Summary
Detta protokoll beskriver en metod för produktion av tre olika typer av sfäroider på ett sätt som gör dem lämpliga för storskalig screening och analys med högt innehåll. Dessutom presenteras exempel som visar hur de kan analyseras på sfäroid- och individcellsnivåer.
Abstract
Höginnehållsscreening (HCS) och höginnehållsanalys (HCA) är tekniker som ger forskare möjlighet att extrahera storskaliga kvantitativa fenotypiska mätningar från celler. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara kraftfullt för att fördjupa vår förståelse av ett brett spektrum av både grundläggande och tillämpade händelser inom cellbiologi. Hittills har majoriteten av applikationerna för denna teknik förlitat sig på användningen av celler som odlas i monoskikt, även om det alltmer insers att sådana modeller inte rekapitulerar många av de interaktioner och processer som förekommer i vävnader. Som sådan har det skett en framväxt i utveckling och användning av 3-dimensionella (3D) cellenheter, såsom sfäroider och organoider. Även om dessa 3D-modeller är särskilt kraftfulla i samband med cancerbiologi och läkemedelsleveransstudier, utgör deras produktion och analys på ett reproducerbart sätt som lämpar sig för HCS och HCA ett antal utmaningar. Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för generering av multicellulära tumör sfäroider (MCTS), och visar att det kan tillämpas på tre olika cellinjer på ett sätt som är kompatibelt med HCS och HCA. Metoden underlättar produktionen av flera hundra sfäroider per brunn, vilket ger den specifika fördelen att när de används i ett screeningsystem kan data erhållas från flera hundra strukturer per brunn, alla behandlade på ett identiskt sätt. Exempel ges också, som beskriver hur man bearbetar sfäroiderna för högupplöst fluorescensavbildning och hur HCA kan extrahera kvantitativa funktioner både på sfäroidnivå och från enskilda celler inom varje sfäroid. Detta protokoll kan enkelt tillämpas för att svara på ett brett spektrum av viktiga frågor inom cellbiologi.
Introduction
Traditionellt har cellbaserade analyser utförts i monoskikt som växer på ett fast substrat, vilket effektivt kan betraktas som en tvådimensionell (2D) miljö. Det blir dock alltmer erkänt att 2D-cellkulturmodeller saknar fysiologisk relevans i vissa sammanhang och inte kan replikera många av de komplexa interaktioner som uppstår mellan celler1. Tredimensionella (3D) cellodlingsmetoder blir snabbt populära bland forskare, och 3D-cellmodeller visar hög potential att bättre efterlikna de fysiologiska förhållanden som celler i vävnadsmiljön möter2. Det finns flera olika typer av 3D-cellenheter som har använts, men de två vanligaste typerna är sfäroider och organoider. Sfäroider kan odlas från många olika cellinjer, och de kan anta olika former och storlekar beroende på vilken celltyp som används och deras monteringsmetod3. Dessutom kan sfäroider också kallas multicellulära tumörsfäroider (MCTS) när de odlas från cancer cellinjer, och dessa modeller har funnit särskild användning för preklinisk in vitro-läkemedelsleverans och toxicitetsstudier4,5. Organoider, å andra sidan, syftar till att bättre efterlikna vävnader och organ i vår kropp och kan anta mer komplexa morfologiska arrangemang. Produktionen av organoider innebär användning av vuxna stamceller eller pluripotenta stamceller, som kan omprogrammeras till lämpliga celler för att likna den vävnad eller det organ som är av intresse. De används främst för att undersöka utvecklingen av organ och för att modellera sjukdomar och värdpatogeninteraktioner6.
