Summary
A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos geralmente envolve acesso através dos ossos do crânio e é guiada por marcos do crânio. Aqui descrevemos uma abordagem estereotaxa alternativa para atingir o tronco cerebral caudal e a medula espinhal cervical superior através da cisterna magna que se baseia na visualização direta de marcos do tronco cerebral.
Abstract
A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos é comumente guiada por marcos do crânio. O acesso é então obtido através de orifícios de rebarba perfurados através do crânio. Esta abordagem padrão pode ser desafiadora para alvos no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior devido a desafios anatômicos específicos, pois esses locais são distantes de marcos do crânio, levando à imprecisão. Aqui descrevemos uma abordagem estereutílica alternativa através da cisterna magna que tem sido usada para atingir regiões discretas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. A cisterna magna estende-se do osso occipital até o atlas (ou seja, o segundo osso vertebral), é preenchida com fluido cefalorraquidiano, e é coberta por dura mater. Esta abordagem fornece uma rota reprodutível de acesso a estruturas selecionadas do sistema nervoso central (CNS) que são de outra forma difíceis de alcançar devido a barreiras anatômicas. Além disso, permite a visualização direta de marcos do tronco cerebral nas proximidades dos locais alvo, aumentando a precisão ao fornecer pequenos volumes de injeção para regiões restritas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. Por fim, essa abordagem oferece uma oportunidade de evitar o cerebelo, que pode ser importante para estudos motores e sensoriais.
Introduction
Cirurgia estereotaxa padrão para atingir locais cerebrais em camundongos1 geralmente envolve fixação do crânio usando um conjunto de barras de ouvido e uma barra de boca. As coordenadas são então estimadas com base em atlas de referência 2,3, e marcos do crânio, ou seja, bregma (o ponto onde as suturas dos ossos frontais e parietal se unem) ou lambda (o ponto onde as suturas dos ossos parietal e occipital se unem; Figura 1A,B). Através de um orifício de rebarba no crânio acima do alvo estimado, a região alvo pode então ser alcançada, seja para entrega de microinjeções ou instrumentação com cânulas ou fibras ópticas. Devido à variação na anatomia dessas suturas e erros na localização de bregma ou lambda 4,5, a posição de zero pontos em relação ao cérebro varia de animal para animal. Embora pequenos erros de segmentação, que resultem dessa variabilidade, não sejam um problema para alvos grandes ou próximos, seu impacto é maior para áreas menores de interesse que são distantes dos pontos zero nos planos anteroposterior ou dorsoventral e/ou ao estudar animais de tamanho variado devido à idade, tensão e/ou sexo. Existem vários desafios adicionais que são únicos para a medula oblongata e a corda cervical superior. Em primeiro lugar, pequenas alterações nas coordenadas anteroposterioras estão associadas a mudanças significativas nas coordenadas dorsoventra em relação à dura, devido à posição e forma do cerebelo (Figura 1Bi)2,6,7. Segundo, a corda cervical superior não está contida no crânio2. Em terceiro lugar, a posição inclinada do osso occipital e a camada excessiva dos músculos do pescoço2 torna a abordagem estereotaxic padrão ainda mais desafiadora para estruturas localizadas perto da transição entre o tronco cerebral e a medula espinhal (Figura 1Bi). Finalmente, muitos alvos de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical são pequenos2, exigindo injeções precisas e reprodutíveis 8,9.
Uma abordagem alternativa através da cisterna magna contorna esses problemas. A cisterna magna é um grande espaço que se estende do osso occipital até o atlas (Figura 1A, ou seja, o segundo osso vertebral)10. É preenchido com fluido cefalorraquidiano e coberto por dura mater10. Este espaço entre o osso occipital e o atlas abre quando a anteroflexão da cabeça. Ele pode ser acessado navegando entre as barrigas emparelhadas excessivamente do músculo longus capitis, expondo a superfície dorsal do tronco cerebral caudal. Regiões de interesse podem então ser alvo com base nos marcos dessas regiões se estiverem localizadas perto da superfície dorsal; ou usando o obex, o ponto onde o canal central se abre no ventrículo IV, como ponto zero para que as coordenadas alcancem estruturas mais profundas. Esta abordagem tem sido usada com sucesso em uma variedade de espécies, incluindo o rato11, gato12, rato 8,9, e primata não humano13 para atingir o grupo respiratório ventral, formação reticular medial medular, o núcleo do trato solitário, área pós-orssal. No entanto, essa abordagem não é amplamente utilizada, pois requer conhecimento de anatomia, um kit de ferramentas especializado e habilidades cirúrgicas mais avançadas em comparação com a abordagem estereotaxa padrão.
Aqui descrevemos uma abordagem cirúrgica passo a passo para alcançar o tronco cerebral e a medula cervical superior através da cisterna magna, visualizamos marcos, definimos o ponto zero (Figura 2), e estimamos e otimizamos coordenadas-alvo para a entrega estereotaxa de microinjeções nas discretas regiões de tronco cerebral e medula espinhal (Figura 3). Em seguida, discutimos as vantagens e desvantagens relacionadas a essa abordagem.
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Protocol
O autor declara que o protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e quadro estereotaxic
NOTA: A cirurgia é realizada em condições assépticas. A esterilidade é mantida usando a técnica de ponta estéril.
- Instale o braço estereotaxic com uma micropipette ou seringa preenchida com uma opção injetável (vírus associado ao Adeno (AAV) ou rastreador convencional) no quadro estereotaxico e prepare o adaptador do mouse (Figura 2A).
- Prepare instrumentos cirúrgicos autoclavados (Tabela de materiais) e coloque-os em uma superfície estéril.
2. Indução de anestesia e preparação do rato
- Ligue O2 a 0,5 L/min e coloque o vaporizador isoflurane em 4.0, certificando-se de que o fluxo O2 está na caixa de indução.
ATENÇÃO: Certifique-se de que a caixa de indução de isoflurane seja colocada em um capô e que o isoflurane seja retirado do local cirúrgico. - Coloque o mouse (C57BL/6J masculino de 10 semanas) na câmara de indução.
- Uma vez que a respiração tenha diminuído, abra a câmara de indução e levante o rato ligeiramente. Use cortadores para remover o cabelo da cabeça aos ombros.
3. Posicionamento do mouse no quadro estereotaxic
- Mova o mouse para a estrutura estereotaxa e coloque o nariz em um cone de nariz flexível. Nesta fase, certifique-se de que o fluxo O2 agora seja direcionado para o cone do nariz.
- Coloque o mouse no quadro estereotaxic usando apenas barras de ouvido.
NOTA: Certifique-se de que as barras de ouvido estão uniformes e a cabeça está nivelada. - Anteroflexe a cabeça do mouse para um ângulo de 90° guiando manualmente o nariz. Para fixar essa posição, coloque uma barreira plástica entre os pilares da barra de ouvido do adaptador do mouse, paralelamente aos pilares. A parte plana do crânio serve como referência, semelhante à abordagem do crânio plano na cirurgia estereotaxica convencional.
NOTA: Não flexione sobre a cabeça (ou seja, além de um ângulo de 90° entre o plano do osso frontal do crânio e o plano da superfície da mesa) pois isso impede o fluxo de ar através das vias aéreas superiores. Se o fluxo de ar for impedido, reposicione o mouse, certificando-se de que o corpo esteja suportado sob o porta-malas e uma placa de plástico seja fixado em 90° entre o plano do osso frontal do crânio e o plano da superfície da mesa, conforme descrito na Figura 2A,C. - Coloque a almofada de aquecimento por baixo do mouse e, em seguida, certifique-se de que o pescoço e o resto do corpo estão posicionados no mesmo nível (ou seja, aproximadamente 180° ou paralelo à mesa). A caixa de ferramentas que segura a tesoura de mola pode ser usada para levantar o corpo para esta posição.
NOTA: Este passo é importante à medida que o tronco cerebral caudal e o cordão cervical superior se movem dependendo da posição, em contraste com partes mais rostrais do CNS que são mantidas no lugar pelo crânio. - Injete uma única dose de 4 mg/kg meloxicam de liberação lenta (RS) subcutânea (s.c.) a um volume de 2 μL/g de peso corporal e coloque lubrificante nos olhos.
- Limpe o local de incisão cirúrgica primeiro com uma almofada de preparação de 70% de álcool, depois com uma almofada de preparação betadina, e depois novamente com uma almofada de preparação para álcool e deixe secar.
- Coloque uma cortina debaixo do corpo.
- Desinfete as mãos e coloque luvas estéreis.
- Coloque uma cortina no local cirúrgico.
4. Cirurgia para acesso à cisterna magna
- Certifique-se de que o mouse está apropriadamente anestesiado, apertando os dedos dos dedos ou verificando o reflexo da córnea.
- Reduza o isoflurane aos níveis de manutenção (2.0).
- Faça uma incisão de 1-1,2 cm com lâmina cirúrgica #10 da borda do osso occipital em direção aos ombros em um movimento suave.
- Faça uma incisão no raphe da linha média do músculo trapézio. Isso expõe os músculos longus capitis emparelhados.
NOTA: Em camundongos, o músculo trapézio é um músculo muito fino, quase transparente. Certifique-se de ficar na linha média e não cortar nos músculos subjacentes, pois isso causará sangramento desnecessário. - Coloque ambos os ganchos retraídos entre os músculos longus capitis emparelhados, um orientado para a esquerda e outro para a direita. O peso dos hemostatas proporciona tensão aos ganchos retráteis que podem ser modificados reajustando a posição dos hemostates.
- Posicione o microscópio cirúrgico no lugar para visualizar melhor o campo cirúrgico.
- Use os fórceps de laminectomia contundente para separar as barrigas esquerda e direita do músculo longus capitis emparelhado, a partir da occiput, onde a linha média é prontamente visível. Guie os fórceps contundentes através do osso da occiput na linha média até onde ele encontra a dura gêmea cisterna, e, em seguida, continuar através da dura mater para o atlas.
NOTA: Não há necessidade de cortar os músculos longus capitis emparelhados, pois nada os mantém unidos na linha média; fazendo isso causará sangramento desnecessário. - Reposicione os retratores e ajuste a tensão reposicionando os hemostatos, abrindo a visão da cisterna magna.
- Use os fórceps de laminectomia contundente para separar os músculos ainda mais na linha média para obter uma boa janela de visualização do tronco cerebral e cerebelo.
- Repita os passos 4.7-4.9 conforme necessário até que o cerebelo e o tronco cerebral venham em vista abaixo da dura.
- Usando fórceps de laminectomia contundente, limpe a dura dura dos pequenos fios do tecido conjuntivo movendo os fórceps da linha média em direção lateral, até que haja uma visão clara do tronco cerebral e para criar mais espaço lateral, conforme necessário para o alvo.
5. Abertura da membrana cisterna
- Use as fórceps Dumont angulares (#4/45) para pegar a dura, que se estende do osso occipital até o atlas. Pegue a dura dura perto do osso occipital e use a tesoura de mola para fazer uma pequena abertura (~0,5 a 1,5 mm) na dura.
NOTA: Neste local rostral, o espaço entre o tronco cerebral e a dura sobrelaçada é mais amplo, proporcionando amplo espaço para uma manipulação segura da dura. - Use a tesoura de mola para levantar a dura e abrir ainda mais a dura. O tamanho da janela depende do alvo.
NOTA: Uma janela maior será necessária ao fazer múltiplas injeções longitudinais ou injeções bilaterais; uma pequena janela será suficiente ao fazer injeções unilaterais ou médias únicas. - Uma vez aberto o dura, escorra o excesso de fluido cefalorraquidiano com uma ponta de sinalização estéril.
6. Identificação de marcos e ponto zero
- Veja a superfície dorsal do tronco cerebral com marcos detalhados através da dura abertura. O obex, o ponto onde o canal central se abre para o ventrículo IV, é o ponto zero anterior-posterior e mediolateral padrão.
7. Coordenadas de alvo
NOTA: Para vários alvos, incluímos uma lista de coordenadas padrão com coordenadas posteriores anteriores (AP) e mediolateral (ML) relativas às coordenadas bregma e cisterna magna de ponto zero com coordenadas AP e ML relativas a zero ponto obex para facilitar a transição entre metodologias (Tabela 1). As coordenadas dorsoventral (DV) são relativas à superfície do cérebro ou cerebelo (abordagem padrão) ou à superfície do tronco cerebral ou da cordão cervical superior (abordagem cisterna magna) no ponto de entrada de AP e ML. O planejamento deve ser feito antes da cirurgia.
- Use os três conjuntos de coordenadas para determinar o alvo: AP, ML e DV. Devido à posição da cabeça, a orientação relativa das estruturas do tronco cerebral varia de acordo com a localização.
- Para a distância alvo >0,4 mm de caudal para o obex (Figura 1B, verde) realizar o seguinte.
- AP: Use qualquer atlas de referência estereotaxic padrão (por exemplo, Paxinos e Franklin atlas2) ou série de tecido cortado no plano transversal para estimar a distância AP entre o obex e o alvo.
- ML: Use qualquer atlas de referência estereotaxic padrão ou corte de tecido no plano transversal para estimar a distância ML entre o obex e o alvo.
- DV: Estimar coordenadas relativas à superfície do cérebro ou cerebelo no ponto alvo AP e ML. Use qualquer atlas de referência estereóxica padrão ou série de tecido cortado no plano transversal para estimar a distância entre a superfície do tronco cerebral nas coordenadas AP e ML desejadas e no alvo.
- Para a distância alvo <0,4 mm de caudal para o obex (Figura 1B, laranja) realizar o seguinte.
- AP: Ajuste as coordenadas para explicar a anteroflexão do tronco cerebral. Para coordenadas ventral e rostral, o ponto de entrada do brainstem AP será mais caudal em relação à coordenada AP alvo no plano padrão.
- ML: Obtenha coordenadas de destino de um atlas de referência estereóxica padrão ou corte de série de tecidos no plano transversal. As coordenadas serão relativas à linha média visualizada no nível AP alvo.
- DV: Estimar coordenadas relativas à superfície do tronco cerebral no ponto alvo AP e ML. Ajuste DV para explicar a anteroflexão do tronco cerebral. Para coordenadas ventral e rostral, as coordenadas DV serão maiores do que a distância da superfície dorsal do tronco cerebral no plano padrão.
- Para a distância alvo >0,4 mm de caudal para o obex (Figura 1B, verde) realizar o seguinte.
8. Injeção do alvo
- Abaixe a pipeta ou a seringa para o alvo usando o braço estereotaxic e injete solução como para abordagens estereotaxas padrão. Deixe no lugar por 1-5 minutos após a injeção, para evitar uma pista de agulha ao usar volumes entre 3-50 nL. Em seguida, levante a pipeta ou a seringa usando o braço estereotaxic.
- Repita o passo 8.1. para vários alvos.
9. Encerramento do campo cirúrgico
- Remova os ganchos cuidadosamente do campo cirúrgico. Os músculos longus capitis emparelhados cairão de volta em uma posição neutra, cobrindo totalmente a cisterna magna. Não feche o músculo trapézio e a dura-costura na linha média, pois eles são muito frágeis para segurar suturas.
- Feche a pele com três suturas de nylon ou polipropileno (5-0 ou 6-0).
10. Cuidados pós-operatórios
- Desligue isoflurane e remova o mouse do quadro estereotaxic. Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento e observe até acordar e se mover.
- Monitore o estado de saúde, o peso e as suturas nos dias pós-operatórios 1-3. Remova as suturas no dia 10 se ainda não for removido.
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Representative Results
A abordagem cisterna magna torna possível atingir estruturas cerebrais caudais e cordões cervicais superiores que são de outra forma difíceis de alcançar através de abordagens estereotaxas padrão ou são propensas a alvos inconsistentes. A cirurgia para chegar à cisterna magna requer incisões da pele, uma fina camada de músculo trapézio, e abertura da dura mater e, portanto, bem tolerada por camundongos. É especialmente eficiente e menos invasivo ao atingir múltiplos locais (longitudinalmente dispersos ou bilaterais), pois não requer perfuração de múltiplos orifícios de rebarba como em abordagens estereotribicas padrão. Em camundongos, temos rotineiramente estruturas direcionadas, como o núcleo hipoglossal9, o grupo respiratório ventral8, e a formação reticular adjacente8 no tronco cerebral caudal usando a abordagem cisterna magna, como ilustramos ainda mais para o núcleo hipoglossal e a medula ventromedial (GiV) na Figura 3. Por exemplo, o núcleo hipoglossal é uma coluna fina, mas rostrocaudally alongada de motoneurons na medula dorsal oblongata e seu polo rostral pode ser alvo através de uma abordagem padrão. No entanto, como as coordenadas DV (~4,5 mm) são ditadas principalmente pelo cerebelo sobrelada com apenas 1,2-1,4 mm entrando no tronco cerebral, uma diferença relativamente pequena no posicionamento da cabeça do mouse poderia, portanto, facilmente resultar em uma injeção extraviada. Devido à proximidade deste alvo ao obex de ponto zero, ele pode ser mais confiável através da abordagem cisterna magna. Além disso, a extremidade caudal do núcleo hipoglossal que se estende até a transição entre o tronco cerebral e a medula espinhal pode ser alvo da mesma abordagem cisterna magna, enquanto a abordagem padrão teria que ser modificada para alcançar tal local caudal, angling a abordagem AP e o ajuste de coordenadas para evitar o osso occipital e a musculatura do pescoço excessivamente.
A fim de determinar a precisão da abordagem cisterna magna versus a abordagem padrão, medimos a distância entre os locais alvo pretendidos e reais nos planos anteroposterior, mediolateral e dorsoventral para os planos ventral (medulla ventromedial; GiA/V; N = 10) e dorsal (NuXII; N = 16) regiões. As medidas foram feitas em seções transversais do tronco cerebral caudal (Figura 3). Os resultados (Figura 4) mostram erros significativamente menores nos planos anteroposterior, mediolateral e, especialmente, dorsoventral para a abordagem cisterna magna em comparação com a abordagem padrão. Esses resultados destacam a maior precisão da abordagem cisterna magna para esses alvos. Incluímos coordenadas estereotaxas padrão (relativas à bregma, derivadas de Paxinos e Franklin 2, mas otimizadas para nossos estudos) e coordenadas cisterna magna (relativas ao obex) na Tabela 1. Todas essas coordenadas foram otimizadas e verificadas como mostrado para o núcleo hipoglossal e medulla ventromedial na Figura 3.
Figura 1: Representação esquemática de marcos-chave, áreas alvo e o plano da abordagem estéreotaxa cisterna magna. (A) Principais marcos anatômicos e posicionamento no plano sagital. (B) Áreas que podem ser alcançadas através da abordagem estereotaxic padrão versus cisterna magna abordagem estereotaxic e relação com seus pontos de referência. i) A abordagem padrão faz uso de marcos ósseos bregma e lambda, que estão distantes das regiões alvo em magenta e roxo. A área em magenta (caudal medulla oblongata e cordão cervical superior) é desafiadora de alcançar devido aos músculos occipitais inclinados e do pescoço. A área em roxo (rostral medulla oblongata) é propensa ao movimento e distante dos marcos tradicionais. ii) A abordagem cisterna magna é apropriada para acessar a medulla caudal oblongata e a cordão cervical superior e tem vantagens ao estudar estruturas de tronco cerebral que são organizadas em colunas longitudinais que se estendem desde a medulla caudal oblongata rostrally, até o nível dos pons caudais. (C) Esquema dos planos de vários atlas de referência estereotaxic em relação à abordagem cisterna magna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral esquemática passo a passo da abordagem estéreotaxa cisterna magna. (A) Adaptador de rato com barras de ouvido posicionadas uniformemente no mais alto nível, a barra da boca em uma posição baixa e um cartão de plástico para fixar a cabeça anteroflexada em um ângulo de 90°. (B) Fixar o mouse no quadro estereotático usando as barras de ouvido e anteroflexar a cabeça a 90° e manter-se em posição através de uma placa de plástico rígida, com o quadro estereotaxic como referência. (C) Certifique-se de que o corpo está elevado para que esteja no mesmo plano que o occiput. Marcos principais palpate. (D) Faça uma incisão de pele da occiput até a parte rostral dos ombros. (E) Faça uma incisão no raphe do músculo trapézio. Certifique-se de ficar na linha média e não cortar nos músculos subjacentes. (F) Identifique a linha média entre as duas barrigas do músculo longus capitis, começando pela occiput, e guie os fórceps de laminectomia em uma direção caudal. (G) Coloque cada um dos ganchos de ferida entre as barrigas do músculo longus capitis e re-posicione até que a cisterna magna venha à vista. (H) Identifique marcos ósseos (osso occipital, atlas), a dura mater que se estende entre essas estruturas ósseas, e o cerebelo e tronco cerebral subjacentes. Limpe a dura-se mater conforme necessário para expor o nível de destino. (I) Usando tesouras de mola e fórceps finos abram a dura. (J) Identifique o obex, que forma o ponto zero AP e ML. Mova a pipeta para as coordenadas AP e ML de escolha. Abaixe a pipeta até atingir a superfície dorsal do tronco cerebral. Este é o ponto de zero do DV. Abaixe a pipeta para a coordenada desejada. (K) Remova a pipeta e os ganchos da ferida e deixe que os músculos longus capitis retomem sua posição original. (L) Feche a ferida e remova o mouse do quadro estereotaxic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação das coordenadas de alvo. Fómicgrafos de baixa ampliação do tronco cerebral caudal. (A) Injeção de toxina cólera retrógrada de cólera subunnit b (CTb; azul) no núcleo hipoglossal de um rato repórter ChAT-cre L10 GFP (verde) (feminino, 6 meses de idade). Note que a injeção de CTb está restrita ao núcleo hipoglossal. (B) Transfecção de células glutamatergicas de um rato vGluT2-ires-cre L10 GFP (verde) com um rastreador anterogrado condicional (magenta) na parte ventral da medulla oblongata medial caudal (polo caudal da região giv). (C) Rastreamento retrógrado condicional em um rato vGLuT2-ires-cre (masculino, 2 meses de idade) mostrando transfecção de TVA (magenta) de neurônios glutamatergicos e infecção antirrábica modificada (verde) na medulla oblongata medial caudal (polo caudal da região giv). O vírus da raiva foi injetado na medula espinhal cervical superior. Marcos internos servem como orientação. Abreviaturas-cAmb: Núcleo Compacto do complexo de Ambiguus; Ap: Área Postrema; Detran: Núcleo Motor Dorsal do Vagus; GiV: Núcleo Gigantocelular, parte ventral; IO: Azeitona inferior; IRt: Núcleo Reticular Intermediário; LRN: Núcleo Reticular Lateral; Núcleo NuXII- Hipoglossal; sol: Núcleo do Trato Solitário; Sp5: Núcleo Trigeminal Espinhal; VRG: grupo respiratório ventral. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação da precisão entre as abordagens padrão e cisterna magna. Distância média entre o centro do alvo pretendido e o centro do local real no plano anteroposterior (A), plano mediolateral (B) e plano dorsoventral (C). Os dados foram obtidos de N = 13 camundongos adultos usando uma abordagem padrão e N = 13 camundongos adultos usando uma abordagem cisterna magna. O raio do alvo foi fixado em 30 μm. Os resultados mostram maior precisão no plano anteroposterior (t(24) = 2,08, p = 0,049; teste t de duas caudas; alfa 0,05), plano mediolateral (t(24) = 2,55, p = 0,018; teste t de duas caudas; alfa 0,05) e plano dorsoventral (t(24) = 4,33, p = 0,0002; teste t de duas caudas; alfa 0,05). Os gráficos de barras representam a média com desvio padrão e pontos individuais representam valores em cada mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Visão geral das coordenadas estéreo estéreo padrão e cisterna magna para atingir estruturas de troncos cerebrais caudais. Observe que, tanto para as abordagens padrão quanto para cisterna magna, as coordenadas do AtlasPaxinos e Franklin 2 foram ajustadas até que regiões de interesse fossem adequadamente alvo, conforme verificado pela histologia (Figura 3). Além disso, note que as áreas na formação reticular carecem de limites bem definidos e estão aqui rotuladas como em Paxinos e Franklin2. Abreviaturas-AP: anteroposterior. ML: mediolateral. DV: dorsoventral. ChAT: Choline Acetyltransferase; F: Feminino; M: Masculino; M&F: Masculino e Feminino; NA: não aplicável; Pet1: plasmacitoma expresso fator de transcrição 1; Sert: Transportador de serotonina, vGaT: transportador GABA vesicular; vGluT2: Transportador de glutamato vesicular 2; WT: Tipo selvagem. Todas as coordenadas estão em milímetros (mm). Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A cirurgia estereóxica padrão geralmente depende de marcos do crânio para calcular as coordenadas dos locais alvo no CNS1. Os locais alvo são então acessados através de orifícios de rebarba que são perfurados através do crânio1. Este método não é ideal para o tronco cerebral caudal, pois os locais alvo estão localizados distantes dos marcos do crânio nos planos anteroposterior e dorsoventral2 e como a anatomia do crânio e músculos sobrepostos tornam o acesso desafiador6 (Figura 1Bi). Nosso estudo descreve uma abordagem estereotaxa alternativa para acessar locais-alvo no tronco cerebral caudal e medula espinhal superior chamada abordagem cisterna magna. Características-chave que tornam este método diferente de uma abordagem estereotática padrão são o posicionamento, com anteroflexão da cabeça para abrir a cisterna magna, e uso de marcos cerebrais chave na superfície dorsal do tronco cerebral como pontos de referência como o obex. Nossos resultados indicam que esta abordagem é adequada para a entrega de pequenos volumes (5-50 nL) de rastreadores ou vírus associados a adeno (AAVs) em estruturas cerebrais discretas. Além disso, o uso de um ponto de referência que represente um marco cns, em vez de uma estrutura óssea, e que está próximo do alvo pretendido aumenta a reprodutibilidade e a precisão para alvos pequenos e pequenos volumes de injeção, conforme relevante para mapeamento de circuitos e estudos quimigênicos (Figura 3)14,15.
Como em qualquer protocolo, a abordagem cisterna magna tem passos que são fundamentais para alcançar a reprodutibilidade. Como em qualquer abordagem estereotaxa que depende de coordenadas em três planos diferentes (anteroposterior, mediolateral e dorsoventral), o posicionamento é crítico. Para a abordagem cisterna magna, isso envolve não apenas a posição da cabeça, que deve ser anteroflexada a 90° mas também a do corpo, que deve ser elevada para que o tronco cerebral caudal e a corda cervical superior estejam no mesmo plano. Outro passo crítico é evitar manipulações desnecessárias que causam sangramento, pois isso dificultaria a visualização de marcos-chave. Há duas manipulações que carregam um alto risco de sangramento. Em primeiro lugar, a dura-mater que cobre a cisterna magna é coberta por um músculo relativamente grande (longus capitis). Como este é um músculo emparelhado, com uma barriga em ambos os lados da linha média, as duas barrigas deste músculo só precisarão ser separadas suavemente na linha média. A incisão desses músculos não é necessária e causará sangramento. Em segundo lugar, na abertura bem sucedida da dura-mater, um número variável de veias com um curso variável se tornará visível em cima da superfície dorsal do tronco cerebral caudal e da cordão cervical superior. Essas veias devem ser evitadas aplicando pequenos ajustes nas coordenadas (até 0,1 mm) ou, se o paradigma experimental permitir, selecionando um alvo diferente.
Uma grande vantagem da abordagem cisterna magna é que ela fornece acesso às estruturas cervicais e cervicais superiores que são desafiadoras de alcançar ao usar o plano estereotaxic padrão, pois estão localizados perto da extremidade caudal ou apenas caudal ao osso occipital. Além disso, para alvos na medula oblongata a abordagem evita o cerebelo e, portanto, efeitos da lesão cerebelar ou rotulagem espúria através de um trato de agulha, o que pode afetar os resultados do estudo ao usar a metodologia padrão não são uma preocupação. Outra vantagem da abordagem cisterna magna é que a superfície dorsal do tronco cerebral torna-se visível. Isso proporciona a oportunidade de usar um marco na superfície dorsal como ponto de referência para coordenadas. Além disso, a abordagem é flexível e pode ser otimizada dependendo do alvo. Por exemplo, usamos um marco médio, o obex, como ponto de referência. No entanto, ao direcionar estruturas dorsais, a estrutura de interesse em si pode ditar a paisagem da superfície dorsal. Por exemplo, o núcleo cuneato externo se projeta dorsais e, portanto, pode ser visualizado e injetado diretamente. Para alvos laterais, como o grupo respiratório ventral ou complexo ambíguo, a janela cisterna magna pode ser aumentada em uma direção lateral. Da mesma forma, para o direcionamento de estruturas cervicais superiores, a janela pode ser estendida em direção ao atlas. Embora tenhamos usado um adaptador de mouse colocado em um grande quadro estereotático animal, a abordagem pode ser facilmente adaptada a outros quadros ou configurações, desde que os passos-chave estejam sendo seguidos. Por exemplo, em vez de um cartão de plástico, a barra da boca pode ser colocada contra a ponte do nariz para manter a cabeça em uma posição anteroflexada estável. Vale ressaltar que as coordenadas dos locais alvo do tronco cerebral com o obedecimento como ponto zero, conforme previsto na Tabela 1, servem como referência, e ajustes podem ser indicados com base na cepa do camundongo, idade, sexo, calibração do braço estereotaxic e técnica de posicionamento, semelhante aos ajustes que se precisa fazer ao derivar coordenadas de destino para uma abordagem padrão de um atlas de referência. Isso requer uma visão do plano da abordagem, especialmente para alvos mais rostrais como ilustrado na Figura 1. O teste das coordenadas pode ser feito usando diferentes rastreadores, por exemplo, contas fluorescentes ou subunidade de toxina de cólera com marca fluorescente b para diferentes coordenadas no mesmo mouse. Análises histológicas das seções cérebrostem/tecido espinhal (não cobertas neste protocolo) fornecem feedback sobre localização em relação aos marcos internos objetivos 8,9,11,16 ou para comparação com um atlas de referência. As coordenadas podem então ser ajustadas, testadas novamente e finalizadas.
A abordagem cisterna magna também tem limitações. As regiões de CNS que podem ser alcançadas através desta abordagem estão restritas aos pons caudais, medulla oblongata e cordão cervical superior. Embora os pons caudais possam ser acessados facilmente através da abordagem padrão, a abordagem cisterna magna tem vantagens ao estudar subdivisões de estruturas longitudinalmente orientadas que se estendem da medula oblongata até os pons caudais, como é o caso de subdivisões dentro da formação reticular. Outra limitação relativa ocorre ao usar essa abordagem pela segunda vez no mesmo mouse, por exemplo, no rastreamento de raiva modificada14. A presença de tecido cicatricial pode aumentar a duração da cirurgia ou obscurecer pequenos marcos. No entanto, em nossas mãos, este método ainda tem sido superior à abordagem estereotaxa padrão neste caso, pois o local da primeira injeção pode ser documentado em relação à posição das veias de outros marcos únicos, facilitando a localização do ponto de entrada exato para trás. Embora essa abordagem seja superior para estudos de rastreamento na medula espinhal caudal e medula espinhal superior, não pode ser usada para implantar cronicamente o hardware. Portanto, para estudos de optogenética in vivo e imagem de cálcio que requerem implantação de fibras ópticas17 a abordagem cisterna magna pode ser usada primeiro para entregar um AAV ao local alvo, seguido de uma segunda cirurgia usando uma abordagem padrão para instrumentar camundongos com fibras ou cânulas. Essa abordagem permite manter o local de destino discreto, enquanto a colocação de fibra/hardware é mais tolerante (ou seja, pode ser menos precisa), devido ao tamanho relativamente grande do hardware. Por fim, a abordagem cisterna magna requer habilidades cirúrgicas mais avançadas do que uma abordagem estereotaxa padrão. Em vez de reconhecimento de marcos ósseos simples, requer uma visão sobre tronco cerebral mais complexo e marcos musculoesqueléticos. Além disso, como em qualquer cirurgia delicada, o sucesso e a eficiência do procedimento dependem de um kit de ferramentas adequado que esteja em excelentes condições. Este protocolo aborda os últimos problemas e pode ser usado como um guia detalhado por experimentadores.
Em conclusão, a abordagem cisterna magna é complementar à abordagem estereotaxic padrão e fornece múltiplas vantagens ao mirar o tronco cerebral caudal e o cordão cervical superior, que não são facilmente acessados através de uma abordagem estereotaxic padrão. Ele usa pontos de referência que são CNS em vez de marcos ósseos que estão próximos dos alvos pretendidos, aumentando a reprodutibilidade e a precisão. Isso torna a abordagem especialmente valiosa quando pequenos volumes de injeção precisam ser entregues em locais discretos no contexto de mapeamento detalhado ou estudos quimigênicos. Essa abordagem também é relevante para abordagens funcionais de quimioterapia, optogenética, fotometria de fibras ou lesões, onde um vírus AAV ou toxina é entregue a um alvo com função motora ou integração sensorial como leitura: evita um curso através do cerebelo para alvos na medula oblongata e, portanto, limita sua interferência nos resultados do estudo. Do ponto de vista do bem-estar animal, o procedimento não requer a perfuração de múltiplos orifícios de rebarba para acessar locais bilateral ou longitudinalmente, reduzindo a duração da cirurgia e a invasividade do procedimento. Embora tenhamos delineado a abordagem em detalhes para camundongos, os mesmos princípios se aplicam a outras espécies 11,12,13.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por R01 NS079623, P01 HL149630 e P01 HL095491.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
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