Summary
Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.
Abstract
Yüksek içerikli tarama (HCS) ve yüksek içerikli analiz (HCA), araştırmacılara hücrelerden büyük ölçekli nicel fenotipik ölçümler çıkarma yeteneği sağlayan teknolojilerdir. Bu yaklaşım, hücre biyolojisindeki çok çeşitli temel ve uygulamalı olaylar hakkındaki anlayışımızı derinleştirmek için güçlü olduğunu kanıtlamıştır. Bugüne kadar, bu teknoloji için uygulamaların çoğu, tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerin kullanımına dayanıyordu, ancak bu tür modellerin dokularda meydana gelen etkileşimlerin ve süreçlerin çoğunu özetlemediği giderek daha fazla fark ediliyor. Bu nedenle, sferoidler ve organoidler gibi 3 boyutlu (3B) hücre gruplarının geliştirilmesinde ve kullanımında bir ortaya çıkmıştır. Bu 3D modeller kanser biyolojisi ve ilaç dağıtım çalışmaları bağlamında özellikle güçlü olmasına rağmen, HCS ve HCA için uygun tekrarlanabilir bir şekilde üretim ve analizleri bir takım zorluklar ortaya koymaktadır. Burada detaylandırılan protokol, çok hücreli tümör sferoidlerinin (MCTS) üretilmesi için bir yöntemi açıklamakta ve HCS ve HCA ile uyumlu bir şekilde üç farklı hücre hattına uygulanabileceğini göstermektedir. Yöntem, kuyu başına birkaç yüz sferoid üretimini kolaylaştırır ve bir tarama rejiminde kullanıldığında, hepsi aynı şekilde muamele edilen kuyu başına birkaç yüz yapıdan veri elde edilebilmesi için özel bir avantaj sağlar. Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için sferoidlerin nasıl işleneceğini ve HCA'nın hem sferoid seviyesinde hem de her bir sferoid içindeki bireysel hücrelerden nicel özellikleri nasıl çıkarabileceğini ayrıntılarıyla anlatan örnekler de verilmiştir. Bu protokol, hücre biyolojisindeki çok çeşitli önemli soruları cevaplamak için kolayca uygulanabilir.
Introduction
Geleneksel olarak, hücre bazlı tahliller, etkili bir şekilde iki boyutlu (2D) bir ortam olarak kabul edilebilecek katı bir substrat üzerinde büyüyen tek katmanlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, 2B hücre kültürü modellerinin bazı bağlamlarda fizyolojik alaka düzeyinden yoksun olduğu ve hücreler arasında meydana gelen karmaşık etkileşimlerin çoğunu kopyalayamadığı giderek daha fazla kabul edilmektedir1. Üç boyutlu (3D) hücre kültürü yöntemleri araştırmacılar arasında hızla popüler hale gelmektedir ve 3D hücre modelleri, doku ortamında hücrelerin karşılaştığı fizyolojik koşulları daha iyi taklit etmek için yüksek potansiyel göstermektedir2. Kullanılan birkaç farklı 3D hücre derlemesi türü vardır, ancak en yaygın iki tip sferoidler ve organoidlerdir. Sferoidler birçok farklı hücre hattından yetiştirilebilir ve kullanılan hücre tipine ve montaj yöntemlerine bağlı olarak çeşitli şekil ve boyutlar benimseyebilirler3. Dahası, sferoidler, kanser hücre hatlarından yetiştirildiklerinde çok hücreli tümör sferoidleri (MCTS) olarak da adlandırılabilir ve bu modeller preklinik in vitro ilaç dağıtımı ve toksisite çalışmaları için özel bir kullanım alanı bulmuştur4,5. Öte yandan organoidler, vücudumuzdaki dokuları ve organları daha iyi taklit etmeyi amaçlar ve daha karmaşık morfolojik düzenlemeleri benimseyebilirler. Organoidlerin üretimi, yetişkin kök hücrelerin veya pluripotent kök hücrelerin kullanılmasını içerir; bunlar, ilgilenilen doku veya organa benzemek için uygun hücrelere yeniden programlanabilir. Öncelikle organların gelişimini araştırmak ve hastalıkları ve konakçı-patojen etkileşimlerini modellemek için kullanılırlar6.
3B hücre derlemeleri oluşturmak için kullanılan bir dizi farklı yöntem vardır. İskele tabanlı yöntemler, hücrelerin içinde bağlanabileceği veya büyüyebileceği bir substrat veya destek sağlar. Bu iskeleler çeşitli şekillerde olabilir ve çeşitli malzemelerden yapılabilir. En yaygın olanları hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri ve hidrojellerdir ve hücrelerin doğal hücre dışı ortamına benzeyecek ve böylece fizyolojik etkileşimleri kolaylaştıracak şekilde tasarlanmıştır4,7. ECM bodrum materyali Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu tümöründen ekstrakte edilmiş ve laminin, tip IV kollajen ve perlecan8 dahil olmak üzere zengin bir ECM bileşenleri karışımı içerdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, avantajlı bileşimine rağmen, kullanımıyla ilgili iki ana zorluk vardır: partiden partiye değişkenliği ve 10 ° C8,9'un altında ve üstünde iki farklı agrega durumuna sahip olması. Buna karşılık, hidrojeller bileşenlerine ve sertliklerine göre esnek olma avantajına sahiptir ve istenen belirli 3D hücre düzeneğine uyacak şekilde özelleştirilebilirler7,10. İskele bazlı yöntemler organoid büyüme için gereklidir, ancak aynı zamanda sferoidler için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Hücrelerin büyüdükleri yüzeye yapışmasını engelleyerek çalışan iskelesiz yöntemler, genellikle sadece küresel montaj ile uyumludur. Örnekler arasında, hücrelerin sferoidlere toplanmasına izin veren düz tabanlı veya U-dipli ultra düşük bağlantı (ULA) plakaları veya iplikçik/rotasyon şişelerinde hücrelerin sürekli ajitasyonunun kullanılması sayılabilir10.
