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Neuroscience

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का परिमाणीकरण 2', 7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe और Müller Glial कोशिकाओं में फ्लो-साइटोमेट्री का उपयोग करके

Published: May 13, 2022 doi: 10.3791/63337
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

Summary

यहां, हम सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए एक व्यवस्थित, सुलभ और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जो मुलर ग्लियाल कोशिकाओं (एमजीसी) में 2', 7'-डाइक्लोरोफ्लोरोरेसीन डायसीटेट प्रोब (डीसीएफएच-डीए) का उपयोग करते हैं। यह विधि एक प्रवाह साइटोमीटर के साथ कुल सेलुलर आरओएस स्तरों को निर्धारित करती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए बहुत आसान है, उपयुक्त है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य.

Abstract

सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में रेडॉक्स संतुलन की एक महत्वपूर्ण भूमिका है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की बढ़ी हुई पीढ़ी प्रोटीन, लिपिड और डीएनए के संशोधन को बढ़ावा देती है, जो अंततः सेलुलर फ़ंक्शन और सेल मृत्यु में परिवर्तन का कारण बन सकती है। इसलिए, हानिकारक अपमान के जवाब में कोशिकाओं के लिए अपने एंटीऑक्सिडेंट रक्षा को बढ़ाने के लिए फायदेमंद है, या तो Keap1 / Nrf2 जैसे एंटीऑक्सिडेंट मार्ग को सक्रिय करके या रेडॉक्स स्कैवेंजर्स (विटामिन ए, सी, और ई, β-कैरोटीन, और पॉलीफेनोल्स, दूसरों के बीच) में सुधार करके। सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव रोगजनन और रेटिनोपैथी की प्रगति में शामिल हैं, जैसे कि मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) और रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी (आरओपी)। चूंकि मुलर ग्लियाल कोशिकाएं (एमजीसी) तंत्रिका रेटिना ऊतक के होमोस्टैसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, इसलिए उन्हें इन सेलुलर सुरक्षात्मक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल माना जाता है। इस अर्थ में, एक पुनरुत्पादक और सरल विधि के साथ आरओएस स्तरों को परिमाणित करना एंटीऑक्सिडेंट सेल रक्षा तंत्र में भाग लेने वाले मार्गों या अणुओं के योगदान का आकलन करने के लिए आवश्यक है। इस लेख में, हम MGCs में DCFH-DA जांच और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ ROS के माप के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का पूरा विवरण प्रदान करते हैं। सॉफ़्टवेयर के साथ प्रवाह साइटोमेट्री डेटा प्रोसेसिंग के लिए महत्वपूर्ण चरण यहां प्रदान किए गए हैं, इसलिए पाठक ROS स्तरों (FITC के ज्यामितीय साधन) को मापने और प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम का विश्लेषण करने में सक्षम होंगे। ये उपकरण न केवल एक सेलुलर अपमान के बाद आरओएस में वृद्धि का मूल्यांकन करने के लिए अत्यधिक सहायक हैं, बल्कि कुछ अणुओं के एंटीऑक्सिडेंट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी हैं जो कोशिकाओं पर सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

तंत्रिका रेटिना एक बहुत ही संगठित ऊतक है जो अच्छी तरह से परिभाषित न्यूरोनल परतों को प्रस्तुत करता है। इनमें, न्यूरॉन्स (गैंग्लियन, एमेक्राइन, द्विध्रुवी, क्षैतिज और फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं) एक-दूसरे से जुड़े हुए हैं और मुलर ग्लियाल कोशिकाओं (एमजीसी) और एस्ट्रोसाइट्स के साथ भी, जिससे पर्याप्त फोटोट्रांसडक्शन और दृश्य जानकारी 1,2 का प्रसंस्करण होता है। एमजीसी को रेटिना होमोस्टैसिस के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है क्योंकि वे पूरे रेटिना अनुभाग को पार करते हैं और इस प्रकार, वे सभी सेल प्रकारों के साथ बातचीत कर सकते हैं जो कई सुरक्षात्मक प्रक्रियाओं को संशोधित करते हैं। यह बताया गया है कि एमजीसी में रेटिना न्यूरॉन्स के रखरखाव और अस्तित्व के लिए कई महत्वपूर्ण कार्य हैं, जिनमें न्यूरॉन्स को ऊर्जा प्रदान करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस, न्यूरोनल कचरे को हटाना, न्यूरोट्रांसमीटर का पुनर्चक्रण, और न्यूरोट्रॉफिक कारकों की रिहाई शामिल है, दूसरों के बीच 3,4,5।

दूसरी ओर, सूजन, ऑक्सीडेटिव और नाइट्रोसेटिव तनाव कई मानव बीमारियों के रोगजनन और प्रगति में शामिल हैं, जिसमें रेटिनोपैथी 6,7,8,9,10,11 शामिल हैं। कोशिकाओं में रेडॉक्स संतुलन आरओएस स्तरों के तंग विनियमन पर निर्भर करता है। आरओएस मुख्य रूप से एरोबिक श्वसन के परिणामस्वरूप शारीरिक परिस्थितियों में लगातार उत्पन्न होते हैं। ROS परिवार के प्रमुख सदस्यों में प्रतिक्रियाशील मुक्त कण जैसे सुपरऑक्साइड अनियन (O2π•−), हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स (•OH), विभिन्न पेरोक्साइड (ROOR'), हाइड्रोपेरोक्साइड (ROOH), और कोई कट्टरपंथी हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2)12,13 शामिल हैं। पिछले वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि आरओएस आवश्यक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करके कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग भूमिका निभाता है। MGCs transcriptional परमाणु कारक के सक्रियण द्वारा एक मजबूत एंटीऑक्सिडेंट रक्षा है- 2 से संबंधित कारक 2 (Nrf2) और एंटीऑक्सीडेंट प्रोटीन के बाद की अभिव्यक्ति रोग की स्थिति 14,15,16 के तहत आरओएस के अत्यधिक उत्पादन को खत्म करने के लिए। जब कोशिकाएं आरओएस के अतिरंजित उत्पादन या आरओएस को हटाने की दोषपूर्ण क्षमता के कारण अपने रेडॉक्स संतुलन को खो देती हैं, तो ऑक्सीडेटिव तनाव का संचय प्रोटीन, लिपिड और डीएनए में हानिकारक संशोधनों को बढ़ावा देता है, जिससे सेलुलर तनाव या मृत्यु हो जाती है। रेटिना एंटीऑक्सिडेंट रक्षा प्रणाली की वृद्धि रेटिनोपैथी के संकल्प और रोकथाम में सुधार करती है, जैसे कि आरओपी और आरडी 17,18,19,20,21,22,23,24। इसलिए, वास्तविक समय में आरओएस उत्पादन का माप एक शक्तिशाली और उपयोगी उपकरण है।

कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन या ऑक्सीडेटिव तनाव को मापने के लिए कई तरीके हैं। इनमें से, 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) जांच सीधे सेल 25,26,27,28 के रेडॉक्स राज्य को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक है। यह जांच लिपोफिलिक और गैर-फ्लोरोसेंट है। सेल झिल्ली के पार इस जांच का प्रसार दो एस्टर बांडों पर इंट्रासेल्युलर एस्टेरेस द्वारा अपनी दरार की अनुमति देता है, जो अपेक्षाकृत ध्रुवीय और सेल झिल्ली-अपारगम्य उत्पाद, 2′, 7′-डाइक्लोरोफ्लोरोरेससीन (एच2डीसीएफ) का उत्पादन करता है। यह गैर-फ्लोरोसेंट अणु इंट्रासेल्युलर रूप से जमा होता है, और आरओएस द्वारा बाद में ऑक्सीकरण अत्यधिक फ्लोरोसेंट उत्पाद डीसीएफ उत्पन्न करता है। जांच का ऑक्सीकरण कई प्रकार के आरओएस (पेरोक्सिनिट्रिटाइट, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स, नाइट्रिक ऑक्साइड, या पेरोक्साइड) की कार्रवाई का उत्पाद है, जिसे फ्लो साइटोमेट्री या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (530 एनएम पर उत्सर्जन और 485 एनएम पर उत्तेजना) द्वारा पता लगाया जा सकता है। इस तकनीक की सीमा यह है कि सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड एच 2 डीसीएफ25,29 के साथ दृढ़ता से प्रतिक्रिया नहीं करते हैं। इस लेख में, हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा आरओएस को मापने और मापने के लिए डीसीएफएच-डीए जांच का उपयोग करते हैं। उस कारण से, हम ROS प्रेरक, ए या बी के साथ MGCs को उत्तेजित करके ROS उत्पादन को प्रेरित करते हैं, जो फ्लोरोसेंट जांच के साथ कोशिकाओं को लोड करने के लिए पिछले है। इसके अलावा, हम एक एंटीऑक्सिडेंट यौगिक का उपयोग करते हैं। अंत में, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि और विश्वसनीय डेटा दिखाते हैं।

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Protocol

नोट:: बफ़र रचनाओं के लिए तालिका 1 देखें।

1. सेल संस्कृति तैयारी

नोट: यहां वर्णित एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं की संस्कृति की तैयारी है, जो एक अनायास अमर मानव मुलर ग्लियाल सेल लाइन (मूरफील्ड / इंस्टीट्यूट ऑफ ऑप्थाल्मोलॉजी- मुलर 1) है। हमेशा उचित एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करें और एक लैमिनर प्रवाह हुड में काम करें।

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) पूर्ण माध्यम तैयार करें। 4.5 ग्राम / एल डी-ग्लूकोज और 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट युक्त डीएमईएम के लिए, 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, 10 एमएम 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथिल) -1-पाइपरिजीनइथेनेसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 50 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें। ताजा माध्यम तैयार करें, जिस दिन एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं को पिघलाया जाएगा।
  2. दिन 1 पर जमे हुए MIO-M1 कोशिकाओं को पिघलाएं।
    1. ऐसा करने के लिए, तरल नाइट्रोजन भंडारण से 10% डीएमएसओ के साथ एफबीएस में 5 x 105 एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं वाले क्रायोवियल को हटा दें और तुरंत इसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
      नोट: हमेशा एक फेस मास्क या सुरक्षा चश्मे पहनें, क्योंकि तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत क्रायोवियल्स पिघलने पर विस्फोट का खतरा पेश करते हैं।
    2. एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं को तेजी से पिघलाएं (1 मिनट से भी कम समय में) 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी को गर्म करके जब तक कि शीशी में बर्फ का एक छोटा सा हिस्सा नहीं बचा है।
    3. 70% इथेनॉल के साथ शीशी के बाहर पोंछें और इसे एक लैमिनर प्रवाह हुड में स्थानांतरित करें।
    4. शीशी से पिघली हुई कोशिकाओं को एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और फिर पूर्व-गर्म पूर्ण DMEM माध्यम ड्रॉपवाइज के 6 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. 5 मिनट के लिए लगभग 600 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। centrifugation के बाद, एक स्पष्ट supernatant और एक पूर्ण गोली कल्पना की जाएगी। सेल गोली परेशान किए बिना एक पिपेट के साथ supernatant त्याग.
    6. धीरे से गोली को अलग करें और पूर्ण DMEM माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इस सेल निलंबन को 100 मिमी व्यास के ऊतक संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर लगभग2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. जब MIO-M1 कक्ष 80%-90% confluent दिन 4 पर हो जाते हैं, तो निम्न चरणों का पालन करें।
    1. प्लेट को इनक्यूबेटर से एक लैमिनर प्रवाह हुड में स्थानांतरित करें। ध्यान से supernatant निकालें और बाँझ और पूर्व गर्म PBS के 5 mL के साथ 2x धोना। PBS Aspirate.
    2. 0.5% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1 मिलीलीटर को वितरित करें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 3-5 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. ट्रिप्सिन क्रिया को बाधित करने के लिए पूर्ण DMEM माध्यम के 7 mL जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे pipetting (P1000) द्वारा संकुल ट्रिप्सिनाइज्ड MGCs disaggregate. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए।
    4. 5 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज। supernatant को छोड़ दें। धीरे से पूर्ण DMEM मीडिया के 2 mL में सेल गोली resuspend. इस सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर को 100 मिमी प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें 9 एमएल पूर्व-गर्म पूर्ण डीएमईएम माध्यम शामिल हैं।
    5. एक और 100 मिमी प्लेट के साथ कार्रवाई को दोहराएं। एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 दिन के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. जब दोनों प्लेटें 80% -90% confluent (दिन 6 पर) बन जाती हैं, तो प्लेट को एक लैमिनर प्रवाह हुड में स्थानांतरित करें। चरण 1.3 का पालन करें। एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए।
  5. धीरे से गोली को अलग करें और पूर्ण डीएमईएम मीडिया के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक hemocytometer (Neubauer कक्ष) और trypan नीले समाधान नीचे दिए गए चरणों का पालन करके का उपयोग कर MIO-M1 कोशिकाओं की गणना करें।
    1. Neubauer कक्ष केंद्रीय क्षेत्र पर ग्लास कवर रखो. कक्ष को एक सपाट सतह पर रखें (उदाहरण के लिए, एक मेज या वर्कबेंच)।
    2. कोशिकाओं के साथ ट्राइपैन नीले दाग की एक समान मात्रा मिलाएं। उदाहरण के लिए, 1: 2 कमजोर पड़ने के लिए कोशिकाओं के 60 μL के साथ ट्राइपैन नीले रंग के 60 μL को मिलाएं।
    3. इस मिश्रण से, एक Neubauer कक्ष में एक micropipette के साथ 10 μL लोड करें।
    4. माइक्रोस्कोप मंच पर लोड Neubauer कक्ष जगह. फिर, प्रकाश को चालू करें और चमक को समायोजित करें।
    5. माइक्रोस्कोप चरण को एक इष्टतम स्थिति में ले जाएं और कोशिकाओं की एक तेज छवि प्राप्त होने तक फोकस को समायोजित करें।
    6. हेमोसाइटोमीटर (मात्रा: 0.1 मिमी3 प्रत्येक) के कोने में स्थित चार वर्गों (16 में उपविभाजित) के अंदर कोशिकाओं की गणना करें।
    7. नीचे दिए गए समीकरणों का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें।
      सांद्रता = (कक्षों की संख्या x 10.000)/वर्गों की संख्या
      सांद्रता = (कोशिकाओं की संख्या x 10.000)/4
      सांद्रता = कोशिकाओं की संख्या x 2500
      नोट:: यदि सेल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन किया जाता है, तो प्राप्त एकाग्रता को कमजोर पड़ने से पहले मूल एकाग्रता में कनवर्ट किया जाना चाहिए।
      सांद्रता = (कक्षों की संख्या x 2500 x 2) = (कक्षों की संख्या x 5000 कोशिकाओं/mL)
    8. पूर्ण DMEM माध्यम में सेल निलंबन को 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल और प्लेट 2 एमएल में समायोजित करें इस सेल निलंबन को 6-अच्छी तरह से प्लेट (2 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से)। कोशिकाओं को सजातीय रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं। 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 °C पर रात भर में 6-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें।

