Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.

Abstract

סינון תוכן גבוה (HCS) וניתוח תוכן גבוה (HCA) הן טכנולוגיות המספקות לחוקרים את היכולת לחלץ מדידות פנוטיפיות כמותיות בקנה מידה גדול מתאים. גישה זו הוכיחה את עצמה כבעלת עוצמה להעמקת הבנתנו במגוון רחב של אירועים בסיסיים ויישומיים בביולוגיה של התא. עד כה, רוב היישומים עבור טכנולוגיה זו הסתמכו על השימוש בתאים הגדלים monolayers, אם כי הוא הבין יותר ויותר כי מודלים כאלה אינם מסכמים רבים של אינטראקציות ותהליכים המתרחשים ברקמות. ככזה, חלה הופעתה בהתפתחות ושימוש במכלולי תאים תלת מימדיים (3D), כגון כדוריות ואורגנוידים. למרות שמודלים תלת-ממדיים אלה חזקים במיוחד בהקשר של ביולוגיה של סרטן ומחקרי אספקת תרופות, הייצור והניתוח שלהם באופן ניתן לשחזור המתאים ל- HCS ו- HCA מציבים מספר אתגרים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה ליצירת כדוריות גידול רב-תאיות (MCTS), ומדגים כי ניתן להחיל אותה על שלושה קווי תאים שונים באופן התואם את HCS ו- HCA. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות כדוריות לבאר, ומספקת את היתרון הספציפי שכאשר משתמשים בו במשטר סינון, ניתן להשיג נתונים מכמה מאות מבנים לבאר, כולם מטופלים באופן זהה. דוגמאות מסופקות גם, המפרטות כיצד לעבד את הספרואידים להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה וכיצד HCA יכול לחלץ תכונות כמותיות הן ברמת הספרואיד והן מתאים בודדים בתוך כל ספרואיד. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מיושם כדי לענות על מגוון רחב של שאלות חשובות בביולוגיה של התא.

Introduction

באופן מסורתי, בדיקות מבוססות תאים בוצעו ב-monolayers הגדלים על מצע מוצק, אשר למעשה יכול להיחשב כסביבה דו-ממדית (דו-ממדית). עם זאת, זה הופך להיות מוכר יותר ויותר כי מודלים תרבית תאים 2D חסר רלוונטיות פיזיולוגית בהקשרים מסוימים ולא יכול לשכפל רבים של אינטראקציות מורכבות המתרחשות בין תאים1. שיטות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) של תרבית תאים הופכות במהירות לפופולריות בקרב החוקרים, ומודלים של תאים תלת-ממדיים מראים פוטנציאל גבוה לחקות טוב יותר את התנאים הפיזיולוגיים בהם נתקלים התאים בסביבת הרקמה2. ישנם מספר סוגים שונים של מכלולי תאים תלת-ממדיים שהועסקו, אך שני הסוגים הנפוצים ביותר הם כדוריות ואורגנוידים. ניתן לגדל כדורים מקווי תאים רבים ושונים, והם יכולים לאמץ צורות וגדלים שונים בהתאם לסוג התא המשמש ולשיטת ההרכבה שלהם3. יתר על כן, spheroids יכול גם להיקרא spheroids גידול רב תאי (MCTS) כאשר הם גדלים מקווי תאים סרטניים, ומודלים אלה מצאו שימוש מיוחד עבור משלוח תרופות הפריה-קלינית במבחנה ומחקרי רעילות4,5. Organoids, לעומת זאת, שואפים לחקות טוב יותר את הרקמות והאיברים בגוף שלנו והוא יכול לאמץ סידורים מורפולוגיים מורכבים יותר. הייצור של organoids כרוך בשימוש בתאי גזע בוגרים או תאי גזע pluripotent, אשר ניתן לתכנת מחדש לתוך התאים המתאימים כדי להידמות לרקמה או איבר העניין. הם משמשים בעיקר כדי לחקור את התפתחות האיברים וכדי מודל מחלות ואינטראקציות מארח-פתוגן6.

יש מגוון של שיטות שונות המשמשות ליצירת הרכבות תאים תלת-ממדיות. שיטות מבוססות פיגומים מספקות מצע או תמיכה שבהם תאים יכולים להיצמד או לגדול בתוכם. פיגומים אלה יכולים להיות צורות שונות והוא יכול להיעשות ממגוון רחב של חומרים שונים. הנפוצים ביותר הם רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) והידרו-ג'לים, והם נועדו להידמות לסביבה החוץ-תאית הטבעית של התאים ובכך להקל על אינטראקציות פיזיולוגיות4,7. חומר מרתף ECM הופק מגידול סרקומה עכבר אנגלברט-הולם-נחיל והוכח שהוא מכיל תערובת עשירה של רכיבי ECM, כולל למינין, קולגן מסוג IV ופרלקן8. עם זאת, למרות הרכב היתרון שלה, ישנם שני אתגרים עיקריים עם השימוש בו, כלומר שונות אצווה לאצווה שלה וכי יש לו שני מצבים מצרפיים שונים מתחת ומעל 10 °C8,9. לעומת זאת, הידרוג'לים יש את היתרון של להיות גמיש ביחס לרכיבים שלהם קשיחות, והם יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים את הרכבה ספציפית 3D התא הרצוי 7,10. שיטות מבוססות פיגומים חיוניות לצמיחת אורגנויד אך משמשות גם באופן נרחב עבור כדוריות. שיטות נטולות פיגומים, הפועלות על ידי מניעת הצמדת תאים לפני השטח שעליהם הם גדלים, תואמות בדרך כלל רק להרכבה כדורית. דוגמאות כוללות לוחות קובץ מצורף אולטרה-נמוך (ULA), עם תחתית שטוחה או U-bottom, המאפשרים צבירה של התאים לתוך spheroids, או שימוש בתסיסה מתמשכת של התאים בבקבוקי ספינר / סיבוב10.

