Summary
Este protocolo detalla un método para la producción de tres tipos diferentes de esferoides de una manera que los hace adecuados para la detección y el análisis de alto contenido a gran escala. Además, se presentan ejemplos que muestran cómo se pueden analizar a nivel de células esferoides e individuales.
Abstract
El cribado de alto contenido (HCS) y el análisis de alto contenido (HCA) son tecnologías que proporcionan a los investigadores la capacidad de extraer mediciones fenotípicas cuantitativas a gran escala de las células. Este enfoque ha demostrado ser poderoso para profundizar nuestra comprensión de una amplia gama de eventos fundamentales y aplicados en biología celular. Hasta la fecha, la mayoría de las aplicaciones de esta tecnología se han basado en el uso de células cultivadas en monocapas, aunque cada vez se da más cuenta de que tales modelos no recapitulan muchas de las interacciones y procesos que ocurren en los tejidos. Como tal, ha habido una aparición en el desarrollo y uso de ensamblajes celulares de 3 dimensiones (3D), como esferoides y organoides. Aunque estos modelos 3D son particularmente poderosos en el contexto de la biología del cáncer y los estudios de administración de fármacos, su producción y análisis de una manera reproducible adecuada para HCS y HCA presentan una serie de desafíos. El protocolo detallado aquí describe un método para la generación de esferoides tumorales multicelulares (MCTS), y demuestra que se puede aplicar a tres líneas celulares diferentes de una manera que es compatible con HCS y HCA. El método facilita la producción de varios cientos de esferoides por pozo, proporcionando la ventaja específica de que cuando se utiliza en un régimen de cribado, se pueden obtener datos de varios cientos de estructuras por pozo, todas tratadas de manera idéntica. También se proporcionan ejemplos, que detallan cómo procesar los esferoides para imágenes de fluorescencia de alta resolución y cómo HCA puede extraer características cuantitativas tanto a nivel de esferoides como de células individuales dentro de cada esferoide. Este protocolo podría aplicarse fácilmente para responder a una amplia gama de preguntas importantes en biología celular.
Introduction
Tradicionalmente, los ensayos basados en células se han realizado en monocapas que crecen sobre un sustrato sólido, que efectivamente puede considerarse como un entorno bidimensional (2D). Sin embargo, cada vez se reconoce más que los modelos de cultivo celular 2D carecen de relevancia fisiológica en algunos contextos y no pueden replicar muchas de las complejas interacciones que ocurren entre las células1. Los métodos de cultivo celular tridimensional (3D) se están volviendo rápidamente populares entre los investigadores, y los modelos de células 3D muestran un alto potencial para imitar mejor las condiciones fisiológicas encontradas por las células en el entorno tisular2. Hay varios tipos diferentes de ensamblajes de células 3D que se han empleado, pero los dos tipos más comunes son los esferoides y los organoides. Los esferoides se pueden cultivar a partir de muchas líneas celulares diferentes, y pueden adoptar varias formas y tamaños dependiendo del tipo de célula utilizada y su método de ensamblaje3. Además, los esferoides también pueden denominarse esferoides tumorales multicelulares (MCTS) cuando se cultivan a partir de líneas celulares de cáncer, y estos modelos han encontrado un uso particular para la administración preclínica de fármacos in vitro y estudios de toxicidad4,5. Los organoides, por otro lado, tienen como objetivo imitar mejor los tejidos y órganos de nuestro cuerpo y pueden adoptar disposiciones morfológicas más complejas. La producción de organoides implica el uso de células madre adultas o células madre pluripotentes, que pueden reprogramarse en las células apropiadas para parecerse al tejido u órgano de interés. Se utilizan principalmente para investigar el desarrollo de órganos y para modelar enfermedades e interacciones huésped-patógeno6.
Hay una gama de diferentes métodos utilizados para generar ensamblajes de células 3D. Los métodos basados en andamios proporcionan un sustrato o soporte al que las células pueden unirse o crecer dentro. Estos andamios pueden tener varias formas y pueden estar hechos de una variedad de materiales diferentes. Los más comunes son los componentes de la matriz extracelular (ECM) y los hidrogeles, y están diseñados para parecerse al entorno extracelular natural de las células y, por lo tanto, facilitar las interacciones fisiológicas4,7. El material del basamento de ECM se ha extraído del tumor de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm y se ha demostrado que contiene una rica mezcla de componentes de ECM, incluida la laminina, colágeno tipo IV y perlecan8. Sin embargo, a pesar de su ventajosa composición, su uso plantea dos retos principales, a saber, su variabilidad de lote a lote y que tiene dos estados agregados diferentes por debajo y por encima de 10 °C8,9. Por el contrario, los hidrogeles tienen la ventaja de ser flexibles con respecto a sus componentes y rigidez, y se pueden personalizar para adaptarse al conjunto específico de celdas 3D deseado7,10. Los métodos basados en andamios son esenciales para el crecimiento de organoides, pero también se usan ampliamente para los esferoides. Los métodos sin andamios, que funcionan evitando que las células se adhieran a la superficie en la que están creciendo, generalmente solo son compatibles con el ensamblaje de esferoides. Los ejemplos incluyen placas de fijación ultra baja (ULA), con fondo plano o fondo en U, que permiten la agregación de las células en esferoides, o el uso de agitación continua de las células en matraces giratorios / de rotación10.
