Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.
Abstract
High-Content-Screening (HCS) und High-Content-Analyse (HCA) sind Technologien, die Forschern die Möglichkeit geben, groß angelegte quantitative phänotypische Messungen aus Zellen zu extrahieren. Dieser Ansatz hat sich als wirksam erwiesen, um unser Verständnis einer breiten Palette von grundlegenden und angewandten Ereignissen in der Zellbiologie zu vertiefen. Bis heute stützte sich die Mehrheit der Anwendungen für diese Technologie auf die Verwendung von Zellen, die in Monoschichten gezüchtet wurden, obwohl zunehmend erkannt wird, dass solche Modelle viele der Wechselwirkungen und Prozesse, die in Geweben auftreten, nicht rekapitulieren. Daher hat sich bei der Entwicklung und Verwendung von 3-dimensionalen (3D) Zellanordnungen wie Sphäroiden und Organoiden eine Entstehung herausgebildet. Obwohl diese 3D-Modelle im Kontext von Krebsbiologie- und Drug-Delivery-Studien besonders leistungsfähig sind, stellen ihre Herstellung und Analyse in einer reproduzierbaren Weise, die für HCS und HCA geeignet ist, eine Reihe von Herausforderungen dar. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von multizellulären Tumorsphäroiden (MCTS) und zeigt, dass es auf drei verschiedene Zelllinien in einer Weise angewendet werden kann, die mit HCS und HCA kompatibel ist. Das Verfahren erleichtert die Herstellung von mehreren hundert Sphäroiden pro Bohrloch und bietet den spezifischen Vorteil, dass bei Verwendung in einem Screening-Regime Daten aus mehreren hundert Strukturen pro Bohrloch gewonnen werden können, die alle auf identische Weise behandelt werden. Es werden auch Beispiele bereitgestellt, die detailliert beschreiben, wie die Sphäroide für die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung verarbeitet werden und wie HCA quantitative Merkmale sowohl auf Sphäroidebene als auch aus einzelnen Zellen innerhalb jedes Sphäroides extrahieren kann. Dieses Protokoll könnte leicht angewendet werden, um eine Vielzahl wichtiger Fragen in der Zellbiologie zu beantworten.
Introduction
Traditionell wurden zellbasierte Assays in Monoschichten durchgeführt, die auf einem festen Substrat wachsen, das effektiv als zweidimensionale (2D) Umgebung betrachtet werden kann. Es wird jedoch zunehmend erkannt, dass 2D-Zellkulturmodelle in einigen Kontexten keine physiologische Relevanz haben und viele der komplexen Interaktionen, die zwischen Zellen auftreten, nicht replizieren können1. Dreidimensionale (3D) Zellkulturmethoden werden bei Forschern immer beliebter, und 3D-Zellmodelle zeigen ein hohes Potenzial, die physiologischen Bedingungen, mit denen Zellen in der Gewebeumgebung konfrontiert sind, besser nachzuahmen2. Es gibt verschiedene Arten von 3D-Zellbaugruppen, die verwendet wurden, aber die beiden häufigsten Typen sind Sphäroide und Organoide. Sphäroide können aus vielen verschiedenen Zelllinien gezüchtet werden, und sie können je nach verwendetem Zelltyp und ihrer Montagemethode verschiedene Formen und Größen annehmen3. Darüber hinaus können Sphäroide auch als multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) bezeichnet werden, wenn sie aus Krebszelllinien gezüchtet werden, und diese Modelle haben besondere Verwendung für präklinische In-vitro-Arzneimittelverabreichungs- und Toxizitätsstudien gefunden4,5. Organoide hingegen zielen darauf ab, die Gewebe und Organe in unserem Körper besser nachzuahmen und können komplexere morphologische Anordnungen annehmen. Die Produktion von Organoiden beinhaltet die Verwendung von adulten Stammzellen oder pluripotenten Stammzellen, die in die entsprechenden Zellen umprogrammiert werden können, um dem interessierenden Gewebe oder Organ zu ähneln. Sie werden vor allem eingesetzt, um die Entwicklung von Organen zu untersuchen und Krankheiten und Wirt-Pathogen-Interaktionen zu modellieren6.
Es gibt eine Reihe von verschiedenen Methoden, um 3D-Zellbaugruppen zu erzeugen. Gerüstbasierte Methoden bieten ein Substrat oder eine Unterstützung, an die sich Zellen entweder anheften oder darin wachsen können. Diese Gerüste können verschiedene Formen haben und aus einer Vielzahl von verschiedenen Materialien hergestellt werden. Am häufigsten sind extrazelluläre Matrixkomponenten (ECM) und Hydrogele, die so konzipiert sind, dass sie der natürlichen extrazellulären Umgebung von Zellen ähneln und dadurch physiologische Interaktionen erleichtern4,7. ECM-Kellermaterial wurde aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkom-Tumor extrahiert und enthält nachweislich eine reichhaltige Mischung von ECM-Komponenten, einschließlich Laminin, Typ-IV-Kollagen und Perlecan8. Trotz seiner vorteilhaften Zusammensetzung gibt es jedoch zwei Hauptherausforderungen bei seiner Verwendung, nämlich seine Variabilität von Charge zu Charge und dass es zwei verschiedene Aggregatzustände unter und über 10 ° C 8,9 aufweist. Im Gegensatz dazu haben Hydrogele den Vorteil, dass sie in Bezug auf ihre Komponenten und Steifigkeit flexibel sind und an die gewünschte 3D-Zellbaugruppe angepasst werden können7,10. Gerüstbasierte Methoden sind für das Organoidwachstum unerlässlich, werden aber auch häufig für Sphäroide verwendet. Gerüstfreie Methoden, die verhindern, dass sich Zellen an der Oberfläche festsetzen, auf der sie wachsen, sind in der Regel nur mit der Sphäroidmontage kompatibel. Beispiele hierfür sind Ultra-Low-Attachment-Platten (ULA) mit entweder flachem Boden oder U-Boden, die eine Aggregation der Zellen zu Sphäroiden ermöglichen, oder die Verwendung einer kontinuierlichen Bewegung der Zellen in Spinner-/Rotationskolben10.
