Summary
Nous proposons ici un protocole systématisé, accessible et reproductible pour détecter les espèces réactives cellulaires de l’oxygène (ROS) à l’aide d’une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). Cette méthode quantifie les niveaux de ROS cellulaires totaux à l’aide d’un cytomètre en flux. Ce protocole est très facile à utiliser, adapté et reproductible.
Abstract
L’équilibre redox joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. La génération accrue d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) favorise la modification des protéines, des lipides et de l’ADN, ce qui peut finalement entraîner une altération de la fonction cellulaire et la mort cellulaire. Par conséquent, il est bénéfique pour les cellules d’augmenter leur défense antioxydante en réponse à des insultes préjudiciables, soit en activant une voie antioxydante comme Keap1 / Nrf2 ou en améliorant les piégeurs redox (vitamines A, C et E, β-carotène et polyphénols, entre autres). L’inflammation et le stress oxydatif sont impliqués dans la pathogenèse et la progression des rétinopathies, telles que la rétinopathie diabétique (DR) et la rétinopathie du prématuré (ROP). Étant donné que les cellules gliales de Müller (MGC) jouent un rôle clé dans l’homéostasie du tissu rétinien neural, elles sont considérées comme un modèle idéal pour étudier ces mécanismes de protection cellulaire. En ce sens, quantifier les niveaux de ROS avec une méthode reproductible et simple est essentiel pour évaluer la contribution des voies ou des molécules qui participent au mécanisme de défense cellulaire antioxydant. Dans cet article, nous fournissons une description complète des procédures requises pour la mesure des ROS avec la sonde DCFH-DA et la cytométrie en flux dans les MGC. Les étapes clés pour le traitement des données de cytométrie en flux avec le logiciel sont fournies ici, afin que les lecteurs puissent mesurer les niveaux de ROS (moyens géométriques de FITC) et analyser les histogrammes de fluorescence. Ces outils sont très utiles pour évaluer non seulement l’augmentation des ROS après une insulte cellulaire, mais aussi pour étudier l’effet antioxydant de certaines molécules qui peuvent fournir un effet protecteur sur les cellules.
Introduction
La rétine neurale est un tissu très organisé qui présente des couches neuronales bien définies. Dans ceux-ci, les neurones (cellules ganglionnaires, amacrines, bipolaires, horizontales et photoréceptrices) sont interconnectés les uns aux autres ainsi qu’aux cellules gliales de Müller (MGC) et aux astrocytes, ce qui conduit à une phototransduction et à un traitement adéquats de l’information visuelle 1,2. Les MGC sont connus pour avoir un rôle important dans le maintien de l’homéostasie rétinienne car ils traversent toute la section rétinienne et, par conséquent, ils peuvent interagir avec tous les types de cellules qui modulent de multiples processus de protection. Il a été rapporté que les MGC ont plusieurs fonctions importantes pour le maintien et la survie des neurones rétiniens, y compris la glycolyse pour fournir de l’énergie aux neurones, l’élimination des déchets neuronaux, le recyclage des neurotransmetteurs et la libération de facteurs neurotrophiques, entre autres 3,4,5.
D’autre part, l’inflammation, le stress oxydatif et nitrosatif sont impliqués dans la pathogenèse et la progression de nombreuses maladies humaines, y compris les rétinopathies 6,7,8,9,10,11. L’équilibre redox dans les cellules dépend d’une régulation stricte des niveaux de ROS. Les ROS sont constamment générés dans des conditions physiologiques à la suite de la respiration aérobie principalement. Les principaux membres de la famille ROS comprennent les radicaux libres réactifs tels que l’anion superoxyde (O2͘͘͘͘•−), les radicaux hydroxyles (•OH), divers peroxydes (ROOR′), les hydroperoxydes (ROOH) et le peroxyde d’hydrogène sans radical (H2O2)12,13. Au cours des dernières années, il est devenu évident que les ROS jouent un rôle de signalisation important dans les cellules en contrôlant les processus essentiels. Les MGC ont une forte défense antioxydante par l’activation du facteur nucléaire transcriptionnel érythroïde-2-lié au facteur 2 (Nrf2) et l’expression ultérieure de protéines antioxydantes pour éliminer la production excessive de ROS dans des conditions pathologiques 14,15,16. Lorsque les cellules perdent leur équilibre redox en raison d’une production exagérée de ROS ou d’une capacité défectueuse à éliminer les ROS, l’accumulation de stress oxydatif favorise des modifications nocives dans les protéines, les lipides et l’ADN, entraînant un stress cellulaire ou la mort. L’augmentation du système de défense antioxydant rétinien améliore la résolution et la prévention des rétinopathies, telles que ROP et RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Par conséquent, la mesure de la production de ROS en temps réel est un outil puissant et utile.
