Summary
Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.
Abstract
Le criblage à haute teneur (HCS) et l’analyse à haute teneur (HCA) sont des technologies qui permettent aux chercheurs d’extraire des mesures phénotypiques quantitatives à grande échelle des cellules. Cette approche s’est avérée puissante pour approfondir notre compréhension d’un large éventail d’événements fondamentaux et appliqués en biologie cellulaire. À ce jour, la majorité des applications de cette technologie reposent sur l’utilisation de cellules cultivées en monocouches, bien qu’il soit de plus en plus réalisé que de tels modèles ne récapitulent pas bon nombre des interactions et des processus qui se produisent dans les tissus. En tant que tel, il y a eu une émergence dans le développement et l’utilisation d’assemblages cellulaires en 3 dimensions (3D), tels que les sphéroïdes et les organoïdes. Bien que ces modèles 3D soient particulièrement puissants dans le contexte de la biologie du cancer et des études d’administration de médicaments, leur production et leur analyse d’une manière reproductible adaptée au HCS et au HCA présentent un certain nombre de défis. Le protocole détaillé ici décrit une méthode de génération de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (MCTS) et démontre qu’il peut être appliqué à trois lignées cellulaires différentes d’une manière compatible avec HCS et HCA. La méthode facilite la production de plusieurs centaines de sphéroïdes par puits, offrant l’avantage spécifique que lorsqu’elles sont utilisées dans un régime de criblage, les données peuvent être obtenues à partir de plusieurs centaines de structures par puits, toutes traitées de manière identique. Des exemples sont également fournis, qui détaillent comment traiter les sphéroïdes pour l’imagerie par fluorescence à haute résolution et comment HCA peut extraire des caractéristiques quantitatives à la fois au niveau des sphéroïdes ainsi qu’à partir de cellules individuelles dans chaque sphéroïde. Ce protocole pourrait facilement être appliqué pour répondre à un large éventail de questions importantes en biologie cellulaire.
Introduction
Traditionnellement, les essais cellulaires ont été effectués dans des monocouches se développant sur un substrat solide, qui peut effectivement être considéré comme un environnement bidimensionnel (2D). Cependant, il est de plus en plus reconnu que les modèles de culture cellulaire 2D manquent de pertinence physiologique dans certains contextes et ne peuvent pas reproduire bon nombre des interactions complexes qui se produisent entre les cellules1. Les méthodes de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) deviennent rapidement populaires parmi les chercheurs, et les modèles cellulaires 3D montrent un potentiel élevé pour mieux imiter les conditions physiologiques rencontrées par les cellules dans l’environnement tissulaire2. Il existe plusieurs types différents d’assemblages de cellules 3D qui ont été utilisés, mais les deux types les plus courants sont les sphéroïdes et les organoïdes. Les sphéroïdes peuvent être cultivés à partir de nombreuses lignées cellulaires différentes, et ils peuvent adopter différentes formes et tailles en fonction du type de cellule utilisé et de leur méthode d’assemblage3. De plus, les sphéroïdes peuvent également être appelés sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) lorsqu’ils sont cultivés à partir de lignées cellulaires cancéreuses, et ces modèles ont trouvé une utilisation particulière pour l’administration préclinique de médicaments in vitro et les études de toxicité4,5. Les organoïdes, d’autre part, visent à mieux imiter les tissus et les organes de notre corps et peuvent adopter des arrangements morphologiques plus complexes. La production d’organoïdes implique l’utilisation de cellules souches adultes ou de cellules souches pluripotentes, qui peuvent être reprogrammées dans les cellules appropriées pour ressembler au tissu ou à l’organe d’intérêt. Ils sont principalement utilisés pour étudier le développement des organes et modéliser les maladies et les interactions hôte-pathogène6.
Il existe une gamme de méthodes différentes utilisées pour générer des assemblages de cellules 3D. Les méthodes basées sur l’échafaudage fournissent un substrat ou un support auquel les cellules peuvent s’attacher ou se développer à l’intérieur. Ces échafaudages peuvent avoir différentes formes et peuvent être fabriqués à partir d’une variété de matériaux différents. Les plus courants sont les composants de la matrice extracellulaire (ECM) et les hydrogels, et ils sont conçus pour ressembler à l’environnement extracellulaire naturel des cellules et faciliter ainsi les interactions physiologiques4,7. Le matériau du sous-sol ECM a été extrait de la tumeur du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm et il a été démontré qu’il contenait un riche mélange de composants ECM, y compris la laminine, le collagène de type IV et le perlécan8. Cependant, malgré sa composition avantageuse, son utilisation présente deux défis principaux, à savoir sa variabilité d’un lot à l’autre et le fait qu’il présente deux états agrégés différents inférieurs et supérieurs à 10 °C8,9. En revanche, les hydrogels ont l’avantage d’être flexibles en ce qui concerne leurs composants et leur rigidité, et ils peuvent être personnalisés pour s’adapter à l’assemblage de cellules 3D spécifique souhaité7,10. Les méthodes basées sur l’échafaudage sont essentielles pour la croissance organoïde, mais sont également largement utilisées pour les sphéroïdes. Les méthodes sans échafaudage, qui fonctionnent en empêchant les cellules de se fixer à la surface sur laquelle elles poussent, ne sont généralement compatibles qu’avec l’assemblage sphéroïde. Les exemples incluent des plaques à fixation ultra-faible (ULA), avec un fond plat ou un fond en U, qui permettent l’agrégation des cellules en sphéroïdes, ou l’utilisation d’une agitation continue des cellules dans des flacons de rotation10.
L’utilisation d’assemblages de cellules 3D pour étudier une grande variété d’événements biologiques gagne rapidement en popularité; toutefois, il est essentiel que la méthode choisie pour leur culture soit appropriée et compatible avec les plans d’analyse en aval. Par exemple, l’utilisation de plaques ULA génère des sphéroïdes de haute consistance; cependant, cette méthode est limitée à la production d’un seul sphéroïde par puits, limitant ainsi le débit. Une attention particulière est nécessaire lors de la planification de l’imagerie par fluorescence de la structure 3D. Le substrat ou la plaque sur lequel l’assemblage est cultivé doit être optiquement compatible et il faut veiller à minimiser les effets de la diffusion de la lumière causés par les échafaudages qui ont pu être utilisés11. Ce problème particulier devient plus aigu à mesure que l’ouverture numérique des lentilles de l’objectif du microscope augmente.
On peut soutenir que l’une des principales raisons de choisir de travailler avec un modèle de cellule 3D est d’extraire des données d’imagerie volumétrique non seulement sur l’ensemble de l’assemblage, mais aussi sur les cellules individuelles qu’il contient. Les modèles MCTS, en particulier, commencent à s’avérer très puissants pour approfondir notre compréhension de la façon dont les thérapies transitent de l’extérieur vers les cellules centrales (comme elles en auraient besoin dans une tumeur)12, et il est donc essentiel d’acquérir des connaissances à partir de cellules individuelles à différentes couches. La technologie d’imagerie qui extrait des informations quantitatives de cellules individuelles est appelée analyse à haute teneur (HCA) et constitue une approche puissante dans le contexte du dépistage13. À ce jour, le HCA a été presque exclusivement appliqué aux cultures monocouches, mais on se rend de plus en plus compte que cette approche a le pouvoir d’être appliquée aux cultures 3D permettant d’étudier un large éventail de fonctions et de processus cellulaires14. Il aurait l’avantage évident qu’un grand nombre d’assemblages 3D pourraient être analysés, fournissant potentiellement des données au niveau de la cellule de chaque structure. Cependant, les défis associés à l’imagerie d’assemblages de cellules potentiellement épaisses, ainsi qu’aux grands ensembles de données générés, doivent être surmontés.
Dans cet article, une méthode robuste basée sur un échafaudage pour la production à grande échelle de MCTS dans un format de 96 puits est présentée. La méthode facilite la production de plusieurs centaines d’assemblages de cellules 3D dans chaque puits. Des exemples sont présentés pour trois types de cellules différents, représentant des modèles de tumeurs solides du foie, du poumon et du côlon. Les sphéroïdes qui se forment peuvent être de différentes tailles, et donc HCA est utilisé pour sélectionner des structures d’une taille et / ou d’une morphologie particulière. Cette caractéristique offre l’avantage supplémentaire que tous les phénotypes observés peuvent être comparés entre des sphéroïdes de tailles différentes, mais tous traités de la même manière dans le même puits. Cette approche est compatible avec l’imagerie à haute résolution, fournissant de manière importante des données quantitatives au niveau cellulaire et subcellulaire provenant des mêmes assemblages cellulaires. Cette méthode de production de sphéroïdes présente l’avantage supplémentaire par rapport aux méthodes qui génèrent un seul sphéroïde par puits, que le grand nombre de sphéroïdes produits dans chaque puits fournit potentiellement suffisamment de biomasse pour d’autres analyses en aval, telles que le transcriptome et le profilage du protéome.
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Protocol
1. Culture cellulaire
- Préparer les médias
- Préparer des milieux de culture cellulaire spécifiques en fonction du type de lignée cellulaire. S’assurer que tous les milieux pour l’entretien cellulaire contiennent 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
REMARQUE: Différentes lignées cellulaires utilisent différents médias. Les cellules de carcinome du côlon HT-29 (ATCC HTB-38) sont cultivées dans McCoys 5A + 10% FBS. Les cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2 (ATCC HB-8065) sont cultivées dans un milieu essentiel minimum + 1% de L-glutamine + 10% fbS. Les cellules du carcinome broncho-alvéolaire H358 (ATCC CRL-5807) sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 + 1% L-glutamine + 10% FBS. Tous les milieux contenant de la L-glutamine et du FBS sont appelés milieux complets. Lors du placage de cellules pour qu’elles se développent sous forme de sphéroïdes, un milieu sans rouge phénol avec 10% de FBS est nécessaire pour éviter la coloration du matériau du sous-sol ECM, ce qui peut à son tour provoquer des artefacts pendant le processus d’imagerie.
- Préparer des milieux de culture cellulaire spécifiques en fonction du type de lignée cellulaire. S’assurer que tous les milieux pour l’entretien cellulaire contiennent 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
- Cellules de sous-culture
- Lorsque les cellules sont confluentes à environ 80 %, laver brièvement avec 2 mL de trypsine-EDTA (0,25 % (p/v) de trypsine/0,53 mM d’EDTA). Aspirer la trypsine-EDTA, ajouter 3 mL de trypsine-EDTA fraîche et incuber pendant 3-5 min à 37 °C.