Die Verwendung von 3D-Zellanordnungen zur Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Ereignissen gewinnt schnell an Popularität; Es ist jedoch von wesentlicher Bedeutung, dass die für ihre Kultur gewählte Methode angemessen und mit den Plänen für ihre nachgelagerte Analyse vereinbar ist. Zum Beispiel erzeugt die Verwendung von ULA-Platten Sphäroide von hoher Konsistenz; Diese Methode beschränkt sich jedoch auf die Herstellung eines einzelnen Sphäroids pro Well, wodurch der Durchsatz begrenzt wird. Besondere Beachtung ist geboten, wenn die Fluoreszenzbildgebung der 3D-Struktur geplant ist. Das Substrat oder die Platte, auf der die Baugruppe angebaut wird, muss optisch kompatibel sein, und es muss darauf geachtet werden, die Auswirkungen der Lichtstreuung, die durch möglicherweise verwendete Gerüste verursacht wird, zu minimieren11. Dieses spezielle Problem wird akuter, wenn die numerische Blende der Objektivlinsen des Mikroskops zunimmt.
Einer der Hauptgründe für die Auswahl der Arbeit mit einem 3D-Zellmodell ist wohl die Extraktion volumetrischer Bilddaten nicht nur über die gesamte Baugruppe, sondern auch über die einzelnen Zellen darin. Insbesondere MCTS-Modelle beginnen sich als sehr leistungsfähig zu erweisen, um unser Verständnis dafür zu vertiefen, wie Therapeutika von außen zu zentralen Zellen gelangen (wie sie es in einem Tumor benötigen würden)12, und daher ist es wichtig, Wissen von einzelnen Zellen auf verschiedenen Schichten zu gewinnen. Die bildgebende Technologie, die quantitative Informationen aus einzelnen Zellen extrahiert, wird als High-Content-Analyse (HCA) bezeichnet und ist ein leistungsfähiger Ansatz im Kontext des Screenings13. Bisher wurde HCA fast ausschließlich auf Monolayer-Kulturen angewendet, aber es gibt eine zunehmende Erkenntnis, dass dieser Ansatz die Kraft hat, auf 3D-Kulturen angewendet zu werden, so dass eine breite Palette von zellulären Funktionen und Prozessen untersucht werden kann14. Es hätte den klaren Vorteil, dass eine große Anzahl von 3D-Baugruppen analysiert werden könnte, die möglicherweise Daten auf Zellebene aus jeder Struktur liefern. Die Herausforderungen, die mit der Bildgebung von potenziell dickzelligen Baugruppen verbunden sind, sowie die großen Datensätze, die generiert werden, müssen jedoch überwunden werden.
In diesem Artikel wird ein robustes gerüstbasiertes Verfahren zur Großserienfertigung von MCTS im 96-Well-Format vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht die Herstellung von mehreren hundert 3D-Zellbaugruppen in jedem Bohrloch. Es werden Beispiele für drei verschiedene Zelltypen gezeigt, die solide Tumormodelle von Leber, Lunge und Dickdarm darstellen. Die Sphäroide, die sich bilden, können von einer Vielzahl von Größen sein, und so wird HCA verwendet, um Strukturen einer bestimmten Größe und / oder Morphologie auszuwählen. Diese Eigenschaft bietet den zusätzlichen Vorteil, dass alle beobachteten Phänotypen über Sphäroide unterschiedlicher Größe hinweg verglichen werden können, aber alle auf die gleiche Weise im selben Brunnen behandelt werden. Dieser Ansatz ist mit hochauflösender Bildgebung kompatibel und liefert sowohl quantitative Daten auf Zellebene als auch auf subzellulärer Ebene von denselben zellulären Anordnungen. Diese Methode der Sphäroidproduktion hat gegenüber Methoden, die ein einzelnes Sphäroid pro Bohrloch erzeugen, den zusätzlichen Vorteil, dass die große Anzahl von Sphäroiden, die in jedem Bohrloch produziert werden, möglicherweise genügend Biomasse für andere nachgelagerte Analysen wie Transkriptom- und Proteomprofilierung liefert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zellkultur
- Medien vorbereiten
- Bereiten Sie je nach Art der Zelllinie spezifische Zellkulturmedien vor. Stellen Sie sicher, dass alle Medien für die Zellerhaltung 10% fötales Rinderserum (FBS) enthalten.
HINWEIS: Verschiedene Zelllinien verwenden unterschiedliche Medien. HT-29 Dickdarmkarzinomzellen (ATCC HTB-38) werden in McCoys 5A + 10% FBS gezüchtet. HepG2 hepatozelluläre Karzinomzellen (ATCC HB-8065) werden in Minimum Essential Medium + 1% L-Glutamin + 10% FBS gezüchtet. H358 bronchoalveoläre Karzinomzellen (ATCC CRL-5807) werden in RPMI 1640 medium + 1% L-Glutamin + 10% FBS gezüchtet. Alle Medien, die L-Glutamin und FBS enthalten, werden als vollständige Medien bezeichnet. Bei der Beschichtung von Zellen, um als Sphäroide zu wachsen, ist ein phenolrotfreies Medium mit 10% FBS erforderlich, um eine Färbung des ECM-Kellermaterials zu vermeiden, die wiederum Artefakte während des Bildgebungsprozesses verursachen kann.
- Bereiten Sie je nach Art der Zelllinie spezifische Zellkulturmedien vor. Stellen Sie sicher, dass alle Medien für die Zellerhaltung 10% fötales Rinderserum (FBS) enthalten.