El uso de ensamblajes de células 3D para estudiar una amplia variedad de eventos biológicos está ganando popularidad rápidamente; sin embargo, es esencial que el método elegido para su cultivo sea adecuado y compatible con los planes para su análisis posterior. Por ejemplo, el uso de placas ULA genera esferoides de alta consistencia; sin embargo, este método está restringido a la producción de un solo esferoide por pozo, lo que limita el rendimiento. Se necesita una consideración particular cuando se planifica la obtención de imágenes de fluorescencia de la estructura 3D. El sustrato o placa sobre la que se cultiva el conjunto debe ser ópticamente compatible, y se debe tener cuidado de minimizar los efectos de dispersión de la luz causados por cualquier andamio que se haya podido utilizar11. Este problema en particular se agudiza a medida que aumenta la apertura numérica de las lentes del objetivo del microscopio.
Podría decirse que una de las principales razones para seleccionar trabajar con un modelo de célula 3D es extraer datos de imágenes volumétricas no solo sobre todo el conjunto sino también sobre las células individuales dentro de él. Los modelos MCTS, en particular, están comenzando a ser muy poderosos para profundizar nuestra comprensión de cómo las terapias transitan desde el exterior a las células centrales (como lo necesitarían en un tumor)12, por lo que es esencial obtener conocimiento de células individuales en diferentes capas. La tecnología de imagen que extrae información cuantitativa de células individuales se denomina análisis de alto contenido (HCA) y es un enfoque poderoso en el contexto del cribado13. Hasta la fecha, el HCA se ha aplicado casi exclusivamente a cultivos monocapa, pero cada vez hay más conciencia de que este enfoque tiene el poder de aplicarse a cultivos 3D que permiten estudiar una amplia gama de funciones y procesos celulares14. Tendría la clara ventaja de que se podría analizar un gran número de ensamblajes 3D, lo que podría proporcionar datos a nivel de celda de cada estructura. Sin embargo, los desafíos asociados con la obtención de imágenes de ensamblajes de células potencialmente gruesas, así como los grandes conjuntos de datos generados, deben superarse.
En este artículo, se presenta un método robusto basado en andamios para la producción a gran escala de MCTS en un formato de 96 pocillos. El método facilita la producción de varios cientos de ensamblajes de células 3D en cada pozo. Se muestran ejemplos para tres tipos de células diferentes, que representan modelos de tumores sólidos del hígado, pulmón y colon. Los esferoides que se forman pueden ser de una variedad de tamaños, por lo que HCA se utiliza para seleccionar estructuras de un tamaño y / o morfología particular. Esta característica proporciona la ventaja adicional de que cualquier fenotipo observado se puede comparar entre esferoides de diferentes tamaños, pero todos tratados de la misma manera en el mismo pozo. Este enfoque es compatible con imágenes de alta resolución, proporcionando datos cuantitativos a nivel celular y subcelular de los mismos ensamblajes celulares. Este método de producción de esferoides tiene la ventaja adicional sobre los métodos que generan un solo esferoide por pozo, que el gran número de esferoides producidos en cada pozo potencialmente proporciona suficiente biomasa para otros análisis aguas abajo, como el perfil de transcriptoma y proteoma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivo celular
- Preparar medios
- Preparar medios de cultivo celular específicos dependiendo del tipo de línea celular. Asegúrese de que todos los medios para el mantenimiento celular contengan un 10% de suero bovino fetal (FBS).
NOTA: Diferentes líneas celulares utilizan diferentes medios. Las células de carcinoma de colon HT-29 (ATCC HTB-38) se cultivan en McCoys 5A + 10% FBS. Las células de carcinoma hepatocelular HepG2 (ATCC HB-8065) se cultivan en Medio Esencial Mínimo + 1% L-glutamina + 10% FBS. Las células de carcinoma broncoalveolar H358 (ATCC CRL-5807) se cultivan en medio RPMI 1640 + 1% L-glutamina + 10% FBS. Todos los medios que contienen L-glutamina y FBS se conocen como medios completos. Al enchapar las células para que crezcan como esferoides, se requiere un medio libre de rojo de fenol con 10% de FBS para evitar la coloración del material del basamento de ECM, que a su vez puede causar artefactos durante el proceso de imagen.