Çok çeşitli biyolojik olayları incelemek için 3D hücre montajlarının kullanımı hızla popülerlik kazanmaktadır; ancak, kültürleri için seçilen yöntemin, aşağı akış analizleri için planlara uygun ve uyumlu olması esastır. Örneğin, ULA plakalarının kullanımı yüksek tutarlılığa sahip sferoidler üretir; Bununla birlikte, bu yöntem kuyu başına tek bir sferoid üretimi ile sınırlıdır, böylece verim sınırlandırılır. 3D yapının floresan görüntülemesi planlanırken özellikle dikkat edilmesi gerekir. Montajın yetiştirildiği alt tabaka veya plaka optik olarak uyumlu olmalı ve kullanılmış olabilecek iskelelerin neden olduğu ışık saçılmasının etkilerini en aza indirmek için özen gösterilmelidir11. Bu özel sorun, mikroskop objektif lenslerinin sayısal açıklığı arttıkça daha akut hale gelir.
Muhtemelen bir 3B hücre modeliyle çalışmayı seçmenin en önemli nedenlerinden biri, yalnızca tüm montaj hakkında değil, aynı zamanda içindeki tek tek hücreler hakkında hacimsel görüntüleme verilerini çıkarmaktır. Özellikle MCTS modelleri, terapötiklerin dışarıdan merkezi hücrelere (bir tümörde ihtiyaç duyacakları gibi) nasıl geçtiğine dair anlayışımızı derinleştirmek için çok güçlü olduğunu kanıtlamaya başlıyor12 ve bu nedenle farklı katmanlardaki bireysel hücrelerden bilgi edinmek çok önemlidir. Tek tek hücrelerden kantitatif bilgileri çıkaran görüntüleme teknolojisi, yüksek içerikli analiz (HCA) olarak adlandırılır ve tarama bağlamında güçlü bir yaklaşımdır13. Bugüne kadar, HCA neredeyse sadece tek katmanlı kültürlere uygulanmıştır, ancak bu yaklaşımın çok çeşitli hücresel fonksiyonların ve süreçlerin incelenmesini sağlayan 3B kültürlere uygulanma gücüne sahip olduğunun giderek daha fazla farkına varılmıştır14. Çok sayıda 3B montajın analiz edilebilmesi ve potansiyel olarak her yapının içinden hücre düzeyinde veri sağlaması açık bir avantaja sahip olacaktır. Bununla birlikte, potansiyel olarak kalın hücre gruplarının görüntülenmesi ve oluşturulan büyük veri kümelerinin görüntülenmesiyle ilgili zorlukların üstesinden gelinmesi gerekir.
Bu makalede, MCTS'nin 96 kuyucuklu bir formatta büyük ölçekli üretimi için sağlam bir iskele tabanlı yöntem sunulmuştur. Yöntem, her kuyucukta birkaç yüz 3D hücre düzeneğinin üretimini kolaylaştırır. Karaciğer, akciğer ve kolonun katı tümör modellerini temsil eden üç farklı hücre tipi için örnekler gösterilmiştir. Oluşan sferoidler çeşitli boyutlarda olabilir ve bu nedenle HCA, belirli bir boyuttaki ve / veya morfolojideki yapıları seçmek için kullanılır. Bu özellik, gözlemlenen herhangi bir fenotipin farklı boyutlardaki sferoidler arasında karşılaştırılabilmesi, ancak hepsinin aynı kuyuda aynı şekilde muamele görmesi için ek avantaj sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumludur, daha da önemlisi, aynı hücresel gruplardan hem hücre düzeyinde hem de hücre altı düzeyinde nicel veriler sağlar. Bu sferoid üretim yöntemi, kuyu başına tek bir sferoid üreten yöntemlere göre ek bir avantaja sahiptir, her bir kuyuda üretilen çok sayıda sferoid, transkriptom ve proteom profillemesi gibi diğer aşağı akış analizleri için potansiyel olarak yeterli biyokütle sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü
- Medya hazırlama
- Hücre hattının türüne bağlı olarak belirli hücre kültürü ortamları hazırlayın. Hücre bakımı için tüm ortamların% 10 fetal sığır serumu (FBS) içerdiğinden emin olun.
NOT: Farklı hücre satırları farklı ortamlar kullanır. HT-29 kolon karsinom hücreleri (ATCC HTB-38) McCoys 5A +% 10 FBS'de yetiştirilir. HepG2 hepatosellüler karsinom hücreleri (ATCC HB-8065) Minimum Esansiyel Orta +% 1 L-glutamin +% 10 FBS'de yetiştirilir. H358 bronkoalveoler karsinom hücreleri (ATCC CRL-5807) RPMI 1640 orta +% 1 L-glutamin +% 10 FBS'de yetiştirilir. L-glutamin ve FBS içeren tüm ortamlar tam medya olarak adlandırılır. Hücreleri sferoidler olarak büyümek üzere kaplarken, ECM bodrum malzemesinin renklendirilmesini önlemek için% 10 FBS'li fenol kırmızısı içermeyen bir ortam gerekir, bu da görüntüleme işlemi sırasında eserlere neden olabilir.
- Hücre hattının türüne bağlı olarak belirli hücre kültürü ortamları hazırlayın. Hücre bakımı için tüm ortamların% 10 fetal sığır serumu (FBS) içerdiğinden emin olun.