Det finns en rad olika metoder som används för att generera 3D-cellenheter. Ställningsbaserade metoder ger ett substrat eller stöd till vilket celler antingen kan fästas eller växa inuti. Dessa byggnadsställningar kan ha olika former och kan tillverkas av en mängd olika material. De vanligaste är extracellulära matriskomponenter (ECM) och hydrogeler, och de är utformade för att likna cellernas naturliga extracellulära miljö och därigenom underlätta fysiologiska interaktioner4,7. ECM källarmaterial har extraherats från Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom tumör och visat sig innehålla en rik blandning av ECM komponenter, inklusive laminin, typ IV kollagen och perlecan8. Trots dess fördelaktiga sammansättning finns det dock två huvudutmaningar med dess användning, nämligen dess variabilitet från parti till parti och att den har två olika aggregerade tillstånd under och över 10 °C8,9. Däremot har hydrogeler fördelen att de är flexibla med avseende på sina komponenter och styvhet, och de kan anpassas för att passa den specifika 3D-cellenheten som önskas7,10. Ställningsbaserade metoder är viktiga för organoid tillväxt men används också i stor utsträckning för sfäroider. Ställningsfria metoder, som fungerar genom att förhindra att celler fästs på ytan de växer på, är vanligtvis endast kompatibla med sfäroidmontering. Exempel är ultralåga ULA-plattor(ULA), med antingen en platt botten eller U-botten, som möjliggör aggregering av cellerna i sfäroider, eller användning av kontinuerlig omrörning av cellerna i spinner/rotationskolvar10.
Användningen av 3D-cellenheter för att studera en mängd olika biologiska händelser blir snabbt populär; Det är dock viktigt att den metod som valts för deras kultur är lämplig och förenlig med planerna för deras nedströmsanalys. Till exempel genererar användningen av ULA-plattor sfäroider med hög konsistens; Denna metod är dock begränsad till produktion av en enda sfäroid per brunn, vilket begränsar genomströmningen. Särskild hänsyn behövs när fluorescensavbildning av 3D-strukturen planeras. Det substrat eller den platta på vilken monteringen odlas måste vara optiskt kompatibel, och försiktighet måste vidtas för att minimera effekterna av ljusspridning orsakad av eventuella byggnadsställningar som kan ha använts11. Detta speciella problem blir mer akut när mikroskopmållinsernas numeriska bländare ökar.
Förmodligen är en av de främsta anledningarna till att välja att arbeta med en 3D-cellmodell att extrahera volymetriska bilddata om inte bara hela enheten utan också de enskilda cellerna i den. MCTS-modeller, i synnerhet, börjar visa sig vara mycket kraftfulla för att fördjupa vår förståelse för hur terapeutiska transitering från utsidan till centrala celler (som de skulle behöva i en tumör)12, och därför är det viktigt att få kunskap från enskilda celler vid olika lager. Den bildteknik som extraherar kvantitativ information från enskilda celler kallas höginnehållsanalys (HCA) och är ett kraftfullt tillvägagångssätt i samband med screening13. Hittills har HCA nästan uteslutande tillämpats på monolayerkulturer, men det finns en ökande insikt om att detta tillvägagångssätt har kraften att tillämpas på 3D-kulturer som gör det möjligt att studera ett brett spektrum av cellulära funktioner och processer14. Det skulle ha den tydliga fördelen att ett stort antal 3D-sammansättningar kunde analyseras, vilket potentiellt ger data på cellnivå från alla strukturer. Utmaningar i samband med avbildning av potentiellt tjocka cellenheter, liksom de stora datamängder som genereras, måste dock övervinnas.
I den här artikeln presenteras en robust ställningsbaserad metod för storskalig produktion av MCTS i ett 96-välformat. Metoden underlättar produktionen av flera hundra 3D-cellenheter i varje brunn. Exempel visas för tre olika celltyper, som representerar solida tumörmodeller av lever, lunga och kolon. Sfäroiderna som bildas kan vara av olika storlekar, så HCA används för att välja strukturer av en viss storlek och / eller morfologi. Denna funktion ger den extra fördelen att alla fenotyper som observeras kan jämföras över sfäroider av olika storlekar, men alla behandlas på samma sätt i samma brunn. Detta tillvägagångssätt är kompatibelt med högupplöst avbildning, vilket i huvudsak ger både kvantitativa data på cellnivå och subcellulär nivå från samma cellulära sammansättningar. Denna metod för sfäroid produktion har den extra fördelen jämfört med metoder som genererar en enda sfäroid per brunn, att det stora antalet sfäroider som produceras i varje brunn potentiellt ger tillräcklig biomassa för andra nedströmsanalyser, såsom transkriptom och proteomprofilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur
- Förbereda media
- Förbered specifika cellodlingsmedier beroende på typen av cellinje. Se till att alla medier för cellunderhåll innehåller 10% fosterbovinserum (FBS).