- Subkulturzellen
- Wenn die Zellen zu etwa 80% konfluent sind, waschen Sie kurz mit 2 ml Trypsin-EDTA (0,25% (w / v) Trypsin / 0,53 mM EDTA). Trypsin-EDTA abpumpen, 3 ml frisches Trypsin-EDTA hinzufügen und 3-5 min bei 37 °C inkubieren.
- Wenn sich die Zellen von der Zellkulturschale lösen, fügen Sie 7 ml frisches Vollmedium hinzu.
- 1 ml Zellsuspension in eine neue 10 cm Zellkulturschale pipettieren und 9 ml frisches Vollmedium hinzufügen, um eine 1:10-Verdünnung der Zellen zu erhalten.
- Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2.
- Subkulturieren Sie die Zellen alle 3-5 Tage, abhängig von der Zelllinie.
2. Erzeugung von Sphäroiden
- Beschichtung von 96-Well-Platten mit ECM-Kellermaterial
- Auftauen von ECM-Kellermaterial über Nacht auf Eis.
- Verdünnen Sie ECM-Kellermaterial in kaltem phenolrotfreiem serumfreiem Medium mit vorgekühlten Spitzen, die bei -20 ° C gehalten werden.
HINWEIS: Die Endkonzentration des ECM-Kellermaterials hängt von der verwendeten Zelllinie ab. Für HT-29- und H358-Zellen verwenden Sie 4 mg·mL-1 ECM-Kellermaterial . Für HepG2-Zellen verwenden Sie 4 mg·mL-1 ECM-Kellermaterial mit reduziertem Wachstumsfaktor. - Pippen Sie 15 μL des ECM-Kellermaterials/der Mediumlösung in eine 96-Well-Bildplatte.
HINWEIS: Für die Sphäroidproduktion in großem Maßstab kann dieser Schritt sowohl mit einer 8-Kanal-Pipette als auch mit einem 96-Kanal-Pipettierkopf durchgeführt werden, solange die Spitzen und das Reservoir, die das ECM-Kellermaterial enthalten, gekühlt sind. - Zentrieren Sie die Platte für 20 min bei 91 x g bei 4 °C.
- Inkubieren Sie die Platte nicht länger als 30 min bei 37 °C.
- Subkultur- und Zählzellen
- Inkubieren Sie die Zellen während der Platteninkubationszeit mit Trypsin-EDTA und resuspendieren Sie sie in einem vollständigen Medium, das 10% FBS enthält.
- Pipette 10 μL der Zellsuspension in eine Hämozytometer-Zählkammer. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in 4 Quadranten der Kammer.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen innerhalb der Zellsuspension, indem Sie die mittlere Anzahl der Zellen innerhalb der 4 Quadranten bestimmen.
HINWEIS: Zellen können auch mit automatisierten Zellzählgeräten gezählt werden. - Zentrifen Sie die Zellen bei 135 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT).
- Sobald die Zellen pelletiert sind, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem phenolrotfreien vollständigen Medium, um eine Konzentration von 1 x 106 Zellen pro ml zu erhalten.
- Samenzellen in ECM-Keller-Material-beschichtete Platten
- Verdünnen Sie die Zellen in einem phenolrotfreien Vollmedium.
HINWEIS: Die Dichte der ausgesäten Zellen hängt von der verwendeten Zelllinie ab. Für HT-29- und HepG2-Zellen werden pro Bohrung 3 x 104 Zellen ausgesät; für H358-Zellen werden pro Well 4 x 104 Zellen ausgesät. - Säen Sie die Zellen in einem Gesamtvolumen von 35 μL pro Well. Stellen Sie sicher, dass Sie sie tropfenweise in einer kreisförmigen Bewegung hinzufügen.
HINWEIS: Für die großtechnische Sphäroidproduktion kann dieser Schritt mit einer 8-Kanal-Pipette durchgeführt werden, solange die Pipettierkreisbewegung erreicht werden kann. - Die Zellen für 1 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 inkubieren.
- Bereiten Sie eine Lösung von ECM-Kellermaterial in phenolrotfreiem Vollmedium vor, was zu einer Endkonzentration von 2% ECM-Kellermaterial im Bohrloch führt. Um dies zu erreichen, fügen Sie 1,2 μL ECM-Kellermaterial zu 23,8 μL phenolrotfreiem Vollmedium pro Vertiefung hinzu, was zu einem Endvolumen von 60 μL pro Vertiefung führt.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2.
- Ersetzen Sie das Medium am folgenden Tag durch 100 μL frisches phenolrotfreies Vollmedium.
- Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch 100 μL frisches phenolrotfreies Vollmedium.
- Verdünnen Sie die Zellen in einem phenolrotfreien Vollmedium.
3. Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Nürnberg et al., 202015, übernommen. Diese Anpassungen beruhen in erster Linie auf der Tatsache, dass die in diesem Protokoll beschriebenen Sphäroide kleiner sind als die in den Arbeiten Nürnberg et al.15 verwendeten und somit kürzere Inkubationszeiten ermöglichen. So werden beispielsweise die Sperrzeiten von 2 h auf 1 h reduziert. Da das Protokoll für die Hochdurchsatzproduktion von Sphäroiden ausgelegt ist, werden außerdem alle Verarbeitungsschritte in der Vertiefung durchgeführt, in der die Sphäroide kultiviert werden, so dass die Übertragung einzelner Sphäroide in Rohre nicht erforderlich ist.
- Bereiten Sie alle Lösungen und Puffer vor, die für die Fixierung und Färbung erforderlich sind
- Bereiten Sie Phosphat Buffered Saline (PBS) vor, indem Sie 1 PBS-Tablette pro 200 ml Wasser hinzufügen. Autoklavieren Sie das PBS.
- Paraformaldehyd (PFA) nach den Schritten 3.1.3-3.1.4 herstellen.
- Verwenden Sie einen beheizten Rührer, um 400 ml PBS in einem Abzug auf 60-70 °C zu erhitzen. Unter Rühren 15 g PFA hinzufügen. Sobald sich die PFA aufgelöst hat, fügen Sie 50 μL von 1 M CaCl2 und 50 μL von 1 M MgCl2 hinzu.
- Fügen Sie 100 ml PBS hinzu, um ein Endvolumen von 500 ml zu erhalten. Verwenden Sie NaOH, um die PFA auf pH 7,4 auszugleichen. Filtern Sie die PFA durch sterile Vakuumfilter (Porengröße 0,22 μm), aliquot und lagern Sie sie bei -20 °C.
- Bereiten Sie eine 1 M Glycin-Stammlösung vor, indem Sie 3,75 g Glycin zu 50 ml PBS hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 5 ml Permeabilisierungspuffer vor, indem Sie 100 μL Triton X-100, 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1,5 ml 1 M Glycin zu 2,4 ml PBS hinzufügen. Bei 4 °C nicht länger als 2 Wochen lagern.
- Bereiten Sie 5 ml Blockpuffer vor, indem Sie 100 μL Triton X-100, 0,5 ml DMSO und 0,05 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 4,9 ml PBS hinzufügen. Aliquot den Sperrpuffer in 1,5-ml-Röhrchen geben und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 5 ml Antikörper-Inkubationspuffer vor, indem Sie 10 μL Polysorbat 20, 0,05 g BSA und 250 μL DMSO zu 4,74 ml PBS hinzufügen. Aliquot den Antikörper-Inkubationspuffer in 1,5-ml-Röhrchen und lagern ihn bei -20 °C.
HINWEIS: In dem hier beschriebenen Protokoll werden Sphäroide nur in den inneren 60 Vertiefungen einer 96-Well-Platte montiert, obwohl sie in allen 96 Wells der Platte hergestellt werden können. Der Grund dafür, nur Sphäroide in den inneren 60 Vertiefungen vorzubereiten, ist, dass einige Objektivlinsen mit hoher numerischer Apertur aufgrund des "Rocks" auf einigen Plattentypen nicht in der Lage sind, den gesamten Brunnen der äußeren Vertiefungen physisch abzubilden. Die oben genannten Volumina sind ausreichend für die Herstellung von 60 Wells, die Sphäroide enthalten.
- Fixieren und Permeabilisieren der Sphäroide
- Entfernen Sie das Medium vorsichtig von den Sphäroiden und stellen Sie sicher, dass die ECM-Kellermaterialschicht nicht gestört wird.
- Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
- Fixieren Sie die Sphäroide mit 70 μL 3% PFA für 1 h bei 37 °C.
- Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
- Abschrecken mit 70 μL 0,5 M Glycinlösung für 30 min bei 37 °C.
- Permeabilisieren Sie die Sphäroide mit 70 μL des Permeabilisierungspuffers für 30 min bei RT.
- Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
- Inkubieren Sie die Sphäroide in 70 μL Sperrpuffer für 1 h bei 37 °C.
HINWEIS: Sobald die Sphäroide fixiert sind, können alle nachfolgenden Verarbeitungsschritte mit einer 8-Kanal-Pipette oder einem 96-Well-Pipettierkopf, falls verfügbar, durchgeführt werden. Dies erhöht die Geschwindigkeit der Sphäroidpräparation vor der Bildgebung.
- Immunflecken-Sphäroide mit primären und sekundären Antikörpern
- Verdünnen Sie den primären Antikörper zu einer geeigneten Verdünnung im Antikörper-Inkubationspuffer und fügen Sie 70 μL zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Sphäroide mit dem primären Antikörper über Nacht.
HINWEIS: Die Verdünnung hängt vom spezifischen verwendeten Antikörper ab. In dem hier gezeigten Beispiel werden Lysosomen mit Maus-Anti-LAMP1-Antikörpern unter Verwendung einer Verdünnung von 1:500 immungefärbt. - Waschen Sie die Sphäroide am nächsten Tag 5 Mal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
- Verdünnen Sie den sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1:500, fluoreszenzkonjugiertes Phalloidin bei 1:500 und Hoechst 33342 (aus einem 1 mg ml-1-Vorrat) bei 1 :5000 im Antikörper-Inkubationspuffer und fügen Sie 70 μL zu jeder Vertiefung hinzu. Über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Die Antikörperverdünnung hängt vom spezifischen verwendeten Antikörper ab. Empfohlen werden stark kreuzadsorbierte sekundäre Antikörper, die eine hohe Photostabilität und hohe Helligkeit aufweisen. - Waschen Sie die Sphäroide am nächsten Tag 5 Mal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
HINWEIS: Platten können vor der Bildgebung bis zu zwei Wochen bei RT gelagert werden, solange die Sphäroide mit PBS bedeckt bleiben.
- Verdünnen Sie den primären Antikörper zu einer geeigneten Verdünnung im Antikörper-Inkubationspuffer und fügen Sie 70 μL zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Sphäroide mit dem primären Antikörper über Nacht.
4. Bildaufnahme und Analyse von Sphäroiden
- Bildaufnahme
- Setzen Sie die 96-Well-Platte, die Sphäroide enthält, in ein konfokales High-Content-Screening-Mikroskop ein.
- Wählen Sie die geeigneten Laser aus, um die verwendeten Fluorophore anzuregen.
- Erfassen Sie die Kanäle nacheinander, um Übersprechen zu vermeiden.
- Stellen Sie die Sphäroide mit geeigneten Objektiven dar.
HINWEIS: Die Verwendung von Wassertauchobjektiven wird empfohlen, falls verfügbar. Zum Beispiel kann ein 20x / 1.0 NA-Objektiv einen ganzen Brunnen in ~ 77 Sichtfeldern abbilden. Ein 63x/1,15 NA Objektiv kann einen ganzen Brunnen in ca. 826 Sichtfeldern abbilden. - Bild ~30-40 Scheiben, abhängig von der Tiefe des Sphäroides, wobei jede Schicht in einem Intervall von 1,5 μm von der vorhergehenden aufgenommen wird.
- Bildanalyse
- Für die morphologische Analyse von Sphäroiden führen Sie die Schritte 4.2.2-4.2.6 aus.
- Segmentieren Sie die Sphäroide basierend auf der fluoreszierend konjugierten Phalloidin-Färbung.
- Segmentieren Sie die Kerne basierend auf der Hoechst 33342-Färbung.
- Segmentieren Sie das Zytoplasma jeder Zelle durch den verbleibenden Hoechst 33342-Fleck, der im Zellzytoplasma vorhanden ist.
- Berechnen Sie verschiedene morphologische Eigenschaften der Sphäroide, einschließlich Volumen, Oberfläche, Sphärizität und der Anzahl der Kerne pro Sphäroide.
HINWEIS: Diese Informationen werden mit verschiedenen Algorithmen extrahiert, die in der Bildanalysesoftware Ihrer Wahl integriert sind. - Verarbeiten Sie die Bilder weiter, um Sphäroide kleiner als 75.000 μm3 und größer als 900.000 μm3 zu entfernen.
HINWEIS: Diese Werte sind Vorschläge, um das Entfernen von sehr kleinen Zellbaugruppen und großen Baugruppen zu ermöglichen, die möglicherweise durch die Fusion mehrerer Sphäroide entstanden sind. Sphäroide können in diesem Schritt auch in verschiedene Größenklassen eingeteilt werden. - Um einzelne Zellen innerhalb von Sphäroiden zu analysieren, führen Sie die Schritte 4.2.8-4.2.12 aus.
- Segmentieren Sie die Sphäroide basierend auf der fluoreszierend konjugierten Phalloidin-Färbung.
- Segmentieren Sie die Kerne basierend auf der Hoechst 33342-Färbung.
- Segmentieren Sie das Zytoplasma jeder Zelle durch den verbleibenden Hoechst 33342-Fleck, der im Zellzytoplasma vorhanden ist.
- Segmentieren Sie die Lysosomen anhand der sekundären Antikörperfärbung.
- Berechnen Sie verschiedene morphologische Eigenschaften der Zellen in jedem Sphäroid, einschließlich der Anzahl der Lysosomen pro Zelle, des Zellvolumens und der Zelloberfläche.
HINWEIS: Diese Informationen werden mit verschiedenen Algorithmen extrahiert, die in der Bildanalysesoftware Ihrer Wahl integriert sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In diesem Protokoll wird eine robuste Methode zur Herstellung von 3D-Zellkulturanordnungen in Form von Sphäroiden beschrieben, bei denen verschiedene Zelltypen verwendet werden, um verschiedene Tumorgewebe darzustellen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von Hunderten von Sphäroiden pro Well, wodurch zellbasierte Assays in einer High-Content-Weise durchgeführt werden können (Abbildung 1). Dieser Ansatz wurde zuvor verwendet, um die Aufnahme von Nanopartikeln in HT-29-Sphäroiden16 und die durch Nanopartikel induzierte Toxizität in HepG2-Sphäroiden17 zu untersuchen. Das Verfahren beruht auf der Herstellung einer dünnen und gleichmäßigen Verteilung von Gerüstmaterial über den Brunnenboden einer optischen Qualitätsplatte. Zellen werden in jedes Bohrloch gesät, und weiteres Gerüstmaterial in geringer Konzentration wird als Overlay auf den Zellen hinzugefügt. Dies führt zu einer Basis, die ein gleichmäßiges Wachstum von Sphäroiden unterstützt, was bedeutet, dass mehrere hundert Sphäroide in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte kultiviert werden können. Ein Objektiv mit geringer Vergrößerung wird verwendet, um ein Übersichtsbild der gesamten Population zu erzeugen (Abbildung 2). Unterbereiche des Bohrlochs können dann mit einem hochauflösenden Objektiv ausgewählt und abgebildet werden, und in jeder Position wird ein vollständiger konfokaler Stapel erfasst. Dies liefert die notwendigen Informationen für die anschließende volumetrische Analyse jedes Sphäroids.
Die einzelnen Sphäroide können dann mittels HCA analysiert werden und liefern so Aufschluss über die morphologischen Eigenschaften der Sphäroide. Typischerweise besteht der erste Schritt darin, jedes Sphäroid als ein einzelnes Objekt zu identifizieren. Zu diesem Zweck wird ein Fluoreszenzkanal ausgewählt, der wahrscheinlich eine gleichmäßige Färbung oder Verteilung im gesamten Sphäroid ermöglicht. In dem hier gezeigten Beispiel wird das Signal im fluoreszenzkonjugierten Phalloidinkanal verwendet, da Aktin in der Nähe der Plasmamembran in allen Zellen der verschiedenen Sphäroidtypen gefunden wird (Abbildung 2 und Abbildung 3A). Durch die Generierung kompletter konfokaler Stacks können alle HCA-Schritte volumetrisch statt Slice-by-Slice-Basis durchgeführt werden. Dies ist wichtig, da es alle Verzerrungen beseitigt, die mit der Analyse einer kleinen Anzahl ausgewählter Ebenen verbunden sind. Dieser volumetrische Ansatz wird dann auf die anderen Kanäle im Bild angewendet. Die Kerne wurden basierend auf der Hoechst 33342-Färbung detektiert und segmentiert, und derselbe Kanal kann zum Nachweis des Zellzytoplasmas verwendet werden, da Hoechst 33342 in niedrigen Konzentrationen vorhanden ist (Abbildung 3B). Wenn eine nachgeschaltete Analyse einzelner Zellen innerhalb des Sphäroids erforderlich ist, können auch die anderen Kanäle (z. B. mit Anti-LAMP1-Antikörpern immunangefärbte Lysosomen) auf ähnliche Weise verarbeitet werden. Der volumetrische Ansatz ermöglicht es, alle fluoreszierend markierten Strukturen aus allen Ansichten zu visualisieren (Abbildung 3C).
Nachdem das Sphäroid als eigenständiges Objekt identifiziert wurde, können verschiedene morphologische Messungen auf Sphäroidebene durchgeführt werden. Diese Messungen umfassen die Berechnung der Anzahl der Kerne pro Sphäroid (Abbildung 4A) sowie der Sphärizität (Abbildung 4B), des Volumens (Abbildung 4C) und der Oberfläche (Abbildung 4D) des Sphäroids. Abhängig von der verwendeten HCA-Software können auch andere morphologische Merkmale wie Querschnittsfläche, innerer Scheibenradius und innerer Kugelradius berechnet werden. In den hier gezeigten Beispielen wurden Sphäroide unter 75.000 μm3 und oberhalb von 900.000 μm3 aus den Messungen verworfen, aber diese Parameter können vom Benutzer abhängig von den gewünschten Sphäroideigenschaften für die Analyse eingestellt werden. Tabellenkalkulationen wurden von der Bildanalysesoftware generiert und zur Analyse in RStudio importiert. Boxplot-Diagramme wurden erstellt, um die morphologischen Eigenschaften der verschiedenen Arten von Sphäroiden darzustellen (Abbildung 4). Diese Boxplots zeigen den Grad der Sphäroidheterogenität in der Population, weshalb es wichtig ist, eine große Anzahl von Sphäroiden in einem einzigen Experiment zu quantifizieren. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber Methoden, die ein einzelnes Sphäroid pro Bohrloch erzeugen. Die drei hier gezeigten Sphäroidtypen weisen eine hohe Ähnlichkeit in Bezug auf ihr Volumen und ihre Oberfläche auf, wobei bemerkenswert ist, dass die Kugelförmigkeit der HepG2-Sphäroide etwas geringer ist als die der anderen hier gezeigten Typen (Abbildung 4B).
Bildgebende Sphäroide mit einem hochauflösenden Objektiv, wie das hier verwendete 63-fache Wassertauchobjektiv, ermöglichen eine subzelluläre Auflösung einzelner Zellen innerhalb des Sphäroids. Die verschiedenen Organellen können in Abhängigkeit von den verwendeten Antikörpern segmentiert werden. In dem hier gezeigten Beispiel wurden Lysosomen anhand der Immunfärbung unter Verwendung von Anti-LAMP1-Antikörpern identifiziert, gefolgt von einer sekundären Antikörperaddition (Abbildung 3C). Die Segmentierung jeder Organelle innerhalb jeder Zelle ermöglicht dann die Quantifizierung von Messungen auf Zellebene. Das typische Volumen jeder Zelle in den drei Sphäroidtypen (Abbildung 5A) sowie die Anzahl der Lysosomen pro Zelle (Abbildung 5B) sind dargestellt. Der Bedarf an solchen subzellulären Details wird durch den Assay bestimmt, in dem die Sphäroide verwendet werden.
Die Optimierung der anfänglichen Zellaussaatdichte zu Beginn der Sphäroidbildung ist ein kritischer Schritt. Das Hinzufügen von zu vielen Zellen ermöglicht immer noch die Bildung von Sphäroiden; Dies kann jedoch zur Fusion von Sphäroiden führen (Abbildung 6). Dies führt zur Erzeugung von unregelmäßig geformten Baugruppen, was wiederum für die nachgeschaltete Identifizierung der Sphäroide höchst problematisch sein kann. Wenn Sphäroide fälschlicherweise als unterschiedliche Strukturen identifiziert werden, kann es auch zu Problemen bei der Analyse der einzelnen Zellen kommen. Daher ist die sorgfältige Optimierung jeder Zelllinie, die für die Sphäroiderzeugung verwendet wird, einschließlich der Zellaussaatdichte und der Länge der Wachstumszeit, kritische Parameter, die es zu etablieren gilt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls, das zur Generierung von Sphäroiden für HCS und HCA verwendet wird . 96-Well-Platten werden mit einer Schicht ECM-Kellermaterial beschichtet, gefolgt von der Aussaat von Zellen, die dann die Sphäroidbildung einleiten. Medium wird am folgenden Tag und jeden zweiten Tag danach ersetzt. In Vorbereitung auf die Bildgebung werden Sphäroide fixiert, permeabilisiert und mit spezifischen Antikörpern immunisiert. Sphäroide werden dann mit einem konfokalen HCS-Mikroskop abgebildet. Mit BioRender.com erstellte Grafik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispielbilder von H358-, HepG2- und HT-29-Sphäroiden Vollautomatische konfokale HCS-Bildgebung von (A) H358-, (B) HepG2- und (C) HT-29-Sphäroiden. Die Panels zeigen eine einzelne Bohrlochübersicht sowie drei konfokale Beispielschnitte und die volumetrische Rekonstruktion eines Sphäroids aus jeder Zelllinie. Mit Hoechst 33342 gefärbte Kerne sind blau, mit fluoreszierend konjugiertem Phalloidin rot mit Aktin und für LAMP1 immungefärbte Lysosomen grün dargestellt. Bilder der Brunnenübersicht wurden mit einem 20-fachen Wassertauchobjektiv (NA 1.0) aufgenommen. Bilder einzelner Sphäroide wurden mit einem 63-fachen Wassertauchobjektiv (NA 1.15) aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Beispiel für wichtige Schritte in der Bildanalyse. (A) Jedes Sphäroid wird zunächst im volumetrischen Modus durch Detektion der fluoreszierend konjugierten Phalloidinfärbung identifiziert. (B) Unter Verwendung dieser Informationen als Maske wird das Zytoplasma jeder Zelle durch den verbleibenden Hoechst 33342-Fleck segmentiert, der im Zellzytoplasma vorhanden ist. Die Kerne sind durch den Hoechst 33342-Fleck segmentiert. Die Lysosomen werden mit Hilfe des Antikörpers (Anti-LAMP1) immunfärbend segmentiert. Volumetrische Ansichten werden angezeigt. (C) 3-Ebenen-Ansichten desselben Sphäroids. Das gezeigte Beispiel zeigt ein H358-Zellsphäroid. Die Bilder wurden mit einem 63-fachen Wassertauchobjektiv aufgenommen (NA 1.15) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispiele für Sphäroid-Füllstandsmessungen. Alle Messungen wurden mit einer automatisierten Bildanalyse-Pipeline durchgeführt und für drei Arten von Sphäroiden, nämlich H358, HepG2 und HT-29, mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen. Dargestellt sind (A) die mittlere Anzahl der Kerne pro Sphäroide, (B) die Sphäroidsphärizität, (C) das Sphäroidvolumen und (D) die Sphäroidoberfläche. Alle Boxplots zeigen den Medianwert und die Quartile für jeden Sphäroidtyp. Die Daten stammen aus 3 Replikatbohrungen; Die Gesamtzahl der analysierten Sphäroide betrug 1259 (H358), 1522 (HepG2) und 1326 (HT-29). Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Wassertauchobjektiv (NA 1.0) aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beispiele für Messungen auf Zellebene mit Sphäroiden. Alle Messungen wurden mit einer automatisierten Bildanalyse-Pipeline durchgeführt und für drei Arten von Sphäroiden, nämlich H358, HepG2 und HT-29, mit einem 63-fachen Objektiv aufgenommen. Gezeigt werden (A) Volumina einzelner Zellen und (B) mittlere Anzahl von Lysosomen pro Zelle. Die Gesamtzahl der analysierten Zellen betrug 1410 (H358), 1625 (HepG2) und 1401 (HT-29) von 20 Sphäroiden jeder Zelllinie. Die Bilder wurden mit einem 63-fachen Wassertauchobjektiv aufgenommen (NA 1.15) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Beispielbilder, die die Auswirkungen der Überplattierung von Zellen auf die Sphäroidbildung zeigen. Beispielbilder werden für H358-, HepG2- und HT-29-Sphäroide gezeigt. Pfeile zeigen Stellen an, an denen Sphäroide wahrscheinlich verschmolzen sind. Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Wassertauchobjektiv (NA 1.0) aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der hier beschriebene Ansatz beschreibt eine Plattform zur Erzeugung von mehreren hundert Sphäroiden pro Bohrloch in einer Weise, die für HCS und HCA geeignet ist. Im Vergleich zu anderen populären Methoden, wie der Verwendung von ULA-Platten mit flachem und rundem Boden, die die Bildung von nur einem Sphäroid pro Bohrloch ermöglichen18,19, bietet diese Methode die Möglichkeit, hochauflösende Informationen aus einer großen Anzahl von Sphäroiden in einem Screening-Format zu extrahieren. Insbesondere wurde diese Methode in 3 verschiedenen Zelllinien demonstriert, die verschiedene Tumorarten darstellen, was ihre breite Eignung zur Untersuchung einer Reihe von zellulären Prozessen in verschiedenen Modellen unterstreicht. Obwohl die mit dieser Methode erzeugten Sphäroide eine gewisse Variabilität in Größe und Form aufweisen, kann HCA sie leicht nach Größe (oder anderen interessierenden Parametern) klassifizieren. Unser Labor hat diesen Ansatz erfolgreich eingesetzt, um die durch Nanopartikel induzierte Toxizität in Abhängigkeit von der Sphäroidgröße zu untersuchen. Wichtig ist, dass alle verschiedenen Größenklassen von Sphäroiden im selben Brunnen untersucht werden können, was bedeutet, dass alle identischen Behandlungen ausgesetzt waren, was zu äußerst robusten Ergebnissen einer großen Sphäroidpopulation führte17. Die hier beschriebene Methodik könnte leicht für die Verwendung mit anderen Zelltypen angepasst werden, die verschiedene Gewebe darstellen. Darüber hinaus könnten solche Sphäroide zur Beurteilung verschiedener biologischer Prozesse verwendet werden14. Wenn die Sphäroide mit Zellen erzeugt werden, die stabil fluoreszierend markierte Proteine exprimieren, ist auch eine Lebendzellbildgebung möglich.
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Herstellung der ECM-Kellermaterialschicht, auf der die Zellen beschichtet sind. Wenn die Schicht zu dick ist, kann sie einen Meniskus20 bilden, der das Wachstum von Monoschichten in der Mitte des Brunnens und Sphäroide nur an den äußeren Rändern des Brunnens fördert. Daher ist es wichtig, dass die richtige Konzentration und das richtige Volumen des ECM-Kellermaterials gewählt werden, um eine gleichmäßige Sphäroidbildung im gesamten Bohrloch zu ermöglichen; Dies ist immer zelllinienabhängig. Bemerkenswert ist auch, dass überschüssiges ECM-Kellermaterial während des Immunfärbungsprozesses Probleme verursachen kann, da es sich nicht leicht auflöst. Dies wiederum kann bei der Verwendung eines konfokalen HCS-Mikroskopsystems zu Komplikationen bei der Bildaufnahme führen. Eine weitere Überlegung ist, dass verschiedene Zelllinien unterschiedliche ECM-Formulierungen erfordern können. Zum Beispiel erfordern HepG2-Sphäroide ECM-Kellermaterial mit einer reduzierten Konzentration von Wachstumsfaktoren, verglichen mit dem, das von H358- und HT-29-Sphäroiden verwendet wird. Die Methode der Zellplattierung ist ebenfalls wichtig, da diese bestimmt, wie die Zellen im Brunnen verteilt sind. Wenn entweder zu viele Zellen ausgesät sind oder wenn sie schlecht verteilt sind, kann dies zu einer Sphäroidfusion führen (Abbildung 6). Eine weitere Herausforderung bei der Verwendung von ECM-Gerüsten besteht darin, dass sie bei niedrigen Temperaturen (unter 10 ° C) gehandhabt werden müssen, was besonders bei der Verwendung von Automatisierung für HCS problematisch ist. Dieses Problem wurde jedoch kürzlich von Eismann und Kollegen (2020) gelöst, die die Microarray-Technologie einsetzten, um 0,2 μL-Tröpfchen von ECM-Kellermaterial und Zellen in gekammerten Objektträgern zu erkennen. Dies war ausreichend Material, um das Wachstum kleiner Sphäroide zu erleichtern21. Ob ein solcher Ansatz auch für die Beschichtung größerer Mengen von ECM-Kellermaterial in Vertiefungen von Multi-Well-Platten funktionieren würde, muss noch demonstriert werden.