השימוש במכלולי תאים תלת-ממדיים כדי לחקור מגוון רחב של אירועים ביולוגיים צובר במהירות פופולריות; עם זאת, זה חיוני כי השיטה שנבחרה עבור התרבות שלהם מתאימה ותואמת עם התוכניות לניתוח במורד הזרם שלהם. לדוגמה, השימוש בלוחות ULA יוצר כדוריות של עקביות גבוהה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת לייצור של ספרואיד יחיד לבאר, ובכך להגביל את התפוקה. שיקול מסוים נדרש כאשר הדמיית פלואורסצנטיות של המבנה 3D מתוכנן. המצע או הצלחת שעליהם גדל ההרכבה צריכים להיות תואמים אופטית, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את ההשפעות של פיזור אור שנגרם על ידי פיגומים שאולי נעשה בהם שימוש11. בעיה מסוימת זו הופכת חריפה יותר ככל שהצמצם המספרי של עדשות המטרה של המיקרוסקופ עולה.

ניתן לטעון שאחת הסיבות העיקריות לבחירה לעבוד עם מודל תא תלת-ממדי היא לחלץ נתוני הדמיה נפחית לא רק על ההרכבה כולה אלא גם על התאים הבודדים שבתוכה. מודלים של MCTS, בפרט, מתחילים להיות חזקים מאוד להעמקת ההבנה שלנו כיצד טיפוליות עוברות מבחוץ לתאים מרכזיים (כפי שהם יצטרכו בגידול)12, ולכן רכישת ידע מתאים בודדים בשכבות שונות היא חיונית. טכנולוגיית ההדמיה המחלצת מידע כמותי מתאים בודדים נקראת ניתוח תוכן גבוה (HCA) והיא גישה רבת עוצמה בהקשר של סינון13. עד כה, HCA יושם כמעט אך ורק על תרבויות monolayer, אבל יש הבנה הולכת וגוברת כי גישה זו יש את הכוח להיות מיושם על תרבויות 3D המאפשר מגוון רחב של פונקציות ותהליכים הסלולר להיחקר14. זה יהיה היתרון הברור כי מספר גדול של הרכבות 3D ניתן לנתח, פוטנציאל מתן נתונים ברמת התא מכל מבנה. עם זאת, יש להתגבר על אתגרים הקשורים להדמיה של הרכבות תאים עבות פוטנציאליות, כמו גם את ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו.

במאמר זה מוצגת שיטה חזקה המבוססת על פיגומים לייצור בקנה מידה גדול של MCTS בפורמט של 96 בארות. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות מכלולי תאים תלת-ממדיים בכל באר. דוגמאות מוצגות עבור שלושה סוגי תאים שונים, המייצגים מודלים של גידול מוצק של הכבד, הריאות והמעי הגס. הספרואידים הנוצרים יכולים להיות במגוון גדלים, ולכן HCA משמש לבחירת מבנים בגודל ו/או מורפולוגיה מסוימים. תכונה זו מספקת את היתרון הנוסף כי כל פנוטיפים שנצפו ניתן להשוות על פני כדוריות בגדלים שונים, אבל כל מטופלים באותו אופן באותה באר. גישה זו תואמת הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך מספקת נתונים כמותיים ברמת התא והן ברמת התא התת-תאית מאותן מכלולים תאיים. שיטה זו של ייצור כדורי יש יתרון נוסף על פני שיטות המייצרות ספרואיד יחיד לכל באר, כי המספרים הגדולים של spheroids המיוצר בכל באר פוטנציאל לספק ביומסה מספקת עבור ניתוחים אחרים במורד הזרם, כגון תמלול ופרופיל פרוטאום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות התא

  1. הכנת מדיה
    1. הכן מדיית תרבית תאים ספציפית בהתאם לסוג קו התא. ודא שכל המדיה לתחזוקת התא מכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS).
      הערה: שורות תאים שונות משתמשות במדיה שונה. תאי קרצינומה במעי הגס HT-29 (ATCC HTB-38) גדלים ב- McCoys 5A + 10% FBS. תאי קרצינומה hepG2 hepatocellular (ATCC HB-8065) גדלים במדיום חיוני מינימלי + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. תאי קרצינומה סימפונולוגית H358 סימפונות (ATCC CRL-5807) גדלים ב-RPMI 1640 בינוני + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. כל המדיה המכילה L-גלוטמין ו- FBS נקראים מדיה מלאה. כאשר ציפוי תאים לגדול כמו spheroids, מדיום פנול אדום חינם עם 10% FBS נדרש כדי למנוע צביעה של חומר המרתף ECM, אשר בתורו יכול לגרום חפצים במהלך תהליך ההדמיה.
  2. תאי תת-תרבות
    1. כאשר תאים הם כ 80% יחד, לשטוף בקצרה עם 2 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25% (w / v) טריפסין / 0.53 mM EDTA). לשאוף את טריפסין-EDTA, להוסיף 3 מ"ל של טרי-EDTA ודגור במשך 3-5 דקות ב 37 °C (37 °F).
    2. כאשר תאים מנותקים מצלחת תרבית התא, מוסיפים 7 מ"ל של מדיום מלא טרי.
    3. פיפטה 1 מ"ל של השעיית תאים לתוך צלחת חדשה של תרבית תאים 10 ס"מ ולהוסיף 9 מ"ל של מדיום שלם טרי לתת דילול של 1:10 של תאים.
    4. תרבית את התאים ב 37 °C (5° C) באינקובטור לח עם 5% CO2.
    5. תת תרבות התאים כל 3-5 ימים, בהתאם לקו התא.