- Preparar medios de cultivo celular específicos dependiendo del tipo de línea celular. Asegúrese de que todos los medios para el mantenimiento celular contengan un 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Células de subcultivo
- Cuando las células sean aproximadamente 80% confluentes, lavar brevemente con 2 ml de tripsina-EDTA (0,25% (p/v) tripsina/0,53 mM EDTA). Aspire la tripsina-EDTA, agregue 3 ml de tripsina-EDTA fresca e incube durante 3-5 min a 37 °C.
- Cuando las células se desprenden de la placa de cultivo celular, agregue 7 ml de medio completo fresco.
- Pipetear 1 ml de suspensión celular en una nueva placa de cultivo celular de 10 cm y agregar 9 ml de medio completo fresco para dar una dilución de células de 1:10.
- Cultive las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Subcultivo de las células cada 3-5 días, dependiendo de la línea celular.
2. Generación de esferoides
- Recubrir placas de 96 pocillos con material de sótano ECM
- Descongele el material del sótano de ECM en hielo durante la noche.
- Diluya el material del basamento de ECM en un medio libre de suero sin rojo de fenol frío utilizando puntas preenfriadas mantenidas a -20 ° C.
NOTA: La concentración final de material del basamento de ECM depende de la línea celular utilizada. Para las células HT-29 y H358, use 4 mg·mL-1 de material de basamento ECM. Para las células HepG2, use 4 mg·mL-1 de material de basamento ECM de factor de crecimiento reducido. - Pipetear 15 μL del material del sótano de ECM/solución mediana en una placa de imagen de 96 pocillos.
NOTA: Para la producción de esferoides a gran escala, este paso se puede realizar tanto con una pipeta de 8 canales como con un cabezal de pipeteo de 96 canales, siempre que las puntas y el depósito que contienen el material del sótano de ECM estén refrigerados. - Centrifugar la placa durante 20 min a 91 x g a 4 °C.
- Incubar la placa durante no más de 30 min a 37 °C.
- Subcultivo y recuento de células
- Durante el período de incubación de la placa, incube las células con tripsina-EDTA y resuspónda en un medio completo que contenga 10% de FBS.
- Pipetear 10 μL de la suspensión celular en una cámara de conteo de hemocitómetros. Cuente el número de celdas en 4 cuadrantes de la cámara.
- Calcule el número de células dentro de la suspensión celular determinando el número medio de células dentro de los 4 cuadrantes.
NOTA: Las celdas también se pueden contar utilizando dispositivos automatizados de conteo de células. - Centrifugar las células a 135 x g durante 4 min a temperatura ambiente (RT).
- Una vez que las células están granuladas, aspirar el sobrenadante y resuspendir las células en un medio completo libre de fenol en rojo para obtener una concentración de 1 x 106 células por ml.
- Células de semillas en placas recubiertas de material del sótano de ECM
- Diluya las células en un medio completo libre de fenol en rojo.
NOTA: La densidad de las células sembradas depende de la línea celular utilizada. Para las células HT-29 y HepG2, se siembran 3 x 104 células por pozo; para las células H358, se siembran 4 x 104 células por pozo. - Sembrar las células en un volumen total de 35 μL por pozo. Asegúrese de agregarlos gota a gota en un movimiento circular.
NOTA: Para la producción de esferoides a gran escala, este paso se puede realizar con una pipeta de 8 canales, siempre que se pueda lograr el movimiento circular de pipeteo. - Incubar las células durante 1 h a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Prepare una solución de material de basamento de ECM en medio completo libre de rojo de fenol, lo que resulta en una concentración final de 2% de material de base de ECM en el pozo. Para lograr esto, agregue 1.2 μL de material de basamento de ECM a 23.8 μL de medio completo libre de rojo de fenol por pozo, lo que resulta en un volumen final de 60 μL por pozo.
- Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2.
- Al día siguiente, reemplace el medio con 100 μL de fenol fresco sin rojo medio completo.
- Reemplace el medio cada dos días con 100 μL de fenol fresco sin rojo medio completo.
- Diluya las células en un medio completo libre de fenol en rojo.
3. Tinción por inmunofluorescencia de esferoides
NOTA: Este protocolo está adaptado de Nürnberg et al., 202015. Estas adaptaciones se basan principalmente en el hecho de que los esferoides descritos en este protocolo son más pequeños que los utilizados en el trabajo de Nürnberg et al.15 y, como tales, facilitan tiempos de incubación más cortos. Por ejemplo, los tiempos de bloqueo se reducen de 2 h a 1 h. Además, como el protocolo está diseñado para la producción de esferoides de alto rendimiento, todos los pasos de procesamiento se llevan a cabo en el pozo en el que se cultivan los esferoides, lo que significa que no se requiere la transferencia de esferoides individuales a los tubos.
- Preparar todas las soluciones y tampones necesarios para la fijación y tinción
- Prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) agregando 1 tableta de PBS por 200 ml de agua. Autoclave el PBS.
- Preparar paraformaldehído (PFA) siguiendo los pasos 3.1.3-3.1.4.
