Stereotaxische chirurgische benadering van micro-injecteren van de caudale hersenstam en het bovenste cervicale ruggenmerg via de Cisterna Magna bij muizen

Summary

Stereotaxische chirurgie om hersenlocaties bij muizen te targeten, omvat vaak toegang via de schedelbotten en wordt geleid door schedeloriëntatiepunten. Hier schetsen we een alternatieve stereotaxische benadering om de caudale hersenstam en het bovenste cervicale ruggenmerg te richten via de cisterna magna die afhankelijk is van directe visualisatie van hersenstamoriëntatiepunten.

Abstract

Stereotaxische chirurgie om hersenlocaties bij muizen te targeten, wordt meestal geleid door schedeloriëntatiepunten. Toegang wordt vervolgens verkregen via braamgaten die door de schedel worden geboord. Deze standaardbenadering kan een uitdaging zijn voor doelen in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale navelstreng vanwege specifieke anatomische uitdagingen, omdat deze locaties ver verwijderd zijn van schedeloriëntatiepunten, wat leidt tot onnauwkeurigheid. Hier schetsen we een alternatieve stereotaxische benadering via de cisterna magna die is gebruikt om zich te richten op discrete gebieden van belang in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale koord. De cisterna magna strekt zich uit van het achterhoofdsbeen tot de atlas (d.w.z. het tweede wervelbeen), is gevuld met hersenvocht en wordt bedekt door dura mater. Deze benadering biedt een reproduceerbare toegangsweg tot geselecteerde structuren van het centrale zenuwstelsel (CZS) die anders moeilijk te bereiken zijn vanwege anatomische barrières. Bovendien maakt het directe visualisatie van hersenstamoriëntatiepunten in de nabijheid van de doellocaties mogelijk, waardoor de nauwkeurigheid toeneemt bij het leveren van kleine injectievolumes aan beperkte gebieden van belang in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale koord. Ten slotte biedt deze aanpak de mogelijkheid om het cerebellum te vermijden, wat belangrijk kan zijn voor motorische en sensomotorische studies.

Introduction

Standaard stereotaxische chirurgie om hersenplaatsen bij muizen te targeten¹ omvat gewoonlijk fixatie van de schedel met behulp van een set oorstaven en een mondbalk. Coördinaten worden vervolgens geschat op basis van referentieatlassen ^2,3 en schedeloriëntatoren, namelijk bregma (het punt waar de hechtingen van de frontale en pariëtale botten samenkomen) of lambda (het punt waar de hechtingen van de pariëtale en occipitale botten samenkomen; Figuur 1A,B). Via een braamgat in de schedel boven het geschatte doel kan vervolgens het doelgebied worden bereikt, hetzij voor levering van micro-injecties of instrumentatie met canules of optische vezels. Door variatie in de anatomie van deze hechtingen en fouten in de lokalisatie van bregma of lambda ^4,5 varieert de positie van nulpunten ten opzichte van de hersenen van dier tot dier. Hoewel kleine fouten in de targeting, die het gevolg zijn van deze variabiliteit, geen probleem zijn voor grote of nabijgelegen doelen, is hun impact groter voor kleinere interessegebieden die ver verwijderd zijn van de nulpunten in de anteroposterior- of dorsoventrale vlakken en / of bij het bestuderen van dieren van verschillende grootte als gevolg van leeftijd, stam en / of geslacht. Er zijn verschillende extra uitdagingen die uniek zijn voor de medulla oblongata en het bovenste cervicale koord. Ten eerste zijn kleine veranderingen in anteroposteriorcoördinaten geassocieerd met significante veranderingen in dorsoventrale coördinaten ten opzichte van de dura, als gevolg van de positie en vorm van het cerebellum (figuur 1Bi)^2,6,7. Ten tweede bevindt het bovenste cervicale koord zich niet in de schedel². Ten derde maakt de schuine positie van het achterhoofdsbeen en de bovenliggende laag nekspieren² de standaard stereotaxische benadering nog uitdagender voor structuren die zich in de buurt van de overgang tussen de hersenstam en het ruggenmerg bevinden (figuur 1Bi). Ten slotte zijn veel doelen van belang voor de caudale hersenstam en cervicale navelstreng klein², waarvoor nauwkeurige en reproduceerbare injecties^{nodig zijn 8,9}.