- Lorsque les cellules sont détachées de la boîte de culture cellulaire, ajouter 7 mL de milieu frais complet.
- Pipeter 1 mL de suspension cellulaire dans un nouveau plat de culture cellulaire de 10 cm et ajouter 9 mL de milieu frais complet pour obtenir une dilution de 1:10 des cellules.
- Cultiver les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
- Sous-cultiver les cellules tous les 3-5 jours, selon la lignée cellulaire.
2. Génération de sphéroïdes
- Enduire les plaques de 96 puits avec un matériau de sous-sol ECM
- Décongelez le matériau du sous-sol ECM sur la glace pendant la nuit.
- Diluer le matériau de sous-sol ECM dans un milieu sans sérum sans phénol froid à l’aide d’embouts pré-réfrigérés maintenus à -20 ° C.
REMARQUE: La concentration finale de matériau de sous-sol ECM dépend de la lignée cellulaire utilisée. Pour les cellules HT-29 et H358, utilisez 4 mg·mL-1 de matériau de sous-sol ECM. Pour les cellules HepG2, utilisez 4 mg·mL-1 de matériau de sous-sol ECM à facteur de croissance réduit. - Pipette 15 μL de la solution matériau/milieu du sous-sol ECM dans une plaque d’imagerie de 96 puits.
REMARQUE: Pour la production de sphéroïdes à grande échelle, cette étape peut être effectuée à la fois avec une pipette à 8 canaux et une tête de pipetage à 96 canaux, à condition que les extrémités et le réservoir contenant le matériau du sous-sol ECM soient refroidis. - Centrifuger la plaque pendant 20 min à 91 x g à 4 °C.
- Incuber la plaque pendant 30 min au maximum à 37 °C.
- Sous-culture et cellules de comptage
- Pendant la période d’incubation de la plaque, incuber les cellules avec de la trypsine-EDTA et les remettre en suspension dans un milieu complet contenant 10% de FBS.
- Pipette 10 μL de la suspension cellulaire dans une chambre de comptage hémocytométrique. Comptez le nombre de cellules dans 4 quadrants de la chambre.
- Calculez le nombre de cellules dans la suspension cellulaire en déterminant le nombre moyen de cellules dans les 4 quadrants.
REMARQUE: Les cellules peuvent également être comptées à l’aide de dispositifs automatisés de comptage de cellules. - Centrifuger les cellules à 135 x g pendant 4 min à température ambiante (RT).
- Une fois les cellules granulées, aspirez le surnageant et ressuspendez les cellules dans un milieu complet sans phénol rouge pour obtenir une concentration de 1 x 106 cellules par mL.
- Ensemencez des cellules dans des plaques revêtues de matériau de sous-sol ECM
- Diluer les cellules dans un milieu complet sans rouge de phénol.
REMARQUE: La densité des cellules ensemencées dépend de la lignée cellulaire utilisée. Pour les cellules HT-29 et HepG2, 3 x 104 cellules sont ensemencées par puits; pour les cellules H358, 4 x 104 cellules sont ensemencées par puits. - Ensemencez les cellules dans un volume total de 35 μL par puits. Assurez-vous de les ajouter goutte à goutte dans un mouvement circulaire.
REMARQUE: Pour la production de sphéroïdes à grande échelle, cette étape peut être effectuée avec une pipette à 8 canaux, à condition que le mouvement circulaire de pipetage puisse être réalisé. - Incuber les cellules pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
- Préparez une solution de matériau de sous-sol ECM dans un milieu complet sans phénol rouge, ce qui donne une concentration finale de 2% de matériau de sous-sol ECM dans le puits. Pour ce faire, ajoutez 1,2 μL de matériau de sous-sol ECM à 23,8 μL de milieu complet sans phénol sans rouge par puits, ce qui donne un volume final de 60 μL par puits.
- Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
- Le lendemain, remplacer le milieu par 100 μL de milieu complet sans phénol frais.
- Remplacez le milieu tous les deux jours par 100 μL de milieu complet sans phénol frais.
- Diluer les cellules dans un milieu complet sans rouge de phénol.
3. Coloration par immunofluorescence des sphéroïdes
NOTE: Ce protocole est adapté de Nürnberg et al., 202015. Ces adaptations sont principalement basées sur le fait que les sphéroïdes décrits dans ce protocole sont plus petits que ceux utilisés dans les travaux de Nürnberg et al.15 et, en tant que tels, facilitent des temps d’incubation plus courts. Par exemple, les temps de blocage sont réduits de 2 h à 1 h. De plus, comme le protocole est conçu pour la production à haut débit de sphéroïdes, toutes les étapes de traitement sont effectuées dans le puits dans lequel les sphéroïdes sont cultivés, ce qui signifie que le transfert de sphéroïdes individuels dans des tubes n’est pas nécessaire.
- Préparer toutes les solutions et tampons nécessaires à la fixation et à la coloration
- Préparez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en ajoutant 1 comprimé de PBS par 200 mL d’eau. Autoclavez le PBS.