OLIKA cellinjer använder olika medier. HT-29 kolon carcinom celler (ATCC HTB-38) odlas i McCoys 5A + 10% FBS. HepG2 hepatocellulära carcinomceller (ATCC HB-8065) odlas i Minimum Essential Medium + 1% L-glutamin + 10% FBS. H358 bronchoalveolar carcinom celler (ATCC CRL-5807) odlas i RPMI 1640 medium + 1% L-glutamin + 10% FBS. Alla medier som innehåller L-glutamin och FBS kallas komplett media. Vid plätering av celler för att växa som sfäroider krävs ett fenolrött medium med 10% FBS för att undvika färgning av ECM-källarmaterialet, vilket i sin tur kan orsaka artefakter under avbildningsprocessen.
- Förbered specifika cellodlingsmedier beroende på typen av cellinje. Se till att alla medier för cellunderhåll innehåller 10% fosterbovinserum (FBS).
- Subkulturceller
- När cellerna är cirka 80% sammanflöde, tvätta kort med 2 ml trypsin-EDTA (0,25% (w/v) trypsin/0,53 mM EDTA). Aspirera trypsin-EDTA, tillsätt 3 ml färsk trypsin-EDTA och inkubera i 3-5 min vid 37 °C.
- När celler lossnar från cellodlingsformen, tillsätt 7 ml färskt komplett medium.
- Pipettera 1 ml cellfjädring i en ny 10 cm cellodlingsskål och tillsätt 9 ml färskt komplett medium för att ge en 1:10 utspädning av celler.
- Odla cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5% CO2.
- Subkulturera cellerna var 3-5 dag, beroende på cellinjen.
2. Generering av sfäroider
- Täck 96-brunnsplattor med ECM-källarmaterial
- Tina ECM källarmaterial på is över natten.
- Späd ECM källarmaterial i kallt fenolrött serumfritt medium med förkylda spetsar som hålls vid -20 °C.
OBS: Den slutliga koncentrationen av ECM-källarmaterial beror på vilken cellinje som används. För HT-29- och H358-celler, använd 4 mg·mL-1 ECM källarmaterial. För HepG2 celler, använd 4 mg·mL-1 av minskad tillväxtfaktor ECM källare material. - Pipett 15 μL ecm källarmaterial/mediumlösning till en 96-väl bildplatta.
OBS: För storskalig sfäroidproduktion kan detta steg utföras med både en 8-kanals pipett och ett 96-kanals pipetterhuvud, så länge spetsarna och behållaren som innehåller ECM-källarmaterialet kyls. - Centrifugera plattan i 20 min vid 91 x g vid 4 °C.
- Inkubera plattan i högst 30 min vid 37 °C.
- Subkultur- och räkningsceller
- Under plattinkubationsperioden, inkubera cellerna med trypsin-EDTA och återanvända dem i ett komplett medium som innehåller 10% FBS.
- Pipett 10 μL av cellupphängningen i en hemocytometerräkningskammare. Räkna antalet celler i 4 kvadranter i kammaren.
- Beräkna antalet celler i cellavstängningen genom att bestämma medelvärdet av antalet celler i de 4 kvadranterna.
Celler kan också räknas med hjälp av automatiserade cellräkningsenheter. - Centrifugera cellerna vid 135 x g i 4 min vid rumstemperatur (RT).
- När cellerna har pelleterat, aspirera supernatanten och resuspend cellerna i ett fenol rödfritt komplett medium för att få en koncentration av 1 x 106 celler per ml.
