Summary
针对小鼠大脑部位的立体定向手术通常涉及通过颅骨进入，并由颅骨特征引导。在这里，我们概述了一种替代立体定位方法， 通过 大水箱靶向尾部脑干和上颈椎脊髓，该方法依赖于脑干特征的直接可视化。
Abstract
靶向小鼠大脑部位的立体定位手术通常由颅骨标志物引导。然后 通过 钻入颅骨的毛刺孔获得通道。由于特定的解剖学挑战，这种标准方法对于尾部脑干和上颈带的靶标可能具有挑战性，因为这些部位远离颅骨标志物，导致不精确。在这里，我们概述了一种 通过 大蓄水池的替代立体定位方法，该方法已用于靶向尾脑干和上颈髓中感兴趣的离散区域。大池从枕骨延伸到图谱（即第二椎骨），充满脑脊液，并被硬脑膜覆盖。这种方法为选择中枢神经系统（CNS）结构提供了一条可重复的途径，这些结构由于解剖学障碍而难以到达。此外，它允许直接可视化靠近目标部位的脑干特征，提高将小注射量输送到尾部脑干和上颈髓中受限的感兴趣区域时的准确性。最后，这种方法提供了避免小脑的机会，小脑对运动和感觉运动研究很重要。
Introduction
针对小鼠1 的大脑部位的标准立体定位手术通常涉及使用一组耳杆和嘴条固定颅骨。然后根据参考图集2，3和颅骨特征估计坐标，即前颌骨（额骨和顶骨缝合在一起的点）或λ（顶骨和枕骨缝合在一起的点; 图1A、B）。通过进入估计目标上方颅骨的毛刺孔，然后可以到达目标区域，用于传递显微注射或带有插管或光纤的仪器。由于这些缝合线的解剖结构的变化以及bregma或lambda4，5定位的错误，零点相对于大脑的位置因动物而异。虽然由于这种变异性而导致的小目标误差对于大型或附近的目标来说不是问题，但对于远离前后或背阴平面零点的较小感兴趣区域和/或研究由于年龄，菌株和/或性别而不同大小的动物时，它们的影响更大。延髓和上颈髓还有几个独特的挑战。首先，由于小脑的位置和形状，前后坐标的微小变化与背腹坐标相对于硬脑膜的显着变化有关（图1Bi）2，6，7。其次，上颈带不包含在颅骨2内。第三，枕骨和颈部肌肉2 的上覆层的倾斜位置使得标准立体定位方法对于位于脑干和脊髓之间过渡附近的结构更具挑战性（图1Bi）。最后，尾部脑干和颈带中许多感兴趣的靶标是小2，需要精确和可重复的注射8，9。
通过大蓄水池的另一种方法规避了这些问题。大水箱是从枕骨延伸到图谱的大空间（图1A，即第二椎骨）10。它充满脑脊液，并由硬脑膜10覆盖。枕骨和图谱之间的这个空间在头部前屈时打开。它可以通过在长头炎肌肉的上覆成对的腹部之间导航来访问，暴露尾部脑干的背表面。然后，如果感兴趣区域位于背表面附近，则可以根据这些区域本身的地标来定位这些区域;或者通过使用obex，即中央管通向IV心室的点，作为坐标到达更深结构的零点。这种方法已成功用于多种物种，包括大鼠11，猫12，小鼠8，9和非人灵长类动物13 ，以靶向腹侧呼吸组，髓质内侧网状结构，孤束核，区域后或舌下核。然而，这种方法并未得到广泛使用，因为与标准立体定位方法相比，它需要解剖学知识，专门的工具包和更高级的手术技能。
在这里，我们描述了一种循序渐进的手术方法， 通过 大水箱到达脑干和上颈髓，可视化标志点，设置零点（图2），并估计和优化目标坐标，以便将显微注射物立体定向传递到感兴趣的离散脑干和脊髓区域（图3）。然后，我们讨论与此方法相关的优缺点。
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Protocol
作者声明，该协议遵循Beth Israel Deaconess医疗中心机构动物护理和使用委员会的指导方针。
1. 手术器械和立体定位框架的准备
注意：手术是在无菌条件下进行的。使用无菌尖端技术保持无菌状态。
- 在立体定位框架上安装带有微量移液管或注射器的立体定位臂，其中装有所选注射剂（腺相关病毒（AAV）或常规示踪剂），并准备鼠标适配器（图2A）。
- 准备高压灭菌的手术器械（材料表）并将其放置在无菌表面上。