- Préparer le paraformaldéhyde (PFA) en suivant les étapes 3.1.3-3.1.4.
- Utilisez un agitateur chauffé pour chauffer 400 mL de PBS à 60-70 °C dans une hotte. Ajouter 15 g de PFA en remuant. Une fois le PFA dissous, ajouter 50 μL de 1 M CaCl2 et 50 μL de 1 M MgCl2.
- Ajouter 100 mL de PBS pour obtenir un volume final de 500 mL. Utilisez naOH pour équilibrer le PFA à un pH de 7,4. Filtrer le PFA à travers des filtres à vide stériles (taille des pores 0,22 μm), aliquote et conserver à -20 °C.
- Préparer une solution mère de glycine de 1 M en ajoutant 3,75 g de glycine à 50 mL de PBS. Conserver à 4 °C.
- Préparer 5 mL de tampon de perméabilisation en ajoutant 100 μL de Triton X-100, 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 1,5 mL de glycine 1 M à 2,4 mL de PBS. Conserver à 4 °C pendant 2 semaines au maximum.
- Préparer 5 mL de tampon bloquant en ajoutant 100 μL de Triton X-100, 0,5 mL de DMSO et 0,05 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 4,9 mL de PBS. Aliquoter le tampon bloquant dans des tubes de 1,5 mL et le stocker à -20 °C.
- Préparer 5 mL de tampon d’incubation d’anticorps en ajoutant 10 μL de polysorbate 20, 0,05 g de BSA et 250 μL de DMSO à 4,74 mL de PBS. Aliquoter le tampon d’incubation des anticorps dans des tubes de 1,5 mL et le stocker à -20 °C.
REMARQUE: Dans le protocole décrit ici, les sphéroïdes ne sont assemblés que dans les 60 puits intérieurs d’une plaque de 96 puits, bien qu’ils puissent être préparés dans les 96 puits de la plaque. La raison pour laquelle on ne prépare que des sphéroïdes dans les 60 puits intérieurs est que certains objectifs à haute ouverture numérique ne sont pas capables d’imager physiquement l’ensemble du puits des puits extérieurs en raison de la « jupe » sur certains types de plaques. Les volumes ci-dessus sont suffisants pour la préparation de 60 puits contenant des sphéroïdes.
- Fixer et perméabiliser les sphéroïdes
- Retirez soigneusement le milieu des sphéroïdes, en veillant à ce que la couche de matériau du sous-sol ECM ne soit pas perturbée.
- Lavez les sphéroïdes deux fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
- Fixer les sphéroïdes avec 70 μL de PFA à 3 % pendant 1 h à 37 °C.
- Lavez les sphéroïdes deux fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
- Tremper avec 70 μL de solution de glycine 0,5 M pendant 30 min à 37 °C.
- Perméabiliser les sphéroïdes à l’aide de 70 μL du tampon de perméabilisation pendant 30 min à TA.
- Lavez les sphéroïdes deux fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
- Incuber les sphéroïdes dans 70 μL de tampon bloquant pendant 1 h à 37 °C.
REMARQUE: Une fois les sphéroïdes fixés, toutes les étapes de traitement ultérieures peuvent être effectuées à l’aide d’une pipette à 8 canaux ou d’une tête de pipetage à 96 puits, si disponible. Cela augmente la vitesse de préparation des sphéroïdes avant l’imagerie.
- Sphéroïdes immunotachés utilisant des anticorps primaires et secondaires
- Diluer l’anticorps primaire à une dilution appropriée dans le tampon d’incubation de l’anticorps et ajouter 70 μL à chaque puits. Incuber les sphéroïdes avec l’anticorps primaire pendant la nuit.
REMARQUE: La dilution dépend de l’anticorps spécifique utilisé. Dans l’exemple présenté ici, les lysosomes sont immunocolorés avec des anticorps anti-LAMP1 de souris en utilisant une dilution de 1:500. - Le lendemain, lavez les sphéroïdes 5 fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
- Diluer l’anticorps secondaire à une dilution de 1:500, la phalloïdine conjuguée par fluorescence à 1:500, et Hoechst 33342 (à partir d’un stock de 1 mg mL-1 ) à 1:5000 dans le tampon d’incubation des anticorps et ajouter 70 μL à chaque puits. Incuber pendant la nuit.
REMARQUE: La dilution de l’anticorps dépend de l’anticorps spécifique utilisé. Des anticorps secondaires hautement adsorbés par croisement qui présentent une photostabilité élevée et une luminosité élevée sont recommandés. - Le lendemain, lavez les sphéroïdes 5 fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
REMARQUE: Les plaques peuvent être stockées jusqu’à deux semaines à RT avant l’imagerie, tant que les sphéroïdes restent recouverts de PBS.
- Diluer l’anticorps primaire à une dilution appropriée dans le tampon d’incubation de l’anticorps et ajouter 70 μL à chaque puits. Incuber les sphéroïdes avec l’anticorps primaire pendant la nuit.
4. Acquisition d’images et analyse de sphéroïdes
- Acquisition d’images
- Insérez la plaque de 96 puits contenant des sphéroïdes dans un microscope confocal à haute teneur.
- Sélectionnez les lasers appropriés pour exciter les fluorophores utilisés.