- Fröceller i ECM källare materialbelagda plattor
- Späd cellerna i ett fenolrött komplett medium.
OBS: Densiteten hos sådda celler beror på vilken cellinje som används. För HT-29- och HepG2-celler sås 3 x 104 celler per brunn; För H358-celler sås 4 x 104 celler per brunn. - Så cellerna i en total volym på 35 μL per brunn. Se till att lägga till dem droppvis i en cirkulär rörelse.
OBS: För storskalig sfäroidproduktion kan detta steg utföras med en 8-kanals pipett, så länge pipetteringscirkelrörelsen kan uppnås. - Inkubera cellerna i 1 h vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5% CO2.
- Förbered en lösning av ECM källarmaterial i fenolrödfritt komplett medium, vilket resulterar i en slutlig koncentration av 2% ECM källarmaterial i brunnen. För att uppnå detta, tillsätt 1,2 μL ECM-källarmaterial till 23,8 μL fenolrött komplett medium per brunn, vilket resulterar i en slutlig volym på 60 μL per brunn.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5% CO2.
- Följande dag, ersätt mediet med 100 μL färsk fenolrödfritt komplett medium.
- Byt ut mediet varannan dag med 100 μL färsk fenolrödfritt komplett medium.
- Späd cellerna i ett fenolrött komplett medium.
3. Immunofluorescensfärgning av sfäroider
OBS: Detta protokoll är anpassat från Nürnberg et al., 202015. Dessa anpassningar är främst baserade på det faktum att de sfäroider som beskrivs i detta protokoll är mindre än de som används i Nürnberg et al. arbete15 och därmed underlättar kortare inkubationstider. Till exempel reduceras blockeringstiderna från 2 h till 1 h. Dessutom, eftersom protokollet är utformat för hög genomströmningsproduktion av sfäroider, utförs alla bearbetningssteg i den brunn där sfäroiderna odlas, vilket innebär att överföring av enskilda sfäroider till rör inte krävs.
- Förbered alla lösningar och buffertar som krävs för fixering och färgning
- Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att tillsätta 1 PBS-tablett per 200 ml vatten. Autoklava PBS.
- Förbered paraformaldehyd (PFA) enligt steg 3.1.3-3.1.4.
- Använd en uppvärmd omrörare för att värma 400 ml PBS till 60-70 °C i en rökhuv. Tillsätt 15 g PFA under omrörning. När PFA har upplösts tillsätt 50 μL av 1 M CaCl2 och 50 μL av 1 M MgCl2.
- Lägg till 100 ml PBS för att göra en slutlig volym på 500 ml. Använd NaOH för att balansera PFA till pH 7.4. Filtrera PFA genom sterila vakuumfilter (porstorlek 0,22 μm), alikvot och förvara vid -20 °C.
- Förbered en 1 M glycinbuljonglösning genom att tillsätta 3,75 g glycin till 50 ml PBS. Förvara vid 4 °C.
- Förbered 5 ml permeabiliseringsbuffert genom att tillsätta 100 μL Triton X-100, 1 ml dimetylsulfoxid (DMSO) och 1,5 ml 1 M glycin till 2,4 ml PBS. Förvara vid 4 °C i högst 2 veckor.
- Förbered 5 ml blockeringsbuffert genom att tillsätta 100 μL Triton X-100, 0,5 ml DMSO och 0,05 g bovint serumalbumin (BSA) till 4,9 ml PBS. Aliquot blockeringsbufferten i 1,5 ml rör och förvara vid -20 °C.
- Förbered 5 ml antikroppskubationsbuffert genom att tillsätta 10 μL polysorbat 20, 0,05 g BSA och 250 μL DMSO till 4,74 ml PBS. Aliquot antikropp inkubationsbufferten i 1,5 ml rör och lagra den vid -20 °C.