Il existe plusieurs méthodes pour mesurer la production de ROS ou le stress oxydatif dans les cellules. Parmi celles-ci, la sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) est l’une des techniques les plus largement utilisées pour quantifier directement l’état redox d’une cellule 25,26,27,28. Cette sonde est lipophile et non fluorescente. La diffusion de cette sonde à travers la membrane cellulaire permet son clivage par des estérases intracellulaires au niveau des deux liaisons ester, produisant un produit relativement polaire et imperméable à la membrane cellulaire, la 2′,7′-dichlorofluorescéine (H2DCF). Cette molécule non fluorescente s’accumule intracellulairement, et l’oxydation ultérieure par ROS donne le produit hautement fluorescent DCF. L’oxydation de la sonde est le produit de l’action de plusieurs types de ROS (peroxynitrite, radicaux hydroxyles, oxyde nitrique ou peroxydes), qui peuvent être détectés par cytométrie en flux ou microscopie confocale (émission à 530 nm et excitation à 485 nm). La limite de cette technique est que le superoxyde et le peroxyde d’hydrogène ne réagissent pas fortement avecH2DCF 25,29. Dans cet article, nous utilisons la sonde DCFH-DA pour mesurer et quantifier les ROS par cytométrie en flux. Pour cette raison, nous induisons la production de ROS en stimulant les MGC avec un inducteur ROS, A ou B, avant de charger les cellules avec la sonde fluorescente. De plus, nous utilisons un composé antioxydant. Enfin, nous montrons des données représentatives et fiables obtenues à l’aide de ce protocole.
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Protocol
REMARQUE : Pour les compositions tampons, voir le tableau 1.
1. Préparation de la culture cellulaire
REMARQUE: Décrit ici est la préparation de culture de cellules MIO-M1, une lignée cellulaire gliale de Müller humaine spontanément immortalisée (Moorfield’s / Institut d’ophtalmologie - Müller 1). Utilisez toujours une technique aseptique appropriée et travaillez dans une hotte à écoulement laminaire.
- Préparez le milieu complet modifié Eagle’s medium (DMEM) de Dulbecco. Pour le DMEM contenant 4,5 g/L de D-glucose et 110 mg/L de pyruvate de sodium, ajouter 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES), 2 mM de L-glutamine et 50 U/mL de pénicilline/streptomycine. Préparez le milieu frais, le jour où les cellules MIO-M1 seront décongelées.
- Décongelez les cellules MIO-M1 congelées le jour 1.
- Pour ce faire, retirez le cryovial contenant 5 x 105 cellules MIO-M1 dans FBS avec 10% de DMSO du stockage d’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie à 37 ° C.
REMARQUE: Portez toujours un masque facial ou des lunettes de sécurité, car les cryoviaux stockés dans l’azote liquide présentent un risque d’explosion lorsqu’ils sont décongelés. - Décongeler les cellules MIO-M1 rapidement (en moins de 1 min) en réchauffant le flacon dans le bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit peu de glace dans le flacon.
- Essuyez l’extérieur du flacon avec 70% d’éthanol et transférez-le dans une hotte à écoulement laminaire.
- Transférer les cellules décongelées du flacon dans un tube stérile de 15 mL, puis ajouter 6 mL de milieu DMEM complet préchauffé goutte à goutte.
- Centrifuger la suspension de la cellule à environ 600 x g pendant 5 min. Après la centrifugation, un surnageant clair et une pastille complète seront visualisés. Jetez le surnageant avec une pipette sans déranger la pastille de cellule.
- Dissocier délicatement la pastille et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu DMEM complet. Transférer cette suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire de 100 mm de diamètre et incuber la plaque pendant environ 2 jours à 37 °C, 5 % de CO2.
- Pour ce faire, retirez le cryovial contenant 5 x 105 cellules MIO-M1 dans FBS avec 10% de DMSO du stockage d’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie à 37 ° C.
- Lorsque les cellules MIO-M1 deviennent confluentes à 80% à 90% le jour 4, effectuez les étapes suivantes.
- Transférer la plaque dans une hotte à flux laminaire à partir de l’incubateur. Retirez soigneusement le surnageant et lavez 2x avec 5 mL de PBS stérile et préchauffé. Aspirez le PBS.
- Distribuer 1 mL de solution de trypsine-EDTA à 0,5 % et incuber à 37 °C dans l’incubateur à CO2 pendant 3 à 5 min pour détacher les cellules.
- Ajouter 7 mL du milieu DMEM complet pour inhiber l’action de la trypsine. Désagréger les MGC trypsinisés groupés en pipetant lentement de haut en bas (P1000). Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
- Centrifuger à 600 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant. Remettez doucement en suspension la pastille de cellule dans 2 mL de milieu DMEM complet. Transférer 1 mL de cette suspension cellulaire dans une plaque de 100 mm contenant 9 mL de milieu DMEM complet préchauffé.