2. דור של כדוריות

  1. מעיל 96-היטב צלחות עם חומר מרתף ECM
    1. להפשיר חומר מרתף ECM על קרח לילה.
    2. לדלל את חומר המרתף ECM במדיום נטול סרום נטול פנול קר ללא רדום באמצעות טיפים מצוננים מראש שנשמרו בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).
      הערה: הריכוז הסופי של חומר מרתף ECM תלוי בקו התא המשמש. עבור תאי HT-29 ו- H358, השתמש ב- 4 mg·mL-1 של חומר מרתף ECM. עבור תאי HepG2, השתמש 4 mg·mL-1 של חומר מרתף ECM גורם גדילה מופחת.
    3. פיפטה 15 μL של חומר מרתף ECM / פתרון בינוני לתוך צלחת הדמיה 96-well.
      הערה: עבור ייצור כדורי בקנה מידה גדול, שלב זה יכול להתבצע עם פיפטה 8 ערוצים וראש צינור 96 ערוצים, כל עוד הטיפים והמאגר המכילים את חומר המרתף ECM מקוררים.
    4. צנטריפוגה הצלחת במשך 20 דקות ב 91 x g ב 4 °C (4 °F).
    5. לדגור על הצלחת במשך לא יותר מ 30 דקות ב 37 °C (50 °F).
  2. תת-תרבות ותאי ספירה
    1. במהלך תקופת הדגירה של הצלחת, דגירה התאים עם טריפסין-EDTA ו resuspend אותם במדיום שלם המכיל 10% FBS.
    2. פיפטה 10 μL של השעיית התא לתוך תא ספירת המוציטומטר. לספור את מספר התאים ב 4 רבעים של התא.
    3. חשב את מספר התאים בתוך ההשעיה התאית על-ידי קביעת המספר הממוצע של תאים בתוך 4 הרביעים.
      הערה: ניתן לספור תאים גם באמצעות התקני ספירת תאים אוטומטיים.
    4. צנטריפוגה התאים ב 135 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. ברגע שהתאים הם גלולה, לשאוף את supernatant resuspend התאים במדיום מלא ללא פנול אדום כדי לקבל ריכוז של 1 x 106 תאים לכל mL.
  3. תאי זרעים לתוך לוחות מצופים חומר מרתף ECM
    1. לדלל את התאים במדיום מלא ללא פנול אדום.
      הערה: צפיפות התאים שנזרעו תלויה בקו התאים שבו נעשה שימוש. עבור תאי HT-29 ו- HepG2, 3 x 104 תאים נזרעים לבאר; עבור תאי H358, 4 x 104 תאים נזרעים לבאר.
    2. זרע את התאים בנפח כולל של 35 μL לבאר. הקפד להוסיף אותם טיפה בתנועה מעגלית.
      הערה: עבור ייצור כדורי בקנה מידה גדול, שלב זה יכול להתבצע עם פיפטה 8 ערוצים, כל עוד ניתן להשיג את התנועה המעגלית pipetting.
    3. לדגור על התאים במשך 1 שעות ב 37 °C (37 °F) באינקובטור לח עם 5% CO2.
    4. הכן פתרון של חומר מרתף ECM במדיום מלא ללא פנול אדום, אשר התוצאה בריכוז סופי של 2% חומר מרתף ECM בבאר. כדי להשיג זאת, להוסיף 1.2 μL של חומר מרתף ECM ל 23.8 μL של פנול אדום חינם בינוני מלא לכל באר, וכתוצאה מכך נפח סופי של 60 μL לבאר.
    5. לדגור על התאים ב 37 °C (5 ° C ) באינקובטור לח עם 5% CO2.
    6. למחרת, להחליף את המדיום עם 100 μL של פנול טרי אדום חינם מדיום מלא.
    7. החלף את המדיום בכל יום שני עם 100 μL של פנול טרי אדום חינם בינוני מלא.

3. כתמי אימונופלואורסצנטיות של כדוריות

הערה: פרוטוקול זה מותאם מ נירנברג ואח ', 202015. התאמות אלה מבוססות בעיקר על העובדה כי spheroids המתוארים בפרוטוקול זה הם קטנים יותר מאלה המשמשים Nürnberg et al. work15 , וככזה, להקל על זמני דגירה קצרים יותר. לדוגמה, זמני חסימה מופחתים מ 2 שעות ל 1 שעות. בנוסף, כמו הפרוטוקול מיועד לייצור תפוקה גבוהה של spheroids, כל שלבי העיבוד מתבצעים בבאר שבה spheroids הם תרבותיים, כלומר, העברת spheroids בודדים לתוך צינורות אינו נדרש.