Een alternatieve aanpak via de cisterna magna omzeilt deze problemen. De cisterna magna is een grote ruimte die zich uitstrekt van het achterhoofdsbeen tot de atlas (figuur 1A, d.w.z. het tweede wervelbeen)¹⁰. Het is gevuld met hersenvocht en bedekt met dura mater¹⁰. Deze ruimte tussen het achterhoofdsbeen en de atlas opent zich bij het anteroflexen van het hoofd. Het is toegankelijk door te navigeren tussen de bovenliggende gepaarde buiken van de longus capitis spier, waardoor het dorsale oppervlak van de caudale hersenstam wordt blootgesteld. Regio's van belang kunnen dan worden gericht op basis van de oriëntatiepunten van deze regio's zelf als ze zich in de buurt van het dorsale oppervlak bevinden; of door de obex te gebruiken, het punt waar het centrale kanaal uitkomt in de IV-ventrikel, als nulpunt voor coördinaten om diepere structuren te bereiken. Deze aanpak is met succes gebruikt bij verschillende soorten, waaronder de rat¹¹, kat¹², muis ^8,9 en niet-menselijke primaat¹³ om zich te richten op de ventrale ademhalingsgroep, medullaire mediale reticulaire formatie, de kern van het solitaire kanaal, gebied postrema of hypoglossale kern. Deze aanpak wordt echter niet op grote schaal gebruikt, omdat het kennis van anatomie, een gespecialiseerde toolkit en meer geavanceerde chirurgische vaardigheden vereist in vergelijking met de standaard stereotaxische benadering.

Hier beschrijven we een stapsgewijze chirurgische aanpak om de hersenstam en het bovenste cervicale koord te bereiken via de cisterna magna, oriëntatiepunten te visualiseren, het nulpunt in te stellen (figuur 2) en doelcoördinaten te schatten en te optimaliseren voor stereotaxische afgifte van micro-injecties in de discrete hersenstam- en ruggenmerggebieden van belang (figuur 3). Vervolgens bespreken we de voor- en nadelen van deze aanpak.

Protocol

De auteur verklaart dat het protocol de richtlijnen volgt van het Institutional Animal Care and Use Committee in het Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Voorbereiding van chirurgische instrumenten en stereotaxisch frame

OPMERKING: De operatie wordt uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. De steriliteit wordt gehandhaafd met behulp van de steriele tiptechniek.

1. Installeer de stereotaxische arm met een micropipette of spuit gevuld met een injecteerbaar product naar keuze (adeno-geassocieerd virus (AAV) of conventionele tracer) op het stereotaxische frame en bereid de muisadapter voor (figuur 2A).
2. Bereid geautoclaveerde chirurgische instrumenten (materiaaltafel) voor en plaats ze op een steriel oppervlak.

2. Anesthesie inductie en muis voorbereiding

1. Zet O₂ aan op 0,5 l/min en stel de isofluraanverdamper in op 4,0, zorg ervoor dat de O_2-stroom naar de inductiebox gaat.
   LET OP: Zorg ervoor dat de isofluraan inductiedoos in een kap is geplaatst en dat de isofluraan van de operatieplaats wordt verwijderd.
2. Plaats de muis (10 weken oude reu C57BL/6J) in de inductiekamer.
3. Zodra de ademhaling is vertraagd, opent u de inductiekamer en tilt u de muis iets op. Gebruik tondeuses om het haar van hoofd tot schouders te verwijderen.

3. Positionering van de muis in het stereotaxische frame

1. Beweeg de muis naar het stereotaxische frame en plaats de neus in een flexibele neuskegel. Zorg er in dit stadium voor dat de O_2-stroom nu naar de neuskegel wordt geleid.
2. Plaats de muis in het stereotaxische frame met alleen oorstaven.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de oorstaven gelijkmatig zijn en dat het hoofd waterpas staat.
3. Anteroflex de kop van de muis in een hoek van 90° door de neus handmatig te begeleiden. Om deze positie te bevestigen, plaatst u een plastic barrière tussen de oorbalkstijlen van de muisadapter, parallel aan de pilaren. Het platte deel van de schedel dient als referentie, vergelijkbaar met de platte schedelbenadering in conventionele stereotaxische chirurgie.
   OPMERKING: Buig het hoofd niet te veel (d.w.z. voorbij een hoek van 90° tussen het vlak van het frontale schedelbot en het vlak van het oppervlak van de tafel), omdat dit de luchtstroom door de bovenste luchtwegen belemmert. Als de luchtstroom wordt belemmerd, verplaatst u de muis, zorg ervoor dat het lichaam onder de stam wordt ondersteund en dat een plastic kaart wordt ingesteld op 90 ° tussen het vlak van het frontale schedelbot en het vlak van het oppervlak van de tafel zoals beschreven in figuur 2A, C.
4. Plaats het verwarmingskussen onder de muis en zorg er vervolgens voor dat de nek en de rest van het lichaam op hetzelfde niveau zijn geplaatst (d.w.z. op ongeveer 180 ° of evenwijdig aan de tafel). De gereedschapskist die de veerschaar vasthoudt, kan worden gebruikt om het lichaam naar deze positie te tillen.
   OPMERKING: Deze stap is belangrijk omdat de caudale hersenstam en de bovenste cervicale navelstreng afhankelijk van de positie bewegen, in tegenstelling tot meer rostrale delen van het CZS die op hun plaats worden gehouden door de schedel.
5. Injecteer een enkele dosis van 4 mg/kg Meloxicam slow-release (SR) subcutaan (s.c.) bij een volume van 2 μL/g lichaamsgewicht en breng glijmiddel op de ogen.
6. Reinig de chirurgische incisieplaats eerst met een 70% alcoholvoorbereidingspad, vervolgens met een betadine-preppad en vervolgens opnieuw met een alcoholvoorbereidingspad en laat drogen.
7. Plaats een gordijn onder het lichaam.
8. Desinfecteer de handen en trek steriele handschoenen aan.
9. Plaats een gordijn op de operatieplaats.