- Répétez l’action avec une autre plaque de 100 mm. Incuber la plaque pendant environ 1 jour à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2.
- Lorsque les deux plaques deviennent confluentes à 80% à 90% (le jour 6), transférez la plaque dans une hotte à flux laminaire. Suivez l’étape 1.3. pour obtenir une pastille de cellule.
- Dissocier délicatement la pastille et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu DMEM complet. Comptez les cellules MIO-M1 à l’aide d’un hémocytomètre (chambre de Neubauer) et d’une solution de bleu de trypan en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez le couvercle en verre sur la zone centrale de la chambre Neubauer. Placez la chambre sur une surface plane (p. ex., une table ou un établi).
- Mélanger un volume égal de tache bleue de trypan avec les cellules. Par exemple, mélanger 60 μL de bleu de trypan avec 60 μL de cellules pour une dilution de 1:2.
- À partir de ce mélange, chargez 10 μL avec une micropipette dans une chambre Neubauer.
- Placez la chambre Neubauer chargée sur l’étage du microscope. Ensuite, allumez la lumière et ajustez la luminosité.
- Déplacez l’étage du microscope dans une position optimale et ajustez la mise au point jusqu’à ce qu’une image nette des cellules soit obtenue.
- Compter les cellules à l’intérieur des quatre carrés (subdivisés en 16) situés au coin de l’hémocytomètre (volume: 0,1 mm3 chacun).
- Calculez la concentration cellulaire à l’aide des équations ci-dessous.
Concentration = (Nombre de cellules x 10.000)/Nombre de carrés
Concentration = (Nombre de cellules x 10.000)/4
Concentration = Nombre de cellules x 2500
REMARQUE: Si une dilution cellulaire est effectuée, la concentration obtenue doit être convertie à la concentration d’origine avant la dilution.
Concentration = (Nombre de cellules x 2500 x 2) = (Nombre de cellules x 5000 cellules/mL) - Ajuster la suspension cellulaire à 1 x 105 cellules/mL en milieu DMEM complet et plaquer 2 mL de cette suspension cellulaire dans une plaque à 6 puits (2 x 105 cellules/puits). Agiter doucement la plaque pour répartir les cellules de manière homogène. Incuber la plaque de 6 puits pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2.
2. Conditions d’analyse et contrôles
- Inclure les contrôles expérimentaux suivants pour chaque expérience :
- Contrôle de l’autofluorescence (cellules sans sonde DCFH-DA, contrôle pour régler les paramètres du cytomètre en flux).
- Contrôle basal (cellules non stimulées).
- Contrôle positif (cellules traitées avec un inducteur ROS, A ou B).
- Contrôle négatif (cellules traitées avec un composé antioxydant)
- Échantillon (cellules traitées avec un composé antioxydant et un inducteur ROS, A ou B).
3. Effectuer le test
REMARQUE: Le test est effectué le jour 7. Utilisez toujours la bonne technique aseptique et travaillez dans une hotte à écoulement laminaire, sauf indication contraire.
- Préparer un DMEM à faible teneur en sérum. Supplément DMEM contenant 4,5 g/L de D-glucose et 110 mg/L de pyruvate de sodium avec 0,5 % de FBS inactivé par la chaleur, 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamine et 50 U/mL de pénicilline/streptomycine. Préparez le milieu frais le jour où le MIO-M1 sera traité.
- Transférer la plaque à 6 puits (confluence de 60 % à 70 %) dans une hotte à écoulement laminaire à partir de l’incubateur. Aspirer le surnageant et laver les cellules 1x avec PBS. Ajouter 2 mL de DMEM à faible teneur en sérum par puits et incuber la plaque à 6 puits pendant 2 h à 37 °C, soit 5 % de CO2. Ceci est fait pour affamer les cellules.
- Après la famine sérique, traiter les cellules avec le composé antioxydant pendant 6 h.
- Aspirer le surnageant et ajouter 2 mL de la matière diluée aux conditions suivantes : contrôle négatif (cellules traitées avec un composé antioxydant) et échantillon (cellules traitées avec un composé antioxydant et un inducteur ROS, A ou B).
- Incuber la plaque à 6 puits pendant 6 h à 37 °C, 5 % de CO2.
REMARQUE: Si vous utilisez un autre composé antioxydant ou un inhibiteur des ROS, normalisez le temps et la concentration optimaux pour les stimuli.
- Après 6 h d’incubation, traiter les cellules avec un inducteur ROS, A ou B, pendant 30 min.
- Ajouter les stimuli aux conditions suivantes: contrôle positif (cellules traitées avec un inducteur ROS, A ou B) et puits d’échantillonnage (cellules traitées avec un composé antioxydant et un inducteur ROS, A ou B).
REMARQUE: Gardez les solutions mères sur la glace. - Incuber la plaque de 6 puits pendant 30 min à 37 °C, 5% de CO2.