- Acquérez les canaux séquentiellement pour éviter les diaphonies.
- Imagez les sphéroïdes en utilisant des objectifs appropriés.
REMARQUE : L’utilisation d’objectifs d’immersion dans l’eau est recommandée si disponible. Par exemple, un objectif NA 20x/1.0 peut imager un puits entier dans environ 77 champs de vision. Un objectif 63x/1.15 NA peut imager un puits entier dans environ 826 champs de vision. - Image ~ 30-40 tranches, en fonction de la profondeur du sphéroïde, avec chaque tranche prise à un intervalle de 1,5 μm de la précédente.
- Analyse d’images
- Pour l’analyse morphologique des sphéroïdes, suivez les étapes 4.2.2-4.2.6.
- Segmentez les sphéroïdes en fonction de la coloration à la phalloïdine conjuguée par fluorescence.
- Segmentez les noyaux en fonction de la coloration Hoechst 33342.
- Segmenter le cytoplasme de chaque cellule par la coloration résiduelle de Hoechst 33342 présente dans le cytoplasme cellulaire.
- Calculez différentes propriétés morphologiques des sphéroïdes, y compris le volume, la surface, la sphéricité et le nombre de noyaux par sphéroïde.
REMARQUE: Ces informations sont extraites à l’aide de divers algorithmes intégrés au logiciel d’analyse d’images de votre choix. - Traitez davantage les images pour éliminer les sphéroïdes de moins de 75 000 μm3 et de plus de 900 000 μm3.
REMARQUE: Ces valeurs sont des suggestions pour permettre l’élimination des assemblages de très petites cellules et des grands assemblages qui peuvent avoir surgi à la suite de la fusion de plusieurs sphéroïdes. Les sphéroïdes peuvent également être classés en différentes classes de taille à cette étape. - Pour analyser des cellules individuelles dans les sphéroïdes, suivez les étapes 4.2.8-4.2.12.
- Segmentez les sphéroïdes en fonction de la coloration à la phalloïdine conjuguée par fluorescence.
- Segmentez les noyaux en fonction de la coloration Hoechst 33342.
- Segmenter le cytoplasme de chaque cellule par la coloration résiduelle de Hoechst 33342 présente dans le cytoplasme cellulaire.
- Segmenter les lysosomes en fonction de la coloration secondaire des anticorps.
- Calculez différentes propriétés morphologiques des cellules dans chaque sphéroïde, y compris le nombre de lysosomes par cellule, le volume cellulaire et la surface cellulaire.
REMARQUE: Ces informations sont extraites à l’aide de divers algorithmes intégrés au logiciel d’analyse d’images de votre choix.
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Representative Results
Dans ce protocole, une méthode robuste pour produire des assemblages de culture cellulaire 3D sous forme de sphéroïdes, en utilisant différents types de cellules pour représenter divers tissus tumoraux, est détaillée. Cette méthode permet de générer des centaines de sphéroïdes par puits, ce qui permet d’effectuer des essais cellulaires à haute teneur (Figure 1). Cette approche a déjà été utilisée pour étudier l’absorption de nanoparticules dans les sphéroïdes HT-2916 et la toxicité induite par les nanoparticules dans les sphéroïdes HepG217. La méthode repose sur la production d’une distribution mince et uniforme du matériau de l’échafaudage sur le fond du puits d’une plaque de qualité optique. Les cellules sont ensemencées dans chaque puits, et d’autres échafaudages, à faible concentration, sont ajoutés comme superposition sur les cellules. Il en résulte une base qui soutient même la croissance des sphéroïdes, ce qui signifie que plusieurs centaines de sphéroïdes peuvent être cultivés dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Un objectif de faible grossissement est utilisé pour générer une image d’ensemble de l’ensemble de la population (Figure 2). Les sous-régions du puits peuvent ensuite être sélectionnées et imagées à l’aide d’un objectif haute résolution, et dans chaque position, une pile confocale complète est acquise. Cela fournit les informations nécessaires pour l’analyse volumétrique ultérieure de chaque sphéroïde.
Les sphéroïdes individuels peuvent ensuite être analysés par HCA, fournissant ainsi des informations sur les propriétés morphologiques des sphéroïdes. En règle générale, la première étape consiste à identifier chaque sphéroïde comme un seul objet. Pour ce faire, un canal de fluorescence susceptible de donner une coloration ou une distribution cohérente dans tout le sphéroïde est sélectionné. Dans l’exemple présenté ici, le signal dans le canal phalloïdine conjugué par fluorescence est utilisé, car l’actine se trouve près de la membrane plasmique dans toutes les cellules des différents types de sphéroïdes (Figure 2 et Figure 3A). Grâce à la génération de piles confocales complètes, toutes les étapes HCA peuvent être effectuées de manière volumétrique plutôt que tranche par tranche. Ceci est important car il élimine tout biais associé à l’analyse d’un petit nombre de plans sélectionnés. Cette approche volumétrique est ensuite appliquée aux autres couches de l’image. Les noyaux ont été détectés et segmentés sur la base de la coloration Hoechst 33342, et ce même canal peut être utilisé pour détecter le cytoplasme cellulaire, car il y a hoechst 33342 résiduel présent à de faibles niveaux (Figure 3B). Si une analyse en aval de cellules individuelles dans le sphéroïde est nécessaire, les autres canaux (par exemple, les lysosomes immunocolorés avec des anticorps anti-LAMP1) peuvent également être traités de la même manière. L’approche volumétrique permet de visualiser toutes les structures marquées par fluorescence à partir de toutes les vues (Figure 3C).
