Summary
Stereotoksisk kirurgi for å målrette hjernesteder hos mus innebærer vanligvis tilgang gjennom skallebenene og styres av hodeskallelandemerker. Her skisserer vi en alternativ stereotaxisk tilnærming for å målrette kaudal hjernestamme og øvre cervical ryggmarg via cisterna magna som er avhengig av direkte visualisering av brainstem landemerker.
Abstract
Stereotoksisk kirurgi for å målrette hjernesteder hos mus styres ofte av hodeskallelandemerker. Tilgang oppnås deretter via burrhull boret gjennom skallen. Denne standardtilnærmingen kan være utfordrende for mål i kaudal hjernestamme og øvre livmorhalsledning på grunn av spesifikke anatomiske utfordringer, da disse stedene er fjernt fra hodeskallelandemerker, noe som fører til upresise. Her skisserer vi en alternativ stereotaxisk tilnærming via cisterna magna som har blitt brukt til å målrette diskrete regioner av interesse for kaudal hjernestamme og øvre cervical ledning. Cisterna magna strekker seg fra occipital bein til atlaset (dvs. det andre vertebrale beinet), er fylt med cerebrospinalvæske, og er dekket av dura mater. Denne tilnærmingen gir en reproduserbar vei for tilgang til utvalgte sentralnervesystem (CNS) strukturer som ellers er vanskelig å nå på grunn av anatomiske barrierer. Videre gir det mulighet for direkte visualisering av brainstem landemerker i nærheten av målstedene, noe som øker nøyaktigheten når du leverer små injeksjonsvolumer til begrensede interesseområder i kaudal hjernestamme og øvre livmorhalsledning. Til slutt gir denne tilnærmingen en mulighet til å unngå cerebellum, noe som kan være viktig for motoriske og sensoriske studier.
Introduction
Standard stereotaxisk kirurgi for å målrette hjernesteder hos mus1 innebærer vanligvis fiksering av skallen ved hjelp av et sett med ørestenger og en munnstang. Koordinater estimeres deretter basert på referanseatlaser 2,3, og hodeskalle landemerker, nemlig bregma (punktet der suturene i frontal og parietal bein kommer sammen) eller lambda (punktet der suturene i parietal og occipital bein kommer sammen; Figur 1A,B). Gjennom et burrhull inn i skallen over det estimerte målet, kan målområdet nås, enten for levering av mikroinjeksjoner eller instrumentering med kanyler eller optiske fibre. På grunn av variasjon i anatomien til disse suturene og feilene i lokaliseringen av bregma eller lambda 4,5, varierer posisjonen til nullpunkter i forhold til hjernen fra dyr til dyr. Selv om små feil i målretting, som følge av denne variasjonen, ikke er et problem for store eller nærliggende mål, er deres innvirkning større for mindre interesseområder som er fjernt fra nullpunktene i anteroposterior eller dorsoventral fly og / eller når de studerer dyr av varierende størrelse på grunn av alder, belastning og / eller kjønn. Det er flere ekstra utfordringer som er unike for medulla oblongata og øvre livmorhalsledning. For det første er små endringer i anteroposteriorkoordinater forbundet med betydelige endringer i dorsoventralkoordinater i forhold til dura, på grunn av cerebellumets posisjon og form (figur 1Bi)2,6,7. For det andre er den øvre livmorhalsledningen ikke inneholdt i skallen2. For det tredje gjør den skråstillingen til oksipitalt bein og overliggende lag av nakkemuskler2 standard stereotaxisk tilnærming enda mer utfordrende for strukturer som ligger nær overgangen mellom hjernestammen og ryggmargen (figur 1Bi). Til slutt er mange mål av interesse for kaudal hjernestamme og livmorhalsledning liten2, noe som krever presise og reproduserbare injeksjoner 8,9.
En alternativ tilnærming gjennom cisterna magna omgår disse problemene. Cisternamagnaten er et stort rom som strekker seg fra oksipitalbenet til atlaset (figur 1A, dvs. det andre vertebrale beinet)10. Den er fylt med cerebrospinalvæske og dekket av dura mater10. Dette rommet mellom occipitalbenet og atlaset åpnes når anteroflexing hodet. Det kan nås ved å navigere mellom de overliggende parrede magene i longus capitis-muskelen, og utsette dorsaloverflaten til kaudal hjernestamme. Regioner av interesse kan da målrettes basert på landemerkene i disse regionene selv hvis de ligger nær dorsaloverflaten; eller ved å bruke obex, punktet der den sentrale kanalen åpner inn i IV ventrikelen, som et nullpunkt for koordinater for å nå dypere strukturer. Denne tilnærmingen har blitt brukt i en rekke arter, inkludert rotte11, katt12, mus 8,9 og ikke-menneskelig primat13 for å målrette den ventrale respiratoriske gruppen, medullær medial retikulær formasjon, kjernen i den ensomme kanalen, området postrema eller hypoglossale kjernen. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke mye brukt, da den krever kunnskap om anatomi, et spesialisert verktøysett og mer avanserte kirurgiske ferdigheter sammenlignet med standard stereotakaxisk tilnærming.
