i 30 min ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Sonden er lysfølsom. Kast all ubrukt sondeløsning.
4. Celleforberedelse for strømningscytometri
- Etter 6 timer, hold platen på is. Fra dette trinnet og fremover er det ikke nødvendig å bruke riktig aseptisk teknikk og jobbe i en laminær strømningshette.
- Vask cellene 3x med 2 ml kald PBS per brønn. Tilsett 0,5 ml kald avløsningsbuffer til hver brønn. Høst cellene ved å pipette forsiktig opp og ned ved hjelp av en P1000 pipette.
- Samle dem i merkede 1,5 ml rør og sentrifuger ved 600 x g i 5 min ved 4 °C.
MERK: Når du høster cellene, unngå bobledannelse ved å sette P1000 pipetten til 0,4 ml. Fra dette trinnet og fremover, arbeid raskt. - Når sentrifugering slutter, legg merkede 1,5 ml rør med cellene på is. Kast supernatanten forsiktig og fjern forsiktig cellepelleten med tapping.
- Tilsett 1 ml FACS-buffer i hvert merket 1,5 ml rør for å vaske cellene. Bruk om nødvendig en virvel med laveste intensitet for fullstendig dissosiasjon av cellepelleten. Sentrifuger dem ved 600 x g i 5 min ved 4 °C. Gjenta disse trinnene 2x mer. (Utfør tre vasker totalt).
- Når den siste vasken slutter, etikett 5 ml rundbunns polystyrenrør (strømningscytometrirør) for alle eksperimentelle forhold (se trinn 2.).
- Når sentrifugering avsluttes, bruker du cellepellets på nytt i 200 μL FACS-buffer. Fjern pelletsen forsiktig i hvert 1,5 ml rør ved hjelp av en virvel. Overfør til merkede 5 ml rundbunnsrør. Hold rørene på is til de analyseres på strømningscytometeret.
5. Datainnsamling i et strømningscytometer
- Bruk flytcytometriprogramvaren til å lage et nytt eksperiment. Dette gjør du ved å gå til Eksperimentere på menylinjen og klikke Nytt eksperiment (Ctrl+E).
- Gå også til Vis på menylinjen, og klikk følgende alternativer: Verktøylinje, Statuslinje, Nettleser, Cytometer, Inspeksjon, Regneark, Anskaffelsesinstrumentbord og Biexponential Editor for å se disse vinduene i arbeidsområdet.
- Klikk Specimen_001 til venstre for programvaren. Dette vil åpne en liste over rør (Tube_001, Tube_002, etc.). Hvis du vil merke rørene for kontrollene og ulike eksperimentelle forhold, dobbeltklikker du Tube_001, Tube_002 osv.
- Velg kanalene/parametrene som skal analyseres (FSC, SSC, FITC og APC eller andre fluorokrom for å se kvadranten) i det første røret fra Cytometer-innstillingene for eksperimentet.
- Klikk på Current Tube Pointer-ikonet for å velge røret, og ikonet endres til grønt. Plasser "autofluorescence control" -røret på aspiratorarmen, og flytt basen forsiktig bare til venstre.
- Hvis du vil kjøre eksemplet "autofluorescence control", går du til vinduet Instrumentbord for anskaffelse og klikker på Hent data. Åpne en prikkplott for FSC (på x-aksen) kontra SSC (på y-aksen).
- Juster fremover- og sidespredningsspenningen raskt for å sikre at hendelsene vises på grafen. Klikk Stopp anskaffelse i vinduet Instrumentbord for anskaffelse. I dette eksperimentet ble følgende spenningsinnstillinger brukt: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
- For å stille inn FITC-spenningen, kjør "positiv kontroll (celler behandlet med en ROS-induser, A eller B)". Juster spenningen slik at alle hendelsene vises på et histogram av FITC. I dette tilfellet, bruk en spenning på 280 V. Klikk Stopp anskaffelse i vinduet Instrumentbord for anskaffelse.
- Plasser igjen "autofluorescence control" -røret på aspiratorarmen. I vinduet Instrumentbord for anskaffelse klikker du på Hent data og deretter Registrer data og velger de ønskede stoppbetingelsene (for eksempel 50 000 hendelser). Tegn en port rundt cellene av interesse, unntatt døde celler og rusk.
MERK: Disse observeres som mye mindre hendelser enn hovedcellepopulasjonen og vises nederst til venstre på plottet. - Når oppkjøpet er avsluttet, fjern røret fra aspiratorarmen. Utstyret vil vaske seg selv. I vinduet Instrumentbord for anskaffelse klikker du Neste rør og kjører Basal-kontrollen (ustimulerte celler). Klikk Hent data og deretter Registrer data.
- Fra den første porten (port som utelukker døde celler og rusk), opprett en annen prikkplott av FITC (på x-aksen) kontra APC (på y-aksen). Tegn en kvadrantport og juster koordinatene for å visualisere hendelsene nederst til venstre i FITC-plottet kontra APC-plottet.
- For å registrere de neste prøvene, fjern røret og klikk på Neste rør > Hent data > Ta opp data.
MERK: Strømningscytometeret som brukes her (se Materialfortegnelser) registrerer maksimalt 1 x 106 hendelser per rør. - Når opptaket av alle rørene er avsluttet, eksporterer du dataene til disk D. Dette gjør du ved å klikke Fil > Eksportere > FCS-filer > Velg 3.0- eller 3.1-versjon.
MERK: Selv om datainnsamling ved hjelp av én programvare (se Materialfortegnelse) er beskrevet i detalj i denne protokollen, kan all annen flytcytometriprogramvare brukes. Anskaffelsesparameterne (FSC, SSC og FITC) kan angis på samme måte for å oppnå resultatene.
6. Analyse av de innhentede dataene
- Åpne programvaren og legg til eksemplene ved hjelp av handlingsknappen Legg til eksempler . Den er plassert på oppgavelinjen eller i Naviger-båndet.
- Klikk Legg til eksempler.
- Bruk filleseren til å navigere til Eksperimentell-mappen.
- Velg Eksperimentell-mappen, og klikk Velg.
MERK: Eksempelfilene lastes inn som en del av gruppen Alle eksempler i arbeidsområdet.
- Dobbeltklikk det første eksemplet i arbeidsområdet: Autofluorescence Control.
MERK: Denne handlingen åpner et Graph-vindu som tegner hendelser langs fremoverspredning (FSC-A på x-aksen) kontra sidespreder (SSC-A på y-aksen) parametere. - Tegn en polygonport for å isolere cellene av interesse, unntatt døde celler og rusk.
- Klikk mangekantportverktøyet .
- Klikk i plottet for å utgjøre polygonporten. Lag så mange sider som nødvendig.
- Dobbeltklikk ved siste punkt for å lukke polygonen og opprette ønsket port.
- Angi et navn for porten, for eksempel "MIO-M1-celler", og trykk OK.
MERK: Et nytt diagramplottvindu viser bare MIO-M1-hendelsene uten døde celler og rusk. - Gjenta med alle prøvene som skal analyseres.
- Endre plottet til et histogram. Dette gjør du ved å klikke parameteretiketten for X-aksen og velge FITC-A. Klikk parameteretiketten Y-akse, og velg Histogram. Dette endrer plottet til et endimensjonalt histogram.
- Legg til statistikk ved hjelp av vinduet Legg til statistikk.
- Klikk Legg til statistikk under histogramdiagrammet. Programmet åpner et nytt statistikkvindu.
- Velg statistikken Geometrisk gjennomsnitt til venstre i det nye vinduet.
- Velg Populasjonen MIO-M 1 celler.
- Velg FIT-C fra listen over tilgjengelige parametere.
- Klikk Legg til for å bruke dem på analysen.
MERK: Dette oppretter den nye statistikken "geometrisk gjennomsnitt: FITC" i prøvetreet, og verdiene deres vises i arbeidsområdet ditt.
- Sett disse geometriske gjennomsnittsverdiene i et statistikkprogram og analyser.
- Klikk L-ikonet for å åpne Oppsettredigering. Dette ikonet er i kategorien Meny i arbeidsområdet. Plasser arbeidsområdevinduet og oppsettredigering side ved side.
MERK: Layout Editor er et separert arbeidsområdevindu med verktøy for å vise flere grafplott og statistikk i en enkel grafisk rapport. Dette kan eksporteres med utvidelsesfilen du foretrekker, som PDF eller JPG, blant andre.- Dra populasjonen MIO-M 1-celler fra gating-treet i et utvalg i arbeidsområdevinduet til Oppsettredigering.
- Kontroller at et histogramdiagram som inneholder hendelsene i porten, vises i Oppsettredigering. Ytterligere grunnleggende informasjon vil bli beskrevet i en tekstboks nedenfor.
- Dra alle eksemplene for å sammenligne dem i samme diagram. Programmet overlapper dem.
- Høyreklikk histogramdiagrammet, og velg Egenskaper. Programmet åpner et nytt Graph Definition -vindu. Dette vinduet har fire faner (Merknad, Skrifter, Forklaring og Angi). Klikk kategorien Angi , og endre y-aksen fra Automatisk til Sperrende. Klikk Bruk.
- Høyreklikk eksemplet, og endre fargelegging, linjestil, linjetykkelse osv.
- Hvis du vil eksportere bildet, klikker du kategorien Fil, og deretter velger du Lagre bilde i Dokument-båndet umiddelbart etter. Velg ønsket type bildefil (f.eks. PDF).
MERK: En lagringsdialogboks åpnes, og du blir bedt om å velge en lagringsplassering. Klikk Lagre.
- Lagre analysen som en arbeidsområdefil (WSP).
- Klikk cytometrianalyseikonet øverst til venstre, og velg Lagre som.
- Velg Lagre som arbeidsområde (WSP) for å lagre dokumentet med data og analyse.
- Skriv inn et navn på arbeidsområdefilen.
- Klikk Lagre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i protokollseksjonen har vi vist representative og kvantitative data som demonstrerer strømningscytometrideteksjon av ROS-produksjon med fluorescenssonden DCFH-DA fra MIO-M1-celler stimulert med ROS-induser, A eller B. Som forventet observerte vi endringer i FITC-fluorescens i ustimulerte celler over autofluorescensnivåer (figur 1A, sammenlign "basal control" vs. "autofluorescence control", dot plots graph). Dette skjedde på grunn av en basal produksjon av ROS i MIO-M1-cellene. (Figur 1B sammenligner du "basal control" vs. "autofluorescence control", histogramgraf).
Interessant nok ble det observert en betydelig økning i FITC-fluorescens da cellene ble stimulert med ROS-induser, A eller B (figur 1B, sammenlign "ROS-induser A" -prøver vs. "basal control" og "ROS inducer B" -prøver vs. "basal control", histogramgraf). Videre, når celler ble behandlet med antioksidantforbindelsen før ROS-induseren, A eller B, ble fluorescensnivået redusert nær basale nivåer (figur 1B, sammenlign "ROS-induser A" vs. "forbehandling med antioksidantforbindelse 6 t + ROS-induser A 30 min", og "ROS-induser B" vs. "forbehandling med antioksidantforbindelse 6 t + ROS-induser B 30 min", histogramgraf). Vær oppmerksom på at det ikke ble observert noen forskjeller i fluorescenssignal i celler behandlet med antioksidantforbindelse (6 h) med hensyn til basal kontroll. (Figur 1B, sammenlign "6h antioksidantforbindelse" vs. "basal kontroll").
Disse resultatene var også tydelige da data ble presentert som det geometriske gjennomsnittet av FITC (figur 1C). Som det fremgår av grafen, er gjennomsnittsverdiene og den tilsvarende standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) angitt.
En viktig fordel med denne protokollen er at programmet følger endringer i ROS over tid. I denne forbindelse har vi kunnet observere en betydelig og tidsavhengig økning i ROS da vi behandlet MIO-M1-celler med ROS-induser C i 2 timer, 4 timer og 6 timer (figur 2).
For optimalisering av denne protokollen har vi forsøkt tre forskjellige strategier for å høste cellene (0,5% trypsin-EDTA, Accutase celleavløsningsløsning og løsrivelsesbuffer) med sammenlignbare resultater (data ikke vist).
Figur 1: Måling av ROS som svar på ROS-induser, A eller B, ved hjelp av DCFH-DA-sonde i MIO-M1-celler: (A) Sammenligning av "basal control" vs. "autofluorescence control"-forhold, representativ prikkplott FL1 (519 nm) vs. FL2 (660 nm). (B) Representative histogrammer for fluorescens indusert av DCFH-DA-sonde ved stimulering av MIO-M1-celler med ROS-induser, A eller B, i 30 min, eller forbehandlet med antioksidantforbindelse i 6 timer og 30 min ROS-induser A, B eller kjøretøy. (C) Geometrisk gjennomsnitt av FITC fluorescens for alle stimuliene i MIO-M1 celler. Data presenteres som gjennomsnittlige ± SEM og analyseres av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts ettertest; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Måling av ROS overtid som svar på ROS-induser C-behandling ved hjelp av DCFH-DA-sonde i MIO-M1-celler: MIO-M1-celler behandlet med ROS-induser C i 2 timer, 4 timer og 6 timer og lastet med DCFH-DA-sonde for å bestemme ROS-nivåer. Representativt histogram for fluorescensintensitet indusert av DCFH-DA-sonde ved stimulering av MIO-M1-celler med ROS-induser C i 2 timer, 4 timer og 6 timer. Geometrisk gjennomsnitt av FITC fluorescens for stimuliene som er beskrevet ovenfor. Data presenteres som gjennomsnittlige ± SEM og analyseres av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts ettertest; ns, ikke signifikant, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Lagringsforhold | Notat | |||||
| Natriumhydroksid (NaOH) 10 M, 1 L | 400 g NaOH pellets | destillert vann til 1 L | RT | "FORSIKTIG": Fremstillingen av en konsentrert NaOH-løsning forårsaker en eksotermisk reaksjon. Det må utvises stor forsiktighet for å unngå kjemiske forbrenninger og brudd på glassbeger. Bruk eventuelt tunge plastbeger. | |||
| Fosfatbufret saltvann (PBS) 10 X, 1 L | 80 g NaCl | destillert vann til 1 L | RT | Juster pH til 7,4 og filtrer løsningen. | |||
| 2 g KCl | |||||||
| 11.5 g Na2HPO4· 7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| Etylendiamin tetraedinsyre (EDTA), 0,5 M pH 8,0, 1 L | 186.1 g Na2EDTA· 2T2O | destillert vann til 1 L | RT | Disodiumsaltet til EDTA er ikke løselig i nøytralt vann eller oppløsning før pH i oppløsningen er justert til ca. 8,0 ved tilsetning av NaOH. Juster pH til 8.0 og steriliser oppløsningen. | |||
| 10% m/v natriumazid (NaN3), 100 ml | 10 g NaN3 | destillert vann til 100 ml | RT | ||||
| Frakoblingsbuffer, 100 ml | 180 mg glukose | PBS 1X til 100 ml | 4 °C | ||||
| 0,6 ml 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| Flow Cytometry-fargebuffer (FACS-buffer), 100 ml | 2 ml foster bovint serum (FBS) | PBS 1X til 100 ml | 4 °C | NaN3 tilsetts som konserveringsmiddel. | |||
| 1 ml 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| 1 ml 10 % m/v natriumazid | |||||||
| 5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 ml | 2,4 mg DCFH-DA | dimetylsulfoksid til 1 ml | -20 °C beskyttet mot lys | Bland forsiktig og aliquot 20 μL i 1,5 ml rør. Unngå flere opptinings-/frysesykluser. Vår anbefaling er å kaste bort all ubrukt sondeløsning fra den eksperimentelle dagen. | |||
| 0,4 % m/v trypan blå 10 X, 50 ml | 0,2 g trypan blå | PBS 1X til 50 ml | 4 °C | ||||
Tabell 1: Bufferoppskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere patologiske tilstander, som kreft, inflammatoriske sykdommer, iskemi/reperfusjon, iskemisk hjertesykdom, diabetes og retinopatier, og også fysiologiske situasjoner som aldring, fører til ROS-overproduksjon 6,7,8,9,10,11. Derfor er deteksjon, måling og forståelse av banen som er involvert i modulering av ROS viktige mål for mange sykdommer. Bruken av sonder for å måle ROS-nivåer, som DCFH-DA, er tilgjengelig, allment beskrevet og akseptert i den vitenskapelige litteraturen 26,27,28. I denne artikkelen beskriver vi en detaljert og reproduserbar protokoll for å måle og kvantifisere ROS-nivåer ved strømningscytometri i MGCer.
En fordel med bruken av denne metoden er at når DCFH-DA-sonden er oksidert av ROS og genererer et fluorescerende DCF-produkt; Dette kan måles i en plateleser, konfokalt mikroskop eller strømningscytometer. Ulempen med plateleseren er at den måler total fluorescens. Følgelig skiller plateleseren ikke den intracellulære fluorescensen fra den ekstracellulære som genereres av kjemiske reaksjoner i kulturmediet. Konfokal mikroskopi er et nyttig verktøy fordi celler kan lastes med DCFH-DA-sonde og vises i sanntid i kulturkamre ved 37 °C. Morfologien og plasseringen av ROS i cellen kan oppdages med denne metoden, men ROS-nivåer mangler en kvantitativ måling. Styrken av strømningcytometri ligger i dens evne til å måle intracellulær fluorescens i levende celler. Kvantitative data om antall celler som avgir fluorescens, samt de geometriske fluorescensmidlene, kan oppnås25.
Det er viktig å ta hensyn til hva som faktisk måles ved bruk av DCFH-DA-sonde. Som vi tidligere nevnte, måler DCFH-DA flere ROS-arter, og fluorescens som følge av den grønne sonden kan ikke brukes til å diskriminere mellom typer ROS-arter29. I denne forbindelse er det kjent at forskjellige sonder kan skjelne typen ROS. For eksempel oksideres dihydroethidium (DHE) sonde av superoksid for å gi det fluorescerende produktet 2-hydroksyethidium (eksitasjon ved 518 nm og utslipp ved 605 nm), men dette produktet kan ikke skilles uten bruk av mer tidkrevende teknikker, for eksempel HPLC30,31. En annen sonde er en mitokondrie superoksid indikator (se Tabell over materialer), som er en ny fluorogen sonde for svært selektiv deteksjon av superoksid i mitokondrier av levende celler31,32. Men for måling av totale ROS-nivåer og økning i ROS etter en fornærmelse eller evaluering av antioksidantevnen til forskjellige produkter, er bruken av DCFH-DA-sonde sammen med de aktuelle kontrollene praktisk og akseptabel 25,28,29.
Et svært viktig problem er valg og bruk av riktige eksperimentelle kontroller: autofluorescence control (celler uten DCFH-DA-sonde), basalkontroll (ustigulerte celler), positiv kontroll (celler behandlet med EN ROS-induser), negativ kontroll (celler behandlet med antioksidantforbindelse) og prøveproblem (celler behandlet med antioksidantforbindelse og ROS-induser). Et nyttig tips er å bruke medium uten fenolrød for å redusere interferens med fluorescerende sonder.
Vi anbefaler også å laste inn celler med DCFH-DA-sonden 30 min før du fullfører den eksperimentelle behandlingen. Standardisering av konsentrasjonen av DCFH-DA, i vårt tilfelle 5 μM, er praktisk og kan variere avhengig av celletype og celleaktiveringsstatus. Vårt råd er å sette opp sondekonsentrasjonene, fra 5μM og 10 μM, og sjekke effekten av fargingen i forsøkene.
Oppsummert er analyse av redoksbalanse i helse eller sykdom avgjørende for å etablere pålitelige metoder for å måle oksidativ stressrespons. Derfor er denne protokollen et enkelt, raskt og kraftig verktøy for å kvantifisere ROS-nivåer i levende MGCer ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke María Pilar Crespo og Paula Alejandra Abadie fra CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjelp i flytcytometri og Gabriela Furlan og Noelia Maldonado for hjelp til cellekultur. Vi takker også Victor Diaz (pro-sekretær for institusjonell kommunikasjon av FCQ) for videoproduksjon og redigering.
Denne artikkelen ble finansiert av tilskudd fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) og Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle til M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