4. Chirurgie om toegang te krijgen tot de cisterna magna

1. Zorg ervoor dat de muis op de juiste manier wordt verdoofd door in de tenen te knijpen of de hoornvliesreflex te controleren.
2. Isofluraan verlagen tot onderhoudsniveaus (2.0).
3. Maak een incisie van 1-1,2 cm met chirurgisch mes # 10 van de rand van het achterhoofdsbeen naar de schouders in één vloeiende beweging.
4. Maak een incisie in de middellijn raphe van de trapezius spier. Dit stelt de gepaarde longus capitis spieren bloot.
   OPMERKING: Bij muizen is de trapeziusspier een zeer dunne, bijna transparante spier. Zorg ervoor dat u in de middellijn blijft en snijd niet in de onderliggende spieren, omdat dit onnodige bloedingen zal veroorzaken.
5. Plaats beide retractorhaken tussen de gepaarde longus capitis spieren, de ene naar links en de andere naar rechts. Het gewicht van de hemostaten zorgt voor spanning aan de retractorhaken die kunnen worden gewijzigd door de positie van de hemostaten opnieuw aan te passen.
6. Plaats de chirurgische microscoop op zijn plaats om het chirurgische veld beter te visualiseren.
7. Gebruik de stompe laminectomietang om de linker- en rechterbuik van de gepaarde longus capitis spier te scheiden, te beginnen bij het achterhoofd, waar de middellijn gemakkelijk zichtbaar is. Leid de stompe tang over het bot van het achterhoofd in de middellijn naar beneden naar waar het de cisternal dura mater ontmoet en ga dan verder over de dura mater naar de atlas.
   OPMERKING: Het is niet nodig om door de gepaarde longus capitis spieren te snijden, omdat niets ze bij elkaar houdt in de middellijn; dit zal onnodige bloedingen veroorzaken.
8. Verplaats de retractors en pas de spanning aan door de hemostaten te herpositioneren, waardoor het zicht op de cisterna magna wordt geopend.
9. Gebruik de stompe laminectomietang om de spieren verder in de middellijn te scheiden om een goed kijkvenster van de hersenstam en het cerebellum te krijgen.
10. Herhaal stap 4,7-4,9 indien nodig totdat het cerebellum en de hersenstam onder de dura in beeld komen.
11. Gebruik stompe laminectomietangen, maak de dura van de kleine strengen bindweefsel vrij door de tang van de middellijn in een laterale richting te bewegen, totdat er een duidelijk zicht is op de hersenstam en om meer laterale ruimte te creëren, zoals nodig voor het doelwit.

5. Opening van het stortbakmembraan

1. Gebruik de schuine Dumont-tang (#4/45) om de dura te grijpen, die zich uitstrekt van het achterhoofdsbeen tot de atlas. Pak de dura bij het achterhoofdsbeen en gebruik de veerschaar om een kleine opening (~0,5 tot 1,5 mm) in de dura te maken.
   OPMERKING: Op deze rostrale locatie is de ruimte tussen de hersenstam en de bovenliggende dura het breedst, waardoor er voldoende ruimte is voor veilige manipulatie van de dura.
2. Gebruik de veerschaar om de dura op te tillen en de dura verder te openen. De grootte van het venster is afhankelijk van het doel.
   OPMERKING: Een groter venster is nodig bij het maken van meerdere longitudinale injecties of bilaterale injecties; een klein venster is voldoende bij het maken van enkele unilaterale of middellijninjecties.
3. Zodra de dura is geopend, voert u overtollig hersenvocht af met een steriele cue tip.

6. Identificatie van oriëntatiepunten en nulpunt

1. Bekijk het dorsale oppervlak van de hersenstam met gedetailleerde oriëntatiepunten door de open dura. De obex, het punt waar het centrale kanaal uitkomt in de IV-ventrikel, is het standaard voorste-achterste en middelmatige nulpunt.

7. Doelcoördinaten

OPMERKING: Voor verschillende doelen hebben we een lijst met standaardcoördinaten opgenomen met anterieure posterieure (AP) en mediolaterale (ML) coördinaten ten opzichte van nulpunts bregma- en cisterna magna-coördinaten met AP- en ML-coördinaten ten opzichte van nulpunt obex om de overgang tussen methodologieën te vergemakkelijken (tabel 1). Dorsoventral (DV) coördinaten zijn relatief ten opzichte van het oppervlak van de hersenen of het cerebellum (standaard benadering) of het oppervlak van de hersenstam of bovenste cervicale koord (cisterna magna benadering) op het punt van AP en ML entry. Planning moet worden gedaan voorafgaand aan de operatie.