2. परख शर्तों और नियंत्रण

  1. प्रत्येक प्रयोग के लिए निम्न प्रयोगात्मक नियंत्रण शामिल करें:
    1. Autofluorescence नियंत्रण (DCFH-DA जांच के बिना कोशिकाएं, प्रवाह साइटोमीटर पैरामीटर सेट करने के लिए नियंत्रण)।
    2. बेसल नियंत्रण (unstimulated कोशिकाओं)।
    3. सकारात्मक नियंत्रण (एक आरओएस प्रेरक, ए या बी के साथ इलाज कोशिकाएं)।
    4. नकारात्मक नियंत्रण (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ इलाज कोशिकाएं)
    5. नमूना (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक और आरओएस प्रेरक, ए या बी के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं)।

3. परख प्रदर्शन

नोट: परख दिन 7 पर प्रदर्शन किया जाता है. हमेशा उचित एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करें और एक लैमिनर प्रवाह हुड में काम करें जब तक कि अन्यथा निर्देश न दिया जाए।

  1. कम सीरम DMEM तैयार करें। पूरक DMEM जिसमें 4.5 g/ L D-glucose और 110 mg/L सोडियम पाइरूवेट होता है, जिसमें 0.5% हीट-इनएक्टिवेटेड FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, और 50 U/mL पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है। जिस दिन एमआईओ-एम1 का इलाज किया जाएगा, उस दिन ताजा माध्यम तैयार करें।
  2. इनक्यूबेटर से एक लैमिनर प्रवाह हुड के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट (60% -70% संगम) स्थानांतरित करें। supernatant aspirate और पीबीएस के साथ कोशिकाओं 1x धोना। अच्छी तरह से प्रति कम सीरम DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 2 ज के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें। यह कोशिकाओं को भूखा रखने के लिए किया जाता है।
  3. सीरम भूख से मरने के बाद, 6 घंटे के लिए एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    1. supernatant aspirate और निम्नलिखित स्थितियों के लिए पतला स्टॉक के 2 मिलीलीटर जोड़ें: नकारात्मक नियंत्रण (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ इलाज कोशिकाओं) और नमूना (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक और आरओएस inducer, ए या बी के साथ इलाज कोशिकाओं)।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 6 घंटे के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि किसी अन्य एंटीऑक्सिडेंट यौगिक या आरओएस अवरोधक का उपयोग कर रहे हैं, तो उत्तेजनाओं के लिए इष्टतम समय और एकाग्रता को मानकीकृत करें।
  4. इनक्यूबेशन के 6 घंटे के बाद, 30 मिनट के लिए आरओएस इनड्यूसर, ए या बी के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    1. निम्नलिखित स्थितियों में उत्तेजनाओं को जोड़ें: सकारात्मक नियंत्रण (आरओएस प्रेरक, ए या बी के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं) और नमूना कुओं (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक और आरओएस प्रेरक, ए या बी के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं)।
      नोट: स्टॉक समाधान को बर्फ पर रखें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 30 मिनट के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि किसी अन्य ROS inducer का उपयोग कर रहे हैं, तो ठीक से उत्तेजनाओं के लिए इष्टतम समय और एकाग्रता मानकीकृत करें।
  5. DCFH-DA जांच के साथ कक्षों को लोड करें।
    1. supernatant aspirate और सभी उत्तेजनाओं को हटाने के लिए PBS के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट 3x में कोशिकाओं को धोलें।
    2. लैमिनर प्रवाह हुड की रोशनी को बंद करें और अंधेरे में काम करें। 15 mL ट्यूब में फिनोल लाल के बिना DMEM में 5 μM DCFH-DA की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 5 mM DCFH-DA जांच स्टॉक समाधान के 1:1000 का एक कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
    3. एक भंवर का उपयोग करके धीरे से मिलाएं और निम्नलिखित कुओं में इस समाधान का 1 मिलीलीटर जोड़ें: बेसल नियंत्रण (अउत्तेजित कोशिकाएं), सकारात्मक नियंत्रण (आरओएस प्रेरक के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं), नकारात्मक नियंत्रण (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं), और नमूना कुओं (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं, और आरओएस प्रेरक, ए या बी)।
    4. autofluorescence नियंत्रण कोशिकाओं के लिए फिनोल लाल के बिना DMEM के 1 mL जोड़ें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 30 मिनट के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: जांच प्रकाश संवेदनशील है। सभी अप्रयुक्त प्रोब समाधान को छोड़ दें।