2. 麻醉诱导和小鼠制备
- 以0.5 L/min的速度打开O2 ，并将异氟醚汽化器设置为4.0，确保O2 流向感应箱。
注意：确保将异氟醚诱导盒放在罩子中，并且异氟醚从手术部位清除。 - 将小鼠（10周龄男性C57BL / 6J）置于诱导室中。
- 呼吸减慢后，打开诱导室，轻轻抬起鼠标。使用剪刀去除头到肩的毛发。
3. 鼠标在立体定位框架中的定位
- 将鼠标移动到立体定位框架，并将鼻子放在柔性鼻锥中。在此阶段，确保O2 流量现在指向鼻锥。
- 仅使用耳条将鼠标放入立体定位框架中。
注意：确保耳杆均匀且头部水平。 - 通过手动引导鼻子将鼠标头部向90°角弯曲。要固定此位置，请在鼠标适配器的耳杆支柱之间放置一个塑料屏障，与支柱平行。颅骨的扁平部分作为参考，类似于传统立体定位手术中的扁平颅骨方法。
注意：不要过度弯曲头部（即额颅骨平面与工作台表面平面之间的90°角以上），因为这会阻碍气流通过上气道。如果气流受阻，请重新定位鼠标，确保身体支撑在躯干下方，并将塑料卡设置为额颅骨平面和表表面平面之间的90°，如图 2A，C所示。 - 将加热垫放在鼠标下方，然后确保颈部和身体的其他部分位于同一水平（即，与桌子约180°或平行）。握住弹簧剪刀的工具箱可用于将身体提升到此位置。
注意：这一步很重要，因为尾部脑干和上颈带根据位置移动，与颅骨固定的中枢神经系统的更多喙部相反。 - 以2μL / g体重的体积皮下注射单剂量4mg / kg美洛昔康缓释（SR）（s.c.），并将润滑剂放在眼睛上。
- 首先用70%酒精制备垫清洁手术切口部位，然后用betadine准备垫清洁手术切口部位，然后用酒精准备垫再次清洁并晾干。
- 在身体下方放置一个垂坠物。
- 消毒双手并戴上无菌手套。
- 在手术部位放置一个悬垂物。
4. 手术进入大水池
- 通过捏脚趾或检查角膜反射，确保对鼠标进行适当的麻醉。
- 将异氟醚降低到维持水平 （2.0）。
- 用手术刀片#10从枕骨边缘向肩部做一个1-1.2厘米的切口，一次平稳的运动。
- 在斜方肌的中线缝合处做一个切口。这暴露了成对的长头炎肌肉。
注意：在小鼠中，斜方肌是非常薄的，几乎透明的肌肉。确保保持在中线，不要切入下面的肌肉，因为这会导致不必要的出血。 - 将两个牵开器钩放在成对的长头炎肌肉之间，一个朝向左侧，另一个面向右侧。止血器的重量为牵开器钩提供张力，可以通过重新调整止血器的位置来修改。
- 将手术显微镜放置在适当的位置，以更好地可视化手术区域。
- 使用钝性椎板切除术镊子分离成对的头长肌的左腹和右腹，从枕骨开始，中线很容易看到。引导钝镊子穿过中线的枕骨，直到它与蓄水池硬脑膜相遇的地方，然后继续穿过硬脑膜到图集。
注意：没有必要切开成对的长头炎肌肉，因为没有任何东西将它们固定在中线;这样做会导致不必要的出血。 - 重新定位收紧器，并通过重新定位止血器来调整张力，打开大水箱的视野。
- 使用钝性椎板切除术镊子在中线进一步分离肌肉，以获得脑干和小脑的良好观察窗。
- 根据需要重复步骤4.7-4.9，直到小脑和脑干进入硬脑膜下方。
- 使用钝性椎板切除术镊子，通过将镊子从中线向横向移动来清除结缔组织小链的硬脑膜，直到有清晰的脑干视图并根据需要为目标创造更多的横向空间。
5. 打开蓄水池膜
- 使用倾斜的杜蒙镊子（#4/45）抓住从枕骨延伸到图谱的硬脑膜。抓住枕骨附近的硬脑膜，用弹簧剪刀在硬脑膜上做一个小开口（~0.5至1.5毫米）。
注意：在这个骨架位置，脑干和上覆硬脑膜之间的空间最宽，为安全操作硬脑膜提供了充足的空间。 - 使用弹簧剪刀抬起硬脑膜并进一步打开硬脑膜。窗口的大小取决于目标。
注意：进行多次纵向注射或双侧注射时，需要更大的窗口;在进行单侧或中线注射时，一个小窗口就足够了。 - 一旦硬脑膜打开，用无菌提示尖端排出多余的脑脊液。
6. 地标和零点的识别