  1. הכן את כל הפתרונות והמאגרים הדרושים לתיקון והכתמה
    1. הכן תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) על ידי הוספת טבלית PBS אחת לכל 200 מ"ל של מים. תסגור אוטומטית את ה-פי.בי.אס.
    2. הכן paraformaldehyde (PFA) בעקבות שלבים 3.1.3-3.1.4.
    3. השתמש מערבל מחומם כדי לחמם 400 מ"ל של PBS עד 60-70 °C (60 °F) במכסה המנוע אדים. מוסיפים 15 גרם של PFA תוך כדי ערבוב. לאחר PFA התמוסס, להוסיף 50 μL של 1 M CaCl2 ו 50 μL של 1 M MgCl2.
    4. הוסף 100 מ"ל של PBS כדי ליצור נפח סופי של 500 מ"ל. השתמש ב- NaOH כדי להשוות את רמת ה-PFA ל-pH 7.4. סנן את ה-PFA באמצעות מסנני ואקום סטריליים (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר), aliquot, ואחסן בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).
    5. הכן פתרון מלאי גליצין 1 M על ידי הוספת 3.75 גרם של גליצין ל 50 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F).
    6. הכן 5 מ"ל של מאגר פרמביליזציה על ידי הוספת 100 μL של טריטון X-100, 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו 1.5 מ"ל של 1 M גליצין ל 2.4 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך לא יותר משבועיים.
    7. הכן 5 מ"ל של חוצץ חסימה על ידי הוספת 100 μL של טריטון X-100, 0.5 מ"ל של DMSO ו 0.05 גרם של אלבומין סרום בקר (BSA) ל 4.9 מ"ל של PBS. Aliquot חוצץ חסימה לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (60 °F).
    8. הכן 5 מ"ל של מאגר דגירה נוגדנים על ידי הוספת 10 μL של פוליסורבט 20, 0.05 גרם של BSA, ו 250 μL של DMSO ל 4.74 מ"ל של PBS. Aliquot את חיץ הדגירה נוגדנים לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן אותו ב -20 °C (60 °F).
      הערה: בפרוטוקול המתואר כאן, כדוריות מורכבות רק ב -60 הבארות הפנימיות של צלחת של 96 בארות, אם כי ניתן להכין אותן בכל 96 הבארות של הצלחת. הסיבה להכנת כדוריות רק ב -60 הבארות הפנימיות היא שכמה עדשות אובייקטיביות צמצם מספריות גבוהות אינן מסוגלות פיזית לדמיין את כל הבאר של הבארות החיצוניות בשל 'החצאית' בסוגי לוחות מסוימים. הכרכים לעיל מספיקים להכנת 60 בארות המכילות כדוריות.
  2. לתקן ולחדירות את הספרואידים
    1. הסר בזהירות את המדיום מהספרואידים, והבטיח כי שכבת החומר במרתף ECM לא תופרע.
    2. לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    3. לתקן את spheroids עם 70 μL של 3% PFA עבור 1 h ב 37 °C (50 °F).
    4. לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    5. להרוות עם 70 μL של 0.5 M תמיסת גליצין במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F).
    6. Permeabilize spheroids באמצעות 70 μL של מאגר permeabilization במשך 30 דקות ב RT.
    7. לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    8. לדגור על spheroids ב 70 μL של חיץ חסימה במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F).
      הערה: לאחר שהספרואידים תוקנו, ניתן לבצע את כל שלבי העיבוד הבאים באמצעות פיפטה של 8 ערוצים, או ראש צנרת של 96 בארות, אם הם זמינים. זה מגביר את המהירות של הכנת spheroid לפני הדמיה.
  3. כדוריות חיסוניות המשתמשות בנוגדנים ראשוניים ומשניים
    1. לדלל את הנוגדן העיקרי לדילול מתאים במאגר הדגירה של הנוגדנים ולהוסיף 70 μL לכל באר. לדגור את הספרואידים עם הנוגדנים העיקריים בן לילה.
      הערה: הדילול תלוי בנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש. בדוגמה המוצגת כאן, ליזוזומים מחוסנים בנוגדני עכבר נגד LAMP1 באמצעות דילול של 1:500.
    2. למחרת, לשטוף את spheroids 5 פעמים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    3. לדלל את הנוגדן המשני בדילול של 1:500, פלואורסצנטית מצומדת phalloidin ב 1:500, ו Hoechst 33342 (ממלאי 1 מ"ג מ"ג-1 ) ב 1:5000 במאגר הדגירה נוגדנים ולהוסיף 70 μL לכל באר. דגירה בין לילה.
      הערה: דילול הנוגדנים תלוי בנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש. מומלץ להשתמש בנוגדנים משניים בעלי סיפוח צולב גבוה, המראים יכולת צילום גבוהה ובהירות גבוהה.
    4. למחרת, לשטוף את spheroids 5 פעמים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
      הערה: ניתן לאחסן לוחות עד שבועיים ב- RT לפני ההדמיה, כל עוד הספרואידים נשארים מכוסים ב- PBS.