Après avoir identifié le sphéroïde comme un objet distinct, diverses mesures morphologiques au niveau du sphéroïde peuvent être effectuées. Ces mesures comprennent le calcul du nombre de noyaux par sphéroïde (figure 4A), ainsi que de la sphéricité (figure 4B), du volume (figure 4C) et de la surface (figure 4D) du sphéroïde. Selon le logiciel HCA utilisé, d’autres caractéristiques morphologiques telles que la section transversale, le rayon interne du disque et le rayon de la sphère interne peuvent également être calculées. Dans les exemples présentés ici, les sphéroïdes inférieurs à 75 000 μm3 et supérieurs à 900 000 μm3 ont été écartés des mesures, mais ces paramètres peuvent être définis par l’utilisateur, en fonction des propriétés sphéroïdes souhaitées pour l’analyse. Les feuilles de calcul ont été générées par le logiciel d’analyse d’images et importées dans RStudio pour analyse. Des graphiques boxplot ont été produits pour afficher les propriétés morphologiques des différents types de sphéroïdes (Figure 4). Ces diagrammes de boîtes révèlent le niveau d’hétérogénéité des sphéroïdes dans la population, c’est pourquoi il est important de quantifier un grand nombre de sphéroïdes dans une expérience. C’est un avantage clé par rapport aux méthodes qui génèrent un seul sphéroïde par puits. Les trois types de sphéroïdes présentés ici présentent un niveau élevé de similitude en ce qui concerne leur volume et leur surface, bien qu’il soit à noter que la sphéricité des sphéroïdes HepG2 est légèrement inférieure à celle des autres types présentés ici (figure 4B).
L’imagerie des sphéroïdes avec un objectif à haute résolution, tel que l’objectif d’immersion dans l’eau 63x utilisé ici, permet d’atteindre la résolution subcellulaire des cellules individuelles dans le sphéroïde. Les différents organites peuvent être segmentés en fonction des anticorps utilisés. Dans l’exemple présenté ici, les lysosomes ont été identifiés sur la base d’une immunocoloration à l’aide d’anticorps anti-LAMP1, suivis d’une addition d’anticorps secondaires (figure 3C). La segmentation de chaque organite au sein de chaque cellule permet alors la quantification des mesures au niveau de la cellule. Le volume typique de chaque cellule dans les trois types de sphéroïdes (Figure 5A), ainsi que le nombre de lysosomes par cellule (Figure 5B), sont montrés. La nécessité d’un tel détail subcellulaire est déterminée par le test dans lequel les sphéroïdes seront utilisés.
L’optimisation de la densité initiale d’ensemencement cellulaire au début de la génération de sphéroïdes est une étape critique. L’ajout de trop de cellules permet toujours la formation de sphéroïdes; cependant, cela peut entraîner la fusion de sphéroïdes (Figure 6). Cela conduit à la génération d’assemblages de forme irrégulière, ce qui peut à son tour être très problématique pour l’identification en aval des sphéroïdes. Lorsque les sphéroïdes sont identifiés à tort comme des structures distinctes, il peut également y avoir des problèmes avec l’analyse des cellules individuelles. En tant que tel, une optimisation minutieuse de chaque lignée cellulaire utilisée pour la génération de sphéroïdes, y compris la densité d’ensemencement cellulaire et la durée de croissance, sont des paramètres critiques à établir.
Figure 1 : Schéma détaillant le protocole utilisé pour générer des sphéroïdes pour HCS et HCA. Les plaques de 96 puits sont recouvertes d’une couche de matériau de sous-sol ECM, suivie de l’ensemencement de cellules, qui initient ensuite la formation de sphéroïdes. Medium est remplacé le lendemain et tous les deux jours par la suite. En préparation de l’imagerie, les sphéroïdes sont fixés, perméabilisés et immunocolorés avec des anticorps spécifiques. Les sphéroïdes sont ensuite imagés à l’aide d’un microscope confocal HCS. Graphique créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples d’images de sphéroïdes H358, HepG2 et HT-29. Imagerie confocale HCS entièrement automatisée des sphéroïdes (A) H358, (B) HepG2 et (C) HT-29. Les panneaux montrent une vue d’ensemble d’un seul puits, ainsi que trois exemples de tranches confocales et la reconstruction volumétrique d’un sphéroïde de chaque lignée cellulaire. Les noyaux colorés avec Hoechst 33342 sont représentés en bleu, l’actine colorée avec de la phalloïdine conjuguée par fluorescence en rouge et les lysosomes immunocolorés pour LAMP1 en vert. Les images de la vue d’ensemble du puits ont été acquises avec un objectif d’immersion dans l’eau 20x (NA 1.0). Des images de sphéroïdes individuels ont été acquises avec un objectif d’immersion dans l’eau 63x (NA 1.15). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Exemple d’étapes clés de l’analyse d’images. (A) Chaque sphéroïde est d’abord identifié en mode volumétrique par la détection de la coloration à la phalloïdine conjuguée par fluorescence. (B) En utilisant cette information comme masque, le cytoplasme de chaque cellule est segmenté par la coloration résiduelle de Hoechst 33342 présente dans le cytoplasme cellulaire. Les noyaux sont segmentés par la coloration Hoechst 33342. Les lysosomes sont segmentés à l’aide de l’immunocoloration anticorps (anti-LAMP1). Les vues volumétriques sont affichées. (C) Vues à 3 plans du même sphéroïde. L’exemple montré est celui d’un sphéroïde à cellules H358. Les images ont été acquises avec un objectif d’immersion dans l’eau 63x (NA 1.15) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Exemples de mesures au niveau des sphéroïdes. Toutes les mesures ont été effectuées à l’aide d’un pipeline d’analyse d’images automatisé, et pour trois types de sphéroïdes, à savoir H358, HepG2 et HT-29, imagés avec un objectif 20x. On y voit (A) le nombre moyen de noyaux par sphéroïde, (B) la sphéricité des sphéroïdes, (C) le volume sphéroïde et (D) la surface des sphéroïdes. Tous les diagrammes en boîte affichent la valeur médiane et les quartiles pour chaque type de sphéroïde. Les données proviennent de 3 puits répliqués; le nombre total de sphéroïdes analysés était de 1259 (H358), 1522 (HepG2) et 1326 (HT-29). Les images ont été acquises avec un objectif d’immersion dans l’eau 20x (NA 1.0). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Exemples de mesures au niveau cellulaire à partir de sphéroïdes. Toutes les mesures ont été effectuées à l’aide d’un pipeline d’analyse d’images automatisé, et pour trois types de sphéroïdes, à savoir H358, HepG2 et HT-29, imagés avec un objectif 63x. On y voit (A) les volumes de cellules individuelles et (B) le nombre moyen de lysosomes par cellule. Le nombre total de cellules analysées était de 1410 (H358), 1625 (HepG2) et 1401 (HT-29), à partir de 20 sphéroïdes de chaque lignée cellulaire. Les images ont été acquises avec un objectif d’immersion dans l’eau 63x (NA 1.15) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Exemples d’images montrant les effets du surplaquage des cellules sur la formation de sphéroïdes. Des exemples d’images sont présentés pour les sphéroïdes H358, HepG2 et HT-29. Les flèches indiquent les endroits où les sphéroïdes ont probablement fusionné. Les images ont été acquises avec un objectif d’immersion dans l’eau 20x (NA 1.0). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’approche décrite ici détaille une plate-forme permettant de générer plusieurs centaines de sphéroïdes par puits d’une manière adaptée aux HCS et HCA. Par rapport à d’autres méthodes populaires, telles que l’utilisation de plaques ULA à fond plat et à fond rond, qui permettent la formation d’un seul sphéroïde par puits18,19, cette méthode offre la possibilité d’extraire des informations à haute résolution d’un grand nombre de sphéroïdes dans un format de criblage. Notamment, cette méthode a été démontrée dans 3 lignées cellulaires différentes, représentant différents types de tumeurs, soulignant sa large aptitude à étudier une gamme de processus cellulaires dans différents modèles. Bien que les sphéroïdes générés à l’aide de cette méthode montrent une certaine variabilité de taille et de forme, HCA peut facilement les classer par taille (ou tout autre paramètre d’intérêt). Notre laboratoire a utilisé avec succès cette approche pour étudier la toxicité induite par les nanoparticules en fonction de la taille des sphéroïdes. Il est important de noter que toutes les différentes classes de taille des sphéroïdes peuvent être étudiées dans le même puits, ce qui signifie que tous ont été exposés à des traitements identiques, ce qui donne des résultats très robustes d’une grande population de sphéroïdes17. La méthodologie décrite ici pourrait facilement être adaptée pour être utilisée avec d’autres types de cellules représentant différents tissus. En outre, ces sphéroïdes pourraient être utilisés pour évaluer différents processus biologiques14. Si les sphéroïdes sont générés avec des cellules exprimant de manière stable des protéines marquées par fluorescence, l’imagerie de cellules vivantes est également possible.
Une étape critique de ce protocole est la production de la couche de matériau de sous-sol ECM sur laquelle les cellules sont plaquées. Lorsque la couche est trop épaisse, elle peut former un ménisque20 qui favorise la croissance des monocouches au centre du puits et des sphéroïdes uniquement sur les bords extérieurs du puits. Par conséquent, il est essentiel que la concentration et le volume corrects du matériau de sous-sol ECM soient choisis pour permettre la formation uniforme de sphéroïdes dans tout le puits; cela dépend toujours de la lignée cellulaire. Il convient également de noter que l’excès de matériau de sous-sol ECM peut causer des problèmes pendant le processus d’immunocoloration, car il n’est pas facilement dissous. Cela peut à son tour entraîner des complications lors de l’acquisition d’images lors de l’utilisation d’un système de microscope confocal HCS. Une autre considération est que différentes lignées cellulaires peuvent nécessiter différentes formulations ECM. Par exemple, les sphéroïdes HepG2 nécessitent un matériau de sous-sol ECM avec une concentration réduite de facteurs de croissance, par rapport à celle utilisée par les sphéroïdes H358 et HT-29. La méthode de placage cellulaire est également importante, car elle détermine la façon dont les cellules sont distribuées dans le puits. Lorsque trop de cellules sont ensemencées ou lorsqu’elles sont mal distribuées, cela peut conduire à une fusion sphéroïde (Figure 6). Un autre défi de l’utilisation d’échafaudages ECM est qu’ils doivent être manipulés à basse température (inférieure à 10 ° C), ce qui est particulièrement problématique lors de l’utilisation de l’automatisation pour HCS. Cependant, ce problème a été récemment résolu par Eismann et ses collègues (2020), qui ont utilisé la technologie des microréseaux pour repérer des gouttelettes de 0,2 μL de matériau de sous-sol ECM et de cellules dans des lames chambrées. C’était un matériau suffisant pour faciliter la croissance de petits sphéroïdes21. Il reste à démontrer si une telle approche fonctionnerait également pour le placage de plus grands volumes de matériaux de sous-sol ECM dans des puits de plaques multi-puits.