- 通过开放的硬脑膜查看脑干的背表面，并附上详细的地标。obex，即中央管通入静脉输液室的点，是标准的前后和中外零点。
7. 目标坐标
注意：对于各种目标，我们列出了一个标准坐标列表，其前后坐标（AP）和中外（ML）坐标相对于零点前后（AP）和中外（ML）坐标相对于零点前后角和大水池坐标，AP和ML坐标相对于零点obex，以促进方法之间的转换（表1）。背动脉 （DV） 坐标相对于 AP 和 ML 入口点处的脑或小脑表面（标准入路）或脑干或上颈带表面（大水池入路）。手术前应进行计划。
- 使用三组坐标来确定目标：AP、ML 和 DV。由于头部位置，脑干结构的相对方向因位置而异。
- 对于从尾部到obex的目标距离>0.4 mm（图1B，绿色），请执行以下操作。
- AP：使用任何标准的立体定位参考图集（例如，Paxinos和Franklin atlas2）或在横向平面上切割的组织序列来估计obex和目标之间的AP距离。
- ML：使用在横向平面上切割的任何标准立体定位参考图集或组织序列来估计obex和目标之间的ML距离。
- DV：估计AP和ML目标点相对于大脑或小脑表面的坐标。使用在横向平面上切割的任何标准立体定位参考图集或组织序列来估计所需AP和ML坐标处的脑干表面与目标之间的距离。
- 对于从尾部到尾部<0.4 mm的目标距离（图1B，橙色），请执行以下操作。
- AP：调整坐标以考虑脑干的前屈。对于腹侧和腹骨坐标，AP脑干入口点相对于标准平面中的目标 AP 坐标将更具尾部。
- ML：从横向平面上切割的标准立体定位参考图集或组织序列中获取目标坐标。坐标将相对于目标 AP 级别的可视化中线。
- DV：估计相对于 AP 和 ML 目标点处脑干表面的坐标。调整 DV 以考虑脑干的前屈。对于腹侧和腹骨坐标，DV坐标将大于标准平面中脑干背表面的距离。
- 对于从尾部到obex的目标距离>0.4 mm（图1B，绿色），请执行以下操作。
8. 注射靶标
- 使用立体定位臂将移液器或注射器降低到目标，并像标准立体定位方法一样注射溶液。注射后留在原位1-5分钟，以避免在3-50nL之间使用体积时出现针头痕迹。然后，使用立体定位臂提起移液器或注射器。
- 重复步骤 8.1。用于多个目标。
9. 手术场的封闭
- 小心地从手术场上取下钩子。成对的长头炎肌肉将落回中立位置，完全覆盖大水池。不要在中线关闭斜方肌和硬脑膜，因为它们太脆弱而无法容纳缝合线。
- 用三根尼龙或聚丙烯缝合线（5-0或6-0）闭合皮肤。
10. 术后护理
- 关闭异氟醚，然后从立体定位框架中取出鼠标。将鼠标放在加热垫上的干净笼子中，观察直到醒来并移动。
- 监测术后第1-3天的健康状况，体重和缝合线。如果尚未移除，请在第10天移除缝合线。
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Representative Results
大水池方法可以靶向尾部脑干和上颈带结构，否则这些结构很难通过标准立体定位方法到达或容易靶向不一致。到达大水池的手术需要切口皮肤，薄薄的梯形肌层和硬脑膜的开口，因此小鼠耐受性良好。当针对多个（纵向分散或双侧）地点时，它特别有效且侵入性更小，因为它不需要像标准立体定位方法那样钻多个毛刺孔。在小鼠中，我们使用大水池方法常规靶向结构，例如尾部脑干中的舌下核9，腹侧呼吸组8和相邻网状结构8，因为我们进一步说明了舌下核和腹内侧髓质（GiV）。例如，舌下核是背延髓中的细小但玫瑰花科细长的动作神经元柱，其喙极可以通过标准方法靶向。然而，由于DV坐标（~4.5 mm）主要由上覆的小脑决定，只有1.2-1.4 mm进入脑干，因此小鼠头部位置相对较小的差异很容易导致错位注射。由于该目标靠近零点obex，因此可以通过大型蓄水池方法更可靠地瞄准它。此外，下舌核的尾端一直延伸到脑干和脊髓之间的过渡，可以由相同的大水箱方法靶向，而标准方法必须通过倾斜AP方法并调整坐标以避开枕骨和覆盖颈部肌肉组织来修改以达到这样的尾部位置。
