Summary
생쥐의 뇌 부위를 표적으로 삼는 입체 택시 수술은 일반적으로 두개골 뼈를 통한 접근을 포함하며 두개골 랜드 마크에 의해 안내됩니다. 여기서 우리는 뇌간 랜드 마크의 직접적인 시각화에 의존하는 cisterna magna를 통해 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부 척수를 목표로하는 대체 입체 택시 접근법을 개략적으로 설명합니다.
Abstract
생쥐의 뇌 부위를 표적으로 삼는 입체 택시 수술은 일반적으로 두개골 랜드 마크에 의해 안내됩니다. 그런 다음 두개골을 통해 뚫린 버 구멍을 통해 접근이 이루어집니다. 이 표준 접근법은 특정 해부학 적 문제로 인해 인과 관계 뇌간 및 상부 자궁 경부의 표적에 도전 할 수 있습니다.이 부위는 두개골 랜드 마크에서 멀리 떨어져 있기 때문에 부정확 함을 초래합니다. 여기서 우리는 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부에서 관심의 개별 영역을 목표로하는 데 사용 된 cisterna magna를 통한 대체 입체 택시 접근법을 개략적으로 설명합니다. cisterna magna는 후두골에서 아틀라스 (즉, 두 번째 척추 뼈)까지 연장되며, 뇌척수액으로 채워지며 경막으로 덮여 있습니다. 이 접근법은 해부학 적 장벽으로 인해 도달하기 어려운 중추 신경계 (CNS) 구조에 대한 재현 가능한 접근 경로를 제공합니다. 또한, 표적 부위와 가까운 곳에 있는 뇌간(brainstem) 랜드마크를 직접 시각화할 수 있어 인과성 뇌간이나 상부 자궁경부의 제한된 관심 영역에 작은 주사량을 전달할 때 정확도가 높아집니다. 마지막으로,이 접근법은 소뇌를 피할 수있는 기회를 제공하며, 이는 모터 및 감각 운동 연구에 중요 할 수 있습니다.
Introduction
생쥐1의 뇌 부위를 표적으로 삼는 표준 입체 택시 수술은 일반적으로 귀 막대 세트와 입 막대를 사용하여 두개골을 고정시키는 것을 포함합니다. 좌표는 참조 아틀라스 2,3 및 두개골 랜드 마크, 즉 bregma (정면과 정수리 뼈의 봉합사가 함께 모이는 지점) 또는 람다 (정수리 및 후두부 뼈의 봉합사가 함께 모이는 지점)를 기반으로 추정됩니다. 그림 1A, B). 추정 된 목표 위의 두개골에 버 구멍을 통해 미세 주사를 전달하거나 캐뉼라 또는 광섬유로 계측하기 위해 목표 영역에 도달 할 수 있습니다. 이러한 봉합사의 해부학의 변화와 브레그마 또는 람다 4,5의 국소화의 오류로 인해 뇌와 관련하여 영점의 위치는 동물마다 다릅니다. 이러한 가변성으로 인한 타겟팅의 작은 오류는 크거나 가까운 대상에게는 문제가되지 않지만 전후 또는 등쪽 비행기의 영점에서 멀리 떨어져있는 작은 관심 영역 및 / 또는 나이, 변형 및 / 또는 성별로 인해 다양한 크기의 동물을 연구 할 때 그 영향이 더 큽니다. 수질 oblongata와 상부 자궁 경부에 독특한 몇 가지 추가 문제가 있습니다. 첫째, 전후 좌표의 작은 변화는 소뇌의 위치와 모양으로 인해 듀라에 비해 등복부 좌표의 중요한 변화와 관련이 있습니다 (그림 1Bi)2,6,7. 둘째, 상부 자궁 경부는 두개골2 내에 포함되어 있지 않습니다. 셋째, 후두골의 기울어진 위치와 목 근육의 겹쳐진 층(2)은 뇌간과 척수 사이의 전이 근처에 위치한 구조물에 대해 표준 입체택시 접근법을 더욱 어렵게 만든다(그림 1Bi). 마지막으로, 인과 관계 뇌간과 자궁 경부에 관심이있는 많은 표적은 작고2이며, 정확하고 재현 가능한 주사 8,9가 필요합니다.