REMARQUE: Si vous utilisez un autre inducteur ROS, standardisez correctement le temps et la concentration optimaux pour les stimuli.
- Ajouter les stimuli aux conditions suivantes: contrôle positif (cellules traitées avec un inducteur ROS, A ou B) et puits d’échantillonnage (cellules traitées avec un composé antioxydant et un inducteur ROS, A ou B).
- Chargez les cellules avec la sonde DCFH-DA.
- Aspirez le surnageant et lavez les cellules dans la plaque à 6 puits 3x avec PBS pour éliminer tous les stimuli.
- Éteignez la lumière de la hotte à flux laminaire et travaillez dans l’obscurité. Préparer une dilution de 1:1000 de la solution mère de sonde DCFH-DA de 5 mM pour obtenir une concentration finale de 5 μM de DCFH-DA dans le DMEM sans rouge de phénol dans un tube de 15 mL.
- Mélanger doucement à l’aide d’un vortex et ajouter 1 mL de cette solution aux puits suivants : contrôle basal (cellules non stimulées), contrôle positif (cellules traitées avec un inducteur ROS), contrôle négatif (cellules traitées avec un composé antioxydant) et puits d’échantillonnage (cellules traitées avec un composé antioxydant et inducteur ROS, A ou B).
- Ajouter 1 mL de DMEM sans rouge phénol aux cellules de contrôle de l’autofluorescence.
- Incuber la plaque de 6 puits pendant 30 min à 37 °C, 5% de CO2.
REMARQUE: La sonde est sensible à la lumière. Jetez toute la solution de sonde inutilisée.
4. Préparation cellulaire pour la cytométrie en flux
- Après 6 h, conserver l’assiette sur la glace. À partir de cette étape, il n’est pas nécessaire d’utiliser une technique aseptique appropriée et de travailler dans une hotte à flux laminaire.
- Lavez les cellules 3x avec 2 mL de PBS froid par puits. Ajouter 0,5 mL de tampon de détachement à froid à chaque puits. Récoltez les cellules en piquant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette P1000.
- Collectez-les dans des tubes étiquetés de 1,5 mL et centrifugez-les à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
REMARQUE: Lors de la récolte des cellules, évitez la formation de bulles en réglant la pipette P1000 à 0,4 mL. À partir de cette étape, travaillez vite. - À la fin de la centrifugation, mettez des tubes marqués de 1,5 mL avec les cellules sur de la glace. Jetez soigneusement le surnageant et dissociez doucement la pastille de cellule en tapotant.
- Ajouter 1 mL de tampon FACS à chaque tube étiqueté de 1,5 mL pour laver les cellules. Si nécessaire, utilisez un vortex à son intensité la plus faible pour la dissociation complète de la pastille cellulaire. Centrifugez-les à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Répétez ces étapes 2 fois plus. (Effectuez trois lavages au total).
- À la fin du dernier lavage, étiqueter des tubes en polystyrène à fond rond de 5 mL (tubes de cytométrie en flux) pour toutes les conditions expérimentales (voir l’étape 2.
- Lorsque la centrifugation se termine, remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 200 μL de tampon FACS. Dissocier doucement la pastille dans chaque tube de 1,5 mL à l’aide d’un vortex. Transférer dans des tubes à fond rond étiquetés de 5 mL. Gardez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient analysés sur le cytomètre en flux.
5. Acquisition de données dans un cytomètre en flux
- À l’aide du logiciel de cytométrie en flux, créez une nouvelle expérience. Pour ce faire, dans la barre de menus, accédez à Expérience et cliquez sur Nouvelle expérience (Ctrl+E).
- En outre, dans la barre de menus, accédez à Affichage et cliquez sur les options suivantes : Barre d’outils, Barre d’état, Navigateur, Cytomètre, Inspecteur, Feuille de calcul, Tableau de bord d’acquisition et Éditeur biexponentiel pour afficher ces fenêtres dans l’espace de travail.
- Sur la gauche du logiciel, cliquez sur le Specimen_001 . Cela ouvrira une liste de tubes (Tube_001, Tube_002, etc.). Pour étiqueter les tubes pour les commandes et les différentes conditions expérimentales, double-cliquez sur Tube_001, Tube_002, etc. et renommez-les (voir étape 2.).
- Sélectionnez les canaux/paramètres à analyser (FSC, SSC, FITC et APC ou tout autre fluorochrome pour voir le quadrant) dans le premier tube à partir des paramètres du cytomètre de l’expérience.
- Cliquez sur l’icône Pointeur du tube actuel pour sélectionner le tube, et l’icône passera au vert. Placez le tube « contrôle d’autofluorescence » sur le bras de l’aspirateur, en déplaçant soigneusement la base uniquement vers la gauche.