OBS: I protokollet som beskrivs här monteras sfäroider endast i de inre 60 brunnarna på en 96-brunnsplatta, även om de kan förberedas i alla 96 brunnar på plattan. Anledningen till att endast förbereda sfäroider i de inre 60 brunnarna är att vissa höga numeriska bländarmållinser inte fysiskt kan avbilda hela brunnen i de yttre brunnarna på grund av "kjolen" på vissa platttyper. Ovanstående volymer är tillräckliga för beredning av 60 brunnar som innehåller sfäroider.
- Fixa och permeabilisera sfäroiderna
- Ta försiktigt bort mediet från sfäroiderna, se till att ECM-källarmaterialets lager inte störs.
- Tvätta sfäroiderna två gånger med 70 μL PBS i 3 minuter varje gång.
- Fixera sfäroiderna med 70 μL 3% PFA för 1 h vid 37 °C.
- Tvätta sfäroiderna två gånger med 70 μL PBS i 3 minuter varje gång.
- Släck med 70 μL 0,5 M glycinlösning i 30 min vid 37 °C.
- Permeabilisera sfäroiderna med hjälp av 70 μL av permeabiliseringsbufferten i 30 min vid RT.
- Tvätta sfäroiderna två gånger med 70 μL PBS i 3 minuter varje gång.
- Inkubera sfäroiderna i 70 μL blockeringsbuffert i 1 h vid 37 °C.
OBS: När sfäroiderna har fixats kan alla efterföljande bearbetningssteg utföras med en 8-kanals pipett eller ett 96-brunnsrörshuvud, om tillgängligt. Detta ökar hastigheten på sfäroidpreparat före avbildning.
- Immunostain sfäroider med primära och sekundära antikroppar
- Späd ut den primära antikroppen till en lämplig utspädning i antikroppsinkubationsbufferten och tillsätt 70 μL till varje brunn. Inkubera sfäroiderna med den primära antikroppen över natten.
OBS: Utspädningen beror på vilken specifik antikropp som används. I exemplet som visas här immunostained lysosomer med mus anti-LAMP1 antikroppar med en utspädning av 1:500. - Följande dag, tvätta sfäroiderna 5 gånger med 70 μL PBS i 3 min varje gång.
- Späd ut den sekundära antikroppen vid en utspädning av 1:500, fluorescerande konjugerat falloidin vid 1:500 och Hoechst 33342 (från ett 1 mg ml-1 lager ) vid 1:5000 i antikroppsinkubationsbufferten och tillsätt 70 μL till varje brunn. Inkubera över natten.
OBS: Antikroppsutspädningen beror på vilken specifik antikropp som används. Mycket kors-adsorberade sekundära antikroppar som visar hög fotostabilitet och hög ljusstyrka rekommenderas. - Följande dag, tvätta sfäroiderna 5 gånger med 70 μL PBS i 3 min varje gång.
OBS: Plattor kan förvaras i upp till två veckor vid RT före avbildning, så länge sfäroiderna förblir täckta med PBS.
- Späd ut den primära antikroppen till en lämplig utspädning i antikroppsinkubationsbufferten och tillsätt 70 μL till varje brunn. Inkubera sfäroiderna med den primära antikroppen över natten.
4. Bildförvärv och analys av sfäroider
- Bildförvärv
- Sätt in 96-brunnsplattan som innehåller sfäroider i ett konfokalt screeningmikroskop med hög halt.
- Välj lämpliga lasrar för att excitera de fluoroforer som används.
- Skaffa kanalerna sekventiellt för att undvika korsprat.
- Avbilda sfäroiderna med lämpliga mål.
OBS: Användning av vattensänkningsmål rekommenderas om det finns tillgängligt. Ett 20x/1.0 NA-mål kan till exempel avbilda en hel brunn i ~77 synfält. Ett 63x/1.15 NA-mål kan avbilda en hel brunn i cirka 826 synfält. - Bild ~30-40 skivor, beroende på sfäroidens djup, där varje segment tas med ett intervall på 1,5 μm från föregående.