Her beskriver vi en trinnvis kirurgisk tilnærming for å nå hjernestammen og øvre livmorhalssnor via cisternamagnaten, visualisere landemerker, sette nullpunktet (figur 2) og estimere og optimalisere målkoordinater for stereotoksisk levering av mikroinjeksjoner i de diskrete hjernestamme- og ryggmargsregionene av interesse (figur 3). Vi diskuterer deretter fordelene og ulempene knyttet til denne tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forfatteren erklærer at protokollen følger retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Fremstilling av kirurgiske instrumenter og stereotaxisk ramme
MERK: Operasjonen utføres under aseptiske forhold. Steriliteten opprettholdes ved hjelp av den sterile spissteknikken.
- Monter den stereotaktiske armen med en mikropipette eller sprøyte fylt med en injiserbar valgbar (adeno-assosiert virus (AAV) eller konvensjonell tracer) på den stereotaktiske rammen og klargjør museadapteren (figur 2A).
- Forbered autoklavede kirurgiske instrumenter (Materialbord) og legg dem på en steril overflate.
2. Anestesiinduksjon og muspreparat
- Slå på O2 ved 0,5 l/min og sett isoflurandamperen på 4,0, og pass på at O2-strømmen er til induksjonsboksen.
FORSIKTIG: Pass på at isofluraninduksjonsboksen er plassert i en hette og at isofluranen er scavenged bort fra operasjonsstedet. - Plasser musen (10 uker gammel mannlig C57BL/6J) i induksjonskammeret.
- Når pusten har avtatt, åpner du induksjonskammeret og løfter musen litt. Bruk clippers for å fjerne hår fra hode til skuldre.
3. Plassering av musen i den stereotaktiske rammen
- Flytt musen til den stereotaktiske rammen og legg nesen i en fleksibel nesekjegle. På dette stadiet må du sørge for at O2-strømmen nå er rettet mot nesekjeglen.
- Plasser musen i den stereotaktiske rammen bare ved hjelp av ørestenger.
MERK: Pass på at ørestengene er jevne og at hodet er i vater. - Anteroflex musens hode til en 90° vinkel ved å styre nesen manuelt. For å sikre denne posisjonen, plasser en plastbarriere mellom ørestangstolpene på museadapteren, parallelt med søylene. Den flate delen av skallen fungerer som referanse, ligner den flate skallen tilnærming i konvensjonell stereotaxic kirurgi.
MERK: Ikke bøy hodet for mye (dvs. utenfor en vinkel på 90° mellom planet på frontskallebenet og planet på overflaten av bordet), da dette hindrer luftstrømmen gjennom den øvre luftveien. Hvis luftstrømmen er imped, omplasser musen, sørg for at kroppen støttes under bagasjerommet og et plastkort er satt til 90 ° mellom planet i frontal skallebenet og planet på overflaten av bordet som beskrevet i figur 2A, C. - Plasser varmeputen under musen, og pass deretter på at nakken og resten av kroppen er plassert på samme nivå (dvs. på ca. 180° eller parallelt med bordet). Verktøykassen som holder vårsaksen kan brukes til å løfte kroppen til denne posisjonen.
MERK: Dette trinnet er viktig ettersom kaudal hjernestamme og øvre cervical ledning beveger seg avhengig av posisjon, i motsetning til mer rostrale deler av CNS som holdes på plass av skallen. - Injiser en enkeltdose på 4 mg/kg Meloksikam langsom frigjøring (SR) subkutant (s.c.) med et volum på 2 μL/g kroppsvekt og legg smøremiddel på øynene.
- Rengjør det kirurgiske snittstedet først med en 70% alkohol prep pad, deretter med en betadine prep pad, og deretter igjen med en alkohol prep pad og la tørke.
- Plasser en gardin under kroppen.