4. רכישה וניתוח תמונה של כדוריות

  1. רכישת תמונה
    1. הכנס את הלוח בן 96 הבארות המכיל כדוריות למיקרוסקופ הקרנה בעל תוכן גבוה קונפוקלי.
    2. בחר את הלייזרים המתאימים כדי לרגש את הפלואורופורים המשמשים.
    3. לרכוש את הערוצים ברצף כדי למנוע דיבורים צולבים.
    4. דמיין את הספרואידים באמצעות מטרות מתאימות.
      הערה: מומלץ להשתמש ביעדי טבילה במים אם הם זמינים. לדוגמה, מטרה של 20x/1.0 NA יכולה לדמות באר שלמה ב- ~ 77 שדות תצוגה. מטרה 63x/1.15 NA יכולה לדמות באר שלמה בכ-826 שדות ראייה.
    5. תמונה ~ 30-40 פרוסות, בהתאם לעומק של spheroid, עם כל פרוסה נלקח במרווח של 1.5 מיקרומטר מן הקודם.
  2. ניתוח תמונה
    1. לניתוח מורפולוגי של כדוריות, בצע את השלבים 4.2.2-4.2.6.
    2. פלח את הספרואידים על סמך כתמי הפאלאואידין המצומדים בפלואורסצנטיות.
    3. לפזר את הגרעינים על סמך הכתם Hoechst 33342.
    4. פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי שאריות Hoechst 33342 כתם שנמצא ציטופלסמה התא.
    5. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של הספרואידים, כולל נפח, שטח פנים, כדוריות, ומספר הגרעינים לכל ספרואיד.
      הערה: מידע זה מופק באמצעות אלגוריתמים שונים המובנים בתוכנת ניתוח התמונה לפי בחירה.
    6. עבד תמונות עוד יותר כדי להסיר כדוריות קטנות מ 75,000 מיקרומטר3 גדול יותר מ 900,000 מיקרומטר3.
      הערה: ערכים אלה הם הצעות לאפשר הסרה של הרכבות תאים קטנות מאוד הרכבות גדולות שאולי התעוררו כתוצאה של היתוך של כדוריות מרובות. כדוריות ניתן גם לסווג לשיעורי גודל שונים בשלב זה.
    7. כדי לנתח תאים בודדים בתוך כדוריות, בצע את השלבים 4.2.8-4.2.12.
    8. פלח את הספרואידים על סמך כתמי הפאלאואידין המצומדים בפלואורסצנטיות.
    9. לפזר את הגרעינים על סמך הכתם Hoechst 33342.
    10. פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי שאריות Hoechst 33342 כתם שנמצא ציטופלסמה התא.
    11. פלח את הליזוזומים על סמך כתמי הנוגדנים המשניים.
    12. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של התאים בתוך כל ספרואיד, כולל מספר הליזוזומים לכל תא, נפח התא ואזור הפנים של התא.
      הערה: מידע זה מופק באמצעות אלגוריתמים שונים המובנים בתוכנת ניתוח התמונה לפי בחירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפרוטוקול זה, מפורטת שיטה חזקה לייצור הרכבות תרבית תאים תלת-ממדית בצורה של כדוריות, תוך שימוש בסוגי תאים שונים כדי לייצג רקמות גידול שונות. שיטה זו מאפשרת יצירת מאות כדוריות לבאר, המאפשרת ביצוע בדיקות מבוססות תאים באופן בעל תוכן גבוה (איור 1). גישה זו שימשה בעבר כדי ללמוד ספיגת חלקיקים ב HT-29 spheroids16 ורעילות הנגרמת על ידי חלקיקים ב HepG2 spheroids17. השיטה מסתמכת על ייצור חלוקה דקה ואחידה של חומר פיגומים על פני תחתית הבאר של צלחת איכות אופטית. תאים נזרעים לתוך כל באר, וחומר פיגומים נוסף, בריכוז נמוך, מתווסף ככיסוי על התאים. התוצאה היא בסיס התומך אפילו צמיחה של כדוריות, כלומר כמה מאות כדוריות ניתן לתרבות בכל באר של צלחת 96-well. מטרת הגדלה נמוכה משמשת ליצירת תמונת סקירה כללית של כלל האוכלוסייה (איור 2). לאחר מכן ניתן לבחור אזורים משניים של הבאר ולדמיין אותם באמצעות מטרה ברזולוציה גבוהה, ובכל מיקום נרכשת מחסנית קונפוקלית מלאה. זה מספק את המידע הדרוש לניתוח נפחי עוקב של כל ספרואיד.

לאחר מכן ניתן לנתח את הספרואידים הבודדים על ידי HCA, ובכך לספק מידע על התכונות המורפולוגיות של הספרואידים. בדרך כלל הצעד הראשון הוא לזהות כל ספרואיד כאובייקט יחיד. לשם כך, נבחר ערוץ פלואורסצנטיות שעשוי לתת כתמים או הפצה עקביים ברחבי הספרואיד. בדוגמה המוצגת כאן, נעשה שימוש באות בערוץ הפלואורסצנטין המצומד בפלואורסצנטיות, שכן אקטין נמצא קרוב לקרום הפלזמה בכל התאים בסוגי הספרואידים השונים (איור 2 ואיור 3A). כתוצאה מערימות קונפוקליות שלמות שנוצרות, ניתן לבצע את כל שלבי HCA באופן נפחי ולא על בסיס פרוסה לפי פרוסה. הדבר חשוב מכיוון שהוא מסיר כל הטיה הקשורה לניתוח של מספר קטן של מישורים נבחרים. גישה נפחית זו מוחלת לאחר מכן על הערוצים האחרים בתמונה. הגרעינים זוהו ומפולחים על סמך הכתמים של Hoechst 33342, וניתן להשתמש באותו ערוץ כדי לזהות את הציטופלסמה התאית, שכן קיים שרידים של Hoechst 33342 ברמות נמוכות (איור 3B). אם יש צורך בניתוח במורד הזרם של תאים בודדים בתוך הספרואיד, ניתן לעבד גם את הערוצים האחרים (לדוגמה, ליזוזומים עם נוגדנים נגד LAMP1) באופן דומה. הגישה הנפחית מאפשרת לדמיין את כל המבנים המסומנים בתווית פלואורסצנטית מכל התצוגות (איור 3C).

לאחר שזיהה את הספרואיד כאובייקט מובחן, ניתן לבצע מדידות מורפולוגיות שונות ברמת הספרואיד. מדידות אלה כוללות חישוב של מספר הגרעינים לכל ספרואיד (איור 4A), כמו גם את הכדוריות (איור 4B), את הנפח (איור 4C) ואת שטח הפנים (איור 4D) של הספרואיד. בהתאם לתוכנת HCA המשמשת, ניתן גם לחשב תכונות מורפולוגיות אחרות כגון אזור חתך, רדיוס דיסק פנימי ורדיוס כדור פנימי. בדוגמאות המוצגות כאן, כדוריות מתחת 75,000 מיקרומטר3 ומעל 900,000 מיקרומטר3 נמחקו מהמדידות, אך פרמטרים אלה יכולים להיות מוגדרים על ידי המשתמש, בהתאם למאפיינים הספרואידיים הרצויים לניתוח. גליונות אלקטרוניים נוצרו על ידי תוכנת ניתוח התמונה ויובאו ל- RStudio לניתוח. גרפים של בוקספלו יוצרו כדי להציג את המאפיינים המורפולוגיים של סוגי הספרואידים השונים (איור 4). ארגזים אלה חושפים את רמת ההטרוגניות הספרואידית באוכלוסייה, ולכן חשוב לכמת מספר רב של כדוריות בכל ניסוי אחד. זהו יתרון מרכזי על פני שיטות המייצרות ספרואיד יחיד לבאר. שלושת סוגי הספרואידים המוצגים כאן מראים רמה גבוהה של דמיון ביחס לנפחם ולשטח הפנים שלהם, אם כי ראוי לציין כי הכדוריות של כדוריות HepG2 נמוכה במקצת מזו של הסוגים האחרים המוצגים כאן (איור 4B).