1. Gebruik de drie sets coördinaten om het doel te bepalen: AP, ML en DV. Vanwege de hoofdpositie varieert de relatieve oriëntatie van hersenstamstructuren per locatie.
   1. Voor doelafstand >0,4 mm van caudaal tot obex (figuur 1B, groen) voert u het volgende uit.
      1. AP: Gebruik een standaard stereotaxische referentieatlas (bijv. Paxinos en Franklin atlas²) of weefselreeksen die in het dwarsvlak zijn gesneden om de AP-afstand tussen obex en het doel te schatten.
      2. ML: Gebruik een standaard stereotaxische referentieatlas of weefselreeks die in het dwarsvlak is gesneden om de ML-afstand tussen obex en het doel te schatten.
      3. DV: Schattingscoördinaten ten opzichte van het oppervlak van de hersenen of het cerebellum op het AP- en ML-doelpunt. Gebruik een standaard stereotaxische referentieatlas of weefselreeks die in het dwarsvlak is gesneden om de afstand tussen het hersenstamoppervlak op de gewenste AP- en ML-coördinaten en het doel te schatten.
   2. Voor doelafstand <0,4 mm van caudaal tot de obex (figuur 1B, oranje) voert u het volgende uit.
      1. AP: Pas coördinaten aan om rekening te houden met anteroflexie van de hersenstam. Voor ventrale en rostrale coördinaten zal het AP-hersenstamingangspunt meer caudaal zijn ten opzichte van de doel-AP-coördinaat in het standaardvlak.
      2. ML: Leid doelcoördinaten af van een standaard stereotaxische referentieatlas of weefselreeks die in het dwarsvlak is gesneden. Coördinaten zijn relatief ten opzichte van de gevisualiseerde middellijn op het doel-AP-niveau.
      3. DV: Schattingscoördinaten ten opzichte van het oppervlak van de hersenstam op het AP- en ML-doelpunt. Pas DV aan om rekening te houden met anteroflexie van de hersenstam. Voor ventrale en rostrale coördinaten zullen de DV-coördinaten groter zijn dan de afstand tot het dorsale oppervlak van de hersenstam in het standaardvlak.

8. Injectie van het doelwit

1. Laat de pipet of spuit op het doel zakken met behulp van de stereotaxische arm en injecteer de oplossing zoals bij standaard stereotaxische benaderingen. Laat na de injectie 1-5 minuten op zijn plaats om een naaldspoor te voorkomen bij gebruik van volumes tussen 3-50 nL. Til vervolgens de pipet of spuit op met behulp van de stereotaxische arm.
2. Herhaal stap 8.1. voor meerdere doelen.

9. Sluiting van het operatieveld

1. Verwijder de haken voorzichtig uit het operatieveld. De gepaarde longus capitis spieren zullen terugvallen in een neutrale positie, die de cisterna magna volledig bedekt. Sluit de trapeziusspier en dura mater niet in de middellijn omdat ze te kwetsbaar zijn om hechtingen vast te houden.
2. Sluit de huid met drie nylon of polypropyleen hechtingen (5-0 of 6-0).

10. Postoperatieve zorg

1. Schakel isofluraan uit en verwijder de muis uit het stereotaxische frame. Plaats de muis in een schone kooi op een verwarmingskussen en observeer totdat hij wakker is en beweegt.
2. Controleer de gezondheidsstatus, het gewicht en de hechtingen op postoperatieve dagen 1-3. Verwijder hechtingen op dag 10 als ze nog niet zijn verwijderd.

Representative Results

De cisterna magna-benadering maakt het mogelijk om caudale hersenstam- en bovenste cervicale koordstructuren aan te pakken die anders moeilijk te bereiken zijn via standaard stereotaxische benaderingen of gevoelig zijn voor inconsistente targeting. De operatie om de cisterna magna te bereiken vereist incisies van de huid, een dunne laag trapeziusspier en opening van de dura mater en wordt daarom goed verdragen door muizen. Het is vooral efficiënt en minder invasief bij het richten op meerdere (longitudinaal verspreide of bilaterale) locaties, omdat het niet nodig is om meerdere braamgaten te boren zoals bij standaard stereotaxische benaderingen. Bij muizen hebben we routinematig structuren zoals de hypoglossale kern⁹, ventrale respiratoire groep⁸ en aangrenzende reticulaire formatie⁸ in de caudale hersenstam gericht met behulp van de cisterna magna-benadering, zoals we verder illustreren voor de hypoglossale kern en de ventromediale medulla (GiV) in figuur 3. De hypoglossale kern is bijvoorbeeld een slanke maar rostrocaudisch langwerpige kolom van motoneuronen in de dorsale medulla oblongata en de rostrale pool kan worden gericht via een standaardbenadering. Omdat de DV-coördinaten (~4,5 mm) echter meestal worden gedicteerd door het bovenliggende cerebellum met slechts 1,2-1,4 mm in de hersenstam, kan een relatief klein verschil in positionering van de kop van de muis daarom gemakkelijk resulteren in een misplaatste injectie. Vanwege de nabijheid van dit doel tot de nulpunts obex, kan het betrouwbaarder worden gericht via de cisterna magna-benadering. Bovendien kan het caudale uiteinde van de hypoglossale kern, dat zich uitstrekt tot de overgang tussen de hersenstam en het ruggenmerg, worden aangevallen door dezelfde cisterna magna-benadering, terwijl de standaardbenadering zou moeten worden aangepast om een dergelijke caudale plaats te bereiken door de AP-benadering te hengelen en coördinaten aan te passen om het occipitale bot en de bovenliggende nekmusculatuur te vermijden.