- Desinfiser hendene og ta på sterile hansker.
- Plasser en gardin på operasjonsstedet.
4. Kirurgi for å få tilgang til cisterna magna
- Pass på at musen er bedøvet ved å klemme tærne eller sjekke hornhinnen refleks.
- Reduser isofluranen til vedlikeholdsnivåer (2.0).
- Lag et snitt på 1-1,2 cm med kirurgisk blad #10 fra kanten av oksipitale beinet mot skuldrene i en jevn bevegelse.
- Lag et snitt i midtlinjen raphe av trapezius muskelen. Dette eksponerer de parrede longus capitis musklene.
MERK: Hos mus er trapesmuskelen en veldig tynn, nesten gjennomsiktig muskel. Sørg for å holde deg i midtlinjen og ikke kutt inn i de underliggende musklene, da dette vil føre til unødvendig blødning. - Plasser begge retraktorkrokene mellom de parrede longus capitis musklene, den ene orientert mot venstre og den andre til høyre. Vekten av hemostatene gir spenning til retraktorkrokene som kan modifiseres ved å justere posisjonen til hemostatene.
- Plasser det kirurgiske mikroskopet på plass for bedre å visualisere det kirurgiske feltet.
- Bruk de stumpe laminektomi tang å skille venstre og høyre mage av parret longus capitis muskel, starter fra oksiputen, hvor midtlinjen er lett synlig. Før de stumpe tangene over beinet på nakkestøtten i midtlinjen ned til der den møter cisternal dura mater, og fortsett deretter over dura mater til atlaset.
MERK: Det er ikke nødvendig å kutte gjennom de parrede longus capitis musklene, da ingenting holder dem sammen i midtlinjen; Dette vil føre til unødig blødning. - Omplasser retraktorene og juster spenningen ved å omplassere hemostatene, og åpne utsikten over cisternamagnaten.
- Bruk stump laminectomy tang for å skille musklene videre i midtlinjen for å få et godt visningsvindu av hjernestammen og cerebellum.
- Gjenta trinn 4.7-4.9 etter behov til cerebellum og hjernestamme kommer til syne under dura.
- Ved hjelp av stumpe laminektomi tang, fjern dura av de små trådene av bindevev ved å flytte tangene fra midtlinjen i en lateral retning, til det er en klar utsikt over hjernestammen og for å skape mer lateralt rom, etter behov for målet.
5. Åpning av cisternalmembranen
- Bruk de vinklede Dumont-tangene (#4/45) til å ta tak i duraen, som strekker seg fra oksipitale bein til atlaset. Ta tak i duraen i nærheten av oksipitalbenet og bruk vårsaksen til å lage en liten åpning (~ 0,5 til 1,5 mm) i duraen.
MERK: På dette rostrale stedet er plassen mellom hjernestammen og den overliggende dura bredest, noe som gir god plass til sikker manipulering av dura. - Bruk vårsaksen til å løfte dura og åpne dura videre. Størrelsen på vinduet avhenger av målet.
MERK: Et større vindu vil være nødvendig når du lager flere langsgående injeksjoner eller bilaterale injeksjoner; et lite vindu vil være tilstrekkelig når du lager enkle ensidige eller midtlinjeinjeksjoner. - Når dura er åpnet, tøm overflødig cerebrospinalvæske med en steril signalspiss.
6. Identifisering av landemerker og nullpunkt
- Se den dorsale overflaten av hjernestammen med detaljerte landemerker gjennom den åpne duraen. Obexen, punktet der den sentrale kanalen åpner inn i IV-ventrikelen, er standard fremre bakre og middelmådig nullpunkt.
7. Målkoordinater
MERK: For ulike mål har vi inkludert en liste over standardkoordinater med fremre bakre (AP) og middelmådige (ML) koordinater i forhold til nullpunkts bregma- og cisternamagnatkoordinater med AP- og ML-koordinater i forhold til nullpunkt obex for å lette overgangen mellom metoder (tabell 1). Dorsoventral (DV) koordinater er i forhold til overflaten av hjernen eller cerebellum (standard tilnærming) eller overflaten av hjernestammen eller øvre cervical ledning (cisterna magna tilnærming) på punktet av AP og ML oppføring. Planlegging bør gjøres før operasjonen.
- Bruk de tre koordinatsettene til å bestemme målet: AP, ML og DV. På grunn av hodeposisjonen varierer den relative orienteringen av hjernestammestrukturer etter sted.