הדמיית כדוריות עם מטרה ברזולוציה גבוהה, כגון מטרת טבילת המים 63x המשמשת כאן, מאפשרת רזולוציה תת-תאית של תאים בודדים בתוך הכדור. ניתן לפלח את האברונים השונים בהתאם לנוגדנים המשמשים. בדוגמה המוצגת כאן, זוהו ליזוזומים המבוססים על חיסון באמצעות נוגדנים נגד LAMP1, ואחריהם תוספת נוגדנים משנית (איור 3C). הפילוח של כל אברון בתוך כל תא מאפשר כימות של מדידות ברמת התא. הנפח הטיפוסי של כל תא בשלושת סוגי הספרואידים (איור 5A), כמו גם מספר הליזוזומים לתא (איור 5B), מוצגים. הצורך בפרט תת-תאי כזה נקבע על ידי הבדיקה שבה ייעשה שימוש בספירואידים.

אופטימיזציה של צפיפות זריעת התא הראשונית בתחילת דור הספרואידים היא צעד קריטי. הוספת תאים רבים מדי עדיין מאפשרת היווצרות כדורית; עם זאת, הדבר עלול לגרום למיזוג של כדוריות (איור 6). זה מוביל לדור של מכלולים בצורה לא סדירה, אשר בתורו יכול להיות בעייתי מאוד עבור זיהוי במורד הזרם של spheroids. כאשר כדוריות מזוהות באופן שגוי כמבנים נפרדים, יכולות להיות גם בעיות בניתוח התאים הבודדים. ככזה, אופטימיזציה זהירה של כל קו תא המשמש לייצור כדורי, כולל צפיפות זריעת התא ומשך זמן הצמיחה, הם פרמטרים קריטיים כדי להקים.

Figure 1
איור 1: פירוט סכמטי של הפרוטוקול המשמש להפקת כדוריות עבור HCS ו- HCA. לוחות של 96 בארות מצופים בשכבה של חומר מרתף ECM, ולאחר מכן זריעת תאים, אשר לאחר מכן ליזום היווצרות ספרואידים. המדיום מוחלף למחרת ובכל יום שני לאחר מכן. כהכנה להדמיה, כדוריות קבועות, חלחלו, ומחוסנות בנוגדנים ספציפיים. לאחר מכן, כדוריות מצולמות באמצעות מיקרוסקופ HCS קונפוקלי. גרפיקה שנוצרה באמצעות BioRender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות לדוגמה של כדורי H358, HepG2 ו-HT-29. הדמיה קונפוקלית אוטומטית לחלוטין של (A) H358, (B) HepG2 ו- (C) HT-29 spheroids. לוחות מציגים סקירה כללית אחת של באר, כמו גם שלוש פרוסות קונפוקליות לדוגמה ושחזור נפחי של ספרואיד אחד מכל קו תא. גרעינים מוכתמים בהוכשסט 33342 מוצגים בכחול, אקטין מוכתם בפאלאואידין מצומד פלואורסצנטי באדום, וליזוזומים מחוסנים עבור LAMP1 בירוק. תמונות של סקירת הבאר נרכשו עם יעד טבילת מים 20x (NA 1.0). תמונות של כדוריות בודדות נרכשו עם יעד טבילת מים 63x (NA 1.15). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שלבים מרכזיים לדוגמה בניתוח תמונות. (A) כל ספרואיד מזוהה לראשונה במצב נפחי על ידי זיהוי של כתמי פאלואידין מצומדים פלואורסצנטיים. (ב) באמצעות מידע זה כמסכה, הציטופלסמה של כל תא מחולקת על ידי שאריות הכתם Hoechst 33342 הנמצא בציטופלסמה התא. הגרעינים מחולקים על ידי כתם Hoechst 33342. הליזוזומים מפולחים באמצעות החיסון נוגדן (אנטי LAMP1). תצוגות נפחיות מוצגות. (ג) תצוגות של 3 מישורים של אותו ספרואיד. הדוגמה המוצגת היא של ספרואיד תא H358. תמונות נרכשו עם יעד טבילת מים 63x (NA 1.15) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דוגמאות למדידות ברמת הספרואיד. כל המדידות נעשו באמצעות צינור ניתוח תמונה אוטומטי, ועבור שלושה סוגים של כדוריות, כלומר H358, HepG2 ו HT-29, בתמונה עם מטרה 20x. מוצגים (A) המספר הממוצע של גרעינים לכל ספרואיד, (B) כדוריות ספרואידיות, (C) נפח ספרואידי, ו -(D) שטח פנים כדורי. כל הקופסאות מציגות את הערך החציוני ואת המחצבות עבור כל סוג כדורי. הנתונים הם מ-3 בארות משוכפלות; המספר הכולל של כדוריות שניתחו היו 1259 (H358), 1522 (HepG2) ו 1326 (HT-29). התמונות נרכשו עם יעד טבילה במים פי 20 (NA 1.0). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דוגמאות למדידות ברמת התא מספרואידים. כל המדידות נעשו באמצעות צינור ניתוח תמונה אוטומטי, ועבור שלושה סוגים של כדוריות, כלומר H358, HepG2, ו HT-29, בתמונה עם מטרה 63x. מוצגים אמצעי אחסון (A) של תאים בודדים, ו- (B) מספרים ממוצעים של ליזוזומים לכל תא. המספר הכולל של התאים שנותחו היו 1410 (H358), 1625 (HepG2) ו-1401 (HT-29), מ-20 כדוריות של כל קו תא. תמונות נרכשו עם יעד טבילת מים 63x (NA 1.15) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונות לדוגמה המציגות השפעות של ציפוי יתר של תאים על היווצרות כדורית. תמונות לדוגמה מוצגות עבור H358, HepG2 ו- HT-29 spheroids. החצים מציינים מקומות שבהם סביר להניח שהספרואידים התמזגו. התמונות נרכשו עם יעד טבילה במים פי 20 (NA 1.0). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגישה המתוארת כאן מפרטת פלטפורמה ליצירת כמה מאות כדוריות לבאר באופן המתאים ל- HCS ו- HCA. בהשוואה לשיטות פופולריות אחרות, כגון שימוש בלוחות ULA שטוחים עם תחתית ועגולה, המאפשרים היווצרות של ספרואיד אחד בלבד לכל well18,19, שיטה זו מספקת את ההזדמנות להפקת מידע ברזולוציה גבוהה ממספר גדול של כדוריות בתבנית הקרנה. ראוי לציין כי שיטה זו הודגמה בשלושה קווי תאים שונים, המייצגים סוגי גידולים שונים, תוך הדגשת התאמתה הרחבה לחקר מגוון תהליכים תאיים במודלים שונים. למרות spheroids שנוצר באמצעות שיטה זו מראה כמה שונות בגודל ובצורה, HCA יכול בקלות לסווג אותם לפי גודל (או כל פרמטר אחר של עניין). המעבדה שלנו השתמשה בהצלחה בגישה זו כדי לחקור רעילות הנגרמת על ידי חלקיקים כפונקציה של גודל כדורי. חשוב לציין, ניתן ללמוד את כל סוגי הגודל השונים של כדוריות באותה באר, כלומר כולם נחשפו לטיפולים זהים, המעניקים תפוקות חזקות מאוד מאוכלוסיית ספרואידים גדולה17. המתודולוגיה המתוארת כאן יכולה בקלות להיות מותאמת לשימוש עם סוגי תאים אחרים המייצגים רקמות שונות. בנוסף, כדוריות כאלה יכול לשמש להערכת תהליכים ביולוגיים שונים14. אם הספרואידים נוצרים עם תאים המבטאים ביציבות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית, הדמיית תאים חיים אפשרית גם כן.