cisterna magna를 통한 대안적인 접근법은 이러한 문제를 우회합니다. cisterna magna는 후두골에서 아틀라스까지 확장되는 넓은 공간입니다 (그림 1A, 즉 두 번째 척추 뼈)10. 그것은 뇌척수액으로 채워지고 경막10으로 덮여 있습니다. 후두골과 아틀라스 사이의이 공간은 머리를 전향 굴곡 할 때 열립니다. 그것은 장수 인두염 근육의 위에 놓인 쌍을 이루는 배꼽 사이를 탐색하여 꼬리 뇌간의 등쪽 표면을 노출시킴으로써 접근 할 수 있습니다. 관심 영역은 등쪽 표면 근처에 위치하는 경우 이러한 지역 자체의 랜드 마크를 기반으로 타겟팅 될 수 있습니다. 또는 중앙 운하가 IV 심실로 열리는 점을 좌표가 더 깊은 구조에 도달하는 영점으로 obex를 사용합니다. 이러한 접근법은 래트11, 고양이12, 마우스8,9, 및 비인간 영장류13을 포함하는 다양한 종에서 성공적으로 사용되어 복부 호흡기, 수질 내측 망상 형성, 독방의 핵, 부위 후술, 또는 저광택 핵을 표적으로 한다. 그러나이 접근법은 해부학에 대한 지식, 전문 툴킷 및 표준 입체 택시 접근법에 비해 고급 수술 기술이 필요하기 때문에 널리 활용되지 않습니다.
여기서는 cisterna magna를 통해 뇌간과 상부 자궁 경부에 도달하고, 랜드 마크를 시각화하고, 영점을 설정하고(그림 2), 미세주사를 관심 있는 개별 뇌간 및 척수 영역으로 입체적으로 전달하기 위한 목표 좌표를 추정 및 최적화하는 단계별 수술 방법을 설명합니다(그림 3). 그런 다음이 접근법과 관련된 장단점에 대해 논의합니다.
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Protocol
저자는이 프로토콜이 Beth Israel Deaconess Medical Center의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따른다고 선언합니다.
1. 수술기구 및 입체형 프레임의 제조
참고 : 수술은 무균 상태에서 수행됩니다. 멸균은 멸균 팁 기술을 사용하여 유지된다.
- 입체택시 프레임에 원하는 주사제(아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 기존 트레이서)가 채워진 마이크로피펫 또는 주사기가 있는 입체형 암을 설치하고 마우스 어댑터를 준비합니다(그림 2A).
- 오토클레이브 수술 도구 (재료 표)를 준비하고 멸균 된 표면에 놓습니다.
2. 마취 유도 및 마우스 준비
- 0.5 L/min에서 O2를 켜고 이소플루란 기화기를 4.0으로 설정하여O2 흐름이 유도 박스에 있는지 확인합니다.
주의: 이소플루란 유도 박스가 후드에 놓여 있고 이소플루란이 수술 부위에서 제거되었는지 확인하십시오. - 마우스(10주령 수컷 C57BL/6J)를 유도 챔버에 놓는다.
- 호흡이 느려지면 유도 챔버를 열고 마우스를 약간 들어 올립니다. 클리퍼를 사용하여 머리에서 어깨까지 머리카락을 제거하십시오.
3. 스테레오 택시 프레임에서 마우스의 위치 지정
- 마우스를 입체 택시 프레임으로 이동하고 코를 유연한 코 콘에 놓습니다. 이 단계에서O2 흐름이 이제 코 원뿔으로 향하는지 확인하십시오.
- 이어 바만 사용하여 마우스를 스테레오택시 프레임에 놓습니다.
참고: 이어 바가 고르고 머리가 평평한지 확인하십시오. - 수동으로 코를 안내하여 마우스의 머리를 90 ° 각도로 Anteroflex하십시오. 이 위치를 확보하려면 마우스 어댑터의 이어 바 기둥 사이에 플라스틱 장벽을 기둥과 평행하게 배치하십시오. 두개골의 평평한 부분은 기존의 입체 택시 수술에서 평평한 두개골 접근법과 유사한 참조 역할을합니다.
참고: 머리를 과도하게 구부리지 마십시오(즉, 전두엽 두개골 뼈의 평면과 테이블 표면의 평면 사이의 각도 90° 이상)는 상부 기도를 통과하는 공기 흐름을 방해합니다. 공기 흐름이 방해 당하면 마우스를 재배치하여 몸체가 트렁크 아래를지지하고 플라스틱 카드가 그림 2A, C에 설명 된대로 전두엽 두개골 뼈의 평면과 테이블 표면의 평면 사이의 90 °로 설정되었는지 확인하십시오. - 가열 패드를 마우스 아래에 놓은 다음 목과 신체의 나머지 부분이 같은 수준(즉, 약 180° 또는 테이블과 평행)에 위치하는지 확인합니다. 스프링 가위를 고정하는 도구 상자는 신체를이 위치로 들어 올리는 데 사용할 수 있습니다.
참고 :이 단계는 두개골에 의해 제자리에 고정되어있는 CNS의 더 많은 rostral 부분과는 달리 위치에 따라 꼬리 뇌 줄기와 상부 자궁 경부가 움직이기 때문에 중요합니다. - 4 mg/kg Meloxicam 저속방출(SR)의 단일 용량을 2 μL/g 체중의 부피로 피하(s.c.)로 주사하고 눈에 윤활제를 바르십시오.
- 수술 절개 부위를 먼저 70 % 알코올 준비 패드로 닦은 다음 베타 딘 준비 패드로 닦은 다음 다시 알코올 준비 패드로 말리십시오.
- 몸 아래에 드레이프를 놓습니다.
- 손을 소독하고 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 수술 부위에 커튼을 놓습니다.
4. 시스테르나 마그나에 접근하는 수술
- 발가락을 꼬집거나 각막 반사를 확인하여 마우스를 적절하게 마취했는지 확인하십시오.
- 이소플루란을 유지보수 수준으로 줄입니다(2.0).
- 수술 블레이드 # 10으로 1-1.2cm 절개를하십시오 후두부 뼈의 가장자리에서 어깨쪽으로 한 번의 부드러운 움직임으로.
- 사다리꼴 근육의 중간 선 랩을 절개하십시오. 이것은 짝을 이룬 장수염 근육을 노출시킵니다.
참고 : 생쥐에서 사다리꼴 근육은 매우 얇고 거의 투명한 근육입니다. 중간 선에 머물러 있어야하며 불필요한 출혈을 일으킬 수 있으므로 기본 근육을 자르지 마십시오. - 두 리트랙터 후크를 쌍을 이룬 장수염 근육 사이에 놓고, 하나는 왼쪽으로, 다른 하나는 오른쪽으로 향하게합니다. 지혈제의 무게는 지혈제의 위치를 다시 조정하여 수정할 수있는 리트랙터 후크에 장력을 제공합니다.
- 수술 현미경을 제자리에 배치하여 수술 현장을보다 잘 시각화하십시오.
- 무딘 laminectomy 포셉을 사용하여 쌍을 이룬 긴 capitis 근육의 왼쪽 및 오른쪽 배를 분리하고, 중간 선이 쉽게 보이는 후두부에서 시작합니다. 중간 선에서 후두부의 뼈를 가로 질러 무딘 포셉을 안내하여 cisternal dura mater와 만나는 곳으로 안내 한 다음 경막을 가로 질러 아틀라스까지 계속하십시오.
참고 : 짝을 이룬 장수염 근육을 통해 절단 할 필요가 없습니다. 그렇게하면 불필요한 출혈이 발생합니다. - 리트랙터의 위치를 변경하고 지혈제의 위치를 변경하여 장력을 조정하여 cisterna magna의 시야를 엽니 다.
- 무딘 laminectomy 포셉을 사용하여 중간 선에서 근육을 더 분리하여 뇌간과 소뇌의 좋은 시야 창을 얻으십시오.
- 소뇌와 뇌간이 두라 아래에 보일 때까지 필요에 따라 4.7-4.9 단계를 반복하십시오.
- 무딘 laminectomy 포셉을 사용하여, 뇌간을 명확하게 볼 수있을 때까지 중간 선에서 횡방향으로 포셉을 이동하여 결합 조직의 작은 가닥의 경막을 지우고 대상에 필요에 따라 더 많은 측면 공간을 만듭니다.
5. 흉골 막의 개방
- 각진 Dumont 포셉 (# 4/45)을 사용하여 후두부에서 아틀라스까지 뻗어있는 듀라를 잡으십시오. 후두부 뼈 근처의 경막을 잡고 봄 가위를 사용하여 두라에 작은 개구부 (~ 0.5 ~ 1.5mm)를 만듭니다.
참고 :이 로스트랄 위치에서는 뇌간과 위에 놓인 경막 사이의 공간이 가장 넓어 두라를 안전하게 조작 할 수있는 충분한 공간을 제공합니다. - 봄 가위를 사용하여 경막을 들어 올리고 경막을 더 엽니 다. 창의 크기는 대상에 따라 다릅니다.
참고 : 여러 개의 세로 주사 또는 양측 주사를 할 때 더 큰 창이 필요합니다. 작은 창은 단일 일방적 또는 중간 선 주입을 할 때 충분합니다. - 경막이 열리면 멸균 큐 팁으로 과도한 뇌척수액을 배출하십시오.
6. 랜드마크와 영점의 식별
- 열린 두라를 통해 상세한 랜드 마크가있는 뇌간의 등쪽 표면을보십시오. 중앙 운하가 IV 심실로 열리는 지점 인 외면은 표준 전후 및 평측 영점입니다.
7. 목표 좌표
참고: 다양한 대상에 대해 방법론 간의 전환을 용이하게 하기 위해 영점 브레그마를 기준으로 한 전방후(AP) 및 평측(ML) 좌표를 갖는 표준 좌표 목록과 영점 오벡스를 기준으로 AP 및 ML 좌표를 사용하는 시스테르나 마그나 좌표를 포함시켰습니다(표 1). Dorsoventral (DV) 좌표는 AP 및 ML 진입 지점에서 뇌 또는 소뇌의 표면 (표준 접근법) 또는 뇌간 또는 상부 경추 (cisterna magna approach)의 표면에 상대적입니다. 계획은 수술 전에해야합니다.
- 세 가지 좌표 집합을 사용하여 대상인 AP, ML 및 DV를 결정합니다. 머리 위치로 인해 뇌간 구조의 상대적 방향은 위치에 따라 다릅니다.
- 꼬리에서 오벡스까지의 목표 거리 >0.4mm(그림 1B, 녹색)의 경우 다음을 수행합니다.
- AP: 표준 입체형 참조 아틀라스(예: Paxinos 및 Franklin atlas2) 또는 횡단면에서 절단된 조직 계열을 사용하여 오벡스와 타겟 사이의 AP 거리를 추정합니다.
- ML: 횡단면에서 절단된 표준 입체택시 참조 아틀라스 또는 조직 시리즈를 사용하여 오벡스와 표적 사이의 ML 거리를 추정합니다.
- DV: AP 및 ML 목표 지점에서 뇌 또는 소뇌의 표면을 기준으로 좌표를 추정합니다. 횡단면에서 절단된 표준 입체택시 기준 아틀라스 또는 조직 계열을 사용하여 원하는 AP 및 ML 좌표와 대상에서 뇌간 표면 사이의 거리를 추정합니다.
- 꼬리에서 오벡스까지의 목표 거리 <0.4mm(그림 1B, 주황색)의 경우 다음을 수행합니다.
- AP: 뇌간을 전치하도록 좌표를 조정합니다. 복부 및 로스트랄 좌표의 경우, AP 뇌간 진입점은 표준 평면의 대상 AP 좌표에 비해 더 인과적일 것입니다.
- ML: 횡단면에서 절단된 표준 입체택시 기준 아틀라스 또는 조직 계열에서 목표 좌표를 도출합니다. 좌표는 대상 AP 레벨에서 시각화된 중간선에 상대적입니다.
- DV: AP 및 ML 목표 지점에서 뇌간 표면을 기준으로 좌표를 추정합니다. 뇌간을 전치 굴곡하도록 DV를 조정하십시오. 복부 및 로스트랄 좌표의 경우, DV 좌표는 표준 평면에서 뇌간장의 등쪽 표면으로부터의 거리보다 큽니다.
- 꼬리에서 오벡스까지의 목표 거리 >0.4mm(그림 1B, 녹색)의 경우 다음을 수행합니다.
8. 표적의 주입
- 입체택시 암을 사용하여 피펫 또는 주사기를 표적에 내리고 표준 입체택시 접근법과 같이 용액을 주입한다. 주사 후 1-5 분 동안 제자리에 두어 3-50 nL 사이의 부피를 사용할 때 바늘 트랙을 피하십시오. 그런 다음 입체 택시 암을 사용하여 피펫 또는 주사기를 들어 올립니다.
- 8.1단계를 반복합니다. 여러 대상에 대해.
9. 수술장 폐쇄
- 수술 현장에서 후크를 조심스럽게 제거하십시오. 쌍을 이룬 장수염 근육은 중립 위치로 되돌아 가서 시스테르나 마그나를 완전히 덮을 것입니다. 봉합사를 잡기에는 너무 약하기 때문에 중간 선의 사다리꼴 근육과 경막은 닫지 마십시오.
- 세 개의 나일론 또는 폴리프로필렌 봉합사(5-0 또는 6-0)로 피부를 닫습니다.
10. 수술 후 관리
- 이소플루란을 끄고 스테레오택시 프레임에서 마우스를 제거합니다. 마우스를 가열 패드의 깨끗한 케이지에 놓고 깨어 있고 움직일 때까지 관찰하십시오.
- 수술 후 1-3 일에 건강 상태, 체중 및 봉합사를 모니터링하십시오. 아직 제거하지 않은 경우 10 일째에 봉합사를 제거하십시오.
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Representative Results
cisterna magna 접근법은 표준 입체 택시 접근법을 통해 도달하기 어렵거나 일관성없는 타겟팅에 취약한 인과 관계 뇌간 및 상부 자궁 경부 구조 구조를 타겟팅 할 수있게합니다. cisterna magna에 도달하는 수술은 피부 절개, 사다리꼴 근육의 얇은 층 및 경막 매트의 개방을 필요로하므로 생쥐가 잘 견뎌냅니다. 표준 입체 택시 접근법에서와 같이 여러 개의 버 구멍을 뚫을 필요가 없기 때문에 여러 (세로 분산 또는 양측) 사이트를 타겟팅 할 때 특히 효율적이고 덜 침습적입니다. 마우스에서, 우리는 cisterna magna 접근법을 사용하여 인과성 뇌간에서 저광택 핵9, 복부 호흡기 그룹8 및 인접한 망상 형성8 과 같은 일상적으로 표적화 된 구조를 가지고 있으며, 도 3에서 저광택 핵 및 벤트로메디아 수질 (GiV)에 대해 더 자세히 설명하고 있습니다. 예를 들어, 저광택 핵은 등쪽 수질 oblongata에서 모토뉴런의 슬림하지만 rostrocaudally 길쭉한 기둥이며 그 로스트랄 폴은 표준 접근법을 통해 타겟팅 될 수 있습니다. 그러나 DV 좌표 (~ 4.5mm)는 대부분 뇌간으로 들어가는 1.2-1.4mm 만 가진 소뇌의 위에 놓인 소뇌에 의해 지시되기 때문에 마우스 머리의 위치 결정의 상대적으로 작은 차이로 인해 잘못 배치 된 주사가 쉽게 발생할 수 있습니다. 이 표적이 영점 오벡스에 근접하기 때문에, 시스테르나 마그나 접근법을 통해 보다 안정적으로 표적화될 수 있다. 또한, 뇌간과 척수 사이의 전이까지 연장되는 저광택 핵의 꼬리 끝은 동일한 cisterna magna 접근법에 의해 표적화 될 수있는 반면, 표준 접근법은 AP 접근법을 앵글링하고 후두부 뼈와 목 근육 조직을 피하기 위해 좌표를 조정함으로써 그러한 인과 부위에 도달하도록 수정되어야합니다.
표준 접근법과 비교하여 cisterna magna 접근법의 정확성을 결정하기 위해, 우리는 복부 (ventromedial medulla; GiA/V; N = 10) 및 등쪽 (NuXII; N = 16) 영역. 측정은 꼬리 뇌간(caudal brainstem)의 횡단 절편에서 이루어졌다(도 3). 결과(그림 4)는 표준 접근법에 비해 시스테르나 마그나 접근법에 대한 전후, 평측방, 특히 등쪽 평면에서 상당히 작은 오류를 보여줍니다. 이러한 결과는 이러한 표적에 대한 cisterna magna 접근법의 향상된 정확성을 강조합니다. 우리는 표 1에 표준 입체 택시 좌표 (Paxinos와 Franklin 2에서 파생 된 브레그마에 상대적이지만 우리 연구에 최적화되어 있음)와 cisterna magna 좌표 (obex에 상대적)를 포함했습니다. 이러한 좌표는 모두 그림 3의 저광택 핵 및 벤트로메디아 수질에 대해 표시된 바와 같이 최적화되고 검증되었습니다.
그림 1: 주요 랜드마크, 목표 영역 및 입체 택시 시스테르나 마그나 접근법의 평면에 대한 개략적인 표현 . (A) 주요 해부학적 랜드마크 및 시상면에서의 위치. (B) 표준 입체택시 접근법 대 시스테르나 마그나 입체택시 접근법 및 그들의 기준점과의 관계를 통해 도달할 수 있는 영역. i) 표준 접근법은 자홍색과 보라색의 대상 지역에서 멀리 떨어져있는 뼈 랜드 마크 브레그마와 람다를 사용합니다. 자홍색 (caudal medulla oblongata 및 상부 자궁 경부)의 영역은 기울어 진 후두부 뼈와 목 근육으로 인해 도달하기가 어렵습니다. 보라색 (rostral medulla oblongata)의 지역은 움직이기 쉽고 전통적인 랜드 마크에서 멀리 떨어져 있습니다. ii) cisterna magna 접근법은 caudal medulla oblongata 및 상부 자궁 경부에 접근하는 데 적합하며 caudal medulla oblongata rostrally에서 caudal pons의 수준까지 연장되는 세로 기둥으로 조직 된 뇌간 구조를 연구 할 때 이점이 있습니다. (C) cisterna magna 접근법과 관련하여 다양한 입체 택시 참조 아틀라스의 평면의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 입체형 시스테르나 마그나 접근법에 대한 단계별 개략적 개요 . (A) 가장 높은 레벨에 고르게 배치된 이어 바가 있는 마우스 어댑터, 낮은 위치에 입 막대, 전치된 헤드를 90° 각도로 고정하는 플라스틱 카드. (B) 이어바를 사용하여 마우스를 입체형 프레임에 고정하고 머리를 90°로 anteroflex하고 스테레오택시 프레임을 참조로 사용하여 단단한 플라스틱 카드를 통해 위치를 유지합니다. (C) 신체가 후두부와 같은 평면에 있도록 상승되었는지 확인하십시오. 주요 랜드마크를 촉촉하게 만듭니다. (D) 후두부에서 어깨의 로스트랄 부분까지 피부를 절개한다. (E) 사다리꼴 근육의 라페를 절개한다. 중간 선에 머물러 있고 기본 근육을 자르지 않도록하십시오. (F) 후두부에서 시작하여 장수염 근육의 두 배꼽 사이의 중간 선을 확인하고 꼬리 방향으로 laminectomy 포셉을 안내하십시오. (G) 각 상처 고리를 장수당 근육의 배꼽 사이에 놓고 cisterna magna가 보일 때까지 다시 위치시킵니다. (H) 뼈 랜드 마크 (후두골, 아틀라스), 이러한 뼈 구조 사이에서 확장되는 경막 매트, 그리고 근본적인 소뇌와 뇌간을 확인하십시오. 필요에 따라 경막 매트를 청소하여 목표 레벨을 노출시킵니다. (I) 스프링 가위와 미세한 포셉을 사용하여 듀라를 엽니 다. (J) AP 및 ML 영점을 형성하는 오벡스를 식별한다. 피펫을 선택한 AP 및 ML 좌표로 이동합니다. 피펫이 뇌간의 등쪽 표면에 도달 할 때까지 피펫을 낮추십시오. DV 영점입니다. 피펫을 원하는 좌표로 내립니다. (K) 피펫과 상처 후크를 제거하고 장수염 근육이 원래 위치를 재개하도록하십시오. (L) 상처를 닫고 입체 택시 프레임에서 마우스를 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 목표 좌표 평가. 꼬리 뇌간장의 낮은 배율 사진 현미경 사진. (a) 역행 트레이서 콜레라 독소 서브유닛 b(CTb; 파란색)를 ChAT-cre L10 GFP(녹색) 리포터 마우스(암컷, 6개월령)의 저광택 핵에 주사한다. CTb 주사는 저광택 핵으로 제한된다는 점에 유의하십시오. (b) vGluT2-ires-cre L10 GFP 리포터(녹색) 마우스(남성, 2개월령)의 글루타마테르기 세포를 꼬리 내측 수질 오브롱가타(GiV 영역의 꼬리 극)의 복부 부분에 조건부 전치료(마젠타)로 형질감염시킨다. (c) vGLuT2-ires-cre 마우스(남성, 2개월령)에서의 조건부 역행 추적은 꼬리 내측 수질 오브롱가타(GiV 영역의 코달 폴)에서 TVA(마젠타) 글루타마테르성 뉴런의 형질감염 및 변형된 광견병 감염(녹색)을 보여준다. 광견병 바이러스는 상부 자궁경부 척수에 주사되었다. 내부 랜드 마크는 지침 역할을합니다. 약어 - cAmb : Ambiguus 복합체의 컴팩트 핵; Ap: 지역 포스트레마; DMV: 미주(Vagus)의 등쪽 운동 핵; GiV: 거대세포핵, 복부부; IO: 열등한 올리브; IRt: 중간 망상 핵; LRN: 측방 망상 핵; NuXII-저광택 핵; sol: 독방의 핵; Sp5: 척추 삼차 핵; VRG : 복부 호흡기. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 표준 및 시스테르나 마그나 접근법 간의 정확도 비교. 의도된 표적의 중심과 전후부 평면(A), 평측면(B), 및 등복부 평면(C)에서 실제 부위의 중심 사이의 평균 거리. 데이터는 표준 접근법을 사용하여 N=13성인 마우스로부터 수득되었고, N=13성인 마우스는 시스테르나 마그나 접근법을 이용하였다. 표적의 반경은 30 μm로 설정하였다. 결과는 전후부 평면(t(24) = 2.08, p = 0.049; 2-꼬리 t-검정; 알파 0.05), 측방면(t(24) = 2.55, p = 0.018; 2꼬리 t-검정; 알파 0.05) 및 등쪽 평면(t(24) = 4.33, p = 0.0002; 2-꼬리 t-검정; 알파 0.05)에서 더 높은 정확도를 보여준다. 막대 그래프는 표준 편차가 있는 평균을 나타내고 개별 점은 각 마우스의 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 인과 관계 뇌 줄기 구조를 대상으로하는 표준 및 cisterna magna 입체 택시 좌표의 개요. 표준 및 시스테르나 마그나 접근법 모두에 대해 Paxinos 및 Franklin atlas2 의 좌표는 관심 영역이 조직학에 의해 검증된 대로 적절하게 타겟팅될 때까지 조정되었습니다(그림 3). 또한 망상 형성의 영역에는 잘 정의 된 경계가 없으며 Paxinos 및 Franklin2에서와 같이 레이블이 지정되어 있습니다. 약어 - AP : 전후. ML : 평범한. DV : 등복부. ChAT: 콜린 아세틸트랜스퍼라제; F: 여성; M: 남성; M & F : 남성과 여성; NA: 해당 사항 없음; Pet1: 혈장 세포종 발현 전사 인자 1; Sert: 세로토닌 수송체, vGaT: 수포 GABA 수송체; vGluT2: 수포성 글루타메이트 수송체 2; WT : 와일드 타입. 모든 좌표는 밀리미터 (mm)입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
표준 입체 택시 수술은 일반적으로 CNS1에서 표적 부위의 좌표를 계산하기 위해 두개골 랜드 마크에 의존합니다. 그런 다음 대상 사이트는 두개골1을 통해 뚫린 버 구멍을 통해 액세스됩니다. 이 방법은 표적 부위가 전후 및 등쪽 평면(2)의 두개골 랜드마크로부터 멀리 떨어져 있고 두개골의 해부학 및 근육의 해부학이접근에 도전하기 때문에 6(그림 1Bi) 인과관계 뇌간에는 이상적이지 않다. 우리의 연구는 cisterna magna 접근법이라고 불리는 꼬리 뇌간과 상부 척수의 표적 부위에 접근하기위한 대체 입체 택시 접근법을 설명합니다. 이 방법을 표준 입체 론적 접근법과 다르게 만드는 주요 특징은 cisterna magna를 열기 위해 머리의 전방 굴곡과 함께 위치하고, 뇌간의 등쪽 표면에있는 주요 뇌 줄기 랜드 마크를 obex와 같은 참조 점으로 사용하는 것입니다. 우리의 결과는이 접근법이 소량 (5-50 nL)의 추적자 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 개별 뇌간 구조로 전달하는 데 적합하다는 것을 나타냅니다. 더욱이, 뼈 구조보다는 CNS 랜드마크를 나타내고, 의도된 표적에 근접하고 있는 기준점의 사용은 회로 매핑 및 화학유전학 연구와 관련된 바와 같이 작은 표적 및 작은 주입 부피에 대한 재현성 및 정확도를 증가시킨다(도 3)14,15.
모든 프로토콜과 마찬가지로 cisterna magna 접근법에는 재현성을 달성하기 위해 중요한 단계가 있습니다. 세 가지 다른 평면 (전방, 평방, 등쪽)의 좌표에 의존하는 고정 관념 접근법과 마찬가지로 위치 지정이 중요합니다. cisterna magna 접근법의 경우, 이것은 90 °에서 전향 굴곡되어야하는 머리의 위치뿐만 아니라 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부가 같은 평면에 있도록 상승되어야하는 신체의 위치도 포함합니다. 또 다른 중요한 단계는 출혈을 유발하는 불필요한 조작을 피하는 것인데, 이는 주요 랜드 마크의 시각화를 방해 할 수 있기 때문입니다. 출혈의 위험이 높은 두 가지 조작이 있습니다. 첫째, 시스테르나 마그나를 덮고있는 경막 매트는 비교적 큰 근육 (longus capitis)으로 덮여 있습니다. 이것은 쌍을 이루는 근육이기 때문에 중간 선의 양쪽에 하나의 배가 있으므로이 근육의 두 배는 중간 선에서 부드럽게 분리되어야합니다. 이러한 근육의 절개는 필요하지 않으며 출혈을 일으킬 것입니다. 둘째, 경막 매트의 성공적인 개통시, 가변 코스를 가진 다양한 수의 정맥이 꼬리 뇌 줄기와 상부 자궁 경부의 등쪽 표면 꼭대기에서 보일 것입니다. 이러한 정맥은 좌표 (최대 0.1mm)에 약간의 조정을 적용하거나 실험 패러다임이 허용하는 경우 다른 대상을 선택하여 피해야합니다.
cisterna magna 접근법의 가장 큰 장점은 표준 입체 택시 평면을 사용할 때 도달하기 어려운 뇌간 및 상부 자궁 경부 구조에 대한 접근을 제공한다는 것입니다. 또한, 수질 oblongata의 표적에 대한 접근법은 소뇌를 피하고 따라서 소뇌 병변 효과 또는 바늘 관을 통한 가짜 라벨링을 피하며, 이는 표준 방법론을 사용할 때 연구 결과에 영향을 줄 수 있습니다. cisterna magna 접근법의 또 다른 장점은 뇌간장의 등쪽 표면이 보이게된다는 것입니다. 이렇게 하면 등쪽 표면의 랜드마크를 좌표의 기준점으로 사용할 수 있습니다. 또한이 접근 방식은 유연하며 목표에 따라 최적화 될 수 있습니다. 예를 들어, 중간선 랜드마크인 오벡스를 기준점으로 사용했습니다. 그러나 등쪽 구조를 타겟팅 할 때 관심있는 구조 자체가 등쪽 표면의 풍경을 지시 할 수 있습니다. 예를 들어, 외부 큐니에이트 핵은 등쪽으로 돌출되어 있으며, 따라서 시각화되고 직접 주입될 수 있다. 복부 호흡기 또는 모호한 복합체와 같은 측방 표적의 경우, 시스테르나 마그나 창은 횡방향으로 증가 될 수 있습니다. 마찬가지로, 상부 자궁 경부 구조의 표적화를 위해, 창은 아틀라스쪽으로 확장 될 수있다. 우리는 큰 동물 입체 프레임에 배치 된 마우스 어댑터를 사용했지만, 주요 단계를 따르는 한 다른 프레임이나 설정에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 플라스틱 카드 대신 입 막대를 코의 다리에 대고 배치하여 머리를 안정적인 전향 구부러진 위치에 유지할 수 있습니다. 표 1에 제공된 바와 같이 오벡스를 영점으로 갖는 뇌간 표적 부위의 좌표가 참조로 작용하고, 조정은 마우스 변형, 나이, 성별, 입체택시 팔의 교정 및 위치 결정 기술에 기초하여 지시될 수 있으며, 이는 기준 아틀라스로부터 표준 접근법에 대한 표적 좌표를 도출할 때 수행해야 하는 조정과 유사하다는 점은 주목할 가치가 있다. 이를 위해서는 접근 방식의 평면, 특히 그림 1에 표시된 것처럼 더 많은 로스트랄 대상에 대한 통찰력이 필요합니다. 좌표의 시험은 상이한 추적자, 예를 들어, 형광 비드 또는 형광 태깅된 콜레라 독소 서브유닛 b를 동일한 마우스에서 상이한 좌표에 대해 사용하여 수행될 수 있다. 뇌간/척추 조직 절편의 조직학적 분석(이 프로토콜에서 다루지 않음)은 객관적인 내부 랜드마크 8,9,11,16과 관련된 국소화에 대한 피드백을 제공하거나 참조 아틀라스와의 비교를 위해 제공합니다. 그런 다음 좌표를 조정하고 다시 테스트하고 마무리 할 수 있습니다.
cisterna magna 접근법에도 한계가 있습니다. 이 접근법을 통해 도달 할 수있는 CNS 영역은 caudal pons, medulla oblongata, 및 상부 자궁 경부로 제한됩니다. caudal pons는 표준 접근법을 통해 쉽게 접근 할 수 있지만, cisterna magna 접근법은 망상 형성 내의 세분과 마찬가지로 수질 oblongata에서 caudal pons로 확장되는 길이 지향 구조의 세분법을 연구 할 때 이점이 있습니다. 또 다른 상대적 제한은 동일한 마우스에서 두 번째로 이 접근법을 사용할 때, 예를 들어, 변형된 광견병 추적(14)에서 발생한다. 흉터 조직의 존재는 수술의 지속 시간을 증가시키거나 사소한 랜드 마크를 모호하게 할 수 있습니다. 그러나 우리 손에는이 방법이 다른 독특한 랜드 마크의 정맥 위치와 관련하여 첫 번째 주사 부위를 문서화 할 수 있기 때문에이 경우 표준 입체 택시 접근법보다 여전히 우수하여 정확한 진입 점을 쉽게 찾을 수 있습니다. 이 접근법은 꼬리 수질과 상부 척수에서의 추적 연구에 탁월하지만 만성적으로 하드웨어를 이식하는 데 사용할 수는 없습니다. 따라서, 광섬유(17)의 이식을 필요로 하는 생체내 광유전학 및 칼슘 이미징 연구를 위해, 시스테르나 마그나 접근법은 먼저 AAV를 표적 부위에 전달하기 위해 사용될 수 있고, 이어서 섬유 또는 캐뉼라를 갖는 계기 마우스에 대한 표준 접근법을 사용하는 두 번째 수술이 뒤따를 수 있다. 이 접근 방식을 사용하면 대상 사이트를 별도로 유지할 수 있지만 광섬유 / 하드웨어 배치는 하드웨어의 크기가 상대적으로 크기 때문에 더 관대합니다 (즉, 덜 정확 할 수 있음). 마지막으로, cisterna magna 접근법은 표준 입체 택시 접근법보다 더 진보 된 수술 기술을 필요로합니다. 단순한 뼈 랜드 마크를 인식하기보다는 더 복잡한 뇌간과 근골격계 랜드 마크에 대한 통찰력이 필요합니다. 또한 섬세한 수술과 마찬가지로 절차의 성공과 효율성은 우수한 상태에있는 적절한 툴킷에 달려 있습니다. 이 프로토콜은 후자의 문제를 해결하며 실험자가 자세한 가이드로 사용할 수 있습니다.
결론적으로, cisterna magna 접근법은 표준 입체 택시 접근법과 보완적이며 표준 입체 택시 접근법을 통해 쉽게 접근 할 수없는 꼬리 뇌간 및 상부 자궁 경부를 타겟팅 할 때 여러 가지 이점을 제공합니다. 의도 된 대상에 근접한 뼈 랜드 마크가 아닌 CNS 인 참조 점을 사용하여 재현성과 정확성을 높입니다. 이것은 상세한 매핑 또는 화학 유전학 연구의 맥락에서 작은 주입 부피가 개별 부위로 전달되어야 할 때 특히 유용합니다. 이 접근법은 또한 기능적 화학유전학, 광유전학, 섬유 광도계 또는 병변 접근법과 관련이 있으며, AAV 바이러스 또는 독소가 운동 기능 또는 감각 운동 통합을 판독으로 사용하여 대상에게 전달됩니다 : 수질 oblongata의 표적에 대한 소뇌를 통한 과정을 피하고 따라서 연구 결과에서 간섭을 제한합니다. 동물 복지의 관점에서 볼 때,이 절차는 양측 또는 세로 사이트에 접근하기 위해 여러 개의 버 구멍을 뚫을 필요가 없으므로 수술 기간과 절차의 침습성이 줄어 듭니다. 우리가 생쥐에 대한 접근법을 자세히 설명했지만, 동일한 원칙이 다른 종11,12,13에도 적용됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 R01 NS079623, P01 HL149630 및 P01 HL095491에서 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
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