4. प्रवाह cytometry के लिए सेल तैयारी

  1. 6 घंटे के बाद, प्लेट को बर्फ पर रखें। इस कदम के बाद से, उचित एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करना और लैमिनर फ्लो हुड में काम करना आवश्यक नहीं है।
  2. कोशिकाओं को अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस के साथ 3x धोएं। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ठंडा detaching बफर के 0.5 mL जोड़ें। धीरे से एक P1000 पिपेट का उपयोग कर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं फसल.
  3. उन्हें लेबल 1.5 mL ट्यूबों में ले लीजिए और 4 °C पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट:: जब कोशिकाओं की कटाई, 0.4 mL करने के लिए P1000 पिपेट सेट करके बुलबुला गठन से बचें। इस कदम से आगे, तेजी से काम करें।
  4. जब सेंट्रीफ्यूजेशन समाप्त हो जाता है, तो बर्फ पर कोशिकाओं के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों को लेबल करें। supernatant ध्यान से त्यागें और धीरे दोहन के साथ सेल गोली अलग.
  5. कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए FACS बफर के 1 mL जोड़ें। यदि आवश्यक हो, तो सेल पैलेट के पूर्ण पृथक्करण के लिए अपनी सबसे कम तीव्रता पर एक भंवर का उपयोग करें। उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। इन चरणों को 2x अधिक दोहराएँ। (कुल मिलाकर तीन वॉश करें)।
  6. जब अंतिम वॉश समाप्त होता है, तो सभी प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए 5 मिलीलीटर राउंड-बॉटम पॉलीस्टीरीन ट्यूब (फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब) को लेबल करें (चरण 2 देखें)।
  7. जब centrifugation समाप्त होता है, FACS बफर के 200 μL में सेल छर्रों resuspend. धीरे से एक भंवर का उपयोग करके प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में गोली को अलग करें। लेबल 5 एमएल राउंड-बॉटम ट्यूबों को स्थानांतरित करें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें जब तक कि वे प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण नहीं कर रहे हैं।

5. एक प्रवाह साइटोमीटर में डेटा अधिग्रहण

  1. प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक नया प्रयोग बनाएँ. ऐसा करने के लिए, मेनू बार में प्रयोग पर जाएँ और नया प्रयोग (Ctrl+E) क्लिक करें.
  2. इसके अलावा, मेनू पट्टी में, देखें पर जाएँ और निम्न विकल्पों पर क्लिक करें: कार्यस्थान में इन विंडो को देखने के लिए उपकरण पट्टी, स्थिति पट्टी, ब्राउज़र, साइटोमीटर, इंस्पेक्टर, कार्यपत्रक, अधिग्रहण डैशबोर्ड और द्विघातात्मक संपादक .
  3. सॉफ़्टवेयर के बाईं ओर, Specimen_001 क्लिक करें. यह ट्यूबों की एक सूची खोलेगा (Tube_001, Tube_002, आदि)। नियंत्रण और विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए ट्यूबों को लेबल करने के लिए, Tube_001, Tube_002, आदि को डबल-क्लिक करें और उनका नाम बदलें (चरण 2 देखें.).
  4. प्रयोग की साइटोमीटर सेटिंग्स से पहली ट्यूब में विश्लेषण किए जाने वाले चैनलों / मापदंडों का चयन करें (FSC, SSC, FITC, और APC या किसी अन्य fluorochrome को चतुर्भुज देखने के लिए)
  5. ट्यूब का चयन करने के लिए वर्तमान ट्यूब पॉइंटर आइकन पर क्लिक करें, और आइकन हरे रंग में बदल जाएगा। एस्पिरेटर बांह पर "ऑटोफ्लोरेसेंस कंट्रोल" ट्यूब रखें, आधार को ध्यान से केवल बाईं ओर ले जाएं।
    1. "autofluorescence नियंत्रण" नमूना को चलाने के लिए, अधिग्रहण डैशबोर्ड विंडो पर जाएँ और डेटा प्राप्त करेंक्लिक करें। FSC (x-अक्ष पर) बनाम SSC (y-अक्ष पर) के लिए एक डॉट प्लॉट खोलें।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि घटनाएं ग्राफ पर दिखाई देती हैं, आगे और साइड स्कैटर वोल्टेज को जल्दी से समायोजित करें। अधिग्रहण डैशबोर्ड विंडो में, प्राप्त करना बंद करें क्लिक करें. इस प्रयोग में, निम्नलिखित वोल्टेज सेटिंग्स का उपयोग किया गया था: एफएससी - 200 वी, एसएससी - 423 वी।
  6. FITC वोल्टेज सेट करने के लिए, "सकारात्मक नियंत्रण (एक ROS inducer, A या B के साथ इलाज कोशिकाओं)" चलाएँ। वोल्टेज को समायोजित करें ताकि सभी घटनाएं FITC के हिस्टोग्राम पर दिखाई दें। इस मामले में, 280 वोल्ट के वोल्टेज का उपयोग करें। अधिग्रहण डैशबोर्ड विंडो में, प्राप्त करना बंद करें क्लिक करें.
  7. Aspirator हाथ पर फिर से "autofluorescence नियंत्रण" ट्यूब जगह. अधिग्रहण डैशबोर्ड विंडो में, डेटा प्राप्त करें क्लिक करें, फिर डेटा रिकॉर्ड करें, और इच्छित स्टॉप शर्तों (उदाहरण के लिए, 50,000 ईवेंट्स) का चयन करें. मृत कोशिकाओं और मलबे को छोड़कर, ब्याज की कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट खींचें।
    नोट:: ये मुख्य सेल जनसंख्या की तुलना में बहुत छोटी घटनाओं के रूप में मनाया जाता है और प्लॉट के निचले बाईं ओर दिखाई देते हैं।
  8. जब अधिग्रहण समाप्त हो जाता है, तो एस्पिरेटर हाथ से ट्यूब को हटा दें। उपकरण खुद को धो लेंगे। अधिग्रहण डैशबोर्ड विंडो में, अगला ट्यूब क्लिक करें और बेसल नियंत्रण (अउत्साहित कक्ष) चलाएँ. डेटा प्राप्त करें क्लिक करें और तब डेटा रिकॉर्ड करें.
    1. प्रारंभिक गेट (गेट जो मृत कोशिकाओं और मलबे को बाहर करता है) से, FITC का एक और डॉट प्लॉट बनाएं (एक्स-अक्ष पर) बनाम एपीसी (y-अक्ष पर)। एक चतुर्भुज गेट ड्रा और FITC बनाम APC प्लॉट के निचले बाएँ चतुर्थांश पर घटनाओं की कल्पना करने के लिए निर्देशांक को समायोजित करें।
  9. अगले नमूने रिकॉर्ड करने के लिए, ट्यूब निकालें और डेटा रिकॉर्ड डेटा > प्राप्त > अगला ट्यूब क्लिक करें.
    नोट: यहां उपयोग किया जाने वाला प्रवाह साइटोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) प्रति ट्यूब अधिकतम 1 x 106 घटनाओं को रिकॉर्ड करता है।
  10. जब सभी ट्यूबों की रिकॉर्डिंग समाप्त हो जाती है, तो डेटा को डिस्क डी पर निर्यात करें। ऐसा करने के लिए फ़ाइल > निर्यात > FCS फ़ाइलें > 3.0 या 3.1 संस्करण का चयन करें क्लिक करें।
    नोट: यद्यपि एक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण ( सामग्री की तालिका देखें) इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित है, किसी भी अन्य प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। अधिग्रहण पैरामीटर (FSC, SSC, और FITC) परिणाम प्राप्त करने के लिए उसी तरह से सेट किया जा सकता है।