为了确定大水池入路与标准进路的准确性，我们测量了腹侧（腹内侧髓质;GiA/V;N = 10）和背侧（NuXII;N = 16） 个区域。测量是在尾部脑干的横截面上进行的（图3）。结果（图4）显示，与标准方法相比，大蓄水池进近的前后、中外侧，尤其是背腹平面的误差明显较小。这些结果凸显了大水池方法对这些目标的更高准确性。我们在表1中包括了标准的立体定位坐标（相对于bregma，源自Paxinos和Franklin 2，但针对我们的研究进行了优化）和cisterna magna坐标（相对于obex）。这些坐标都经过优化和验证，如图3所示为舌下核和腹内侧髓质。
图1：关键地标、目标区域和立体定向大水池接近平面平面的示意图。 （A）关键解剖特征点和矢状平面中的定位。（B） 通过标准立体定位方法与大水池立体定位方法可以到达的领域，以及与它们的参考点的关系。i）标准方法利用了骨地标bregma和lambda，它们与洋红色和紫色的目标区域相距甚远。洋红色区域（长尾髓和上颈带）由于枕骨和颈部肌肉倾斜而难以到达。紫色区域（长圆形胪骨）容易移动，远离传统地标。ii）大水箱方法适用于进入尾状延髓和上颈带，并且在研究从尾状延髓延伸到尾状突直至尾突水平的纵柱的脑干结构时具有优势。（C） 各种立体定位参考图集与大蓄水池方法相关的平面示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：立体定位大水箱进近的分步示意图概述。 （A） 鼠标适配器，其耳杆均匀地放置在最高层，口条位于较低的位置，以及用于将前屈头固定在 90° 角的塑料卡。（B）使用耳杆将鼠标固定在立体战术框架中，并将头部前屈90°， 并通过 刚性塑料卡保持在适当的位置，立体定位框架作为参考。（C）确保身体升高，使其与枕骨处于同一平面。触诊关键地标。（D）从枕骨到肩部的喙部做一个皮肤切口。（E）在斜方肌的裂缝中切开一个切口。确保保持在中线，不要切入下面的肌肉。（F）确定长头炎肌肉两个腹部之间的中线，从枕骨开始，并将椎板切除术镊子引导到尾部方向。（G）将每个伤口钩放在头长肌的腹部之间，并重新定位，直到大水池进入视野。（H）识别骨特征点（枕骨，图谱），在这些骨结构之间延伸的硬脑膜，以及下面的小脑和脑干。根据需要清洁硬脑膜以暴露目标水平。（一）用弹簧剪刀和细镊子打开硬脑膜。（J） 识别形成 AP 和 ML 零点的 obex。将移液器移动到所选的 AP 和 ML 坐标。放下移液器，直到它到达脑干的背表面。这是 DV 零点。将移液器降低到所需的坐标。（K）取下移液管和伤口钩，让长头炎肌肉恢复原来的位置。（L）闭合伤口，将鼠标从立体定位框架中取出。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：目标坐标的评估。 尾部脑干的低放大倍率显微照片。（A）将逆行示踪剂霍乱毒素亚基b（CTb;蓝色）注射到ChAT-cre L10 GFP（绿色）报告小鼠（雌性，6个月大）的舌下核中。请注意，CTb注射仅限于舌下核。（B）转染vGluT2-ires-cre L10 GFP报告基因（绿色）小鼠（雄性，2个月大）的谷氨酸能细胞，在尾内侧延髓（GiV区域的尾极）腹侧部分转染条件顺行示踪剂（洋红色）。（C）在vGLuT2-ires-cre小鼠（雄性，2个月大）中进行有条件的逆行追踪，显示谷氨酸能神经元的TVA（洋红色）转染和尾内侧延髓（GiV区域的尾极）中改良的狂犬病感染（绿色）。狂犬病病毒被注射到上颈椎脊髓中。内部地标用作指导。缩写-cAmb：歧义复合体的致密核;Ap： Area Postrema;DMV：迷走神经的背侧运动核;GiV：巨型细胞核，腹侧部分;IO：劣质橄榄;IRt：中间网状核;LRN：外侧网状核;NuXII- 舌下核;sol：孤束核;Sp5：脊柱三叉神经核;VRG：腹侧呼吸组。比例尺：200 μm 。请点击此处查看此图的大图。
图 4：标准进近和大水池进近之间的精度比较。 前后平面 （A）、中外平面 （B） 和背侧平面 （C） 中预期目标的中心与实际位置中心之间的平均距离。使用标准方法从N = 13只成年小鼠和N = 13只成年小鼠使用大水池方法获得数据。目标的半径设置为30μm。结果显示前后平面（t（24） = 2.08，p = 0.049;双尾 t检验;α 0.05），中外平面（t（24）= 2.55，p = 0.018;双尾 t检验;α 0.05）和背阴平面（t（24）= 4.33，p = 0.0002;双尾 t检验;α 0.05）的精度更高。条形图表示具有标准偏差的平均值，单个点表示每个鼠标中的值。 请点击此处查看此图的大图。
表1：靶向尾部脑干结构的标准和大蓄水池立体定位坐标概述。请注意，对于标准和大型水箱方法，Paxinos和Franklin atlas2 的坐标都已调整，直到通过组织学验证了感兴趣的区域才被适当地定位（图3）。另外，请注意，网状结构中的区域缺乏明确定义的边界，并且此处标记为Paxinos和Franklin2。缩写-AP：前后。ML：中外侧。DV：背腹。ChAT：胆碱乙酰转移酶;女：女;男：男;M&F：男性和女性;不适用：不适用;Pet1：浆细胞瘤表达转录因子1;Sert： 血清素转运蛋白， vGaT： 囊泡 GABA 转运蛋白;vGluT2： 水泡谷氨酸转运蛋白2;WT：野生型。所有坐标均以毫米 （mm） 为单位。 请按此下载此表格。
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Discussion
标准立体定向手术通常依靠颅骨特征来计算中枢神经系统1中靶位点的坐标。然后 通过 钻入颅骨1的毛刺孔进入目标部位。这种方法对于尾部脑干来说并不理想，因为靶点位于前后平面和背腹平面2中远离颅骨标志点， 并且颅骨和上覆肌肉的解剖结构使得进入具有挑战性6 （图1Bi）。我们的研究描述了一种替代立体定位方法，用于访问尾部脑干和上脊髓中的目标部位，称为大蓄水池方法。使该方法与标准立体定向方法不同的关键特征是定位，头部的前屈以打开大水箱，以及使用脑干背表面的关键脑干特征点作为参考点，例如obex。我们的结果表明，这种方法适用于将少量（5-50 nL）的示踪剂或腺相关病毒（AAV）递送到离散的脑干结构中。此外，使用代表CNS标志物而不是骨结构的参考点，并且与预期靶标非常接近，可提高小靶标和小注射体积的可重复性和准确性，这与电路映射和化学遗传学研究相关（图3）14，15。
与任何协议一样，大水池方法具有实现可重复性的关键步骤。与任何依赖于三个不同平面（前后、中外侧和背侧）坐标的立体定位方法一样，定位至关重要。对于大蓄水池入路，这不仅涉及头部的位置，头部的位置应该在90°处前屈，而且还涉及身体的位置，应该升高，以便尾部脑干和上颈髓在同一平面上。另一个关键步骤是避免不必要的操作，导致出血，因为这会妨碍关键地标的可视化。有两种操作具有很高的出血风险。首先，覆盖大水池的硬脑膜被相对较大的肌肉覆盖（长头炎）。由于这是一对肌肉，中线两侧各有一个腹部，因此该肌肉的两个腹部只需要在中线轻轻分开即可。切开这些肌肉不是必需的，会导致出血。其次，在硬脑膜成功打开时，在尾脑干和上颈带的背表面上将可见具有不同病程的可变数量的静脉。应通过在坐标（高达0.1 mm）上进行微小的调整来避免这些静脉，或者，如果实验范式允许，则通过选择不同的目标来避免这些静脉。
大水箱方法的一个主要优点是，它提供了对脑干和上颈椎结构的访问，这些结构在使用标准立体定位平面时很难到达，因为它们位于枕骨尾端附近或只是枕骨尾部。此外，对于延髓中的靶标，该方法避免了小脑，因此避免了小脑病变效应或通过针道的虚假标记，当使用标准方法时，这可能会影响研究结果。大水池方法的另一个优点是脑干的背表面变得可见。这提供了使用背表面上的地标作为坐标参考点的机会。此外，该方法非常灵活，可以根据目标进行优化。例如，我们使用中线地标 obex 作为参考点。然而，当瞄准背侧结构时，感兴趣的结构本身可能决定背表面的景观。例如，外部楔形核向背突出，因此可以可视化并直接注射。对于横向目标，例如腹侧呼吸组或模糊复合体，大蓄水池窗口可以横向增加。同样，对于上颈椎结构的靶向，窗口可以向图谱延伸。虽然我们使用放置在大型动物立体定向框架中的小鼠适配器，但只要遵循关键步骤，该方法就可以很容易地适应其他框架或设置。例如，嘴杆可以放在鼻梁上，而不是塑料卡，以保持头部处于稳定的前屈位置。值得注意的是，表1中提供的以obex为零点的脑干靶位点的坐标作为参考，可以根据小鼠品系，年龄，性别，立体定位臂的校准和定位技术来指示调整，类似于从参考图集推导出标准方法的目标坐标时需要做出的调整。这需要深入了解该方法的平面，特别是对于图1所示的更多喙质目标。坐标的测试可以通过使用不同的示踪剂来完成，例如，荧光珠或荧光标记的霍乱毒素亚基b，用于同一小鼠中的不同坐标。然后，脑干/脊柱组织切片的组织学分析（本方案未涵盖）提供相对于客观内部特征8，9，11，16的定位的反馈或与参考图谱进行比较。然后可以调整坐标，再次测试并完成。
大水池方法也有局限性。可通过这种方法到达的中枢神经系统区域仅限于尾桥、延髓和上颈索。虽然尾突可以通过标准方法轻松访问，但在研究从延髓延伸到尾状脑桥的纵向结构的细分时，大水池方法具有优势，就像网状结构内的细分一样。另一个相对限制发生在同一小鼠中第二次使用这种方法时，例如，在改良的狂犬病追踪14中。疤痕组织的存在可能会增加手术的持续时间或模糊较小的标志物。然而，在我们手中，这种方法在这种情况下仍然优于标准的立体定位方法，因为可以记录第一次注射的部位与其他独特标志的静脉位置的关系，从而很容易找到确切的入口点。虽然这种方法优于尾髓和上脊髓的追踪研究，但它不能用于长期植入硬件。因此，对于需要植入光纤17的体内光遗传学和钙成像研究，可以首先使用大蓄水池方法将AAV传递到目标部位，然后使用标准方法对具有纤维或插管的小鼠进行第二次手术。这种方法使人们能够保持目标站点的离散性，而光纤/硬件放置由于硬件的尺寸相对较大，因此更宽容（即，可能不太准确）。最后，大水箱方法需要比标准立体定位方法更高级的手术技能。它不是识别简单的骨地标，而是需要深入了解更复杂的脑干和肌肉骨骼特征。此外，与任何精细手术一样，手术的成功和效率取决于处于良好状态的适当工具包。该协议解决了后一个问题，可以用作实验人员的详细指南。
总之，大水箱方法与标准立体定位方法相辅相成，在靶向尾脑干和上颈髓时具有多种优势，而 通过 标准立体定位方法不容易获得这些优势。它使用CNS的参考点，而不是靠近预期目标的骨地标，从而提高了可重复性和准确性。这使得当需要在详细绘图或化学遗传学研究的背景下将小注射量输送到离散位点时，该方法特别有价值。这种方法也适用于功能性化学发生，光遗传学，纤维光度测定或病变方法，其中AAV病毒或毒素被传递到具有运动功能或感觉运动整合的靶标作为读数：它避免了延髓中靶标的小脑过程，从而限制了其对研究结果的干扰。从动物福利的角度来看，该手术不需要钻多个毛刺孔来双侧或纵向进入部位，从而减少了手术的持续时间和手术的侵入性。虽然我们详细概述了小鼠的方法，但相同的原则适用于其他物种11，12，13。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了R01 NS079623，P01 HL149630和P01 HL095491的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
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