צעד קריטי אחד בפרוטוקול זה הוא הייצור של שכבת החומר במרתף ECM שעליה מצופים התאים. כאשר השכבה עבה מדי, היא יכולה ליצור מניסקוס20 המקדם את הצמיחה של monolayers במרכז הבאר וספרואידים רק על החישוקים החיצוניים של הבאר. לכן, זה חיוני כי הריכוז הנכון ואת הנפח של חומר המרתף ECM נבחר כדי לאפשר היווצרות כדורית אחידה בכל הבאר; זה תמיד תלוי קו תא. כמו כן, ראוי לציין כי עודף ECM חומר מרתף יכול לגרום לבעיות במהלך תהליך החיסון, כפי שהוא לא מומס בקלות. זה יכול בתורו, להוביל לסיבוכים במהלך רכישת תמונה בעת שימוש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלי HCS. שיקול נוסף הוא כי קווי תא שונים יכולים לדרוש ניסוחים ECM שונים. לדוגמה, כדורי HepG2 דורשים חומר מרתף ECM עם ריכוז מופחת של גורמי גדילה, לעומת זה המשמש את H358 ו HT-29 spheroids. שיטת ציפוי התא חשובה גם היא, שכן זה קובע כיצד התאים מופצים בבאר. כאשר נזרעים תאים רבים מדי או כאשר הם מופצים בצורה גרועה, הדבר עלול להוביל להיתוך כדורי (איור 6). אתגר נוסף של שימוש בפיגומים ECM הוא שהם צריכים להיות מטופלים בטמפרטורות נמוכות (מתחת ל -10 °C (מתחת ל -10 °C ), וזה בעייתי במיוחד בעת שימוש באוטומציה עבור HCS. עם זאת, בעיה זו נפתרה לאחרונה על ידי אייזמן ועמיתיו (2020), שהשתמשו בטכנולוגיית microarray כדי לזהות טיפות 0.2 μL של חומר מרתף ECM ותאים לתוך שקופיות חדרים. זה היה מספיק חומר כדי להקל על הצמיחה של spheroids קטן21. השאלה אם גישה כזו תעבוד גם לציפוי כמויות גדולות יותר של חומר מרתף ECM לתוך בארות של לוחות רב-בארות נותרה להדגים.

בעיה אחת הקשורה לניתוח מודלים של תאים תלת-ממדיים באמצעות מיקרוסקופיה היא היכולת לחלץ מידע מהמישורים המרכזיים של מכלולים אלה. בהקשר זה, חלחול וגישה לנוגדנים במהלך תהליך החיסון יכול להיות בעייתי. עם זאת, הפרוטוקול שפורסם על ידי נירנברג ועמיתיו15 מאפשר חיסון עקבי מאוד של כל הספרואיד. באמצעות שינויים קלים בפרוטוקול זה, טכניקה זו יכולה לחסן אפילו מבנים תת-תאיים קטנים (לדוגמה, ליזוזומים), עם רמה גבוהה של עקביות, ללא קשר אם התאים הם מרכזיים או היקפיים ביחס למבנה הספרואידי הכולל. חשוב כי שלב זה ממוטב בקפידה בעת שימוש בנוגדנים חדשים.