- Use un agitador calentado para calentar 400 ml de PBS a 60-70 ° C en una campana de humos. Añadir 15 g de PFA mientras se agita. Una vez disuelto el PFA, añadir 50 μL de 1 M de CaCl2 y 50 μL de 1 M MgCl2.
- Agregue 100 ml de PBS para hacer un volumen final de 500 ml. Use NaOH para equilibrar el PFA a pH 7.4. Filtrar el PFA a través de filtros de vacío estériles (tamaño de poro 0,22 μm), alícuota, y almacenar a -20 °C.
- Prepare una solución madre de glicina de 1 M agregando 3.75 g de glicina a 50 ml de PBS. Conservar a 4 °C.
- Prepare 5 ml de tampón de permeabilización agregando 100 μL de Tritón X-100, 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y 1,5 ml de 1 M de glicina a 2,4 ml de PBS. Conservar a 4 °C durante no más de 2 semanas.
- Preparar 5 ml de tampón de bloqueo añadiendo 100 μL de Tritón X-100, 0,5 ml de DMSO y 0,05 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 4,9 ml de PBS. Alícuota el tampón de bloqueo en tubos de 1,5 ml y guárdelo a -20 °C.
- Prepare 5 ml de tampón de incubación de anticuerpos agregando 10 μL de polisorbato 20, 0.05 g de BSA y 250 μL de DMSO a 4.74 ml de PBS. Alícuota el tampón de incubación de anticuerpos en tubos de 1,5 ml y guárdelo a -20 °C.
NOTA: En el protocolo descrito aquí, los esferoides solo se ensamblan en los 60 pozos internos de una placa de 96 pocillos, aunque se pueden preparar en los 96 pozos de la placa. La razón para preparar solo esferoides en los 60 pozos internos es que algunas lentes de objetivo de alta apertura numérica no son capaces de ser físicamente capaces de obtener imágenes de todo el pozo de los pozos exteriores debido a la "falda" en algunos tipos de placas. Los volúmenes anteriores son suficientes para la preparación de 60 pocillos que contienen esferoides.
- Fijar y permeabilizar los esferoides
- Retire cuidadosamente el medio de los esferoides, asegurándose de que la capa de material del sótano de ECM no se altere.
- Lave los esferoides dos veces con 70 μL de PBS durante 3 minutos cada vez.
- Fijar los esferoides con 70 μL de PFA al 3% durante 1 h a 37 °C.
- Lave los esferoides dos veces con 70 μL de PBS durante 3 minutos cada vez.
- Apague con 70 μL de solución de glicina de 0,5 M durante 30 min a 37 °C.
- Permeabilizar los esferoides usando 70 μL del tampón de permeabilización durante 30 min a RT.
- Lave los esferoides dos veces con 70 μL de PBS durante 3 minutos cada vez.
- Incubar los esferoides en 70 μL de tampón de bloqueo durante 1 h a 37 °C.
NOTA: Una vez que se han fijado los esferoides, todos los pasos de procesamiento posteriores se pueden realizar utilizando una pipeta de 8 canales o un cabezal de pipeteo de 96 pocillos, si está disponible. Esto aumenta la velocidad de preparación de los esferoides antes de la obtención de imágenes.
- Esferoides inmunotintos con anticuerpos primarios y secundarios
- Diluya el anticuerpo primario a una dilución apropiada en el tampón de incubación de anticuerpos y agregue 70 μL a cada pocillo. Incubar los esferoides con el anticuerpo primario durante la noche.
NOTA: La dilución depende del anticuerpo específico utilizado. En el ejemplo que se muestra aquí, los lisosomas se inmunoteñen con anticuerpos anti-LAMP1 de ratón utilizando una dilución de 1:500. - Al día siguiente, lave los esferoides 5 veces con 70 μL de PBS durante 3 min cada vez.
- Diluir el anticuerpo secundario a una dilución de 1:500, la faloidina conjugada fluorescentemente a 1:500 y Hoechst 33342 (de un stock de 1 mg mL-1 ) a 1:5000 en el tampón de incubación de anticuerpos y agregar 70 μL a cada pocillo. Incubar durante la noche.
NOTA: La dilución de anticuerpos depende del anticuerpo específico utilizado. Se recomiendan anticuerpos secundarios altamente adsorbidos cruzados que muestren alta fotoestabilidad y alto brillo. - Al día siguiente, lave los esferoides 5 veces con 70 μL de PBS durante 3 min cada vez.
NOTA: Las placas se pueden almacenar hasta dos semanas en RT antes de la toma de imágenes, siempre y cuando los esferoides permanezcan cubiertos con PBS.
- Diluya el anticuerpo primario a una dilución apropiada en el tampón de incubación de anticuerpos y agregue 70 μL a cada pocillo. Incubar los esferoides con el anticuerpo primario durante la noche.
4. Adquisición de imágenes y análisis de esferoides
- Adquisición de imágenes
- Inserte la placa de 96 pocillos que contiene esferoides en un microscopio de detección confocal de alto contenido.