- For målavstand >0,4 mm fra kaudal til obex (figur 1B, grønn) gjør du følgende:
- AP: Bruk et hvilket som helst standard stereotaxisk referanseatlas (f.eks. Paxinos og Franklin atlas2) eller vevsserier som er kuttet i det tverrgående planet for å estimere AP-avstanden mellom obex og målet.
- ML: Bruk et hvilket som helst standard stereotaxisk referanseatlas eller vevsseriekutt i det tverrgående planet for å estimere ML-avstanden mellom obex og målet.
- DV: Estimer koordinater i forhold til overflaten av hjernen eller cerebellum ved AP- og ML-målpunktet. Bruk et hvilket som helst standard stereotaxisk referanseatlas eller vevsseriekutt i det tverrgående planet for å estimere avstanden mellom hjernestammeoverflaten ved ønsket AP- og ML-koordinater og målet.
- For målavstand <0,4 mm fra kaudal til obex (figur 1B, oransje) gjør du følgende:
- AP: Juster koordinatene for å gjøre rede for anteroflexion av hjernestammen. For ventrale og rostrale koordinater vil AP brainstem inngangspunktet være mer kaudalt i forhold til målet AP koordinat i standardplanet.
- ML: Utlede målkoordinater fra et standard stereotoksisk referanseatlas eller vevsserie kuttet i tverrplanet. Koordinatene vil være relative til den visualiserte midtlinjen på mål-AP-nivået.
- DV: Beregn koordinater i forhold til overflaten av hjernestammen ved AP- og ML-målpunktet. Juster DV for å gjøre rede for anteroflexion av hjernestammen. For ventrale og rostrale koordinater vil DV-koordinatene være større enn avstanden fra hjernestammens dorsale overflate i standardplanet.
- For målavstand >0,4 mm fra kaudal til obex (figur 1B, grønn) gjør du følgende:
8. Injeksjon av målet
- Senk pipetten eller sprøyten til målet ved hjelp av den stereotaktiske armen og injiser oppløsningen som for standard stereotaxiske tilnærminger. La det stå på plass i 1-5 min etter injeksjon, for å unngå nålespor ved bruk av volumer mellom 3-50 nL. Løft deretter pipetten eller sprøyten ved hjelp av den stereotaktiske armen.
- Gjenta trinn 8.1. for flere mål.
9. Nedleggelse av operasjonsfeltet
- Fjern krokene forsiktig fra det kirurgiske feltet. De parrede longus capitis musklene vil falle tilbake i en nøytral posisjon, som fullt dekker cisterna magna. Ikke lukk trapesmuskelen og dura mater i midtlinjen, da de er for skjøre til å holde suturer.
- Lukk huden med tre nylon- eller polypropylen suturer (5-0 eller 6-0).
10. Postoperativ omsorg
- Slå av isofluran og fjern musen fra den stereotaksiske rammen. Plasser musen i et rent bur på en varmepute og observer til den er våken og beveger seg.
- Overvåk helsestatus, vekt og suturer på postoperative dager 1-3. Fjern suturer på dag 10 hvis de ikke allerede er fjernet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cisterna magna tilnærming gjør det mulig å målrette caudal hjernestamme og øvre Cervical ledning strukturer som ellers er vanskelig å nå via standard stereotaxic tilnærminger eller er utsatt for inkonsekvent målretting. Operasjonen for å nå cisterna magna krever snitt i huden, et tynt lag av trapesmuskel og åpning av dura mater og tolereres derfor godt av mus. Det er spesielt effektivt og mindre invasivt når man målretter mot flere (langsgående spredte eller bilaterale) steder, da det ikke krever boring av flere burrhull som i standard stereotaksiske tilnærminger. Hos mus har vi rutinemessig målrettet strukturer som hypoglossale kjernen9, ventral respiratorisk gruppe8, og tilstøtende retikulær formasjon8 i kaudal hjernestamme ved hjelp av cisterna magna tilnærming, som vi ytterligere illustrerer for hypoglossal kjernen og ventromedial medulla (GiV) i figur 3. For eksempel er hypoglossalkjernen en slank, men rostrocaudally langstrakt kolonne med motoneuroner i dorsal medulla oblongata og dens rostrale pol kan målrettes via en standard tilnærming. Men ettersom DV-koordinatene (~ 4,5 mm) for det meste dikteres av det overdrevne cerebellum med bare 1,2-1,4 mm inn i hjernestammen, kan en relativt liten forskjell i plassering av musens hode derfor lett føre til en feilplassert injeksjon. På grunn av nærheten til dette målet til nullpunkts obex, kan det være mer pålitelig målrettet via cisterna magna-tilnærmingen. Videre kan den kaudale enden av hypoglossalkjernen som strekker seg til overgangen mellom hjernestammen og ryggmargen målrettes mot den samme cisternamagnattilnærmingen, mens standardtilnærmingen må modifiseres for å nå et slikt kaudalt sted ved å vinkle AP-tilnærmingen og justere koordinatene for å unngå oksipitale bein og overlysende nakkemuskulatur.