- Alt kültür hücreleri
- Hücreler yaklaşık% 80 birleştiğinde, 2 mL tripsin-EDTA (% 0.25 (w / v) tripsin / 0.53 mM EDTA) ile kısaca yıkayın. Tripsin-EDTA'yı aspire edin, 3 mL taze tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 3-5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreler hücre kültürü kabından ayrıldığında, 7 mL taze tam ortam ekleyin.
- Pipet, 10 cm'lik yeni bir hücre kültürü kabına 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücrelerin 1:10 seyreltilmesini sağlamak için 9 mL taze komple ortam ekleyin.
- Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de kültürleyin.
- Hücre hattına bağlı olarak hücreleri her 3-5 günde bir alt kültüre alın.
2. Sferoidlerin oluşumu
- 96 delikli plakaları ECM bodrum malzemesi ile kaplayın
- ECM bodrum malzemesini gece boyunca buz üzerinde çözün.
- ECM bodrum malzemesini -20 °C'de tutulan önceden soğutulmuş uçlar kullanarak soğuk fenol kırmızısız serum içermeyen ortamda seyreltin.
NOT: ECM bodrum malzemesinin son konsantrasyonu, kullanılan hücre hattına bağlıdır. HT-29 ve H358 hücreleri için, 4 mg · mL-1 ECM bodrum malzemesi kullanın. HepG2 hücreleri için, 4 mg · mL-1 azaltılmış büyüme faktörü ECM bodrum malzemesi kullanın. - ECM bodrum malzemesinin/orta solüsyonunun 15 μL'lik pipeti, 96 delikli bir görüntüleme plakasına yerleştirilir.
NOT: Büyük ölçekli sferoid üretimi için bu adım, ECM bodrum malzemesini içeren uçlar ve hazne soğutulduğu sürece hem 8 kanallı pipet hem de 96 kanallı pipet kafası ile gerçekleştirilebilir. - Plakayı 4 ° C'de 91 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Plakayı 37 ° C'de 30 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
- Alt kültür ve sayım hücreleri
- Plaka inkübasyon döneminde, hücreleri tripsin-EDTA ile inkübe edin ve% 10 FBS içeren eksiksiz bir ortamda yeniden askıya alın.
- Pipet, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini bir hemositometre sayma odasına yerleştirir. Odanın 4 çeyreğindeki hücre sayısını sayın.
- 4 kadran içindeki ortalama hücre sayısını belirleyerek hücre süspansiyonu içindeki hücre sayısını hesaplayın.
NOT: Hücreler, otomatik hücre sayma cihazları kullanılarak da sayılabilir. - Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca 135 x g'de santrifüj edin.
- Hücreler peletlendikten sonra, süpernatantı aspire edin ve mL başına 1 x 106 hücre konsantrasyonu elde etmek için hücreleri fenol kırmızısı içermeyen tam bir ortamda yeniden askıya alın.
- ECM bodrum malzemesi kaplı plakalara tohum hücreleri
- Hücreleri fenol kırmızısı içermeyen tam bir ortamda seyreltin.
NOT: Tohumlanan hücrelerin yoğunluğu, kullanılan hücre hattına bağlıdır. HT-29 ve HepG2 hücreleri için, kuyu başına 3 x 104 hücre tohumlanır; H358 hücreleri için, kuyu başına 4 x 104 hücre tohumlanır. - Hücreleri kuyucuk başına toplam 35 μL hacimde tohumlayın. Onları dairesel bir hareketle damla damla eklediğinizden emin olun.
NOT: Büyük ölçekli küresel üretim için, pipetleme dairesel hareketi sağlanabildiği sürece bu adım 8 kanallı pipetle gerçekleştirilebilir. - Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 1 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Fenol kırmızısı içermeyen tam ortamda bir ECM bodrum malzemesi çözeltisi hazırlayın, bu da kuyuda% 2 ECM bodrum malzemesinin nihai konsantrasyonu ile sonuçlanır. Bunu başarmak için, kuyu başına 23.8 μL fenol kırmızısız tam ortama 1.2 μL ECM bodrum malzemesi ekleyin, bu da kuyu başına 60 μL'lik bir son hacimle sonuçlanır.
- Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, ortamı 100 μL taze fenol kırmızısız tam ortam ile değiştirin.
- Ortamı her iki günde bir 100 μL taze fenol kırmızısız tam ortam ile değiştirin.
- Hücreleri fenol kırmızısı içermeyen tam bir ortamda seyreltin.
3. Sferoidlerin immünofloresan boyanması
NOT: Bu protokol Nürnberg ve ark., 202015'ten uyarlanmıştır. Bu uyarlamalar temel olarak, bu protokolde açıklanan sferoidlerin Nürnberg ve ark. çalışmalarında15 kullanılanlardan daha küçük olduğu ve bu nedenle daha kısa kuluçka sürelerini kolaylaştırdığı gerçeğine dayanmaktadır. Örneğin, engelleme süreleri 2 saatten 1 saate düşürülür. Ek olarak, protokol sferoidlerin yüksek verimli üretimi için tasarlandığından, tüm işleme adımları, sferoidlerin kültürlendiği kuyuda gerçekleştirilir, yani bireysel sferoidlerin tüplere aktarılması gerekli değildir.
- Sabitleme ve boyama için gerekli tüm çözeltileri ve tamponları hazırlayın
- 200 mL suya 1 PBS tablet ekleyerek Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) hazırlayın. PBS'yi otoklav edin.