- Seleccione los láseres apropiados para excitar los fluoróforos utilizados.
- Adquiera los canales secuencialmente para evitar la diafonía.
- Imagen de los esferoides usando objetivos apropiados.
NOTA: Se recomienda el uso de objetivos de inmersión en agua si están disponibles. Por ejemplo, un objetivo 20x/1.0 NA puede obtener imágenes de un pozo entero en ~77 campos de visión. Un objetivo de 63x/1.15 NA puede obtener imágenes de un pozo completo en aproximadamente 826 campos de visión. - Imagen ~ 30-40 cortes, dependiendo de la profundidad del esferoide, con cada corte tomado a un intervalo de 1.5 μm del anterior.
- Análisis de imágenes
- Para el análisis morfológico de los esferoides, siga los pasos 4.2.2-4.2.6.
- Segmentar los esferoides en función de la tinción de faloidina conjugada fluorescentemente.
- Segmentar los núcleos en base a la tinción de Hoechst 33342.
- Segmentar el citoplasma de cada célula por la tinción residual de Hoechst 33342 que está presente en el citoplasma celular.
- Calcule las diferentes propiedades morfológicas de los esferoides, incluido el volumen, el área de superficie, la esfericidad y el número de núcleos por esferoide.
NOTA: Esta información se extrae utilizando varios algoritmos que están incorporados en el software de análisis de imágenes de su elección. - Procese las imágenes aún más para eliminar los esferoides menores de 75.000 μm3 y mayores de 900.000 μm3.
NOTA: Estos valores son sugerencias para permitir la eliminación de ensamblajes de celdas muy pequeñas y ensamblajes grandes que pueden haber surgido como resultado de la fusión de múltiples esferoides. Los esferoides también se pueden clasificar en diferentes clases de tamaño en este paso. - Para analizar células individuales dentro de los esferoides, siga los pasos 4.2.8-4.2.12.
- Segmentar los esferoides en función de la tinción de faloidina conjugada fluorescentemente.
- Segmentar los núcleos en base a la tinción de Hoechst 33342.
- Segmentar el citoplasma de cada célula por la tinción residual de Hoechst 33342 que está presente en el citoplasma celular.
- Segmentar los lisosomas en función de la tinción secundaria de anticuerpos.
- Calcule las diferentes propiedades morfológicas de las células dentro de cada esferoide, incluido el número de lisosomas por célula, el volumen celular y el área de superficie celular.
NOTA: Esta información se extrae utilizando varios algoritmos que están incorporados en el software de análisis de imágenes de su elección.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este protocolo, se detalla un método robusto para producir ensamblajes de cultivo celular 3D en forma de esferoides, utilizando diferentes tipos de células para representar varios tejidos tumorales. Este método permite la generación de cientos de esferoides por pozo, lo que permite realizar ensayos basados en células de manera de alto contenido (Figura 1). Este enfoque se ha utilizado previamente para estudiar la absorción de nanopartículas en los esferoides HT-2916 y la toxicidad inducida por nanopartículas en los esferoides HepG217. El método se basa en la producción de una distribución delgada y uniforme de material de andamio a través del fondo del pozo de una placa de calidad óptica. Las células se siembran en cada pozo, y se agrega más material de andamio, a una baja concentración, como una superposición en las células. Esto da como resultado una base que soporta el crecimiento uniforme de esferoides, lo que significa que se pueden cultivar varios cientos de esferoides en cada pozo de una placa de 96 pocillos. Se utiliza un objetivo de baja ampliación para generar una imagen general de toda la población (Figura 2). Las subregiones del pozo se pueden seleccionar y visualizar utilizando un objetivo de alta resolución, y en cada posición, se adquiere una pila confocal completa. Esto proporciona la información necesaria para el posterior análisis volumétrico de cada esferoide.
Los esferoides individuales pueden ser analizados por HCA, proporcionando así información sobre las propiedades morfológicas de los esferoides. Por lo general, el primer paso es identificar cada esferoide como un solo objeto. Para hacer esto, se selecciona un canal de fluorescencia que es probable que dé una tinción o distribución consistente en todo el esferoide. En el ejemplo que se muestra aquí, se utiliza la señal en el canal de faloidina conjugada fluorescentemente, ya que la actina se encuentra cerca de la membrana plasmática en todas las células de los diferentes tipos de esferoides (Figura 2 y Figura 3A). Como resultado de la generación de pilas confocales completas, todos los pasos de HCA se pueden llevar a cabo de manera volumétrica en lugar de rebanada por rebanada. Esto es importante ya que elimina cualquier sesgo asociado con el análisis de un pequeño número de planos seleccionados. Este enfoque volumétrico se aplica a los otros canales de la imagen. Los núcleos fueron detectados y segmentados en base a la tinción de Hoechst 33342, y este mismo canal puede ser utilizado para detectar el citoplasma celular, ya que hay residuos de Hoechst 33342 presentes en niveles bajos (Figura 3B). Si se necesita un análisis posterior de células individuales dentro del esferoide, los otros canales (por ejemplo, lisosomas inmunoteñidos con anticuerpos anti-LAMP1) también se pueden procesar de manera similar. El enfoque volumétrico permite visualizar todas las estructuras marcadas fluorescentemente desde todas las vistas (Figura 3C).