Ein Problem, das mit der Analyse von 3D-Zellmodellen mittels Mikroskopie verbunden ist, ist die Fähigkeit, Informationen aus den zentralen Ebenen dieser Baugruppen zu extrahieren. In dieser Hinsicht können Permeabilisierung und Antikörperzugang während des Immunfärbungsprozesses problematisch sein. Das von Nürnberg und Kollegen veröffentlichte Protokoll15 ermöglicht jedoch eine hochkonsistente Immunfärbung des gesamten Sphäroids. Durch leichte Modifikationen dieses Protokolls kann diese Technik selbst kleine subzelluläre Strukturen (z. B. Lysosomen) mit einem hohen Grad an Konsistenz immunfärben, unabhängig davon, ob die Zellen in Bezug auf die gesamte Sphäroidstruktur zentral oder peripher sind. Es ist wichtig, dass dieser Schritt beim Einsatz neuer Antikörper sorgfältig optimiert wird.
Ein weiterer kritischer Schritt ist das gewählte Bildgebungsregime. Es ist wichtig, die entsprechende Anzahl von Z-Slices durch das Sphäroid abzubilden, da dies das Datenvolumen bestimmt, das analysiert und gespeichert werden muss. Zum Beispiel kann die Abbildung einer begrenzten Anzahl von Z-Ebenen in einem zu großen Intervall zu einer Unterschätzung der Gesamtsphäroidgröße und des Gesamtvolumens führen. Auf der anderen Seite kann die Erfassung zu vieler Z-Ebenen zu Datenanalyse- und Speicherproblemen führen. Sehr große Datensätze benötigen für ihre Analyse auch eine intensivere Rechenleistung, insbesondere im volumetrischen Modus. Das optimale Abtastintervall in der z-Ebene wird weitgehend durch die Eigenschaften der Objektivlinse bestimmt, aber für die hier gezeigten Beispiele werden ca. 40 konfokale Scheiben in einem Intervall von 1,5 μm benötigt, um die Bildgebung über die gesamte Tiefe des Sphäroides zu ermöglichen.
Wie bereits erwähnt, wird die Verwendung eines volumetrisch-basierten Bildanalyseansatzes dringend empfohlen, um die Verzerrung durch die Analyse ausgewählter Ebenen zu reduzieren. Auf diese Weise können nicht nur Informationen auf Sphäroidebene extrahiert werden, sondern auch Daten auf Zellebene von jedem einzelnen Sphäroide. Letztendlich müssen die HCA-Pipelines so konzipiert sein, dass sie die spezifische biologische Frage beantworten, die gestellt wird. Multiparametrische Ausgaben ermöglichen es, komplexe Phänotypen quantitativ zu beschreiben. Dies funktioniert nachweislich für 3D-Zellbaugruppen mit kommerzieller HCA-Software16,17 sowie frei zugänglicher Software wie CellProfiler22,23. Volumetrische Analysemethoden haben das Potenzial, auf andere 3D-Zellmodelltypen wie Organoide und ex vivo patientenabgeleitete Explantate (PDEs) angewendet zu werden, die sich unter vivo-Bedingungen noch besser replizieren. Vor kurzem wurde eine Hochdurchsatzpipeline zur Herstellung von Gehirnorganoiden beschrieben24. Dabei werden Organoide in einer 96-Well-Platte erzeugt und anschließend mit einem High-Content-Screening-Mikroskop abgebildet24. PDEs sind sehr vorteilhaft, da sie die ursprüngliche Histologie des Tumors aufweisen und somit ein Zellmodell liefern, das In-vivo-Bedingungen rekapituliert, einschließlich Merkmalen wie der Tumormikroumgebung25. Diese Modelle können prinzipiell auch mit dem hier beschriebenen Ansatz immungefärbt, abgebildet und analysiert werden26,27.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll ein zugängliches und robustes Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Sphäroiden für HCS- und HCA-Anwendungen. Seine Anwendbarkeit wird mit drei verschiedenen Zelllinien gezeigt, die Sphäroide erzeugen, die mit hoher Auflösung abgebildet werden können. Dieses Protokoll zeigt auch, dass die volumetrische Analyse quantitative Informationen über die Sphäroidpopulation sowie auf Einzelzell- und subzellulärer Ebene liefern kann, wodurch sie für eine Vielzahl von Assays nützlich ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass mit dieser Arbeit keine konkurrierenden Interessen verbunden sind.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die Unterstützung eines Infrastrukturforschungszuschusses der Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) an JCS. Die Arbeit im UCD Cell Screening Laboratory wird vom UCD College of Science unterstützt. ASC wird durch ein Postgraduiertenstipendium der irischen Regierung des Irish Research Council (IRC) (GOIPG/2019/68) finanziert. Die Autoren danken auch allen Mitgliedern des Labors für ihren Input und ihre hilfreichen Diskussionen. Das Bildmaterial in Abbildung 1 wurde in BioRender generiert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