- 3.1.3-3.1.4 adımlarını izleyerek paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
- Bir duman davlumbazında 400 mL PBS'yi 60-70 °C'ye ısıtmak için ısıtılmış bir karıştırıcı kullanın. Karıştırırken 15 g PFA ekleyin. PFA çözündükten sonra, 50 μL 1 M CaCl2 ve 50 μL 1 M MgCl2 ekleyin.
- 500 mL'lik bir son hacim oluşturmak için 100 mL PBS ekleyin. PFA'yı pH 7.4'e dengelemek için NaOH kullanın. PFA'yı steril vakum filtrelerinden (gözenek boyutu 0,22 μm), aliquot'tan süzün ve -20 ° C'de saklayın.
- 50 mL PBS'ye 3.75 g glisin ekleyerek 1 M glisin stok çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- 2.4 mL PBS'ye 100 μL Triton X-100, 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ve 1.5 mL 1 M glisin ekleyerek 5 mL geçirgenlik tamponu hazırlayın. 4 °C'de 2 haftadan fazla olmamak üzere saklayın.
- 4.9 mL PBS'ye 100 μL Triton X-100, 0.5 mL DMSO ve 0.05 g sığır serum albümini (BSA) ekleyerek 5 mL bloke edici tampon hazırlayın. Blokaj tamponunu 1,5 mL tüplere boşaltın ve -20 ° C'de saklayın.
- 4.74 mL PBS'ye 10 μL polisorbat 20, 0.05 g BSA ve 250 μL DMSO ekleyerek 5 mL antikor inkübasyon tamponu hazırlayın. Antikor inkübasyon tamponunu 1.5 mL tüplere boşaltın ve -20 ° C'de saklayın.
NOT: Burada açıklanan protokolde, sferoidler sadece 96 kuyucuklu bir plakanın iç 60 kuyucuğuna monte edilir, ancak plakanın 96 kuyucuğunun hepsinde hazırlanabilirler. Sadece iç 60 kuyucukta sferoidlerin hazırlanmasının nedeni, bazı yüksek sayısal açıklıklı objektif lenslerin, bazı plaka tiplerindeki 'etek' nedeniyle dış kuyuların tüm kuyusunu fiziksel olarak görüntüleyememesidir. Yukarıdaki hacimler, sferoidler içeren 60 kuyunun hazırlanması için yeterlidir.
- Sferoidleri düzeltin ve geçirgenleştirin
- ECM bodrum malzemesi tabakasının bozulmamasını sağlamak için ortamı sferoidlerden dikkatlice çıkarın.
- Sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile iki kez yıkayın.
- Sferoidleri 37 ° C'de 1 saat boyunca 70 μL% 3 PFA ile sabitleyin.
- Sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile iki kez yıkayın.
- 37 °C'de 30 dakika boyunca 70 μL 0,5 M glisin çözeltisi ile söndürün.
- RT'de 30 dakika boyunca 70 μL geçirgenlik tamponu kullanarak sferoidleri geçirgenleştirin.
- Sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile iki kez yıkayın.
- Sferoidleri 37 ° C'de 1 saat boyunca 70 μL bloke tamponunda inkübe edin.
NOT: Sferoidler sabitlendikten sonra, sonraki tüm işleme adımları 8 kanallı pipet veya varsa 96 delikli pipetleme kafası kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu, görüntülemeden önce küresel preparatın hızını arttırır.
- Primer ve sekonder antikorları kullanan immünostain sferoidler
- Birincil antikoru antikor inkübasyon tamponunda uygun bir seyreltmeye seyreltin ve her bir oyuğa 70 μL ekleyin. Sferoidleri bir gecede birincil antikor ile inkübe edin.
NOT: Seyreltme, kullanılan spesifik antikora bağlıdır. Burada gösterilen örnekte, lizozomlar 1:500'lük bir seyreltme kullanılarak fare anti-LAMP1 antikorları ile immünoboyalıdır. - Ertesi gün, sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile 5 kez yıkayın.
- Sekonder antikoru 1:500 seyreltmede, floresan konjuge falloidini 1:500'de ve Hoechst 33342'yi (1 mg mL-1 stoktan) antikor inkübasyon tamponunda 1:5000'de seyreltin ve her bir oyuğa 70 μL ekleyin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
NOT: Antikor seyreltmesi, kullanılan spesifik antikora bağlıdır. Yüksek fotostabilite ve yüksek parlaklık gösteren yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikorlar önerilir. - Ertesi gün, sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile 5 kez yıkayın.
NOT: Plakalar, sferoidler PBS ile kaplı kaldığı sürece, görüntülemeden önce RT'de iki haftaya kadar saklanabilir.
- Birincil antikoru antikor inkübasyon tamponunda uygun bir seyreltmeye seyreltin ve her bir oyuğa 70 μL ekleyin. Sferoidleri bir gecede birincil antikor ile inkübe edin.
4. Görüntü toplama ve sferoidlerin analizi
- Görüntü alma
- Sferoidler içeren 96 delikli plakayı konfokal yüksek içerikli bir tarama mikroskobuna yerleştirin.
- Kullanılan floroforları uyarmak için uygun lazerleri seçin.
- Çapraz konuşmayı önlemek için kanalları sırayla edinin.
- Uygun hedefleri kullanarak küreselleri görüntüleyin.
NOT: Varsa suya daldırma hedeflerinin kullanılması önerilir. Örneğin, 20x/1,0 NA objektif, ~77 görüş alanında bir kuyunun tamamını görüntüleyebilir. 63x/1.15 NA hedefi, yaklaşık 826 görüş alanında tüm kuyuyu görüntüleyebilir. - Görüntü ~ 30-40 dilim, küresel derinliğe bağlı olarak, her dilim bir öncekinden 1,5 μm aralıklarla alınır.
- Görüntü analizi
- Sferoidlerin morfolojik analizi için 4.2.2-4.2.6 adımlarını izleyin.
- Floresan konjuge falloidin boyamasına dayanarak sferoidleri segmentlere ayırın.
- Çekirdekleri Hoechst 33342 boyamasına göre segmentlere ayırın.
- Her hücrenin sitoplazmasını, hücre sitoplazmasında bulunan artık Hoechst 33342 boyası ile segmentlere ayırın.
- Sferoidlerin hacim, yüzey alanı, sferisite ve sferoid başına çekirdek sayısı dahil olmak üzere farklı morfolojik özelliklerini hesaplayın.
NOT: Bu bilgiler, tercih edilen görüntü analiz yazılımında yerleşik olarak bulunan çeşitli algoritmalar kullanılarak ayıklanır. - 75.000 μm3'ten küçük ve 900.000 μm3'ten büyük sferoidleri kaldırmak için görüntüleri daha fazla işleyin.
NOT: Bu değerler, çoklu sferoidlerin füzyonu sonucu ortaya çıkmış olabilecek çok küçük hücre düzeneklerinin ve büyük düzeneklerin çıkarılmasına izin vermek için önerilerdir. Sferoidler bu adımda farklı boyut sınıflarına da ayrılabilir. - Sferoidler içindeki tek hücreleri analiz etmek için 4.2.8-4.2.12 arasındaki adımları izleyin.
- Floresan konjuge falloidin boyamasına dayanarak sferoidleri segmentlere ayırın.
- Çekirdekleri Hoechst 33342 boyamasına göre segmentlere ayırın.
- Her hücrenin sitoplazmasını, hücre sitoplazmasında bulunan artık Hoechst 33342 boyası ile segmentlere ayırın.
- Sekonder antikor boyamasına göre lizozomları segmentlere ayırın.
- Hücre başına lizozom sayısı, hücre hacmi ve hücre yüzey alanı dahil olmak üzere her bir sferoid içindeki hücrelerin farklı morfolojik özelliklerini hesaplayın.
NOT: Bu bilgiler, tercih edilen görüntü analiz yazılımında yerleşik olarak bulunan çeşitli algoritmalar kullanılarak ayıklanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, çeşitli tümör dokularını temsil etmek için farklı hücre tiplerini kullanarak, sferoidler şeklinde 3D hücre kültürü montajları üretmek için sağlam bir yöntem detaylandırılmıştır. Bu yöntem, kuyu başına yüzlerce sferoid üretilmesine izin verir, bu da hücre bazlı tahlillerin yüksek içerikli bir şekilde yapılmasını sağlar (Şekil 1). Bu yaklaşım daha önce HT-29 sferoidlerinde16 nanopartikül alımını ve HepG2 sferoidlerinde17 nanopartikül kaynaklı toksisiteyi incelemek için kullanılmıştır. Yöntem, optik kalitede bir plakanın kuyu dibi boyunca ince ve eşit bir iskele malzemesi dağılımı üretmeye dayanır. Hücreler her bir kuyucuğa ekilir ve düşük konsantrasyonda daha fazla iskele malzemesi, hücreler üzerinde bir kaplama olarak eklenir. Bu, sferoidlerin büyümesini bile destekleyen bir bazla sonuçlanır, bu da 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda birkaç yüz sferoidin kültürlenebileceği anlamına gelir. Düşük büyütme hedefi, tüm popülasyonun genel bir görüntüsünü oluşturmak için kullanılır (Şekil 2). Kuyunun alt bölgeleri daha sonra yüksek çözünürlüklü bir hedef kullanılarak seçilebilir ve görüntülenebilir ve her konumda tam bir konfokal yığın elde edilir. Bu, her bir sferoidin sonraki hacimsel analizi için gerekli bilgileri sağlar.
Bireysel sferoidler daha sonra HCA tarafından analiz edilebilir, böylece sferoidlerin morfolojik özellikleri hakkında bilgi sağlanır. Tipik olarak ilk adım, her bir küreyi tek bir nesne olarak tanımlamaktır. Bunu yapmak için, sferoid boyunca tutarlı boyama veya dağılım sağlaması muhtemel bir floresan kanalı seçilir. Burada gösterilen örnekte, floresan konjuge faloidin kanalındaki sinyal kullanılır, çünkü aktin, farklı sferoid tiplerindeki tüm hücrelerde plazma zarına yakın bulunur (Şekil 2 ve Şekil 3A). Tam konfokal yığınların oluşturulmasının bir sonucu olarak, tüm HCA adımları dilim bazında değil, hacimsel bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu, az sayıda seçilen düzlemin analiziyle ilişkili önyargıları ortadan kaldırdığı için önemlidir. Bu hacimsel yaklaşım daha sonra görüntüdeki diğer kanallara uygulanır. Çekirdekler, Hoechst 33342 boyamasına dayanarak tespit edildi ve bölümlere ayrıldı ve aynı kanal, düşük seviyelerde mevcut olan Hoechst 33342 kalıntısı olduğu için hücre sitoplazmasını tespit etmek için kullanılabilir (Şekil 3B). Sferoid içindeki bireysel hücrelerin aşağı akış analizine ihtiyaç duyulursa, diğer kanallar (örneğin, anti-LAMP1 antikorları ile immünoboyalı lizozomlar) da benzer şekilde işlenebilir. Volumetrik yaklaşım, floresan olarak etiketlenmiş tüm yapıların tüm görünümlerden görselleştirilmesini sağlar (Şekil 3C).
Sferoidi ayrı bir nesne olarak tanımladıktan sonra, sferoid düzeyde çeşitli morfolojik ölçümler yapılabilir. Bu ölçümler, sferoid başına çekirdek sayısının (Şekil 4A) yanı sıra sferoidin sferikliğinin (Şekil 4B), hacminin (Şekil 4C) ve yüzey alanının (Şekil 4D) hesaplanmasını içerir. Kullanılan HCA yazılımına bağlı olarak, kesit alanı, iç disk yarıçapı ve iç küre yarıçapı gibi diğer morfolojik özellikler de hesaplanabilir. Burada gösterilen örneklerde, 75.000 μm3'ün altındaki ve 900.000 μm3'ün üzerindeki sferoidler ölçümlerden çıkarılmıştır, ancak bu parametreler analiz için istenen küresel özelliklere bağlı olarak kullanıcı tarafından ayarlanabilir. Elektronik tablolar görüntü analiz yazılımı tarafından oluşturuldu ve analiz için RStudio'ya aktarıldı. Farklı sferoid tiplerinin morfolojik özelliklerini göstermek için boxplot grafikleri üretilmiştir (Şekil 4). Bu kutu grafikleri, popülasyondaki küresel heterojenlik seviyesini ortaya koymaktadır, bu nedenle herhangi bir deneyde çok sayıda sferoidin ölçülmesi önemlidir. Bu, kuyu başına tek bir sferoid üreten yöntemlere göre önemli bir avantajdır. Burada gösterilen üç sferoid tip, hacimleri ve yüzey alanları bakımından yüksek düzeyde benzerlik göstermektedir, ancak HepG2 sferoidlerinin küreselliğinin burada gösterilen diğer tiplerden biraz daha düşük olması dikkat çekicidir (Şekil 4B).
Burada kullanılan 63x suya daldırma hedefi gibi yüksek çözünürlüklü bir hedefe sahip sferoidlerin görüntülenmesi, sferoid içindeki bireysel hücrelerin hücre altı çözünürlüğünün elde edilmesini sağlar. Farklı organeller, kullanılan antikorlara bağlı olarak bölümlere ayrılabilir. Burada gösterilen örnekte, lizozomlar anti-LAMP1 antikorları kullanılarak immün boyamaya dayalı olarak tanımlanmış, ardından ikincil antikor ilavesi yapılmıştır (Şekil 3C). Her bir hücrenin içindeki her bir organelin segmentasyonu daha sonra hücre seviyesi ölçümlerinin nicelleştirilmesine izin verir. Üç sferoid tipteki her hücrenin tipik hacmi (Şekil 5A) ve hücre başına lizozom sayısı (Şekil 5B) gösterilmiştir. Bu tür hücre altı detaylara duyulan ihtiyaç, sferoidlerin kullanılacağı tahlil ile belirlenir.
Küresel üretimin başlangıcında ilk hücre tohumlama yoğunluğunu optimize etmek kritik bir adımdır. Çok fazla hücre eklemek hala küresel oluşuma izin verir; ancak bu, sferoidlerin kaynaşmasına neden olabilir (Şekil 6). Bu, düzensiz şekilli montajların üretilmesine yol açar ve bu da sferoidlerin aşağı yönde tanımlanması için oldukça sorunlu olabilir. Sferoidler yanlış bir şekilde farklı yapılar olarak tanımlandığında, bireysel hücrelerin analizinde de sorunlar olabilir. Bu nedenle, hücre tohumlama yoğunluğu ve büyüme süresinin uzunluğu da dahil olmak üzere küresel üretim için kullanılan her hücre hattının dikkatli optimizasyonu, oluşturulması gereken kritik parametrelerdir.
Şekil 1: HCS ve HCA için sferoidler üretmek için kullanılan protokolün şematik detaylandırılması . 96 delikli plakalar, bir ECM bodrum malzemesi tabakası ile kaplanır, ardından hücrelerin tohumlanması ve daha sonra küresel oluşumu başlatır. Medium ertesi gün ve ondan sonraki her ikinci günde bir değiştirilir. Görüntülemeye hazırlık olarak, sferoidler sabitlenir, geçirgenleşir ve spesifik antikorlarla immünoboyalıdır. Sferoidler daha sonra konfokal HCS mikroskobu kullanılarak görüntülenir. BioRender.com ile oluşturulan grafik. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: H358, HepG2 ve HT-29 sferoidlerinin örnek görüntüleri. (A) H358, (B) HepG2 ve (C) HT-29 sferoidlerinin tam otomatik HCS konfokal görüntülemesi. Paneller tek bir kuyuya genel bakışın yanı sıra üç örnek konfokal dilim ve her hücre hattından bir kürenin hacimsel rekonstrüksiyonunu gösterir. Hoechst 33342 ile boyanmış çekirdekler mavi, aktin kırmızı renkte floresan konjuge falloidin ile boyanmış ve LAMP1 için immünozomlar yeşil renkte gösterilmiştir. Kuyuya genel bakışın görüntüleri 20x suya daldırma hedefi (NA 1.0) ile elde edilmiştir. Bireysel sferoidlerin görüntüleri 63x su daldırma hedefi ile elde edildi (NA 1.15). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntü analizinde örnek önemli adımlar. (A) Her bir sferoid ilk olarak floresan konjuge falloidin boyamasının tespiti ile hacimsel modda tanımlanır. (B) Bu bilgiyi bir maske olarak kullanarak, her hücrenin sitoplazması, hücre sitoplazmasında bulunan artık Hoechst 33342 boyası tarafından bölümlere ayrılır. Çekirdekler Hoechst 33342 boyası ile bölümlere ayrılmıştır. Lizozomlar antikor (anti-LAMP1) immün boyama kullanılarak bölümlere ayrılır. Volumetrik görünümler gösterilir. (C) Aynı kürenin 3 düzlemli görüntüleri. Gösterilen örnek bir H358 hücre sferoididir. Görüntüler 63x suya daldırma hedefi ile elde edilmiştir (NA 1.15) Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Küresel düzeyde