For å bestemme nøyaktigheten av cisterna magna tilnærming versus standard tilnærming, målte vi avstanden mellom tiltenkte og faktiske målsteder i anteroposterior, middelmådige og dorsoventrale plan for ventral (ventromedial medulla; GiA/V; N = 10) og dorsal (NuXII; N = 16) regioner. Målingene ble gjort i tverrgående deler av kaudal hjernestammen (figur 3). Resultatene (figur 4) viser betydelig mindre feil i anteroposterior, middelmådige og spesielt dorsoventrale fly for cisterna magna tilnærming sammenlignet med standard tilnærming. Disse resultatene fremhever den forbedrede nøyaktigheten til cisterna magna-tilnærmingen for disse målene. Vi har inkludert standard stereotaksiske koordinater (i forhold til bregma, avledet fra Paxinos og Franklin 2, men optimalisert for våre studier) og cisterna magna koordinater (i forhold til obex) i tabell 1. Disse koordinatene er alle optimalisert og verifisert som vist for hypoglossale kjernen og ventromedial medulla i figur 3.
Figur 1: Skjematisk representasjon av viktige landemerker, målområder og planet til den stereotaktiske cisternamagnattilnærmingen. (A) Viktige anatomiske landemerker og posisjonering i sagittalplanet. (B) Områder som kan nås gjennom standard stereotaxisk tilnærming kontra cisterna magna stereotaxic tilnærming og forhold til deres referansepunkter. i) Standardtilnærmingen benytter seg av benete landemerker bregma og lambda, som er fjernt fra målregioner i magenta og lilla. Området i magenta (caudal medulla oblongata og øvre cervical ledning) er utfordrende å nå på grunn av skrånende occipital bein og nakke muskler. Området i lilla (rostral medulla oblongata) er utsatt for bevegelse og fjernt fra tradisjonelle landemerker. ii) Cisterna magna tilnærmingen er egnet for å få tilgang til kaudal medulla oblongata og øvre cervical ledning og har fordeler når du studerer hjernestamme strukturer som er organisert i langsgående søyler som strekker seg fra kaudal medulla oblongata rostrally, opp til nivået av kaudale pons. (C) Skjematisk for planene til ulike stereotaksiske referanseatlaser i forhold til cisterna magna tilnærming. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvis skjematisk oversikt over den stereotaktiske cisternamagnattilnærmingen. (A) Museadapter med ørestenger jevnt plassert på høyeste nivå, munnstangen i senket stilling og et plastkort for å sikre det anteroflekserte hodet i en 90° vinkel. (B) Fest musen i den stereotakksiske rammen ved hjelp av ørestengene og anteroflex hodet ved 90° og hold den på plass via et stivt plastkort, med stereotakaxisk ramme som referanse. (C) Kontroller at kroppen er forhøyet slik at den er i samme plan som nakkestøtten. Palpate viktige landemerker. (D) Lag et hudinnsnitt fra nakkestøtten til den rostrale delen av skuldrene. (E) Gjør et snitt i raphe av trapezius muskelen. Pass på å holde deg i midtlinjen og ikke kutt inn i de underliggende musklene. (F) Identifiser midtlinjen mellom de to magene i longus capitis muskelen, starter ved oksiputen, og guide laminectomy tang i en kaudal retning. (G) Plasser hver av sårkrokene mellom magene på longus capitismuskelen og reposisjoner til cisternamagnaten kommer til syne. (H) Identifisere benete landemerker (occipital bein, atlas), dura mater som strekker seg mellom disse benete strukturer, og underliggende cerebellum og brainstem. Rengjør dura mater etter behov for å eksponere målnivået. (I) Bruk av vårsaks og fine tanger åpner dura. (J) Identifiser obexen, som danner AP- og ML-nullpunktet. Flytt pipetten til AP- og ML-koordinatene du velger. Senk pipetten til den når hjernestammens dorsale overflate. Dette er DV nullpunktet. Senk pipetten til ønsket koordinat. (K) Fjern pipetten og sårkrokene og la longus capitis musklene gjenoppta sin opprinnelige posisjon. (L) Lukk såret og fjern musen fra den stereotaksiske rammen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Evaluering av målkoordinater. Fotomikrografer med lav forstørrelse av kaudal hjernestamme. (A) Injeksjon av retrograd tracer kolera toksin subenhet b (CTb; blå) inn i hypoglossal kjernen av en ChAT-cre L10 GFP (grønn) reporter mus (kvinne, 6 måneder gammel). Vær oppmerksom