6. अधिग्रहीत डेटा का विश्लेषण

  1. सॉफ़्टवेयर खोलें और नमूने जोड़ें क्रिया बटन का उपयोग करके नमूने जोड़ें ; यह कार्यपट्टी पर या नेविगेट बैंड में स्थित है।
    1. क्लिक करें,नमूने जोड़ें.
    2. फ़ाइल ब्राउज़र का उपयोग करके, प्रयोगात्मक फ़ोल्डर पर नेविगेट करें.
    3. प्रयोगात्मक फ़ोल्डर का चयन करें और चुनेंक्लिक करें।
      नोट:: नमूना फ़ाइलें कार्यस्थान में "सभी नमूने" समूह के भाग के रूप में लोड।
  2. कार्यस्थान में पहला नमूना डबल-क्लिक करें: स्वत: प्रतिदीप्ति नियंत्रण।
    नोट:: यह क्रिया आगे स्कैटर (X-अक्ष पर FSC-A) बनाम साइड स्कैटर (SSC-A y-अक्ष पर) पैरामीटर के साथ ईवेंट प्लॉटिंग एक ग्राफ विंडो खोलता है।
  3. मृत कोशिकाओं और मलबे को छोड़कर, ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक बहुभुज गेट खींचें।
    1. बहुभुज गेट उपकरण पर क्लिक करें।
    2. बहुभुज गेट बनाने के लिए प्लॉट के भीतर क्लिक करें। जितनी जरूरत हो उतने पक्ष बनाएं।
    3. बहुभुज को बंद करने और वांछित गेट बनाने के लिए अंतिम बिंदु पर डबल-क्लिक करें।
    4. गेट के लिए कोई नाम प्रदान करें, जैसे "MIO-M1 कक्ष", और ठीक दबाएँ.
      नोट:: एक नया ग्राफ़ प्लॉट विंडो केवल MIO-M1 इवेंट मृत कक्षों और मलबे के बिना प्रदर्शित प्रकट होता है।
    5. विश्लेषण करने के लिए सभी नमूनों के साथ दोहराएँ।
  4. प्लॉट को हिस्टोग्राम में बदलें। ऐसा करने के लिए, X अक्ष पैरामीटर लेबल क्लिक करें और FITC-A का चयन करें. Y अक्ष पैरामीटर लेबल क्लिक करें और हिस्टोग्राम का चयन करें. यह प्लॉट को एक-आयामी हिस्टोग्राम में बदल देता है।
  5. आँकड़े जोड़ें विंडो का उपयोग कर आँकड़े जोड़ें।
    1. हिस्टोग्राम ग्राफ़ के नीचे, आँकड़े जोड़ें क्लिक करें. कार्यक्रम एक नई सांख्यिकीय विंडो खोलेगा।
    2. नई विंडो के बाईं ओर आँकड़े ज्यामितीय माध्य का चयन करें।
    3. जनसंख्या MIO-M 1 कक्षों का चयन करें।
    4. उपलब्ध पैरामीटर्स की सूची से, FIT-C का चयन करें.
    5. उन्हें विश्लेषण पर लागू करने के लिए जोड़ें बटन पर क्लिक करें।
      नोट:: यह नमूना गेटिंग ट्री में नए आँकड़े "ज्यामितीय माध्य: FITC" बनाता है, और उनके मान आपके कार्यस्थान में प्रदर्शित होते हैं।
  6. एक सांख्यिकी कार्यक्रम में इन ज्यामितीय माध्य मूल्यों रखो और विश्लेषण.
  7. लेआउट संपादक खोलने के लिए L चिह्न क्लिक करें; यह चिह्न कार्यस्थान पर मेनू टैब में है. कार्यस्थान विंडो और लेआउट संपादक को साथ-साथ रखें.
    नोट:: लेआउट संपादक एक साधारण ग्राफ़िकल रिपोर्ट में एकाधिक ग्राफ़ प्लॉट्स और आँकड़े प्रदर्शित करने के लिए उपकरण के साथ एक अलग कार्यस्थान विंडो है। यह उस एक्सटेंशन फ़ाइल के साथ निर्यात किया जा सकता है जिसे आप पसंद करते हैं, जैसे पीडीएफ या JPG, दूसरों के बीच।
    1. कार्यस्थान विंडो में किसी नमूने के गेटिंग ट्री से, MIO-M 1 कक्ष जनसंख्या लेआउट संपादक में खींचें।
    2. सुनिश्चित करें कि गेट में ईवेंट वाले हिस्टोग्राम ग्राफ़ लेआउट संपादक में प्रदर्शित होता है. अतिरिक्त बुनियादी जानकारी नीचे दिए गए एक पाठ बॉक्स में विस्तृत होगी।
    3. सभी नमूनों को एक ही ग्राफ में तुलना करने के लिए खींचें। कार्यक्रम उन्हें ओवरलैप करेगा।
    4. हिस्टोग्राम ग्राफ़ पर राइट-क्लिक करें और गुण का चयन करें। कार्यक्रम एक नई ग्राफ परिभाषा विंडो खोल देगा। इस विंडो में चार टैब हैं (Annotate, Fonts, Legend, and Specify). निर्दिष्ट करें टैब क्लिक करें और y-अक्ष को ऑटो से मोडल में परिवर्तित करें. लागू करेंक्लिक करें।
    5. नमूना राइट-क्लिक करें और ग्राफ़ को निजीकृत करने के लिए रंग, रेखा शैली, रेखा वजन, आदि परिवर्तित करें।
    6. छवि निर्यात करने के लिए, फ़ाइल टैब क्लिक करें और, इसके तुरंत बाद, दस्तावेज़ बैंड में छवि सहेजें का चयन करें. पसंदीदा प्रकार की छवि फ़ाइल चुनें (उदाहरण के लिए, पीडीएफ)।
      नोट:: एक सहेजें संवाद बॉक्स खुलता है, आपको किसी सहेजें स्थान का चयन करने के लिए प्रेरित करता है। सहेजें क्लिक करें.
  8. विश्लेषण को कार्यस्थान (.wsp) फ़ाइल के रूप में सहेजें.
    1. ऊपरी-बाएँ कोने पर, साइटोमेट्री विश्लेषण आइकन पर क्लिक करें और इस रूप में सहेजें का चयन करें.
    2. डेटा और विश्लेषण के साथ दस्तावेज़ को सहेजने के लिए कार्यस्थान के रूप में सहेजें (WSP) चुनें.
    3. कार्यस्थान फ़ाइल के लिए कोई नाम दर्ज करें.
    4. सहेजें क्लिक करें.

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Representative Results

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है, हमने प्रतिनिधि और मात्रात्मक डेटा दिखाया है जो आरओएस इनड्यूसर, ए या बी के साथ प्रेरित एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति जांच डीसीएफएच-डीए के साथ आरओएस उत्पादन के प्रवाह साइटोमेट्री का पता लगाने का प्रदर्शन करता है। जैसा कि अपेक्षित था, हमने ऑटोफ्लोरेसेंस स्तरों से ऊपर अउत्साहित कोशिकाओं में FITC प्रतिदीप्ति में परिवर्तन देखा (चित्रा 1A, "बेसल नियंत्रण" बनाम "autofluorescence नियंत्रण", डॉट प्लॉट्स ग्राफ की तुलना करें)। यह MIO-M1 कोशिकाओं में ROS के बेसल उत्पादन के कारण हुआ। (चित्रा 1 बी, तुलना "बेसल नियंत्रण" बनाम "autofluorescence नियंत्रण", हिस्टोग्राम ग्राफ).

दिलचस्प बात यह है कि FITC प्रतिदीप्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई थी जब कोशिकाओं को ROS inducer, A या B के साथ उत्तेजित किया गया था (चित्रा 1B, तुलना "ROS inducer A" नमूनों बनाम "बेसल नियंत्रण" और "ROS inducer B" नमूने बनाम "बेसल नियंत्रण", हिस्टोग्राम ग्राफ)। इसके अलावा, जब कोशिकाओं को आरओएस इनड्यूसर, ए या बी से पहले एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ इलाज किया गया था, तो प्रतिदीप्ति स्तर बेसल स्तर के पास कम हो गया था (चित्रा 1 बी, तुलना करें "आरओएस इनड्यूसर ए" बनाम "एंटीऑक्सिडेंट यौगिक 6 एच + आरओएस प्रेरक ए 30 मिनट के साथ pretreatment", और "आरओएस इनड्यूसर बी" बनाम "एंटीऑक्सिडेंट यौगिक 6 एच + आरओएस प्रेरक बी 30 मिनट के साथ pretreatment", क्रमशः, हिस्टोग्राम ग्राफ)। ध्यान दें, बेसल नियंत्रण के संबंध में एंटीऑक्सिडेंट यौगिक (6 ज) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति संकेत में कोई अंतर नहीं देखा गया था। (चित्रा 1B, तुलना "6h एंटीऑक्सिडेंट यौगिक" बनाम "बेसल नियंत्रण").

ये परिणाम भी स्पष्ट रूप से स्पष्ट थे जब डेटा को FITC (चित्रा 1 C) के ज्यामितीय माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया था। जैसा कि ग्राफ में देखा जा सकता है, औसत मान और माध्य (SEM) के संबंधित मानक त्रुटि को इंगित किया गया है।

इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ समय के साथ आरओएस में परिवर्तनों का पालन करने के लिए इसका आवेदन है। इस संबंध में, हम आरओएस में एक महत्वपूर्ण और समय-निर्भर वृद्धि का निरीक्षण करने में सक्षम हैं जब हमने 2 घंटे, 4 घंटे और 6 घंटे (चित्रा 2) के लिए आरओएस प्रेरक सी के साथ एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं का इलाज किया।

इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए, हमने कोशिकाओं (0.5% ट्रिप्सिन-ईडीटीए, Accutase सेल टुकड़ी समाधान, और अलग बफर) को तुलनीय परिणामों (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ फसल के लिए तीन अलग-अलग रणनीतियों का प्रयास किया है।