Om de nauwkeurigheid van de cisterna magna-benadering versus de standaardbenadering te bepalen, maten we de afstand tussen de beoogde en werkelijke doelplaatsen in de anteroposteriorale, mediolaterale en dorsoventrale vlakken voor ventrale (ventromediale medulla; Gia/V; N = 10) en dorsaal (NuXII; N = 16) regio's. De metingen werden verricht in dwarsdoorsneden van de caudale hersenstam (figuur 3). De resultaten (figuur 4) tonen significant kleinere fouten in de anteroposterior, mediolaterale en vooral dorsoventrale vlakken voor de cisterna magna-benadering in vergelijking met de standaardbenadering. Deze resultaten benadrukken de verbeterde nauwkeurigheid van de cisterna magna-aanpak voor deze doelen. We hebben standaard stereotaxische coördinaten (ten opzichte van bregma, afgeleid van Paxinos en Franklin ², maar geoptimaliseerd voor onze studies) en cisterna magna coördinaten (ten opzichte van de obex) opgenomen in tabel 1. Deze coördinaten zijn allemaal geoptimaliseerd en geverifieerd zoals weergegeven voor de hypoglossale kern en ventromediale medulla in figuur 3.

Figuur 1: Schematische weergave van belangrijke oriëntatiepunten, doelgebieden en het vlak van de stereotaxische cisterna magna-benadering. (A) Belangrijke anatomische oriëntatiepunten en positionering in het sagittale vlak. (B) Gebieden die kunnen worden bereikt via de standaard stereotaxische benadering versus cisterna magna stereotaxische benadering en relatie tot hun referentiepunten. i) De standaardbenadering maakt gebruik van benige oriëntatiepunten bregma en lambda, die ver verwijderd zijn van doelgebieden in magenta en paars. Het gebied in magenta (caudale medulla oblongata en bovenste cervicale koord) is moeilijk te bereiken vanwege de schuine achterhoofdsbeen- en nekspieren. Het gebied in paars (rostral medulla oblongata) is gevoelig voor beweging en ver weg van traditionele oriëntatiepunten. ii) De cisterna magna-benadering is geschikt voor toegang tot de caudale medulla oblongata en de bovenste cervicale koord en heeft voordelen bij het bestuderen van hersenstamstructuren die zijn georganiseerd in longitudinale kolommen die zich uitstrekken van de caudale medulla oblongata rostrally, tot het niveau van de caudale pons. (C) Schematiek van de vlakken van verschillende stereotaxische referentieatlassen in relatie tot de cisterna magna-benadering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Stapsgewijs schematisch overzicht van de stereotaxische cisterna magna-benadering. (A) Muisadapter met oorstaven gelijkmatig geplaatst op het hoogste niveau, de mondstang op een verlaagde positie en een plastic kaart om de anteroflexed kop in een hoek van 90° vast te zetten. (B) Bevestig de muis in het stereotacxische frame met behulp van de oorstaven en anteroflex de kop op 90 ° en houd in positie via een stijve plastic kaart, met het stereotaxische frame als referentie. (C) Zorg ervoor dat het lichaam verhoogd is, zodat het zich in hetzelfde vlak bevindt als het achterhoofd. Palpate belangrijke oriëntatiepunten. (D) Maak een huidincisie van het achterhoofd naar het rostrale deel van de schouders. (E) Maak een incisie in de raphe van de trapeziusspier. Zorg ervoor dat je in de middellijn blijft en snijd niet in de onderliggende spieren. (F) Identificeer de middellijn tussen de twee buiken van de longus capitis spier, beginnend bij het achterhoofd, en leid de laminectomietang in een caudale richting. (G) Plaats elk van de wondhaken tussen de buiken van de longus capitis spier en herpositioneer totdat de cisterna magna in zicht komt. (H) Identificeer benige oriëntatiepunten (achterhoofdsbeen, atlas), de dura mater die zich uitstrekt tussen deze benige structuren en het onderliggende cerebellum en de hersenstam. Reinig de dura mater indien nodig om het doelniveau bloot te leggen. (I) Met behulp van een veerschaar en fijne tang opent u de dura. (J) Identificeer de obex, die het AP- en ML-nulpunt vormt. Verplaats de pipet naar de AP- en ML-coördinaten naar keuze. Laat de pipet zakken totdat deze het dorsale oppervlak van de hersenstam bereikt. Dit is het DV-nulpunt. Laat de pipet zakken tot de gewenste coördinaat. (K) Verwijder de pipet en de wondhaken en laat de longus capitis spieren hun oorspronkelijke positie hervatten. (L) Sluit de wond en verwijder de muis uit het stereotaxische frame. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Evaluatie van de doelcoördinaten. Lage vergroting fotomicrografen van de caudale hersenstam. (A) Injectie van retrograde tracer cholera toxine subeenheid b (CTb; blauw) in de hypoglossale kern van een ChAT-cre L10 GFP (groen) reporter muis (vrouw, 6 maanden oud). Merk op dat de CTb-injectie beperkt is tot de hypoglossale kern. (B) Transfectie van glutamaterge cellen van een vGluT2-ires-cre L10 GFP reporter (groene) muis (mannelijk, 2 maanden oud) met een voorwaardelijke anterograde tracer (magenta) in het ventrale deel van de caudale mediale medulla oblongata (caudale pool van het GiV-gebied). (C) Voorwaardelijke retrograde tracing in een vGLuT2-ires-cre muis (mannelijk, 2 maanden oud) met TVA (magenta) transfectie van glutamaterge neuronen en gemodificeerde rabiësinfectie (groen) in de caudale mediale medulla oblongata (caudale pool van het GiV-gebied). Rabiësvirus werd geïnjecteerd in het bovenste cervicale ruggenmerg. Interne oriëntatiepunten dienen als leidraad. Afkortingen-cAmb: Compacte Kern van het Ambiguuscomplex; Ap: Gebied Postrema; DMV: Dorsale Motor Nucleus van de Vagus; GiV: Gigantocellulaire Nucleus, ventraal deel; IO: Inferieure olijf; IRt: Intermediaire reticulaire kern; LRN: Laterale reticulaire kern; NuXII- Hypoglossale Kern; sol: Kern van het solitaire traktaat; Sp5: Spinale trigeminuskern; VRG: ventrale ademhalingsgroep. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van de nauwkeurigheid tussen de standaard- en cisterna magna-benaderingen. Gemiddelde afstand tussen het centrum van het beoogde doel en het midden van de werkelijke plaats in het anteroposterieure vlak (A), mediolateraal vlak (B) en dorsoventrale vlak (C). Gegevens werden verkregen van N = 13 volwassen muizen met behulp van een standaardbenadering en N = 13 volwassen muizen met behulp van een cisterna magna-benadering. De straal van het doel werd ingesteld op 30 μm. De resultaten tonen een hogere nauwkeurigheid in het anteroposteriorvlak (t(24) = 2,08, p = 0,049; tweezijdige t-test; alfa 0,05), mediolateraal vlak (t(24) = 2,55, p = 0,018; tweezijdige t-test; alfa 0,05) en dorsoventrale vlak (t(24) = 4,33, p = 0,0002; tweezijdige t-test; alfa 0,05). Staafdiagrammen vertegenwoordigen het gemiddelde met standaarddeviatie en afzonderlijke stippen vertegenwoordigen waarden in elke muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Overzicht van standaard en cisterna magna stereotaxische coördinaten om caudale hersenstamstructuren te targeten. Houd er rekening mee dat voor zowel de standaard- als de cisterna magna-benadering de coördinaten van de Paxinos- en Franklin-atlas² zijn aangepast totdat de relevante regio's op de juiste manier werden getarget zoals geverifieerd door histologie (figuur 3). Merk ook op dat gebieden in de reticulaire formatie goed gedefinieerde grenzen missen en hier worden gelabeld zoals in Paxinos en Franklin². Afkortingen-AP: anteroposterior. ML: middelmatig. DV: dorsoventral. ChAT: Choline Acetyltransferase; F: Vrouw; M: Man; M&F: Man en Vrouw; NA: niet van toepassing; Pet1: plasmacytoom uitgedrukte transcriptiefactor 1; Sert: Serotonine transporter, vGaT: Vesiculaire GABA transporter; vGluT2: Vesiculaire glutamaat transporter 2; WT: Wild type. Alle coördinaten zijn in millimeter (mm). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Standaard stereotaxische chirurgie vertrouwt vaak op schedeloriëntatiepunten om de coördinaten van doellocaties in het CZS¹ te berekenen. Doellocaties zijn dan toegankelijk via braamgaten die door de schedel worden geboord¹. Deze methode is niet ideaal voor de caudale hersenstam, omdat de doellocaties zich ver van de schedeloriëntatiepunten in de anteroposterior- en dorsoventrale vlakken² bevinden en omdat de anatomie van de schedel en bovenliggende spieren de toegang uitdagend maken⁶ (figuur 1Bi). Onze studie beschrijft een alternatieve stereotaxische benadering voor toegang tot doellocaties in de caudale hersenstam en het bovenste ruggenmerg, de cisterna magna-benadering. Belangrijke kenmerken die deze methode anders maken dan een standaard stereotactische benadering zijn positionering, met anteroflexie van het hoofd om de cisterna magna te openen, en het gebruik van belangrijke hersenstamoriëntatiepunten op het dorsale oppervlak van de hersenstam als referentiepunten zoals de obex. Onze resultaten geven aan dat deze aanpak geschikt is voor de levering van kleine volumes (5-50 nL) tracers of adeno-geassocieerde virussen (AAV's) in discrete hersenstamstructuren. Bovendien verhoogt het gebruik van een referentiepunt dat een CZS-oriëntatiepunt vertegenwoordigt, in plaats van een benige structuur, en dat zich in de nabijheid van het beoogde doel bevindt, de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid voor kleine doelen en kleine injectievolumes, zoals relevant voor circuitkartering en chemogenetische studies (figuur 3)^14,15.