på at CTb-injeksjonen er begrenset til hypoglossale kjernene. (B) Transfeksjon av glutamatergiske celler av en vGluT2-ires-cre L10 GFP reporter (grønn) mus (mann, 2 måneder gammel) med en betinget anterograd tracer (magenta) i den ventrale delen av kaudal medial medulla oblongata (kaudal pol av GiV-regionen). (C) Betinget retrogradsporing i en vGLuT2-ires-cre mus (mann, 2 måneder gammel) som viser TVA (magenta) transfeksjon av glutamatergiske nevroner og modifisert rabiesinfeksjon (grønn) i kaudal medial medulla oblongata (kaudal pol i GiV-regionen). Rabiesvirus ble injisert i øvre cervical ryggmarg. Interne landemerker fungerer som en veiledning. Forkortelser-cAmb: Kompakt kjerne av Ambiguus-komplekset; Ap: Område Postrema; DMV: Dorsal Motor Nucleus av Vagus; GiV: Gigantocellular Nucleus, ventral del; IO: Dårligere oliven; IRt: Mellomliggende retikulær kjerne; LRN: Lateral retikulær kjerne; NuXII- Hypoglossale Nucleus; sol: Kjernen i den ensomme kanalen; Sp5: Spinal trigeminal kjerne; VRG: ventral respiratorisk gruppe. Skalalinje: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av nøyaktigheten mellom standard- og cisternamagnattilnærmingene. Gjennomsnittlig avstand mellom midten av det tiltenkte målet og midten av det faktiske området i anteroposterior-planet (A), middelmådig plan (B) og dorsoventralplan (C). Data ble hentet fra N = 13 voksne mus ved hjelp av en standard tilnærming og N = 13 voksne mus ved hjelp av en cisterna magna tilnærming. Målets radius ble satt til 30 μm. Resultatene viser høyere nøyaktighet i anteroposterior planet (t(24) = 2,08, p = 0,049; to-tailed t-test; alfa 0,05), middelmådig plan (t(24) = 2,55, p = 0,018; tosidig t-test; alfa 0,05) og dorsoventralplan (t(24) = 4,33, p = 0,0002; to-tailed t-test; alfa 0,05). Stolpediagrammer representerer gjennomsnittet med standardavvik, og individuelle prikker representerer verdier i hver mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Oversikt over standard- og cisterna magna stereotaxiske koordinater for å målrette kaudale hjernestammestrukturer. Vær oppmerksom på at for både standard- og cisternamagnattilnærmingene er koordinater fra Paxinos og Franklin atlas2 justert til interesseområder ble riktig målrettet som verifisert av histologi (figur 3). Vær også oppmerksom på at områder i retikulære formasjon mangler veldefinerte grenser og er her merket som i Paxinos og Franklin2. Forkortelser-AP: anteroposterior. ML: middelmådig. DV: dorsoventral. ChAT: Kolin Acetyltransferase; F: Kvinne; M: Mann; M&F: Mann og kvinne; NA: gjelder ikke; Pet1: plasmacytoma uttrykt transkripsjonsfaktor 1; Sert: Serotonin transportør, vGaT: Vesicular GABA transportør; vGluT2: Vesicular Glutamat transportør 2; WT: Vill type. Alle koordinater er i millimeter (mm). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standard stereotaxic kirurgi er vanligvis avhengig av hodeskalle landemerker for å beregne koordinatene til målsteder i CNS1. Målsteder nås deretter via burrhull som bores gjennom skallen1. Denne metoden er ikke ideell for kaudal hjernestamme, da målsteder ligger fjernt fra skallen landemerker i anteroposterior og dorsoventral fly2 og som anatomien til skallen og overliggende muskler gjør tilgang utfordrende6 (Figur 1Bi). Vår studie beskriver en alternativ stereotaxisk tilnærming for tilgang til målsteder i kaudal hjernestamme og øvre ryggmarg kalt cisterna magna tilnærming. Viktige funksjoner som gjør denne metoden forskjellig fra en standard stereotaktisk tilnærming er posisjonering, med anteroflexion av hodet for å åpne cisterna magna, og bruk av viktige brainstem landemerker på dorsal overflaten av hjernestammen som referansepunkter som obex. Våre resultater indikerer at denne tilnærmingen er egnet for levering av små volumer (5-50 nL) av tracere eller adeno-assosierte virus (AAVer) i diskrete hjernestammestrukturer. Videre øker bruken av et referansepunkt som representerer et CNS-landemerke, snarere enn en benaktig struktur, og som er i nærheten av det tiltenkte målet, reproduserbarhet og nøyaktighet for små mål og små injeksjonsvolumer, som relevant for kretskartlegging og kjemogenetiske studier (figur 3)14,15.