- Pour exécuter l’exemple « contrôle d’autofluorescence », accédez à la fenêtre Tableau de bord d’acquisition et cliquez sur Acquérir des données. Ouvrez un diagramme à points pour FSC (sur l’axe des x) par rapport à SSC (sur l’axe des y).
- Ajustez rapidement la tension de diffusion vers l’avant et latérale afin de vous assurer que les événements apparaissent sur le graphique. Dans la fenêtre Tableau de bord d’acquisition, cliquez sur Arrêter l’acquisition. Dans cette expérience, les paramètres de tension suivants ont été utilisés: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
- Pour régler la tension FITC, exécutez le « contrôle positif (cellules traitées avec un inducteur ROS, A ou B) ». Ajustez la tension pour que tous les événements apparaissent sur un histogramme de FITC. Dans ce cas, utilisez une tension de 280 V. Dans la fenêtre Tableau de bord d’acquisition, cliquez sur Arrêter l’acquisition.
- Placez à nouveau le tube « contrôle d’autofluorescence » sur le bras de l’aspirateur. Dans la fenêtre Tableau de bord d’acquisition, cliquez sur Acquérir des données, puis sur Enregistrer les données, puis sélectionnez les conditions d’arrêt souhaitées (par exemple, 50 000 événements). Dessinez une porte autour des cellules d’intérêt, en excluant les cellules mortes et les débris.
REMARQUE: Ceux-ci sont observés comme des événements beaucoup plus petits que la population cellulaire principale et apparaissent en bas à gauche du graphique. - Lorsque l’acquisition se termine, retirez le tube du bras de l’aspirateur. L’équipement se lavera tout seul. Dans la fenêtre Tableau de bord d’acquisition, cliquez sur Tube suivant et exécutez le contrôle Basal (cellules non stimulées). Cliquez sur Acquérir des données , puis sur Enregistrer des données.
- À partir de la porte initiale (porte qui exclut les cellules mortes et les débris), créez un autre diagramme à points de FITC (sur l’axe des x) par rapport à APC (sur l’axe des y). Dessinez une porte de quadrant et ajustez les coordonnées afin de visualiser les événements sur le quadrant inférieur gauche du diagramme FITC par rapport au diagramme APC.
- Pour enregistrer les échantillons suivants, retirez le tube et cliquez sur Tube suivant > Acquérir des données > Enregistrer des données.
REMARQUE: Le cytomètre de flux utilisé ici (voir tableau des matériaux) enregistre un maximum de 1 x 106 événements par tube. - Lorsque l’enregistrement de tous les tubes se termine, exportez les données sur le disque D. Pour ce faire, cliquez sur Fichier > Exporter > fichiers FCS > Sélectionnez la version 3.0 ou 3.1.
REMARQUE: Bien que l’acquisition de données à l’aide d’un logiciel (voir tableau des matériaux) soit décrite en détail dans ce protocole, tout autre logiciel de cytométrie en flux peut être utilisé. Les paramètres d’acquisition (FSC, SSC et FITC) peuvent être réglés de la même manière pour obtenir les résultats.
6. Analyse des données acquises
- Ouvrez le logiciel et ajoutez les exemples à l’aide du bouton d’action Ajouter des exemples ; il se trouve dans la barre des tâches ou dans la bande de navigation.
- Cliquez sur Ajouter des exemples.
- À l’aide de l’explorateur de fichiers, accédez au dossier Expérimental.
- Sélectionnez le dossier Expérimental et cliquez sur Choisir.
Remarque : Les fichiers d’exemple se chargent dans le cadre du groupe « Tous les exemples » dans l’espace de travail.
- Double-cliquez sur le premier exemple de l’espace de travail : Contrôle de la fluorescence automatique.
Remarque : cette action ouvre une fenêtre Graphique traçant les événements le long des paramètres de dispersion directe (FSC-A sur l’axe des x) par rapport aux paramètres de dispersion latérale (SSC-A sur l’axe des y). - Dessinez une porte polygonale pour isoler les cellules d’intérêt, en excluant les cellules mortes et les débris.
- Cliquez sur l’outil Polygon Gate .
- Cliquez dans le tracé pour créer la porte du polygone. Faites autant de côtés que nécessaire.
- Double-cliquez au dernier point pour fermer le polygone et créer la porte souhaitée.
- Indiquez un nom pour la porte, tel que « Cellules MIO-M1 », puis appuyez sur OK.
REMARQUE : Une nouvelle fenêtre de tracé graphique s’affiche affichant uniquement les événements MIO-M1 sans cellules mortes ni débris. - Répétez avec tous les échantillons à analyser.
- Remplacez le tracé par un histogramme. Pour ce faire, cliquez sur l’étiquette du paramètre de l’axe X et sélectionnez FITC-A. Cliquez sur l’étiquette du paramètre de l’axe Y et sélectionnez Histogramme. Cela change le tracé en un histogramme unidimensionnel.
- Ajouter des statistiques à l’aide de la fenêtre Ajouter des statistiques.
- Sous le graphique d’histogramme, cliquez sur Ajouter des statistiques. Le programme ouvrira une nouvelle fenêtre statistique.
- À gauche de la nouvelle fenêtre, sélectionnez les statistiques Moyenne géométrique.
- Sélectionnez les cellules Population MIO-M 1.
- Dans la liste des paramètres disponibles, sélectionnez FIT-C.
- Cliquez sur le bouton Ajouter pour les appliquer à l’analyse.
REMARQUE : Cela crée les nouvelles statistiques « moyenne géométrique : FITC » dans l’exemple d’arborescence de contrôle, et leurs valeurs sont affichées dans votre espace de travail.
- Mettez ces valeurs moyennes géométriques dans un programme de statistiques et analysez..
- Cliquez sur l’icône L pour ouvrir l’éditeur de mise en page ; cette icône se trouve dans l’onglet Menu de l’espace de travail. Placez la fenêtre Espace de travail et l’Éditeur de mise en page côte à côte.
REMARQUE: L’éditeur de mise en page est une fenêtre d’espace de travail séparée avec des outils permettant d’afficher plusieurs graphiques et statistiques dans un rapport graphique simple. Cela peut être exporté avec le fichier d’extension que vous préférez, comme PDF ou JPG, entre autres.- À partir de l’arborescence de contrôle d’un exemple dans la fenêtre Espace de travail, faites glisser la population de cellules MIO-M 1 dans l’éditeur de mise en page.
- Assurez-vous qu’un histogramme contenant les événements dans la porte s’affiche dans l’éditeur de mise en page. Des informations de base supplémentaires seront détaillées dans une zone de texte ci-dessous.
- Faites glisser tous les échantillons pour les comparer dans le même graphique. Le programme les chevauchera.
- Cliquez avec le bouton droit sur le graphique d’histogramme et sélectionnez Propriétés. Le programme ouvrira une nouvelle fenêtre De définition de graphique. Cette fenêtre comporte quatre onglets (Annoter, Polices, Légende et Spécifier). Cliquez sur l’onglet Spécifier et modifiez l’axe des y de Auto à Modal. Cliquez sur Appliquer.
- Cliquez avec le bouton droit sur l’exemple et modifiez la coloration, le style de ligne, le poids de la ligne, etc. pour personnaliser le graphique.
- Pour exporter l’image, cliquez sur l’onglet Fichier et, immédiatement après, sélectionnez Enregistrer l’image dans la bande Document. Choisissez le type de fichier image préféré (par exemple, PDF).
Remarque : Une boîte de dialogue d’enregistrement s’ouvre, vous invitant à sélectionner un emplacement d’enregistrement. Cliquez sur Enregistrer.
- Enregistrez l’analyse en tant que fichier d’espace de travail (.wsp).
- Dans le coin supérieur gauche, cliquez sur l’icône Analyse de cytométrie et sélectionnez Enregistrer sous.
- Choisissez Enregistrer en tant qu’espace de travail (WSP) pour enregistrer le document avec des données et des analyses.
- Entrez un nom pour le fichier d’espace de travail.
- Cliquez sur Enregistrer.
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Representative Results
Comme décrit dans la section du protocole, nous avons montré des données représentatives et quantitatives démontrant la détection par cytométrie en flux de la production de ROS avec la sonde de fluorescence DCFH-DA à partir de cellules MIO-M1 stimulées par un inducteur ROS, A ou B. Comme prévu, nous avons observé des changements dans la fluorescence fitc dans les cellules non stimulées au-dessus des niveaux d’autofluorescence (Figure 1A, comparer « contrôle basal » vs « contrôle autofluorescence », graphique à points). Cela s’est produit en raison d’une production basale de ROS dans les cellules MIO-M1. (Figure 1B, comparer « contrôle basal » vs « contrôle d’autofluorescence », histogramme).
Fait intéressant, une augmentation significative de la fluorescence FITC a été observée lorsque les cellules ont été stimulées avec un inducteur ROS, A ou B (Figure 1B, comparer les échantillons « inducteur ROS A » vs « contrôle basal » et « inducteur ROS B » vs « contrôle basal », histogramme). De plus, lorsque les cellules ont été traitées avec le composé antioxydant avant l’inducteur ROS, A ou B, le niveau de fluorescence a diminué près des niveaux basaux (Figure 1B, comparer « inducteur ROS A » vs « prétraitement avec composé antioxydant 6 h + inducteur ROS A 30 min », et « inducteur ROS B » vs « prétraitement avec composé antioxydant 6 h + inducteur ROS B 30 min », respectivement, histogramme). Il convient de noter qu’aucune différence dans le signal de fluorescence n’a été observée dans les cellules traitées avec un composé antioxydant (6 h) en ce qui concerne le contrôle basal. (Figure 1B, comparer « composé antioxydant 6h » vs « contrôle basal »).