Habiendo identificado el esferoide como un objeto distinto, se pueden realizar varias mediciones morfológicas a nivel de esferoide. Estas mediciones incluyen el cálculo del número de núcleos por esferoide (Figura 4A), así como la esfericidad (Figura 4B), el volumen (Figura 4C) y el área de superficie (Figura 4D) del esferoide. Dependiendo del software HCA utilizado, también se pueden calcular otras características morfológicas como el área de sección transversal, el radio del disco interno y el radio de la esfera interna. En los ejemplos que se muestran aquí, los esferoides por debajo de 75,000 μm3 y por encima de 900,000 μm3 fueron descartados de las mediciones, pero estos parámetros pueden ser establecidos por el usuario, dependiendo de las propiedades esferoides deseadas para el análisis. Las hojas de cálculo fueron generadas por el software de análisis de imágenes e importadas a RStudio para su análisis. Se produjeron gráficos boxplot para mostrar las propiedades morfológicas de los diferentes tipos de esferoides (Figura 4). Estas tramas de caja revelan el nivel de heterogeneidad de los esferoides en la población, por lo que es importante cuantificar un gran número de esferoides en cualquier experimento. Esta es una ventaja clave sobre los métodos que generan un solo esferoide por pozo. Los tres tipos de esferoides aquí mostrados muestran un alto nivel de similitud con respecto a su volumen y área de superficie, aunque es notable que la esfericidad de los esferoides HepG2 es algo menor que la de los otros tipos aquí mostrados (Figura 4B).
La obtención de imágenes de esferoides con un objetivo de alta resolución, como el objetivo de inmersión en agua 63x utilizado aquí, permite lograr la resolución subcelular de células individuales dentro del esferoide. Los diferentes orgánulos se pueden segmentar en función de los anticuerpos utilizados. En el ejemplo que se muestra aquí, se identificaron lisosomas basados en inmunotinción utilizando anticuerpos anti-LAMP1, seguidos de la adición secundaria de anticuerpos (Figura 3C). La segmentación de cada orgánulo dentro de cada célula permite la cuantificación de las mediciones a nivel celular. Se muestra el volumen típico de cada célula en los tres tipos de esferoides (Figura 5A), así como el número de lisosomas por célula (Figura 5B). La necesidad de tal detalle subcelular está determinada por el ensayo en el que se utilizarán los esferoides.
Optimizar la densidad inicial de siembra celular al comienzo de la generación de esferoides es un paso crítico. Agregar demasiadas células aún permite la formación de esferoides; sin embargo, esto puede resultar en la fusión de esferoides (Figura 6). Esto conduce a la generación de ensamblajes de forma irregular, lo que a su vez puede ser altamente problemático para la identificación posterior de los esferoides. Cuando los esferoides se identifican incorrectamente como estructuras distintas, también puede haber problemas con el análisis de las células individuales. Como tal, la optimización cuidadosa de cada línea celular utilizada para la generación de esferoides, incluida la densidad de siembra celular y la duración del tiempo de crecimiento, son parámetros críticos para establecer.