Som med alle protokoller har cisterna magna-tilnærmingen trinn som er kritiske for å oppnå reproduserbarhet. Som med enhver stereotaxisk tilnærming som er avhengig av koordinater i tre forskjellige plan (anteroposterior, middelmådig og dorsoventral), er posisjonering kritisk. For cisterna magna tilnærming, dette innebærer ikke bare posisjonen til hodet, som skal være anteroflexed på 90° men også kroppens, som bør heves slik at kaudal hjernestamme og øvre cervical ledning er i samme plan. Et annet kritisk skritt er å unngå unødvendige manipulasjoner som forårsaker blødning, da dette vil hemme visualiseringen av viktige landemerker. Det er to manipulasjoner som har høy risiko for blødning. For det første er dura mater som dekker cisterna magna dekket av en relativt stor muskel (longus capitis). Siden dette er en parret muskel, med en mage på hver side av midtlinjen, trenger de to magene i denne muskelen bare å skilles forsiktig i midtlinjen. Snitt av disse musklene er ikke nødvendig og vil forårsake blødning. For det andre, på vellykket åpning av dura mater, vil et variabelt antall årer med variabel kurs bli synlig på toppen av den dorsale overflaten av kaudal hjernestamme og øvre livmorhalsledning. Disse venene bør unngås ved å bruke mindre justeringer i koordinater (opptil 0,1 mm) eller, hvis det eksperimentelle paradigmet tillater det, ved å velge et annet mål.
En stor fordel med cisterna magna tilnærmingen er at den gir tilgang til hjernestammen og øvre cervical strukturer som er utfordrende å nå når du bruker standard stereotaxic flyet som de ligger nær kaudal enden av eller bare caudal til occipital bein. Videre, for mål i medulla oblongata, unngår tilnærmingen cerebellum og derfor cerebellar lesjon effekter eller spurious merking via en nål tract, som kan påvirke studieresultatene når du bruker standard metodikk er ikke en bekymring. En annen fordel med cisterna magna tilnærmingen er at hjernestammens dorsale overflate blir synlig. Dette gir mulighet til å bruke et landemerke på dorsaloverflaten som referansepunkt for koordinater. Videre er tilnærmingen fleksibel og kan optimaliseres avhengig av målet. For eksempel brukte vi et mellomlinjelandemerke, obex, som referansepunkt. Men når man retter seg mot dorsale strukturer, kan strukturen av interesse i seg selv diktere landskapet på dorsaloverflaten. For eksempel stikker den eksterne cuneate kjernen dorsalt ut, og kan dermed visualiseres og injiseres direkte. For laterale mål, for eksempel ventral respiratorisk gruppe eller tvetydig kompleks, kan cisterna magna-vinduet økes i sideretning. På samme måte, for målretting av øvre livmorhalsstrukturer, kan vinduet utvides mot atlaset. Mens vi brukte en museadapter plassert i en stor stereotaktisk ramme for dyr, kan tilnærmingen enkelt tilpasses andre rammer eller oppsett, så lenge de viktigste trinnene følges. For eksempel, i stedet for et plastkort, kan munnstangen plasseres mot nesebroen for å holde hodet i en stabil anteroflexed posisjon. Det er verdt å merke seg at koordinater for hjernestammemålsteder med obex som nullpunkt, som angitt i tabell 1, fungerer som en referanse, og justeringer kan angis basert på musens belastning, alder, kjønn, kalibrering av stereotoksisk arm og posisjoneringsteknikk, på samme måte som justeringer man må gjøre når man utleder målkoordinater for en standard tilnærming fra et referanseatlas. Dette krever innsikt i tilnærmingens plan, spesielt for flere rostrale mål som illustrert i figur 1. Testing av koordinater kan gjøres ved hjelp av forskjellige sporstoffer, for eksempel fluorescerende perler eller fluorescerende merket Cholera Toxin subenhet b for forskjellige koordinater i samme mus. Histologiske analyser av hjernestamme/spinalvevsseksjoner (ikke dekket i denne protokollen) gir deretter tilbakemelding om lokalisering i forhold til objektive interne landemerker 8,9,11,16 eller for sammenligning med et referanseatlas. Koordinater kan deretter justeres, testes på nytt og fullføres.
Cisterna magna-tilnærmingen har også begrensninger. CNS-regioner som kan nås via denne tilnærmingen er begrenset til kaudale pons, medulla oblongata og øvre livmorhalsledning. Mens kaudale ponnier lett kan nås via standardtilnærmingen, har cisterna magna-tilnærmingen fordeler når man studerer underavdelinger av langsgående orienterte strukturer som strekker seg fra medulla oblongata til kaudale pons, som det er tilfelle for underavdelinger i retikulære formasjon. En annen relativ begrensning oppstår når du bruker denne tilnærmingen for andre gang i samme mus, for eksempel i modifisert rabiessporing14. Tilstedeværelsen av arrvev kan øke varigheten av operasjonen eller uklare mindre landemerker. Men i våre hender har denne metoden fortsatt vært overlegen den standard stereotaksiske tilnærmingen i dette tilfellet, da stedet for den første injeksjonen kan dokumenteres i forhold til posisjonen til årer av andre unike landemerker, noe som gjør det enkelt å finne det nøyaktige inngangspunktet tilbake. Selv om denne tilnærmingen er overlegen for å spore studier i kaudal medulla og øvre ryggmarg, kan den ikke brukes til kronisk implantatmaskinvare. Derfor, for in-vivo optogenetikk og kalsiumavbildningsstudier som krever implantasjon av optiske fibre17 , kan cisterna magna-tilnærmingen brukes først til å levere en AAV til målstedet, etterfulgt av en annen operasjon ved hjelp av en standard tilnærming til instrumentmus med fibre eller kanyler. Denne tilnærmingen gjør det mulig for en å holde målområdet diskret, mens fiber / maskinvareplassering er mer tilgivende (dvs. kan være mindre nøyaktig), på grunn av den relativt store størrelsen på maskinvaren. Til slutt krever cisterna magna-tilnærmingen mer avanserte kirurgiske ferdigheter enn en standard stereotaxisk tilnærming. I stedet for anerkjennelse av enkle benete landemerker, krever det innsikt i mer komplekse hjernestammer og muskuloskeletale landemerker. Også, som med enhver delikat kirurgi, er suksessen og effektiviteten av prosedyren avhengig av et riktig verktøysett som er i utmerket stand. Denne protokollen tar for seg de sistnevnte problemene og kan brukes som en detaljert veiledning av eksperimenter.
Til slutt er cisterna magna-tilnærmingen komplementær til standard stereotaxisk tilnærming og gir flere fordeler når du målretter mot kaudal hjernestamme og øvre livmorhalsledning, som ikke er lett tilgjengelig via en standard stereotaxisk tilnærming. Den bruker referansepunkter som er CNS i stedet for benete landemerker som er i nærheten av de tiltenkte målene, noe som øker reproduserbarheten og nøyaktigheten. Dette gjør tilnærmingen spesielt verdifull når små injeksjonsvolumer må leveres til diskrete steder i sammenheng med detaljert kartlegging eller kjemogenetiske studier. Denne tilnærmingen er også relevant for funksjonelle kjemogenetiske, optogenetiske, fiberfotometri eller lesjonstilnærminger, der et AAV-virus eller toksin leveres til et mål med motorisk funksjon eller sensorisk integrasjon som en avlesning: det unngår et kurs gjennom cerebellum for mål i medulla oblongata og begrenser derfor forstyrrelsen i studieresultatene. Fra et dyrevelferdssynspunkt krever prosedyren ikke boring av flere burrhull for å få tilgang til steder bilateralt eller langsgående, noe som reduserer varigheten av operasjonen og invasiviteten til prosedyren. Mens vi skisserte tilnærmingen i detalj for mus, gjelder de samme prinsippene for andre arter 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01 NS079623, P01 HL149630 og P01 HL095491.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, Wolfe Publishing Ltd. (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science. , Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004).
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