ölçüm örnekleri. Tüm ölçümler otomatik bir görüntü analizi boru hattı kullanılarak yapıldı ve üç tür sferoid için, yani H358, HepG2 ve HT-29, 20x hedefle görüntülendi. Gösterilenler (A) sferoid başına ortalama çekirdek sayısı, (B) küresel sferisite, (C) küresel hacim ve (D) küresel yüzey alanıdır. Tüm kutu grafikleri, her küresel tür için medyan değeri ve çeyrekleri gösterir. Veriler 3 çoğaltma kuyusundan alınmıştır; analiz edilen toplam sferoid sayısı 1259 (H358), 1522 (HepG2) ve 1326 (HT-29) idi. Görüntüler 20x suya daldırma hedefi (NA 1.0) ile elde edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sferoidlerden hücre düzeyinde ölçüm örnekleri. Tüm ölçümler otomatik bir görüntü analizi boru hattı kullanılarak yapıldı ve H358, HepG2 ve HT-29 olmak üzere üç tür sferoid için 63x hedefle görüntülendi. Gösterilenler, (A) tek tek hücrelerin hacimleri ve (B) hücre başına ortalama lizozom sayılarıdır. Analiz edilen toplam hücre sayısı, her hücre hattının 20 sferoidinden 1410 (H358), 1625 (HepG2) ve 1401 (HT-29) idi. Görüntüler 63x suya daldırma hedefi ile elde edilmiştir (NA 1.15) Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hücrelerin aşırı kaplanmasının küresel oluşum üzerindeki etkilerini gösteren örnek görüntüler. H358, HepG2 ve HT-29 sferoidleri için örnek görüntüler gösterilmiştir. Oklar, sferoidlerin muhtemelen kaynaştığı yerleri gösterir. Görüntüler 20x suya daldırma hedefi (NA 1.0) ile elde edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yaklaşım, HCS ve HCA için uygun bir şekilde kuyu başına birkaç yüz sferoid üretmek için bir platformu detaylandırmaktadır. Kuyu başına sadece bir sferoid oluşumuna izin veren düz tabanlı ve yuvarlak tabanlı ULA plakalarının kullanımı gibi diğer popüler yöntemlerle karşılaştırıldığında18,19, bu yöntem yüksek çözünürlüklü bilgilerin çok sayıda sferoidden bir tarama formatında çıkarılmasına olanak sağlar. Özellikle, bu yöntem, çeşitli tümör tiplerini temsil eden 3 farklı hücre hattında gösterilmiştir ve farklı modellerde bir dizi hücresel süreci incelemek için geniş uygunluğunu vurgulamaktadır. Bu yöntem kullanılarak üretilen sferoidler boyut ve şekil bakımından bazı değişkenlikler gösterse de, HCA bunları boyuta (veya diğer ilgi çekici parametrelere) göre kolayca sınıflandırabilir. Laboratuvarımız bu yaklaşımı, nanopartikül kaynaklı toksisiteyi küresel boyutun bir fonksiyonu olarak incelemek için başarıyla kullanmıştır. Daha da önemlisi, sferoidlerin tüm farklı boyut sınıfları aynı kuyuda incelenebilir, yani hepsi aynı tedavilere maruz kalmış ve büyük bir sferoid popülasyonundan oldukça sağlam çıktılar vermiştir17. Burada açıklanan metodoloji, farklı dokuları temsil eden diğer hücre tipleriyle kullanım için kolayca uyarlanabilir. Ek olarak, bu tür sferoidler farklı biyolojik süreçleri değerlendirmek için kullanılabilir14. Sferoidler, floresan etiketli proteinleri istikrarlı bir şekilde eksprese eden hücrelerle üretilirse, canlı hücre görüntüleme de mümkündür.
Bu protokoldeki kritik bir adım, hücrelerin kaplandığı ECM bodrum malzeme tabakasının üretilmesidir. Tabaka çok kalın olduğunda, kuyunun merkezinde tek katmanların büyümesini teşvik eden bir menisküs20 ve sadece kuyunun dış kenarlarında sferoidler oluşturabilir. Bu nedenle, ECM bodrum malzemesinin doğru konsantrasyonunun ve hacminin, kuyu boyunca düzgün sferoid oluşumuna izin verecek şekilde seçilmesi esastır; bu her zaman hücre hattına bağlıdır. Ayrıca, aşırı ECM bodrum malzemesinin, kolayca çözünmediği için immün boyama işlemi sırasında sorunlara neden olabileceği de dikkat çekicidir. Bu da, HCS konfokal mikroskop sistemi kullanırken görüntü elde etme sırasında komplikasyonlara yol açabilir. Diğer bir husus, farklı hücre hatlarının farklı ECM formülasyonları gerektirebileceğidir. Örneğin, HepG2 sferoidleri, H358 ve HT-29 sferoidleri tarafından kullanılanlara kıyasla, daha düşük konsantrasyonda büyüme faktörüne sahip ECM bodrum malzemesi gerektirir. Hücre kaplama yöntemi de önemlidir, çünkü bu, hücrelerin kuyuda nasıl dağıldığını belirler. Çok fazla hücre tohumlandığında veya kötü dağıldıklarında, bu sferoid füzyona yol açabilir (Şekil 6). ECM iskelelerini kullanmanın bir diğer zorluğu, HCS için otomasyon kullanılırken özellikle sorunlu olan düşük sıcaklıklarda (10 ° C'nin altında) ele alınmaları gerektiğidir. Bununla birlikte, bu sorun yakın zamanda ECM bodrum malzemesinin ve hücrelerinin 0.2 μL damlacıklarını odacıklı slaytlara tespit etmek için mikroarray teknolojisini kullanan Eismann ve meslektaşları (2020) tarafından çözülmüştür. Bu, küçük sferoidlerin büyümesini kolaylaştırmak için yeterli bir malzemeydi21. Böyle bir yaklaşımın daha büyük hacimli ECM bodrum malzemesinin çok kuyulu plakaların kuyularına kaplanması için de işe yarayıp yaramayacağı gösterilmeye devam etmektedir.