Un problème associé à l’analyse de modèles cellulaires 3D à l’aide de la microscopie est la capacité d’extraire des informations des plans centraux de ces assemblages. À cet égard, la perméabilisation et l’accès aux anticorps pendant le processus d’immunocoloration peuvent être problématiques. Cependant, le protocole publié par Nürnberg et ses collègues15 permet une immunocoloration très cohérente de l’ensemble du sphéroïde. En utilisant de légères modifications à ce protocole, cette technique peut immunocolorer même de petites structures subcellulaires (par exemple, les lysosomes), avec un degré élevé de cohérence, que les cellules soient centrales ou périphériques par rapport à la structure sphéroïde globale. Il est important que cette étape soit soigneusement optimisée lors de l’utilisation de nouveaux anticorps.
Une autre étape critique est le régime d’imagerie choisi. Il est important d’imager le nombre approprié de tranches z à travers le sphéroïde, car cela détermine le volume de données qui doivent être analysées et stockées. Par exemple, l’imagerie d’un nombre limité de plans z à un intervalle trop grand peut entraîner une sous-estimation de la taille et du volume globaux des sphéroïdes. D’autre part, la capture d’un trop grand nombre de plans z peut entraîner des problèmes d’analyse et de stockage des données. Les très grands ensembles de données nécessitent également une puissance de calcul plus intensive pour leur analyse, en particulier en mode volumétrique. L’intervalle d’échantillonnage optimal dans le plan z est largement dicté par les caractéristiques de la lentille de l’objectif, mais pour les exemples présentés ici, environ 40 tranches confocales sont nécessaires à un intervalle de 1,5 μm pour faciliter l’imagerie à travers toute la profondeur du sphéroïde.
Comme mentionné, afin de réduire le biais de l’analyse des plans sélectionnés, l’utilisation d’une approche d’analyse d’image volumétrique est fortement recommandée. Cela permet non seulement d’extraire des informations au niveau du sphéroïde, mais également des données au niveau de la cellule de chaque sphéroïde individuel. En fin de compte, les pipelines HCA doivent être conçus de manière à répondre à la question biologique spécifique posée. Les sorties multiparamétriques permettent de décrire quantitativement des phénotypes complexes. Il a été démontré que cela fonctionne pour les assemblages de cellules 3D utilisant le logiciel HCA commercial16,17, ainsi que des logiciels librement accessibles tels que CellProfiler22,23. Les méthodes d’analyse volumétrique ont le potentiel d’être appliquées à d’autres types de modèles cellulaires 3D, tels que les organoïdes et les explants ex vivo dérivés de patients (PDE), qui reproduisent encore mieux les conditions in vivo. Récemment, un pipeline à haut débit pour la production d’organoïdes cérébraux a été décrit24. Il s’agit de générer des organoïdes dans une plaque de 96 puits et de les imager ensuite à l’aide d’un microscope de criblage à haute teneur24. Les PDE sont très avantageux en ce sens qu’ils présentent l’histologie originale de la tumeur, fournissant ainsi un modèle cellulaire qui récapitule les conditions in vivo, y compris des caractéristiques telles que le microenvironnement tumoral25. Ces modèles peuvent également, en principe, être immunocolorés, imagés et analysés à l’aide de l’approche décrite ici26,27.
En résumé, ce protocole décrit une méthode accessible et robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications HCS et HCA. Son applicabilité est montrée avec trois lignées cellulaires différentes, produisant des sphéroïdes qui peuvent être imagés à haute résolution. Ce protocole démontre également que l’analyse volumétrique peut fournir des informations quantitatives sur la population sphéroïde, ainsi qu’aux niveaux unicellulaire et subcellulaire, ce qui la rend utile pour une grande variété de tests.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents associés à cette œuvre.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien d’une subvention de recherche sur les infrastructures de la Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) à JCS. Les travaux du laboratoire de dépistage cellulaire de l’UCD sont soutenus par le Collège des sciences de l’UCD. ASC est financé par une bourse d’études supérieures du gouvernement irlandais de la recherche (IRC) (GOIPG / 2019/68). Les auteurs remercient également tous les membres du laboratoire pour leur contribution et leurs discussions utiles. L’illustration de la figure 1 a été générée dans BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
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