Zoals met elk protocol, heeft de cisterna magna-benadering stappen die van cruciaal belang zijn om reproduceerbaarheid te bereiken. Zoals bij elke stereotaxische benadering die afhankelijk is van coördinaten in drie verschillende vlakken (anteroposterior, mediolateraal en dorsoventral), is positionering van cruciaal belang. Voor de cisterna magna-benadering omvat dit niet alleen de positie van het hoofd, dat op 90 ° moet worden geanoflexeerd, maar ook die van het lichaam, dat moet worden verhoogd zodat de caudale hersenstam en de bovenste cervicale koord zich in hetzelfde vlak bevinden. Een andere cruciale stap is om onnodige manipulaties te voorkomen die bloedingen veroorzaken, omdat dit de visualisatie van belangrijke oriëntatiepunten zou belemmeren. Er zijn twee manipulaties die een hoog risico op bloedingen met zich meebrengen. Ten eerste is de dura mater die de cisterna magna bedekt met een relatief grote spier (longus capitis). Omdat dit een gepaarde spier is, met één buik aan weerszijden van de middellijn, hoeven de twee buiken van deze spier slechts voorzichtig te worden gescheiden in de middellijn. Incisie van deze spieren is niet nodig en zal bloedingen veroorzaken. Ten tweede zal bij de succesvolle opening van de dura mater een variabel aantal aderen met een variabele loop zichtbaar worden bovenop het dorsale oppervlak van de caudale hersenstam en het bovenste cervicale koord. Deze aderen moeten worden vermeden door kleine aanpassingen in coördinaten toe te passen (tot 0,1 mm) of, als het experimentele paradigma het toelaat, door een ander doel te selecteren.

Een groot voordeel van de cisterna magna-benadering is dat het toegang biedt tot de hersenstam en bovenste cervicale structuren die moeilijk te bereiken zijn bij gebruik van het standaard stereotaxische vlak omdat ze zich in de buurt van het caudale uiteinde van of net caudaal tot het achterhoofdsbeen bevinden. Bovendien vermijdt de benadering voor doelwitten in de medulla oblongata het cerebellum en daarom cerebellaire laesie-effecten of valse etikettering via een naaldkanaal, die de onderzoeksresultaten kunnen beïnvloeden wanneer het gebruik van de standaardmethodologie geen probleem is. Een ander voordeel van de cisterna magna benadering is dat het dorsale oppervlak van de hersenstam zichtbaar wordt. Dit biedt de mogelijkheid om een oriëntatiepunt op het dorsale oppervlak te gebruiken als referentiepunt voor coördinaten. Bovendien is de aanpak flexibel en kan deze worden geoptimaliseerd afhankelijk van het doel. We hebben bijvoorbeeld een middellijn landmark, de obex, als referentiepunt gebruikt. Bij het richten op dorsale structuren kan de structuur van belang zelf echter het landschap van het dorsale oppervlak dicteren. Zo steekt de uitwendige cuneate nucleus dorsaal uit en kan zo direct worden gevisualiseerd en geïnjecteerd. Voor laterale doelen, zoals de ventrale ademhalingsgroep of het dubbelzinnige complex, kan het cisterna magna-venster in laterale richting worden verhoogd. Evenzo kan voor het richten van bovenste cervicale structuren het venster worden uitgebreid naar de atlas. Hoewel we een muisadapter hebben gebruikt die in een groot stereotactisch frame voor dieren is geplaatst, kan de aanpak gemakkelijk worden aangepast aan andere frames of opstellingen, zolang de belangrijkste stappen worden gevolgd. In plaats van een plastic kaart kan bijvoorbeeld de mondbalk tegen de brug van de neus worden geplaatst om het hoofd in een stabiele anteroflexe positie te houden. Het is vermeldenswaard dat coördinaten van hersenstamdoellocaties met de obex als nulpunt, zoals aangegeven in tabel 1, als referentie dienen en aanpassingen kunnen worden aangegeven op basis van de muisstam, leeftijd, geslacht, kalibratie van de stereotaxische arm en positioneringstechniek, vergelijkbaar met aanpassingen die men moet maken bij het afleiden van doelcoördinaten voor een standaardbenadering uit een referentieatlas. Dit vereist inzicht in het vlak van de nadering, vooral voor meer rostrale doelen zoals geïllustreerd in figuur 1. Het testen van coördinaten kan worden gedaan met behulp van verschillende tracers, bijvoorbeeld fluorescerende kralen of fluorescerend getagde Cholera Toxine-subeenheid b voor verschillende coördinaten in dezelfde muis. Histologische analyses van hersenstam/spinale weefselsecties (niet behandeld in dit protocol) geven vervolgens feedback over lokalisatie ten opzichte van objectieve interne oriëntatiepunten 8,9,11,16 of ter vergelijking met een referentieatlas. Coördinaten kunnen dan worden aangepast, opnieuw worden getest en afgerond.