Mikroskopi kullanarak 3D hücre modellerinin analizi ile ilgili bir sorun, bu montajların merkezi düzlemlerinden bilgi çıkarma yeteneğidir. Bu bakımdan immün boyama işlemi sırasında geçirgenlik ve antikor erişimi sorunlu olabilir. Bununla birlikte, Nürnberg ve meslektaşları tarafından yayınlanan protokol15, tüm sferoidin son derece tutarlı immün boyama işlemini mümkün kılmaktadır. Bu protokolde hafif değişiklikler kullanarak, bu teknik, hücrelerin genel küresel yapıya göre merkezi veya periferik olup olmadığına bakılmaksızın, küçük hücre altı yapıları (örneğin, lizozomlar) bile yüksek derecede tutarlılıkla immünoboyayabilir. Yeni antikorlar kullanılırken bu adımın dikkatlice optimize edilmesi önemlidir.
Bir diğer kritik adım ise seçilen görüntüleme rejimidir. Küresel üzerinden uygun sayıda z-diliminin görüntülenmesi önemlidir, çünkü bu, analiz edilmesi ve depolanması gereken veri hacmini belirler. Örneğin, sınırlı sayıda z-düzlemini çok büyük bir aralıkta görüntülemek, genel küresel boyut ve hacmin hafife alınmasına neden olabilir. Öte yandan, çok fazla z-düzlemi yakalamak, veri analizi ve depolama sorunlarına neden olabilir. Çok büyük veri kümeleri, özellikle hacimsel modda, analizleri için daha yoğun hesaplama gücü gerektirir. Z-düzlemindeki optimal örnekleme aralığı büyük ölçüde objektif lensin özellikleri tarafından belirlenir, ancak burada gösterilen örnekler için, sferoidin tüm derinliği boyunca görüntülemeyi kolaylaştırmak için 1,5 μm'lik bir aralıkta yaklaşık 40 konfokal dilim gereklidir.
Daha önce de belirtildiği gibi, seçilen düzlemlerin analizinden kaynaklanan önyargıyı azaltmak için, hacimsel tabanlı bir görüntü analizi yaklaşımının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Bu, yalnızca sferoid düzeyindeki bilgilerin değil, aynı zamanda her bir sferoidden hücre düzeyinde verilerin de çıkarılmasına izin verir. Nihayetinde, HCA boru hatlarının, sorulan belirli biyolojik soruyu ele alacak şekilde tasarlanması gerekir. Multiparametrik çıktılar, karmaşık fenotiplerin nicel olarak tanımlanmasını sağlar. Bunun, ticari HCA yazılımı16,17 ve CellProfiler22,23 gibi serbestçe erişilebilen yazılımlar kullanılarak 3B hücre montajları için çalıştığı gösterilmiştir. Volumetrik analiz yöntemleri, in vivo koşullarda daha iyi çoğalan organoidler ve ex vivo hasta kaynaklı eksplantlar (PDE'ler) gibi diğer 3D hücre modeli tiplerine uygulanma potansiyeline sahiptir. Son zamanlarda, beyin organoidleri üretmek için yüksek verimli bir boru hattı tanımlanmıştır24. Bu, 96 delikli bir plakada organoidlerin üretilmesini ve daha sonra yüksek içerikli bir tarama mikroskobu kullanılarak görüntülenmesini içerir24. PDE'ler, tümörden orijinal histolojiyi sergilemeleri açısından oldukça avantajlıdırlar, böylece tümör mikroçevresi25 gibi özellikler de dahil olmak üzere in vivo koşulları özetleyen bir hücre modeli sağlarlar. Bu modeller ayrıca, prensip olarak, burada açıklanan yaklaşım kullanılarak immün boyanabilir, görüntülenebilir ve analiz edilebilir26,27.
Özetle, bu protokol HCS ve HCA uygulamaları için büyük ölçekli sferoid üretimi için erişilebilir ve sağlam bir yöntem tanımlamaktadır. Uygulanabilirliği, yüksek çözünürlükte görüntülenebilen sferoidler üreten üç farklı hücre çizgisi ile gösterilmiştir. Bu protokol aynı zamanda hacimsel analizin sferoid popülasyonun yanı sıra tek hücreli ve hücre altı seviyelerde nicel bilgi sağlayabileceğini ve böylece çok çeşitli tahliller için yararlı olabileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu çalışmayla ilgili rakip çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) tarafından JCS'ye verilen altyapı araştırma hibesinin desteğini kabul etmektedir. UCD Hücre Tarama Laboratuvarı'ndaki çalışmalar UCD Bilim Koleji tarafından desteklenmektedir. ASC, İrlanda Araştırma Konseyi (IRC) İrlanda Hükümeti Lisansüstü Bursu (GOIPG / 2019/68) tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar ayrıca laboratuvarın tüm üyelerine katkıları ve yararlı tartışmaları için teşekkür eder. Şekil 1'deki resim BioRender'da oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