Figura 1: Esquema que detalla el protocolo utilizado para generar esferoides para HCS y HCA. Las placas de 96 pocillos están recubiertas con una capa de material de basamento ECM, seguida de la siembra de células, que luego inician la formación de esferoides. El medio se reemplaza al día siguiente y cada dos días a partir de entonces. En preparación para la obtención de imágenes, los esferoides se fijan, se permeabilizan y se interhumanizan con anticuerpos específicos. Los esferoides se toman imágenes utilizando un microscopio HCS confocal. Gráfico creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de ejemplo de esferoides H358, HepG2 y HT-29. Imágenes confocales HCS totalmente automatizadas de (A) H358, (B) HepG2 y (C) esferoides HT-29. Los paneles muestran una visión general de un solo pozo, así como tres cortes confocales de ejemplo y la reconstrucción volumétrica de un esferoide de cada línea celular. Los núcleos teñidos con Hoechst 33342 se muestran en azul, la actina teñida con faloidina conjugada fluorescentemente en rojo y los lisosomas inmunoteñidos para LAMP1 en verde. Las imágenes de la visión general del pozo se adquirieron con un objetivo de inmersión en agua de 20x (NA 1.0). Las imágenes de esferoides individuales se adquirieron con un objetivo de inmersión en agua de 63x (NA 1.15). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de pasos clave en el análisis de imágenes. (A) Cada esferoide se identifica primero en modo volumétrico mediante la detección de la tinción de faloidina conjugada fluorescentemente. (B) Utilizando esta información como máscara, el citoplasma de cada célula está segmentado por la tinción residual de Hoechst 33342 que está presente en el citoplasma celular. Los núcleos están segmentados por la tinción Hoechst 33342. Los lisosomas se segmentan utilizando la inmunotinción de anticuerpos (anti-LAMP1). Se muestran vistas volumétricas. (C) Vistas de 3 planos del mismo esferoide. El ejemplo que se muestra es de un esferoide de células H358. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de inmersión en agua de 63x (NA 1.15) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplos de mediciones a nivel de esferoides. Todas las mediciones se realizaron utilizando una tubería de análisis de imágenes automatizada, y para tres tipos de esferoides, a saber, H358, HepG2 y HT-29, fotografiados con un objetivo 20x. Se muestran (A) el número medio de núcleos por esferoide, (B) la esfericidad esferoide, (C) el volumen esferoide y (D) el área de superficie esferoide. Todos los diagramas de caja muestran el valor medio y los cuartiles para cada tipo de esferoide. Los datos son de 3 pozos replicados; el número total de esferoides analizados fue de 1259 (H358), 1522 (HepG2) y 1326 (HT-29). Las imágenes se adquirieron con un objetivo de inmersión en agua de 20x (NA 1.0). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de mediciones a nivel celular a partir de esferoides. Todas las mediciones se realizaron utilizando una tubería de análisis de imágenes automatizada, y para tres tipos de esferoides, a saber, H358, HepG2 y HT-29, fotografiados con un objetivo 63x. Se muestran (A) volúmenes de células individuales, y (B) números medios de lisosomas por célula. El número total de células analizadas fueron 1410 (H358), 1625 (HepG2) y 1401 (HT-29), de 20 esferoides de cada línea celular. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de inmersión en agua de 63x (NA 1.15) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de ejemplo que muestran los efectos del sobrechapado de las células en la formación de esferoides. Se muestran imágenes de ejemplo para los esferoides H358, HepG2 y HT-29. Las flechas indican lugares donde es probable que los esferoides se hayan fusionado. Las imágenes se adquirieron con un objetivo de inmersión en agua de 20x (NA 1.0). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El enfoque descrito aquí detalla una plataforma para generar varios cientos de esferoides por pozo de una manera que sea adecuada para HCS y HCA. En comparación con otros métodos populares, como el uso de placas ULA de fondo plano y fondo redondo, que permiten la formación de un solo esferoide por pozo18,19, este método brinda la oportunidad de extraer información de alta resolución de un gran número de esferoides en un formato de detección. Cabe destacar que este método se ha demostrado en 3 líneas celulares diferentes, representando diversos tipos de tumores, destacando su amplia idoneidad para estudiar una gama de procesos celulares en diferentes modelos. Aunque los esferoides generados utilizando este método muestran cierta variabilidad en tamaño y forma, HCA puede clasificarlos fácilmente por tamaño (o cualquier otro parámetro de interés). Nuestro laboratorio ha utilizado con éxito este enfoque para estudiar la toxicidad inducida por nanopartículas en función del tamaño de los esferoides. Es importante destacar que todas las clases de esferoides de diferentes tamaños se pueden estudiar en el mismo pozo, lo que significa que todos fueron expuestos a tratamientos idénticos, dando resultados altamente robustos de una gran población de esferoides17. La metodología descrita aquí podría adaptarse fácilmente para su uso con otros tipos de células que representan diferentes tejidos. Además, estos esferoides podrían utilizarse para evaluar diferentes procesos biológicos14. Si los esferoides se generan con células que expresan de manera estable proteínas marcadas fluorescentemente, también es posible obtener imágenes de células vivas.
Un paso crítico en este protocolo es la producción de la capa de material del basamento ECM en la que se chapan las células. Cuando la capa es demasiado gruesa, puede formar un menisco20 que promueve el crecimiento de monocapas en el centro del pozo y esferoides solo en los bordes exteriores del pozo. Por lo tanto, es esencial que se elija la concentración y el volumen correctos del material del basamento ECM para permitir la formación uniforme de esferoides en todo el pozo; esto siempre depende de la línea celular. También es de destacar que el exceso de material del sótano de ECM puede causar problemas durante el proceso de inmunotinción, ya que no se disuelve fácilmente. Esto, a su vez, puede conducir a complicaciones durante la adquisición de imágenes cuando se utiliza un sistema de microscopio confocal HCS. Otra consideración es que diferentes líneas celulares pueden requerir diferentes formulaciones de ECM. Por ejemplo, los esferoides HepG2 requieren material de basamento ECM con una concentración reducida de factores de crecimiento, en comparación con la utilizada por los esferoides H358 y HT-29. El método de recubrimiento celular también es importante, ya que esto determina cómo se distribuyen las células en el pozo. Cuando se siembran demasiadas células o cuando están mal distribuidas, esto puede conducir a la fusión de esferoides (Figura 6). Otro desafío del uso de andamios ECM es que deben manipularse a bajas temperaturas (por debajo de 10 ° C), lo cual es particularmente problemático cuando se usa la automatización para HCS. Sin embargo, este problema fue resuelto recientemente por Eismann y sus colegas (2020), quienes emplearon la tecnología de microarrays para detectar gotas de 0.2 μL de material de sótano y celdas de ECM en portaobjetos con cámara. Este fue material suficiente para facilitar el crecimiento de pequeños esferoides21. Queda por demostrar si tal enfoque también funcionaría para enchapar grandes volúmenes de material de basamento de ECM en pozos de placas de múltiples pozos.