De cisterna magna-aanpak heeft ook beperkingen. CZS-regio's die via deze aanpak kunnen worden bereikt, zijn beperkt tot de caudale pons, medulla oblongata en het bovenste cervicale koord. Hoewel de caudale pons gemakkelijk toegankelijk zijn via de standaardbenadering, heeft de cisterna magna-benadering voordelen bij het bestuderen van onderverdelingen van longitudinaal georiënteerde structuren die zich uitstrekken van de medulla oblongata tot de caudale pons, zoals het geval is voor onderverdelingen binnen de reticulaire formatie. Een andere relatieve beperking treedt op wanneer deze aanpak voor de tweede keer wordt gebruikt bij dezelfde muis, bijvoorbeeld bij gemodificeerde hondsdolheid die¹⁴ traceert. De aanwezigheid van littekenweefsel kan de duur van de operatie verlengen of kleine oriëntatiepunten verbergen. In onze handen is deze methode in dit geval echter nog steeds superieur aan de standaard stereotaxische benadering, omdat de plaats van de eerste injectie kan worden gedocumenteerd in relatie tot de positie van aderen van andere unieke oriëntatiepunten, waardoor het gemakkelijk is om het exacte toegangspunt terug te vinden. Hoewel deze aanpak superieur is voor het traceren van studies in het caudale medulla en het bovenste ruggenmerg, kan het niet worden gebruikt om hardware chronisch te implanteren. Daarom kan voor in-vivo optogenetica en calciumbeeldvormingsstudies die implantatie van optische vezels^{vereisen 17} , de cisterna magna-benadering eerst worden gebruikt om een AAV op de doellocatie af te leveren, gevolgd door een tweede operatie met behulp van een standaardbenadering om muizen met vezels of canules te instrumenteren. Deze aanpak stelt iemand in staat om de doelsite discreet te houden, terwijl de plaatsing van glasvezel / hardware meer vergevingsgezind is (d.w.z. minder nauwkeurig kan zijn), vanwege de relatief grote omvang van de hardware. Ten slotte vereist de cisterna magna-benadering meer geavanceerde chirurgische vaardigheden dan een standaard stereotaxische benadering. In plaats van herkenning van eenvoudige benige oriëntatiepunten, vereist het inzicht in complexere hersenstam- en musculoskeletale oriëntatiepunten. Ook, zoals bij elke delicate operatie, hangt het succes en de efficiëntie van de procedure af van een goede toolkit die in uitstekende staat verkeert. Dit protocol pakt de laatste problemen aan en kan door experimentatoren als een gedetailleerde gids worden gebruikt.

Kortom, de cisterna magna-benadering is complementair aan de standaard stereotaxische benadering en biedt meerdere voordelen bij het richten op de caudale hersenstam en de bovenste cervicale koord, die niet gemakkelijk toegankelijk zijn via een standaard stereotaxische benadering. Het maakt gebruik van referentiepunten die CZS zijn in plaats van benige oriëntatiepunten die zich in de nabijheid van de beoogde doelen bevinden, waardoor de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid toenemen. Dit maakt de aanpak vooral waardevol wanneer kleine injectievolumes moeten worden afgeleverd op afzonderlijke locaties in de context van gedetailleerde kartering of chemogenetische studies. Deze benadering is ook relevant voor functionele chemogenetische, optogenetische, vezelfotometrie- of laesiebenaderingen, waarbij een AAV-virus of toxine wordt afgeleverd aan een doelwit met motorische functie of sensomotorische integratie als een uitlezing: het vermijdt een cursus door het cerebellum voor doelen in de medulla oblongata en beperkt daarom de interferentie in studieresultaten. Vanuit het oogpunt van dierenwelzijn vereist de procedure niet het boren van meerdere braamgaten om bilateraal of longitudinaal toegang te krijgen tot locaties, waardoor de duur van de operatie en de invasiviteit van de procedure worden verkort. Hoewel we de aanpak in detail hebben geschetst voor muizen, zijn dezelfde principes van toepassing op andere soorten 11,12,13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window