Ces résultats étaient également clairement évidents lorsque les données étaient présentées comme la moyenne géométrique du FITC (figure 1C). Comme on peut le voir sur le graphique, les valeurs moyennes et l’erreur-type correspondante de la moyenne (MEB) sont indiquées.
Un avantage clé de ce protocole est son application pour suivre les changements dans ROS au fil du temps. À cet égard, nous avons pu observer une augmentation significative et dépendante du temps des ROS lorsque nous avons traité des cellules MIO-M1 avec l’inducteur C des ROS pendant 2 h, 4 h et 6 h (Figure 2).
Pour optimiser ce protocole, nous avons tenté trois stratégies différentes pour récolter les cellules (0,5% de trypsine-EDTA, solution de détachement de cellules Accutase et tampon de détachement) avec des résultats comparables (données non présentées).
Figure 1 : Mesure des ROS en réponse à l’inducteur ros, A ou B, à l’aide d’une sonde DCFH-DA dans des cellules MIO-M1 : (A) Comparaison des conditions de « contrôle basal » vs « contrôle d’autofluorescence », diagramme représentatif FL1 (519 nm) vs FL2 (660 nm). (B) Histogrammes représentatifs de la fluorescence induite par la sonde DCFH-DA lors de la stimulation des cellules MIO-M1 avec un inducteur ROS, A ou B, pendant 30 min, ou prétraitées avec un composé antioxydant pendant 6 h et 30 min d’inducteur ROS A, B ou véhicule. (C) Moyenne géométrique de la fluorescence FITC pour tous les stimuli dans les cellules MIO-M1. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM et analysées par une ANOVA unidirectionnelle suivie du post-test de Dunnett; **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mesure des heures supplémentaires de ROS en réponse au traitement de l’inducteur de ROS C à l’aide d’une sonde DCFH-DA dans des cellules MIO-M1 : cellules MIO-M1 traitées avec un inducteur ROS C pendant 2 h, 4 h et 6 h et chargées d’une sonde DCFH-DA pour déterminer les niveaux de ROS. Histogramme représentatif de l’intensité de fluorescence induite par la sonde DCFH-DA lors de la stimulation des cellules MIO-M1 avec l’inducteur ROS C pendant 2 h, 4 h et 6 h. Moyenne géométrique de la fluorescence FITC pour les stimuli détaillés ci-dessus. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM et analysées par une ANOVA unidirectionnelle suivie du post-test de Dunnett; ns, non significatif, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution | Conditions de stockage | Note | |||||
| Hydroxyde de sodium (NaOH) 10 M, 1 L | 400 g de granulés de NaOH | eau distillée à 1 L | RT | « ATTENTION »: La préparation d’une solution concentrée de NaOH provoque une réaction exothermique. Une extrême prudence doit être prise pour éviter les brûlures chimiques et la rupture des béchers en verre. Si possible, utilisez des béchers en plastique lourds. | |||
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10 X, 1 L | 80 g de NaCl | eau distillée à 1 L | RT | Ajustez le pH à 7,4 et filtrez la solution. | |||
| 2 g de KCl | |||||||
| 11,5 g Na2HPO4· 7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| Acide tétraacétique d’éthylènediamine (EDTA), 0,5 M pH 8,0, 1 L | 186,1 g Na2EDTA· 2H2O | eau distillée à 1 L | RT | Le sel disodique de l’EDTA n’est pas soluble dans de l’eau neutre ou une solution jusqu’à ce que le pH de la solution soit ajusté à environ 8,0 par l’ajout de NaOH. Ajuster le pH à 8,0 et stériliser la solution. | |||
| 10 % p/v d’azoture de sodium (NaN3), 100 mL | 10 g de NaN3 | eau distillée à 100 mL | RT | ||||
| Tampon de détachement, 100 mL | 180 mg de glucose | PBS 1X à 100 mL | 4 °C | ||||
| 0,6 mL 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| Tampon de coloration par cytométrie en flux (tampon FACS), 100 mL | 2 mL de sérum fœtal bovin (FBS) | PBS 1X à 100 mL | 4 °C | NaN3 est ajouté comme agent de conservation. | |||
| 1 mL 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| 1 mL 10 % p/v d’azoture de sodium | |||||||
| 5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 mL | 2,4 mg de DCFH-DA | sulfoxyde de diméthyle à 1 mL | -20 °C à l’abri de la lumière | Mélanger doucement et aliquoter 20 μL dans des tubes de 1,5 mL. Évitez les cycles de dégel/congélation multiples. Notre recommandation est d’éliminer toutes les solutions de sonde inutilisées du jour expérimental. | |||
| 0,4 % p/v bleu trypan 10 X, 50 mL | 0,2 g de bleu trypan | PBS 1X à 50 mL | 4 °C | ||||
Tableau 1 : Recettes tampons
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Discussion
Plusieurs conditions pathologiques, telles que le cancer, les maladies inflammatoires, l’ischémie / reperfusion, les cardiopathies ischémiques, le diabète et les rétinopathies, ainsi que des situations physiologiques comme le vieillissement, conduisent à une surproduction de ROS 6,7,8,9,10,11. Par conséquent, la détection, la mesure et la compréhension de la voie impliquée dans la modulation des ROS sont des cibles importantes pour de nombreuses maladies. L’utilisation de sondes pour mesurer les niveaux de ROS, comme le DCFH-DA, est accessible, largement décrite et acceptée dans la littérature scientifique 26,27,28. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé et reproductible pour mesurer et quantifier les niveaux de ROS par cytométrie en flux dans les MGC.
Un avantage de l’utilisation de cette méthode est que, une fois que la sonde DCFH-DA est oxydée par ROS et génère un produit DCF fluorescent; cela peut être mesuré dans un lecteur de plaques, un microscope confocal ou un cytomètre en flux. L’inconvénient du lecteur de plaques est qu’il mesure la fluorescence totale. Par conséquent, le lecteur de plaques ne distingue pas la fluorescence intracellulaire de la fluorescence extracellulaire générée par les réactions chimiques dans le milieu de culture. La microscopie confocale est un outil utile car les cellules peuvent être chargées avec une sonde DCFH-DA et visualisées en temps réel dans des chambres de culture à 37 ° C. La morphologie et l’emplacement des ROS dans la cellule peuvent être détectés avec cette méthodologie, mais les niveaux de ROS manquent d’une mesure quantitative. La force de la cytométrie en flux réside dans sa capacité à mesurer la fluorescence intracellulaire dans les cellules vivantes. Des données quantitatives sur le nombre de cellules émettant de la fluorescence, ainsi que sur les moyens géométriques de fluorescence, peuvent être obtenues25.
Il est important de prendre en compte ce qui est réellement mesuré lors de l’utilisation de la sonde DCFH-DA. Comme nous l’avons mentionné précédemment, le DCFH-DA mesure plusieurs espèces de ROS, de sorte que la fluorescence résultant de la sonde verte ne peut pas être utilisée pour discriminer entre les types d’espèces de ROS29. À cet égard, on sait que différentes sondes peuvent discerner le type de ROS. Par exemple, la sonde de dihydroéthidium (DHE) est oxydée par le superoxyde pour produire le produit fluorescent 2-hydroxyéthidium (excitation à 518 nm et émission à 605 nm), mais ce produit ne peut être distingué sans l’utilisation de techniques plus chronophages, telles que HPLC 30,31. Une autre sonde est un indicateur de superoxyde mitochondrial (voir Tableau des matériaux), qui est une nouvelle sonde fluorogénique pour la détection hautement sélective du superoxyde dans les mitochondries des cellules vivantes31,32. Cependant, aux fins de la mesure des niveaux totaux de ROS et des augmentations de ROS après une insulte ou de l’évaluation de la capacité antioxydante de différents produits, l’utilisation de la sonde DCFH-DA aux côtés des contrôles appropriés est pratique et acceptable 25,28,29.
Une question très importante est la sélection et l’utilisation de contrôles expérimentaux appropriés: contrôle de l’autofluorescence (cellules sans sonde DCFH-DA), contrôle basal (cellules non stimulées), contrôle positif (cellules traitées avec un inducteur ROS), contrôle négatif (cellules traitées avec un composé antioxydant) et problème d’échantillon (cellules traitées avec un composé antioxydant et un inducteur ROS). Un conseil utile est d’utiliser un milieu sans rouge phénol pour réduire les interférences avec les sondes fluorescentes.
Nous recommandons également de charger les cellules avec la sonde DCFH-DA 30 minutes avant de terminer le traitement expérimental. La normalisation de la concentration de DCFH-DA, dans notre cas 5 μM, est pratique et peut différer en fonction du type de cellule et de l’état d’activation cellulaire. Notre conseil est de mettre en place les concentrations de la sonde, à partir de 5μM et 10 μM, et de vérifier l’efficacité de la coloration dans les expériences.
En résumé, l’analyse de l’équilibre redox dans la santé ou la maladie est essentielle pour établir des méthodes fiables pour mesurer la réponse au stress oxydatif. Par conséquent, ce protocole est un outil simple, rapide et puissant pour quantifier les niveaux de ROS dans les MGC vivants par cytométrie en flux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier María Pilar Crespo et Paula Alejandra Abadie du CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentine) pour leur aide en cytométrie en flux et Gabriela Furlan et Noelia Maldonado pour leur aide à la culture cellulaire. Nous remercions également Victor Diaz (Pro-Secrétaire à la Communication Institutionnelle de la FCQ) pour la production et le montage vidéo.
Cet article a été financé par des subventions de Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), et Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (tous à M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
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