Un problema asociado con el análisis de modelos celulares 3D utilizando microscopía es la capacidad de extraer información de los planos centrales de estos ensamblajes. En este sentido, la permeabilización y el acceso a anticuerpos durante el proceso de inmunotinción pueden ser problemáticos. Sin embargo, el protocolo publicado por Nürnberg y sus colegas15 permite una inmunotinción altamente consistente de todo el esferoide. Utilizando ligeras modificaciones a este protocolo, esta técnica puede inmunotintar incluso pequeñas estructuras subcelulares (por ejemplo, lisosomas), con un alto grado de consistencia, independientemente de si las células son centrales o periféricas con respecto a la estructura esferoide general. Es importante que este paso se optimice cuidadosamente cuando se usan nuevos anticuerpos.
Otro paso crítico es el régimen de imágenes elegido. Es importante obtener imágenes del número apropiado de cortes z a través del esferoide, ya que esto determina el volumen de datos que deben analizarse y almacenarse. Por ejemplo, obtener imágenes de un número limitado de planos z en un intervalo demasiado grande puede resultar en una subestimación del tamaño y volumen total del esferoide. Por otro lado, capturar demasiados planos z puede dar lugar a problemas de análisis y almacenamiento de datos. Los conjuntos de datos muy grandes también requieren una potencia computacional más intensiva para su análisis, particularmente en modo volumétrico. El intervalo de muestreo óptimo en el plano z está dictado en gran medida por las características de la lente objetivo, pero para los ejemplos que se muestran aquí, se requieren aproximadamente 40 cortes confocales en un intervalo de 1,5 μm para facilitar la obtención de imágenes a través de toda la profundidad del esferoide.
Como se mencionó, para reducir el sesgo del análisis de planos seleccionados, se recomienda encarecidamente el uso de un enfoque de análisis de imágenes basado en volumetría. Esto permite no solo extraer información a nivel de esferoide, sino también datos a nivel de célula de cada esferoide individual. En última instancia, las tuberías de HCA deben diseñarse de tal manera que aborden la pregunta biológica específica que se plantea. Las salidas multiparamétricas permiten describir cuantitativamente fenotipos complejos. Se ha demostrado que esto funciona para ensamblajes de células 3D utilizando software HCA comercial16,17, así como software de libre acceso como CellProfiler22,23. Los métodos de análisis volumétrico tienen el potencial de aplicarse a otros tipos de modelos de células 3D, como organoides y explantes derivados de pacientes (PDE) ex vivo, que replican aún mejor las condiciones in vivo. Recientemente, se ha descrito una tubería de alto rendimiento para la producción de organoides cerebrales24. Esto implica generar organoides en una placa de 96 pocillos y posteriormente obtener imágenes de ellos utilizando un microscopio de detección de alto contenido24. Las PDE son altamente ventajosas en el sentido de que exhiben la histología original del tumor, proporcionando así un modelo celular que recapitula las condiciones in vivo, incluyendo características como el microambiente tumoral25. Estos modelos también pueden, en principio, ser inmunoteñidos, fotografiados y analizados utilizando el enfoque aquí descrito26,27.
En resumen, este protocolo describe un método accesible y robusto para la producción a gran escala de esferoides para aplicaciones de HCS y HCA. Su aplicabilidad se muestra con tres líneas celulares diferentes, produciendo esferoides que pueden ser fotografiados a alta resolución. Este protocolo también demuestra que el análisis volumétrico puede proporcionar información cuantitativa sobre la población de esferoides, así como a nivel unicelular y subcelular, lo que lo hace útil para una amplia variedad de ensayos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos asociados con este trabajo.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo de una subvención de investigación en infraestructura de Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) a JCS. El trabajo en el Laboratorio de Detección celular de UCD cuenta con el apoyo de la Facultad de Ciencias de UCD. ASC está financiado por una beca de posgrado del Gobierno de Irlanda del Consejo Irlandés de Investigación (IRC) (GOIPG/2019/68). Los autores también agradecen a todos los miembros del laboratorio por sus aportes y discusiones útiles. La obra de arte de la Figura 1 se generó en BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