צעד קריטי נוסף הוא משטר ההדמיה שנבחר. הדמיית המספר המתאים של פרוסות z דרך הספרואיד חשובה, שכן זה קובע את נפח הנתונים שיש לנתח ולאחסן. לדוגמה, הדמיית מספר מוגבל של מטוסי z במרווח גדול מדי עלולה לגרום להערכת חסר של הגודל והנפח הכוללים של הספרואידים. מצד שני, לכידת יותר מדי מטוסי z עלולה לגרום לבעיות ניתוח ואחסון נתונים. ערכות נתונים גדולות מאוד דורשות גם כוח חישובי אינטנסיבי יותר לניתוח שלהן, במיוחד במצב נפחי. מרווח הדגימה האופטימלי במישור z מוכתב במידה רבה על ידי המאפיינים של העדשה האובייקטיבית, אך עבור הדוגמאות המוצגות כאן, נדרשות כ -40 פרוסות קונפוקליות במרווח של 1.5 מיקרומטר כדי להקל על הדמיה דרך כל עומק הספרואיד.

כאמור, על מנת להפחית את ההטיה מניתוח של מישורים נבחרים, מומלץ מאוד להשתמש בגישת ניתוח תמונה מבוססת נפח. זה מאפשר לא רק מידע ברמת הכדוריד להיות מופק, אלא גם נתונים ברמת התא מכל spheroid בודדים. בסופו של דבר, צינורות HCA צריכים להיות מתוכננים באופן כזה שהם מתייחסים לשאלה הביולוגית הספציפית הנשאלת. פלטים רב-פרמטריים מאפשרים לתאר באופן כמותי פנוטיפים מורכבים. זה הוכח לעבוד עבור מכלולים תא 3D באמצעות תוכנת HCA מסחרית 16,17, כמו גם תוכנה נגישה באופן חופשי כגון CellProfiler22,23. שיטות ניתוח נפחיות יש פוטנציאל להיות מיושם על סוגים אחרים של מודלים תא 3D, כגון organoids ו explants ex vivo המטופל נגזר (PDEs), אשר אפילו טוב יותר לשכפל בתנאי vivo. לאחרונה, צינור תפוקה גבוהה לייצור organoids המוח תואר24. זה כרוך ביצירת organoids בלוח 96-well ולאחר מכן הדמיה אותם באמצעות מיקרוסקופ הקרנה תוכן גבוה24. PDEs הם יתרון רב בכך שהם מציגים את ההיסטולוגיה המקורית מהגידול, ובכך מספקים מודל תא כי recapitulats בתנאי vivo, כולל תכונות כגון microenvironment הגידול25. מודלים אלה יכולים גם, באופן עקרוני, להיות מחוסנים, מדמיינים וניתוח באמצעות הגישה המתוארת כאן26,27.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה נגישה וחזקה לייצור בקנה מידה גדול של כדוריות עבור יישומי HCS ו- HCA. הישימות שלה מוצגת עם שלושה קווי תאים שונים, לייצר כדוריות שניתן לדמיין ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה גם מדגים כי ניתוח נפחי יכול לספק מידע כמותי על אוכלוסיית הספרואידים, כמו גם ברמות חד-תאיות ותת-תאיות, ובכך להפוך אותו שימושי עבור מגוון רחב של בדיקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים הקשורים לעבודה זו.

Acknowledgments

המחברים מכירים בתמיכתו של מענק מחקר תשתית מקרן המדע אירלנד (SFI) (16/RI/3745) ל- JCS. העבודה במעבדה להקרנת תאים של UCD נתמכת על ידי המכללה למדעים של UCD. ASC ממומן על ידי מועצת המחקר האירית (IRC) ממשלת אירלנד מלגת תואר שני (GOIPG/2019/68). המחברים מודים גם לכל חברי המעבדה על הקלט והדיונים המועילים שלהם. הגרפיקה באיור 1 נוצרה ב-BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red Gibco 25300054
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A6003
Calcium chloride Fisher Scientific 10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid Perkin Elmer 6055302 These plates have been renamed as Phenoplates
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated Gibco 10500064
Glycine Fisher Scientific BP381-1
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11029
L-Glutamine solution, 200 mM Gibco 25030024
Hoechst 33342 Sigma Aldrich 14533
Magnesium chloride Fisher Scientific 10647032
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL Corning 356237 This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel BD Biosciences 356231 This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning
McCoy's 5A medium Gibco 26600023
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red Hyclone 10358633
Minimum Essential Medium (MEM) Gibco 21090022
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red Gibco 51200046
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) Developmental Studies Hybridoma Bank H4A3-a
Neubauer counting chamber Hirschmann 8100203
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm ThermoFisher Scientific 150350
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software Perkin Elmer HCSHH14000000
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568 Invitrogen A12380
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets Sigma Aldrich P4417
Polysorbate 20 Sigma Aldrich P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco 61870010
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red Gibco 11835063
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284
Stericup sterile vacuum filter units Millipore SCGVU05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  2. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  3. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  4. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  5. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  6. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  7. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  8. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
  9. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  10. Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
  11. Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
  12. Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
  13. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  14. Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
  15. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
  16. Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
  17. Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
  18. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
  19. Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
  20. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  21. Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
  22. Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
  23. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
  24. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
  25. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  26. Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
  27. Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 178
שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chalkley, A. S., Mysior, M. M.,… More

Chalkley, A. S., Mysior, M. M., Simpson, J. C. A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications. J. Vis. Exp. (178), e63436, doi:10.3791/63436 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter