Summary
Stereotaksisk kirurgi til at målrette hjernesteder hos mus involverer almindeligvis adgang gennem kraniet knogler og styres af kraniet landemærker. Her skitserer vi en alternativ stereotaxisk tilgang til at målrette mod den kaudale hjernestamme og øvre cervikale rygmarv via cisterna magna, der er afhængig af direkte visualisering af hjernestammens vartegn.
Abstract
Stereotaksisk kirurgi til at målrette hjernesteder hos mus styres almindeligvis af kraniets vartegn. Adgang opnås derefter via burrhuller boret gennem kraniet. Denne standardtilgang kan være udfordrende for mål i den kaudale hjernestamme og øvre livmoderhalsledning på grund af specifikke anatomiske udfordringer, da disse steder er fjernt fra kraniets vartegn, hvilket fører til upræcision. Her skitserer vi en alternativ stereotaxisk tilgang via cisterna magna, der er blevet brugt til at målrette mod diskrete regioner af interesse i den kaudale hjernestamme og øvre cervikale ledning. Cisterna magna strækker sig fra den occipitale knogle til atlaset (dvs. den anden hvirvelben), er fyldt med cerebrospinalvæske og er dækket af dura mater. Denne tilgang giver en reproducerbar adgangsvej til udvalgte strukturer i centralnervesystemet (CNS), der ellers er svære at nå på grund af anatomiske barrierer. Desuden giver det mulighed for direkte visualisering af hjernestammens landemærker i nærheden af målstederne, hvilket øger nøjagtigheden, når der leveres små injektionsvolumener til begrænsede områder af interesse for den kaudale hjernestamme og øvre livmoderhalsledning. Endelig giver denne tilgang mulighed for at undgå lillehjernen, hvilket kan være vigtigt for motoriske og sensorimotoriske undersøgelser.
Introduction
Standard stereotaksisk kirurgi til at målrette hjernesteder i mus1 involverer almindeligvis fiksering af kraniet ved hjælp af et sæt ørestænger og en mundstang. Koordinaterne estimeres derefterud fra referenceatlasser 2,3 og kraniets landemærker, nemlig bregma (det punkt, hvor suturerne i de frontale og parietale knogler kommer sammen) eller lambda (det punkt, hvor suturerne i parietale og occipitale knogler kommer sammen; Figur 1A,B). Gennem et burrhul i kraniet over det estimerede mål kan målområdet derefter nås, enten til levering af mikroinjektioner eller instrumentering med kanyler eller optiske fibre. På grund af variation i anatomien af disse suturer og fejl i lokaliseringen af bregma eller lambda 4,5 varierer positionen af nulpunkter i forhold til hjernen fra dyr til dyr. Mens små fejl i målretningen, der skyldes denne variabilitet, ikke er et problem for store eller nærliggende mål, er deres indvirkning større for mindre interesseområder, der ligger fjernt fra nulpunkterne i anteroposterior- eller dorsoventralplanerne og/ eller når man studerer dyr af varierende størrelse på grund af alder, stamme og / eller køn. Der er flere yderligere udfordringer, der er unikke for medulla oblongata og den øvre livmoderhalsledning. For det første er små ændringer i anteroposteriorkoordinater forbundet med signifikante ændringer i dorsoventrale koordinater i forhold til dura på grund af cerebellumets position og form (figur 1Bi)2,6,7. For det andet er den øvre livmoderhalsledning ikke indeholdt i kraniet2. For det tredje gør den skrå position af den occipitale knogle og det overliggende lag af nakkemuskler2 den standard stereotaksiske tilgang endnu mere udfordrende for strukturer placeret nær overgangen mellem hjernestammen og rygmarven (figur 1Bi). Endelig er mange mål af interesse for den kaudale hjernestamme og livmoderhalssnor små2, hvilket kræver præcise og reproducerbare injektioner 8,9.
En alternativ tilgang gennem cisterna magna omgår disse problemer. Cisterna magna er et stort rum, der strækker sig fra den occipitale knogle til atlaset (figur 1A, dvs. den anden hvirveldyr)10. Den er fyldt med cerebrospinalvæske og dækket af dura mater10. Dette mellemrum mellem den occipitale knogle og atlaset åbnes, når anteroflexing hovedet. Det kan tilgås ved at navigere mellem de overliggende parrede maver i longus capitis-musklen og udsætte den dorsale overflade af den kaudale hjernestamme. Regioner af interesse kan derefter målrettes baseret på landemærkerne i disse regioner selv, hvis de er placeret nær den dorsale overflade; eller ved at bruge obex, det punkt, hvor den centrale kanal åbner ind i IV-ventriklen, som et nulpunkt for koordinater for at nå dybere strukturer. Denne tilgang er blevet anvendt med succes i en række arter, herunder rotte11, kat12, mus 8,9 og ikke-menneskelig primat13 til at målrette mod den ventrale åndedrætsgruppe, medullær medial retikulær dannelse, kernen i den ensomme kanal, område postrema eller hypoglossal kerne. Denne tilgang anvendes imidlertid ikke i vid udstrækning, da den kræver viden om anatomi, et specialiseret værktøjssæt og mere avancerede kirurgiske færdigheder sammenlignet med den standard stereotaksiske tilgang.
Her beskriver vi en trinvis kirurgisk tilgang til at nå hjernestammen og den øvre livmoderhalsledning via cisterna magna, visualisere landemærker, indstille nulpunktet (figur 2) og estimere og optimere målkoordinater for stereotaksisk levering af mikroinjektioner i de diskrete hjernestamme- og rygmarvsområder af interesse (figur 3). Vi diskuterer derefter fordele og ulemper i forbindelse med denne tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forfatteren erklærer, at protokollen følger retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee på Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Forberedelse af kirurgiske instrumenter og stereotaksisk ramme
BEMÆRK: Operationen udføres under aseptiske forhold. Steriliteten opretholdes ved hjælp af den sterile spidsteknik.
- Installer den stereotaksiske arm med en mikropipette eller sprøjte fyldt med en injicerbar efter eget valg (adeno-associeret virus (AAV) eller konventionelt sporstof) på den stereotaxiske ramme, og forbered museadapteren (figur 2A).
- Forbered autoklavede kirurgiske instrumenter (materialetabel) og læg dem på en steril overflade.
2. Anæstesi induktion og mus forberedelse
- TændO2 ved 0,5 L/min, og indstil isofluranfordamperen til 4,0, og sørg for, atO2-flowet er til induktionsboksen.
FORSIGTIG: Sørg for, at isofluraninduktionsboksen er anbragt i en hætte, og at isofluranen er fjernet fra det kirurgiske sted. - Anbring musen (10 uger gammel han C57BL/6J) i induktionskammeret.
- Når vejrtrækningen er bremset, skal du åbne induktionskammeret og løfte musen lidt. Brug klippere til at fjerne hår fra hoved til skuldre.
3. Placering af musen i den stereotaksiske ramme
- Flyt musen til den stereotaxiske ramme og læg næsen i en fleksibel næsekegle. På dette stadium skal du sørge for, atO2-strømmen nu er rettet mod næsekeglen.
- Placer musen i den stereotaxiske ramme kun ved hjælp af ørestænger.
BEMÆRK: Sørg for, at ørestængerne er jævne, og at hovedet er plant. - Anteroflex musens hoved til en 90° vinkel ved manuelt at styre næsen. For at sikre denne position skal du placere en plastbarriere mellem museadapterens ørestangssøjler parallelt med søjlerne. Den flade del af kraniet tjener som reference, svarende til den flade kranietilgang i konventionel stereotaksisk kirurgi.
BEMÆRK: Bøj ikke hovedet for meget (dvs. ud over en vinkel på 90° mellem planet af den frontale kranieknogle og planet af bordets overflade), da dette hindrer luftstrømmen gennem den øvre luftvej. Hvis luftstrømmen hindres, skal du flytte musen og sørge for, at kroppen understøttes under bagagerummet, og at et plastkort er sat til 90° mellem planet for den frontale kranieknogle og planet af bordets overflade som skitseret i figur 2A,C. - Placer varmepuden under musen, og sørg derefter for, at nakken og resten af kroppen er placeret på samme niveau (dvs. ca. 180° eller parallelt med bordet). Værktøjskassen, der holder fjedersaksen, kan bruges til at løfte kroppen til denne position.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt, da den kaudale hjernestamme og øvre livmoderhalsledning bevæger sig afhængigt af position, i modsætning til mere rostrale dele af CNS, der holdes på plads af kraniet. - En enkelt dosis på 4 mg/kg Meloxicam slow-release (SR) injiceres subkutant (s.c.) med et volumen på 2 μL/g legemsvægt, og smøremiddel anbringes på øjnene.
- Rengør det kirurgiske snitsted først med en 70% alkohol prep pad, derefter med en betadin prep pad, og derefter igen med en alkohol prep pad og lad tørre.
- Placer en drapering under kroppen.
- Desinficer hænder og tag sterile handsker på.
- Placer en drapering på det kirurgiske sted.
4. Kirurgi for at få adgang til cisterna magna
- Sørg for, at musen er korrekt anæstesi ved at klemme tæerne eller kontrollere hornhinderefleksen.
- Reducer isofluran til vedligeholdelsesniveauer (2.0).
- Lav et snit på 1-1,2 cm med kirurgisk blad nr. 10 fra kanten af den occipitale knogle mod skuldrene i en jævn bevægelse.
- Lav et snit i midterlinjen raphe af trapezius muskel. Dette udsætter de parrede longus capitis muskler.
BEMÆRK: Hos mus er trapeziusmusklen en meget tynd, næsten gennemsigtig muskel. Sørg for at blive i midterlinjen og skær ikke i de underliggende muskler, da dette vil forårsage unødvendig blødning. - Placer begge retraktorkroge mellem de parrede longus capitis muskler, den ene orienteret til venstre og den anden til højre. Vægten af hæmostaterne giver spænding til retraktorkrogene, som kan ændres ved at justere hæmostaternes position igen.
- Placer det kirurgiske mikroskop på plads for bedre at visualisere det kirurgiske felt.
- Brug den stumpe laminektomi tang til at adskille venstre og højre mave af den parrede longus capitis muskel, startende fra occiput, hvor midterlinjen er let synlig. Før den stumpe tang hen over knoglen i nakkebenet i midterlinjen ned til det sted, hvor den møder den cisternale dura mater, og fortsæt derefter over dura mater til atlaset.
BEMÆRK: Der er ingen grund til at skære igennem de parrede longus capitis muskler, da intet holder dem sammen i midterlinjen; dette vil forårsage unødvendig blødning. - Flyt retraktorerne og juster spændingen ved at omplacere hæmostaterne og åbne udsigten til cisterna magna.
- Brug den stumpe laminektomi tang til at adskille musklerne yderligere i midterlinjen for at få et godt visningsvindue i hjernestammen og lillehjernen.
- Gentag trin 4.7-4.9 efter behov, indtil lillehjernen og hjernestammen kommer i betragtning under duraen.
- Ved hjælp af stump laminektomi tang skal du rydde duraen af de små tråde af bindevæv ved at flytte tangen fra midterlinjen i lateral retning, indtil der er et klart overblik over hjernestammen og for at skabe mere lateral plads efter behov for målet.
5. Åbning af cisternalmembranen
- Brug den vinklede Dumont-tang (#4/45) til at få fat i duraen, som strækker sig fra den occipitale knogle til atlaset. Tag fat i duraen nær den occipitale knogle, og brug fjedersaksen til at lave en lille åbning (~ 0,5 til 1,5 mm) i duraen.
BEMÆRK: På dette rostrale sted er mellemrummet mellem hjernestammen og den overliggende dura bredest, hvilket giver rigelig plads til sikker manipulation af duraen. - Brug fjedersaksen til at løfte duraen og åbne duraen yderligere. Vinduets størrelse afhænger af målet.
BEMÆRK: Et større vindue vil være nødvendigt, når der foretages flere langsgående injektioner eller bilaterale injektioner; et lille vindue vil være tilstrækkeligt, når der foretages enkelt ensidige eller midterlinjeinjektioner. - Når duraen er åbnet, drænes overskydende cerebrospinalvæske med en steril cue tip.
6. Identifikation af landemærker og nulpunkt
- Se hjernestammens dorsale overflade med detaljerede landemærker gennem den åbne dura. Obex, det punkt, hvor den centrale kanal åbner ind i IV-ventriklen, er det standard forreste-bageste og mediolaterale nulpunkt.
7. Målkoordinater
BEMÆRK: For forskellige mål har vi inkluderet en liste over standardkoordinater med forreste posterior (AP) og mediolaterale (ML) koordinater i forhold til nulpunkts bregma og cisterna magna koordinater med AP- og ML-koordinater i forhold til nulpunkt obex for at lette overgangen mellem metoder (tabel 1). Dorsoventrale (DV) koordinater er i forhold til overfladen af hjernen eller cerebellum (standard tilgang) eller overfladen af hjernestammen eller øvre cervikal ledning (cisterna magna tilgang) på tidspunktet for AP og ML indgang. Planlægning skal ske inden operationen.
- Brug de tre sæt koordinater til at bestemme målet: AP, ML og DV. På grund af hovedpositionen varierer den relative orientering af hjernestammestrukturer efter placering.
- For målafstand >0,4 mm fra kaudal til obex (figur 1B, grøn) skal du udføre følgende.
- AP: Brug ethvert standard stereotaksisk referenceatlas (f.eks. Paxinos og Franklin atlas2) eller vævsserier skåret i det tværgående plan til at estimere AP-afstanden mellem obex og målet.
- ML: Brug ethvert standard stereotaxisk referenceatlas eller vævsserier, der er skåret i tværplanet, til at estimere ML-afstanden mellem obex og målet.
- DV: Estimer koordinater i forhold til overfladen af hjernen eller lillehjernen ved AP- og ML-målpunktet. Brug ethvert standard stereotaxisk referenceatlas eller vævsserie skåret i tværplanet til at estimere afstanden mellem hjernestammeoverfladen ved de ønskede AP- og ML-koordinater og målet.
- For målafstand <0,4 mm fra kaudal til obex (figur 1B, orange) skal du gøre følgende.
- AP: Juster koordinater for at tage højde for anteroflexion af hjernestammen. For ventrale og rostrale koordinater vil AP-hjernestammeindgangspunktet være mere kaudalt i forhold til mål-AP-koordinaten i standardplanet.
- ML: Udled målkoordinater fra et standard stereotaxisk referenceatlas eller vævsserie skåret i tværplanet. Koordinaterne vil være i forhold til den visualiserede midterlinje på mål-AP-niveau.
- DV: Estimer koordinater i forhold til overfladen af hjernestammen ved AP- og ML-målpunktet. Juster DV for at tage højde for anteroflexion af hjernestammen. For ventrale og rostrale koordinater vil DV-koordinaterne være større end afstanden fra hjernestammens dorsale overflade i standardplanet.
- For målafstand >0,4 mm fra kaudal til obex (figur 1B, grøn) skal du udføre følgende.
8. Injektion af målet
- Sænk pipetten eller sprøjten til målet ved hjælp af den stereotaxiske arm, og injicer opløsningen som for standard stereotaksiske tilgange. Lad det sidde i 1-5 minutter efter injektion for at undgå et nålespor, når du bruger volumener mellem 3-50 nL. Løft derefter pipetten eller sprøjten ved hjælp af den stereotaksiske arm.
- Gentag trin 8.1. for flere mål.
9. Lukning af det kirurgiske felt
- Fjern krogene forsigtigt fra det kirurgiske felt. De parrede longus capitis muskler vil falde tilbage i en neutral position, der fuldt ud dækker cisterna magna. Luk ikke trapeziusmusklen og dura mater i midterlinjen, da de er for skrøbelige til at holde suturer.
- Luk huden med tre nylon- eller polypropylensuturer (5-0 eller 6-0).
10. Postoperativ pleje
- Sluk for isofluran, og fjern musen fra den stereotaksiske ramme. Placer musen i et rent bur på en varmepude og observer, indtil den er vågen og bevæger sig.
- Overvåg sundhedsstatus, vægt og suturer på postoperative dage 1-3. Fjern suturer på dag 10, hvis de ikke allerede er fjernet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cisterna magna-tilgangen gør det muligt at målrette mod kaudal hjernestamme og øvre cervikale ledningsstrukturer, der ellers er svære at nå via standard stereotaksiske tilgange eller er tilbøjelige til inkonsekvent målretning. Operationen for at nå cisterna magna kræver snit i huden, et tyndt lag trapezius muskel og åbning af dura mater og tolereres derfor godt af mus. Det er især effektivt og mindre invasivt, når det målrettes mod flere (langsgående dispergerede eller bilaterale) steder, da det ikke kræver boring af flere burrhuller som i standard stereotaksiske tilgange. I mus har vi rutinemæssigt målrettet strukturer som den hypoglossale kerne9, ventral respiratorisk gruppe8 og tilstødende retikulær dannelse8 i den kaudale hjernestamme ved hjælp af cisterna magna-tilgangen, som vi yderligere illustrerer for den hypoglossale kerne og den ventroediale medulla (GiV) i figur 3. For eksempel er den hypoglossale kerne en slank, men rostrokaudalt langstrakt søjle af motoneuroner i den dorsale medulla oblongata, og dens rostrale pol kan målrettes via en standard tilgang. Men da DV-koordinaterne (~4,5 mm) for det meste dikteres af den overlysende lillehjerne med kun 1,2-1,4 mm ind i hjernestammen, kan en relativt lille forskel i placeringen af musens hoved derfor let resultere i en fejlplaceret injektion. På grund af nærheden af dette mål til nulpunkts-obexen kan det målrettes mere pålideligt via cisterna magna-tilgangen. Desuden kan den kaudale ende af den hypoglossale kerne, der strækker sig indtil overgangen mellem hjernestammen og rygmarven, målrettes mod den samme cisterna magna-tilgang, mens standardmetoden skal ændres for at nå et sådant kaudalt sted ved at fiske AP-tilgangen og justere koordinater for at undgå occipital knogle og overliggende nakkemuskulatur.
For at bestemme nøjagtigheden af cisterna magna-tilgangen i forhold til standardmetoden målte vi afstanden mellem tilsigtede og faktiske målsteder i anteroposterior, mediolaterale og dorsoventrale planer for ventral (ventromedial medulla; GiA/V; N = 10) og dorsal (NuXII; N = 16) regioner. Målingerne blev foretaget i tværsnit af den kaudale hjernestamme (figur 3). Resultaterne (figur 4) viser signifikant mindre fejl i anteroposterior, mediolaterale og især dorsoventrale planer for cisterna magna-tilgangen sammenlignet med standardmetoden. Disse resultater fremhæver den forbedrede nøjagtighed af cisterna magna-tilgangen til disse mål. Vi har inkluderet standard stereotaksiske koordinater (i forhold til bregma, afledt af Paxinos og Franklin 2, men optimeret til vores undersøgelser) og cisterna magna koordinater (i forhold til obex) i tabel 1. Disse koordinater er alle blevet optimeret og verificeret som vist for hypoglossalkernen og den ventrodeiale medulla i figur 3.
Figur 1: Skematisk repræsentation af vigtige landemærker, målområder og planet for den stereotaxiske cisterna magna-tilgang. (A) Centrale anatomiske landemærker og positionering i sagittalplanet. (B) Områder, der kan nås gennem den standard stereotaxiske tilgang versus cisterna magna stereotaxic tilgang og relation til deres referencepunkter. i) Standardmetoden gør brug af benede landemærker bregma og lambda, som ligger fjernt fra målregioner i magenta og lilla. Området i magenta (kaudal medulla oblongata og øvre cervikal ledning) er udfordrende at nå på grund af de skrå occipitale knogle- og nakkemuskler. Området i lilla (rostral medulla oblongata) er tilbøjeligt til bevægelse og fjernt fra traditionelle vartegn. ii) Cisterna magna-tilgangen er hensigtsmæssig til at få adgang til den kaudale medulla oblongata og øvre cervikale ledning og har fordele, når man studerer hjernestammestrukturer, der er organiseret i langsgående søjler, der strækker sig fra den kaudale medulla oblongata rostrally, op til niveauet af de kaudale pons. (C) Skematisk oversigt over planerne for forskellige stereotaxiske referenceatlasser i forhold til cisterna magna-tilgangen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin-for-trin skematisk oversigt over den stereotaxiske cisterna magna-tilgang. (A) Museadapter med ørestænger jævnt placeret på højeste niveau, mundstangen i en sænket position og et plastkort til at fastgøre det anteroflexede hoved i en 90 ° vinkel. (B) Fastgør musen i den stereotakksiske ramme ved hjælp af ørestængerne og anteroflex hovedet ved 90° og hold det på plads via et stift plastkort med den stereotaxiske ramme som reference. (C) Sørg for, at kroppen er forhøjet, så den er i samme plan som occiput. Palpate vigtige vartegn. (D) Lav et hudsnit fra nakkebenet til den rostrale del af skuldrene. (E) Lav et snit i trapeziusmusklens raphe. Sørg for at blive i midterlinjen og skær ikke i de underliggende muskler. (F) Identificer midterlinjen mellem de to maver i longus capitis-musklen, der starter ved nakkebenet, og led laminektomi-tangen i en kaudal retning. (G) Placer hver af sårkrogene mellem maven i longus capitis-musklen og re-position, indtil cisterna magna kommer til syne. (H) Identificer benede landemærker (occipital knogle, atlas), dura mater, der strækker sig mellem disse benede strukturer, og den underliggende cerebellum og hjernestamme. Rengør dura mater efter behov for at eksponere målniveauet. (I) Brug fjedersaks og fine tang til at åbne duraen. (J) Identificer obex, som danner AP- og ML-nulpunktet. Flyt pipetten til de valgte AP- og ML-koordinater. Sænk pipetten, indtil den når hjernestammens dorsale overflade. Dette er DV-nulpunktet. Sænk pipetten til den ønskede koordinat. (K) Fjern pipetten og sårkrogene, og lad longus capitis-musklerne genoptage deres oprindelige position. (L) Luk såret, og fjern musen fra den stereotaksiske ramme. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Evaluering af målkoordinater. Fotomikrografer med lav forstørrelse af den kaudale hjernestamme. (A) Injektion af retrograd sporstof koleratoksin underenhed b (CTb; blå) i hypoglossalkernen i en ChAT-cre L10 GFP (grøn) reportermus (hun, 6 måneder gammel). Bemærk, at CTb-injektionen er begrænset til den hypoglossale kerne. (B) Transfektion af glutamatergiske celler af en vGluT2-ires-cre L10 GFP reporter (grøn) mus (han, 2 måneder gammel) med et betinget anterograd sporstof (magenta) i den ventrale del af den kaudale mediale medulla oblongata (kaudal pol i GiV-regionen). (C) Betinget retrograd sporing i en vGLuT2-ires-cre mus (han, 2 måneder gammel), der viser TVA (magenta) transfektion af glutamatergiske neuroner og modificeret rabiesinfektion (grøn) i den kaudale mediale medulla oblongata (kaudal pol i GiV-regionen). Rabiesvirus blev injiceret i den øvre cervikale rygmarv. Interne vartegn tjener som vejledning. Forkortelser-cAmb: Kompakt kerne i Ambiguus-komplekset; Ap: Område Postrema; DMV: Vagus' dorsale motorkerne; GiV: Gigantocellulær kerne, ventral del; IO: Ringere oliven; IRt: Mellemliggende retikulær kerne; LRN: Lateral retikulær kerne; NuXII- Hypoglossal kerne; sol: Kernen i den ensomme kanal; Sp5: Spinal trigeminuskerne; VRG: ventral åndedrætsgruppe. Skalabjælke: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af nøjagtigheden mellem standard- og cisterna magna-tilgangene. Gennemsnitlig afstand mellem midten af det tilsigtede mål og midten af det faktiske sted i det anteroposteriorplan (A), middelmådige plan (B) og dorsoventrale plan (C). Data blev opnået fra N = 13 voksne mus ved hjælp af en standardmetode og N = 13 voksne mus ved hjælp af en cisterna magna-tilgang. Målets radius blev sat til 30 μm. Resultaterne viser højere nøjagtighed i det anteroposteriorplan (t(24) = 2,08, p = 0,049; to-halet t-test; alfa 0,05), mediolateralt plan (t(24) = 2,55, p = 0,018; to-halet t-test; alfa 0,05) og dorsoventralt plan (t(24) = 4,33, p = 0,0002; to-halet t-test; alfa 0,05). Søjlediagrammer repræsenterer gennemsnittet med standardafvigelse, og individuelle prikker repræsenterer værdier i hver mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Oversigt over standard- og cisterna magna stereotaksiske koordinater til målretning af kaudale hjernestammestrukturer. Bemærk, at for både standard- og cisterna magna-tilgangene er koordinaterne fra Paxinos og Franklin atlas2 blevet justeret, indtil regioner af interesse blev passende målrettet som verificeret af histologi (figur 3). Bemærk også, at områder i den retikulære formation mangler veldefinerede grænser og her er mærket som i Paxinos og Franklin2. Forkortelser-AP: anteroposterior. ML: mediolateral. DV: dorsoventral. ChAT: Cholin acetyltransferase; F: Kvinde; M: Mand; M & F: Mand og kvinde; NA: ikke relevant; Pet1: plasmacytom udtrykt transkriptionsfaktor 1; Sert: Serotonin transportør, vGaT: Vesikulær GABA transportør; vGluT2: Vesikulær glutamattransportør 2; WT: Vildtype. Alle koordinater er i millimeter (mm). Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standard stereotaksisk kirurgi er almindeligvis afhængig af kraniet landemærker for at beregne koordinaterne for målsteder i CNS1. Målsteder tilgås derefter via burrhuller, der bores gennem kraniet1. Denne metode er ikke ideel til den kaudale hjernestamme, da målsteder er placeret fjernt fra kraniets landemærker i anteroposterior og dorsoventrale planer2, og da kraniets anatomi og overliggende muskler gør adgangen udfordrende6 (figur 1Bi). Vores undersøgelse beskriver en alternativ stereotaksisk tilgang til adgang til målsteder i den kaudale hjernestamme og øvre rygmarv kaldet cisterna magna-tilgangen. Nøglefunktioner, der gør denne metode forskellig fra en standard stereotaktisk tilgang, er positionering med anteroflexion af hovedet for at åbne cisterna magna og brug af vigtige hjernestamme landemærker på hjernestammens dorsale overflade som referencepunkter som obex. Vores resultater indikerer, at denne fremgangsmåde er egnet til levering af små mængder (5-50 nL) sporstoffer eller adeno-associerede vira (AAV'er) i diskrete hjernestammestrukturer. Desuden øger anvendelsen af et referencepunkt, der repræsenterer et CNS-vartegn snarere end en benstruktur, og som ligger tæt på det tilsigtede mål, reproducerbarheden og nøjagtigheden for små mål og små injektionsvolumener, alt efter hvad der er relevant for kredsløbskortlægning og kemogenetiske undersøgelser (figur 3) 14,15.
Som med enhver protokol har cisterna magna-tilgangen trin, der er kritiske for at opnå reproducerbarhed. Som med enhver stereotaksisk tilgang, der er afhængig af koordinater i tre forskellige planer (anteroposterior, mediolateral og dorsoventral), er positionering kritisk. For cisterna magna-tilgangen involverer dette ikke kun hovedets position, som skal anteroflexes ved 90 °, men også kroppens, som skal hæves, så den kaudale hjernestamme og øvre livmoderhalsledning er i samme plan. Et andet kritisk skridt er at undgå unødvendige manipulationer, der forårsager blødning, da dette ville hæmme visualiseringen af vigtige vartegn. Der er to manipulationer, der bærer en høj risiko for blødning. For det første er dura mater, der dækker cisterna magna, dækket af en relativt stor muskel (longus capitis). Da dette er en parret muskel med en mave på hver side af midterlinjen, skal de to maver i denne muskel kun forsigtigt adskilles i midterlinjen. Snit af disse muskler er ikke nødvendigt og vil forårsage blødning. For det andet vil et variabelt antal vener med et variabelt forløb ved den vellykkede åbning af dura mater blive synligt oven på den dorsale overflade af den kaudale hjernestamme og øvre livmoderhalsledning. Disse vener bør undgås ved at anvende mindre justeringer i koordinater (op til 0,1 mm) eller, hvis forsøgsparadigmet tillader det, ved at vælge et andet mål.
En stor fordel ved cisterna magna-tilgangen er, at den giver adgang til hjernestammen og øvre cervikale strukturer, der er udfordrende at nå, når man bruger det standard stereotaksiske plan, da de er placeret nær den kaudale ende af eller bare kaudal til den occipitale knogle. For mål i medulla oblongata undgår tilgangen desuden lillehjernen, og derfor er cerebellære læsionseffekter eller falsk mærkning via en nålekanal, hvilket kan påvirke undersøgelsesresultaterne ved anvendelse af standardmetodologi ikke et problem. En anden fordel ved cisterna magna-tilgangen er, at hjernestammens dorsale overflade bliver synlig. Dette giver mulighed for at bruge et vartegn på den dorsale overflade som referencepunkt for koordinater. Desuden er tilgangen fleksibel og kan optimeres afhængigt af målet. For eksempel brugte vi et midterlinjemærke, obex, som referencepunkt. Men når man målretter mod dorsale strukturer, kan selve strukturen af interesse diktere landskabet på den dorsale overflade. For eksempel stikker den ydre cuneatkerne dorsalt ud og kan således visualiseres og injiceres direkte. For laterale mål, såsom den ventrale åndedrætsgruppe eller tvetydige kompleks, kan cisterna magna-vinduet øges i lateral retning. Ligeledes kan vinduet forlænges mod atlaset til målretning af øvre cervikale strukturer. Mens vi brugte en museadapter placeret i en stor dyrestereotaktisk ramme, kan tilgangen let tilpasses andre rammer eller opsætninger, så længe de vigtigste trin følges. For eksempel, i stedet for et plastkort, kan mundstangen placeres mod næsebroen for at holde hovedet i en stabil anteroflexed position. Det er værd at bemærke, at koordinater for hjernestammens målsteder med obex som nulpunkt, som angivet i tabel 1, tjener som reference, og justeringer kan angives baseret på musestammen, alder, køn, kalibrering af den stereotaxiske arm og positioneringsteknik, svarende til justeringer, som man skal foretage, når man udleder målkoordinater for en standardtilgang fra et referenceatlas. Dette kræver indsigt i indflyvningsplanet, især for mere rostrale mål som illustreret i figur 1. Test af koordinater kan udføres ved hjælp af forskellige sporstoffer, for eksempel fluorescerende perler eller fluorescerende mærket koleratoksinunderenhed b for forskellige koordinater i samme mus. Histologiske analyser af hjernestamme / rygmarvsvævssektioner (ikke omfattet af denne protokol) giver derefter feedback om lokalisering i forhold til objektive interne landemærker 8,9,11,16 eller til sammenligning med et referenceatlas. Koordinater kan derefter justeres, testes igen og færdiggøres.
Cisterna magna-tilgangen har også begrænsninger. CNS-regioner, der kan nås via denne tilgang, er begrænset til de kaudale pons, medulla oblongata og øvre livmoderhalsledning. Mens de kaudale pons let kan tilgås via standardmetoden, har cisterna magna-tilgangen fordele, når man studerer underinddelinger af langsgående orienterede strukturer, der strækker sig fra medulla oblongata ind i de kaudale pons, som det er tilfældet for underinddelinger inden for den retikulære formation. En anden relativ begrænsning opstår, når man bruger denne fremgangsmåde for anden gang i den samme mus, for eksempel i modificeret rabiessporing14. Tilstedeværelsen af arvæv kan øge varigheden af operationen eller uklare mindre vartegn. I vores hænder har denne metode dog stadig været bedre end den standard stereotaksiske tilgang i dette tilfælde, da stedet for den første injektion kan dokumenteres i forhold til placeringen af vener af andre unikke vartegn, hvilket gør det nemt at finde det nøjagtige indgangspunkt tilbage. Selvom denne tilgang er overlegen til sporing af undersøgelser i den kaudale medulla og øvre rygmarv, kan den ikke bruges til kronisk implantathardware. Derfor, for in-vivo optogenetik og calciumbilleddannelsesundersøgelser, der kræver implantation af optiske fibre17 , kan cisterna magna-tilgangen først bruges til at levere en AAV til målstedet, efterfulgt af en anden operation ved hjælp af en standardmetode til instrumentmus med fibre eller kanyler. Denne tilgang gør det muligt for en at holde målstedet diskret, mens fiber / hardwareplacering er mere tilgivende (dvs. kan være mindre nøjagtig) på grund af hardwarens relativt store størrelse. Endelig kræver cisterna magna-tilgangen mere avancerede kirurgiske færdigheder end en standard stereotaksisk tilgang. I stedet for anerkendelse af simple benede landemærker kræver det indsigt i mere komplekse hjernestamme og muskuloskeletale vartegn. Som med enhver delikat operation afhænger procedurens succes og effektivitet også af et ordentligt værktøjssæt, der er i fremragende stand. Denne protokol behandler sidstnævnte problemer og kan bruges som en detaljeret vejledning af eksperimenter.
Afslutningsvis er cisterna magna-tilgangen komplementær til den standard stereotaksiske tilgang og giver flere fordele, når man målretter mod den kaudale hjernestamme og øvre livmoderhalsledning, som ikke let kan tilgås via en standard stereotaksisk tilgang. Det bruger referencepunkter, der er CNS snarere end benede landemærker, der ligger tæt på de tilsigtede mål, hvilket øger reproducerbarheden og nøjagtigheden. Dette gør tilgangen særlig værdifuld, når små injektionsvolumener skal leveres til diskrete steder i forbindelse med detaljeret kortlægning eller kemogenetiske undersøgelser. Denne tilgang er også relevant for funktionelle kemogenetiske, optogenetiske, fiberfotometri- eller læsionsmetoder, hvor en AAV-virus eller et toksin leveres til et mål med motorisk funktion eller sensorimotorisk integration som en udlæsning: den undgår et kursus gennem lillehjernen for mål i medulla oblongata og begrænser derfor dens interferens i undersøgelsesresultaterne. Ud fra et dyrevelfærdsmæssigt synspunkt kræver proceduren ikke, at der bores flere huller for at få adgang til steder bilateralt eller i længderetningen, hvilket reducerer operationens varighed og indgrebets invasivitet. Mens vi skitserede tilgangen i detaljer for mus, gælder de samme principper for andre arter 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01 NS079623, P01 HL149630 og P01 HL095491.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, Wolfe Publishing Ltd. (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science. , Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004).
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