Figure 1
चित्रा 1: MIO-M1 कोशिकाओं में DCFH-DA जांच का उपयोग करके ROS प्रेरक, A या B के जवाब में ROS का मापन: (A) "बेसल नियंत्रण" बनाम "autofluorescence control" स्थितियों की तुलना, प्रतिनिधि डॉट प्लॉट FL1 (519 nm) बनाम FL2 (660 nm)। (बी) 30 मिनट के लिए आरओएस प्रेरक, ए या बी के साथ एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं की उत्तेजना पर डीसीएफएच-डीए जांच द्वारा प्रेरित प्रतिदीप्ति के लिए प्रतिनिधि हिस्टोग्राम, या आरओएस प्रेरक ए, बी, या वाहन के 6 घंटे और 30 मिनट के लिए एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ प्रीट्रीट किया गया। (सी) एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं में सभी उत्तेजनाओं के लिए एफआईटीसी प्रतिदीप्ति का ज्यामितीय माध्य। डेटा को SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और Dunnett के बाद के परीक्षण के बाद एक तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया जाता है; ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं में डीसीएफएच-डीए जांच का उपयोग करके आरओएस प्रेरक सी उपचार के जवाब में आरओएस ओवरटाइम का मापन: एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं को 2 घंटे, 4 घंटे और 6 घंटे के लिए आरओएस प्रेरक सी के साथ इलाज किया जाता है और आरओएस स्तरों को निर्धारित करने के लिए डीसीएफएच-डीए जांच के साथ लोड किया जाता है। 2 ज, 4 ज, और 6 ज के लिए ROS प्रेरक सी के साथ MIO-M1 कोशिकाओं की उत्तेजना पर DCFH-DA जांच द्वारा प्रेरित प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए प्रतिनिधि हिस्टोग्राम। ऊपर विस्तृत उत्तेजनाओं के लिए FITC प्रतिदीप्ति का ज्यामितीय माध्य। डेटा को SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और Dunnett के बाद के परीक्षण के बाद एक तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया जाता है; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है, ** पी < 0.01, ***पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घोल संग्रहण शर्तें नोट
सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) 10 M, 1 L 400 ग्राम NaOH छर्रों आसुत जल से 1 लीटर प्रारंभ "सावधानी": एक केंद्रित NaOH समाधान की तैयारी एक exothermic प्रतिक्रिया का कारण बनती है। कांच के बीकरों के रासायनिक जलने और टूटने से बचने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए। यदि संभव हो, तो भारी प्लास्टिक बीकर का उपयोग करें।
फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) 10 एक्स, 1 एल 80 ग्राम NaCl आसुत जल से 1 लीटर प्रारंभ पीएच को 7.4 पर समायोजित करें और समाधान को फ़िल्टर करें।
2 ग्राम KCl
11.5 g Na2HPO4· 7H2O
2 ग्राम KH2PO4
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5 M pH 8.0, 1 L 186.1 ग्राम Na2EDTA · 2H2O आसुत जल से 1 लीटर प्रारंभ ईडीटीए का डाइसोडियम नमक तटस्थ पानी या समाधान में घुलनशील नहीं होता है जब तक कि समाधान के पीएच को NaOH के अलावा लगभग 8.0 तक समायोजित नहीं किया जाता है। पीएच को 8.0 में समायोजित करें और समाधान को निष्फल करें।
10% w/v सोडियम अज़ाइड (NaN3), 100 mL 10 ग्राम NaN3 आसुत जल से 100 मिलीलीटर प्रारंभ
डिटैचिंग बफर, 100 mL 180 मिलीग्राम ग्लूकोज पीबीएस 1X से 100 मिलीलीटर 4 °C
0.6 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA
फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर (FACS बफर), 100 mL 2 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) पीबीएस 1X से 100 मिलीलीटर 4 °C NaN3 को एक संरक्षक के रूप में जोड़ा जाता है।
1 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA
1 mL 10% w/v सोडियम azide
5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 mL 2.4 मिलीग्राम DCFH-DA डाइमिथाइल सल्फोक्साइड से 1 मिलीलीटर -20 °C प्रकाश से संरक्षित 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में धीरे से और एलीकोट 20 μL मिलाएं। एकाधिक पिघलने / फ्रीज चक्रों से बचें। हमारी सिफारिश प्रयोगात्मक दिन से सभी अप्रयुक्त जांच समाधान को छोड़ रही है।
0.4% w/v ट्रिपैन नीला 10 X, 50 mL 0.2 ग्राम trypan नीला पीबीएस 1X से 50 मिलीलीटर 4 °C

तालिका 1: बफर व्यंजनों

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Discussion

कई रोग संबंधी स्थितियां, जैसे कि कैंसर, भड़काऊ रोग, इस्केमिया / reperfusion, इस्केमिक हृदय रोग, मधुमेह, और रेटिनोपैथी, और उम्र बढ़ने जैसी शारीरिक स्थितियां, आरओएस overproduction 6,7,8,9,10,11 का कारण बनती हैं। इसलिए, आरओएस के मॉडुलन में शामिल मार्ग का पता लगाना, माप और समझ कई बीमारियों के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य हैं। डीसीएफएच-डीए जैसे आरओएस स्तरों को मापने के लिए जांच का उपयोग सुलभ, व्यापक रूप से वर्णित है, और वैज्ञानिक साहित्य 26,27,28 में स्वीकार किया गया है। इस लेख में, हम MGCs में प्रवाह cytometry द्वारा ROS के स्तर को मापने और मापने के लिए एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

इस विधि के उपयोग का एक लाभ यह है कि, एक बार डीसीएफएच-डीए जांच आरओएस द्वारा ऑक्सीकरण हो जाती है और एक फ्लोरोसेंट डीसीएफ उत्पाद उत्पन्न करती है; यह एक प्लेट रीडर, confocal माइक्रोस्कोप, या प्रवाह साइटोमीटर में मापा जा सकता है। प्लेट रीडर का नुकसान यह है कि यह कुल प्रतिदीप्ति को मापता है। नतीजतन, प्लेट रीडर संस्कृति माध्यम में रासायनिक प्रतिक्रियाओं द्वारा उत्पन्न बाह्य कोशिकीय से इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति को अलग नहीं करता है। Confocal माइक्रोस्कोपी एक उपयोगी उपकरण है क्योंकि कोशिकाओं को DCFH-DA जांच के साथ लोड किया जा सकता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कक्षों में वास्तविक समय में देखा जा सकता है। सेल में आरओएस की आकृति विज्ञान और स्थान का पता इस पद्धति के साथ लगाया जा सकता है, लेकिन आरओएस स्तरों में मात्रात्मक माप की कमी होती है। प्रवाह साइटोमेट्री की ताकत जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति को मापने की क्षमता में निहित है। प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाली कोशिकाओं की संख्या पर मात्रात्मक डेटा, साथ ही प्रतिदीप्ति के ज्यामितीय साधन,25 प्राप्त किए जा सकते हैं।

यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि डीसीएफएच-डीए जांच का उपयोग करते समय वास्तव में क्या मापा जाता है। जैसा कि हमने पहले उल्लेख किया है, DCFH-DA कई ROS प्रजातियों को मापता है, और इसलिए हरे रंग की जांच के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति का उपयोग ROS प्रजातियोंके प्रकारों के बीच भेदभाव करने के लिए नहीं किया जा सकता है। इस संबंध में, यह ज्ञात है कि विभिन्न जांच आरओएस के प्रकार को समझ सकते हैं। उदाहरण के लिए, डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) जांच को सुपरऑक्साइड द्वारा फ्लोरोसेंट उत्पाद 2-हाइड्रोक्सीएथिडियम (518 एनएम पर उत्तेजना और 605 एनएम पर उत्सर्जन) उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीकरण किया जाता है, लेकिन इस उत्पाद को अधिक समय लेने वाली तकनीकों के उपयोग के बिना प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, जैसे कि एचपीएलसी30,31। एक अन्य जांच एक माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड संकेतक है (सामग्री की तालिका देखें), जो जीवित कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया में सुपरऑक्साइड के अत्यधिक चयनात्मक पता लगाने के लिए एक उपन्यास फ्लोरोजेनिक जांचहै 31,32। हालांकि, कुल आरओएस स्तरों के माप के उद्देश्यों के लिए और विभिन्न उत्पादों की एंटीऑक्सिडेंट क्षमता के अपमान या मूल्यांकन के बाद आरओएस में वृद्धि होती है, उचित नियंत्रण के साथ डीसीएफएच-डीए जांच का उपयोग सुविधाजनक और स्वीकार्य 25,28,29 है।

एक बहुत ही महत्वपूर्ण मुद्दा उचित प्रयोगात्मक नियंत्रणों का चयन और उपयोग है: ऑटोफ्लोरेसेंस नियंत्रण (डीसीएफएच-डीए जांच के बिना कोशिकाएं), बेसल नियंत्रण (बिना उकसावे वाली कोशिकाएं), सकारात्मक नियंत्रण (आरओएस प्रेरक के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं), नकारात्मक नियंत्रण (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं), और नमूना समस्या (एंटीऑक्सिडेंट यौगिक और आरओएस प्रेरक के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं)। एक उपयोगी टिप फ्लोरोसेंट जांच के साथ हस्तक्षेप को कम करने के लिए फिनोल लाल के बिना माध्यम का उपयोग करना है।

हम प्रयोगात्मक उपचार को पूरा करने से 30 मिनट पहले डीसीएफएच-डीए जांच के साथ कोशिकाओं को लोड करने की भी सलाह देते हैं। DCFH-DA की एकाग्रता का मानकीकरण, हमारे मामले में 5 μM, सुविधाजनक है और सेल प्रकार और सेल सक्रियण स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकता है। हमारी सलाह जांच सांद्रता स्थापित करने के लिए है, 5μM और 10 μM से शुरू होता है, और प्रयोगों में धुंधला की प्रभावकारिता की जांच करें।

संक्षेप में, स्वास्थ्य या बीमारी में रेडॉक्स संतुलन का विश्लेषण ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया को मापने के लिए विश्वसनीय तरीकों को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा लाइव एमजीसी में आरओएस के स्तर को मापने के लिए एक सरल, तेज और शक्तिशाली उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को मारिया Pilar Crespo और पाउला Alejandra IBBICI के Abadie (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, अर्जेंटीना) प्रवाह cytometry और गैब्रिएला Furlan और Noelia Maldonado सेल संस्कृति सहायता के लिए सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम वीडियो उत्पादन और संपादन के लिए विक्टर डियाज़ (एफसीक्यू के संस्थागत संचार के प्रो-सेक्रेटरी) को भी धन्यवाद देते हैं।

इस लेख को Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), और Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (सभी के लिए M.C.S.) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-DCFH-DA Sigma 35845-1G
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Gibco by life technologies 15630-080
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences FACSCanto
BD FACSDiva software BD Biosciences
Cell Culture Dishes 100x20 mm Cell Star- Greiner Bio-One 664 160
Centrifuge Thermo Sorvall legend micro 17 R
Centrifuge Tubes (15 ml) BIOFIL CFT011150
Centrifuge Tubes (50 ml) BIOFIL CFT011500
Cryovial CRYO.S - Greiner Bio-One 126263
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich W387520-1KG
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate Merck 106575
DMEM without phenol red Gibco by life technologies 31053-028
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco by life technologies 11995065
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate Merck 324503
Fetal Bovine Serum Internegocios
FlowJo v10 Software BD Biosciences
Glucose Merck 108337
hemocytometer, Neubauer chamber BOECO,Germany
Laminar flow hood ESCO AC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX) Gibco by life technologies A12860-01
MitoSOX Red Invitrogen  M36008
Penicillin/Streptomycin Gibco by life technologies 15140-122
Potassium Chloride Merck 104936
Potassium-dihydrogen phosphate Merck 4878
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) Falcon - Corning BD-352008
Sodium Azide Merck 822335
Sodium Chloride Merck 106404
Sodium Hydroxide Merck 106462
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml Tarson 500010-N
Tissue Culture Plate 6 well BIOFIL TCP011006
Trypan Blue Merck 111732
Trypsin-EDTA 0.5% 10X Gibco by life technologies 15400-054
Vortex Mixer Labnet International, Inc.

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का परिमाणीकरण 2', 7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe और Müller Glial कोशिकाओं में फ्लो-साइटोमेट्री का उपयोग करके
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Vaglienti, M. V., Subirada, P. V., Barcelona, P. F., Bonacci, G., Sanchez, M. C. Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in Müller Glial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63337, doi:10.3791/63337 (2022).

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