- Bildanalys
- För morfologisk analys av sfäroider, följ steg 4.2.2-4.2.6.
- Segmentera sfäroiderna baserat på den fluorescerande konjugerade phalloidinfärgningen.
- Segmentera kärnorna baserat på Hoechst 33342 färgning.
- Segmentera cytoplasmans cytoplasma i varje cell med den kvarvarande Hoechst 33342-fläcken som finns i cellens cytoplasma.
- Beräkna olika morfologiska egenskaper hos sfäroiderna, inklusive volym, yta, sfäricitet och antalet kärnor per sfäroid.
OBS: Denna information extraheras med hjälp av olika algoritmer som är inbyggda i den valfria bildanalysprogramvaran. - Bearbeta bilder ytterligare för att ta bort sfäroider mindre än 75 000 μm3 och större än 900 000 μm3.
OBS: Dessa värden är förslag för att tillåta borttagning av mycket små cellenheter och stora sammansättningar som kan ha uppstått som ett resultat av fusion av flera sfäroider. Sfäroider kan också kategoriseras i olika storleksklasser i det här steget. - För att analysera enstaka celler inom sfäroider, följ steg 4.2.8-4.2.12.
- Segmentera sfäroiderna baserat på den fluorescerande konjugerade phalloidinfärgningen.
- Segmentera kärnorna baserat på Hoechst 33342 färgning.
- Segmentera cytoplasmans cytoplasma i varje cell med den kvarvarande Hoechst 33342-fläcken som finns i cellens cytoplasma.
- Segmentera lysosomerna baserat på den sekundära antikroppsfärgningen.
- Beräkna olika morfologiska egenskaper hos cellerna inom varje sfäroid, inklusive antalet lysosomer per cell, cellvolym och cellyta.
OBS: Denna information extraheras med hjälp av olika algoritmer som är inbyggda i den valfria bildanalysprogramvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll beskrivs en robust metod för att producera 3D-cellodlingssammankomster i form av sfäroider, med hjälp av olika celltyper för att representera olika tumörvävnader. Denna metod möjliggör generering av hundratals sfäroider per brunn, vilket gör det möjligt att utföra cellbaserade analyser på ett sätt med högt innehåll (figur 1). Detta tillvägagångssätt har tidigare använts för att studera nanopartiklar upptag i HT-29 sfäroider16 och nanopartikel-inducerad toxicitet i HepG2 sfäroider17. Metoden bygger på att producera en tunn och jämn fördelning av byggnadsställningsmaterial över brunnsbotten på en optisk kvalitetsplatta. Celler sås in i varje brunn, och ytterligare byggnadsställningsmaterial, vid låg koncentration, tillsätts som ett överlägg på cellerna. Detta resulterar i en bas som stöder jämn tillväxt av sfäroider, vilket innebär att flera hundra sfäroider kan odlas i varje brunn på en 96-brunnsplatta. Ett mål med låg förstoring används för att skapa en översiktsbild av hela populationen (figur 2). Underregioner av brunnen kan sedan väljas och avbildas med hjälp av ett högupplöst mål, och i varje position förvärvas en komplett konfokal stack. Detta ger nödvändig information för efterföljande volymetrisk analys av varje sfäroid.
De enskilda sfäroiderna kan sedan analyseras av HCA, vilket ger information om sfäroidernas morfologiska egenskaper. Vanligtvis är det första steget att identifiera varje sfäroid som ett enda objekt. För att göra detta väljs en fluorescenskanal som sannolikt kommer att ge konsekvent färgning eller distribution i hela sfäroiden. I exemplet som visas här används signalen i den fluorescerande konjugerade falloidinkanalen, eftersom aktin finns nära plasmamembranet i alla celler i de olika sfäroidtyperna (figur 2 och figur 3A). Som ett resultat av att kompletta konfokala staplar genereras kan alla HCA-steg utföras på ett volymetriskt sätt snarare än på segment för segment. Detta är viktigt eftersom det tar bort alla fördomar som är förknippade med analysen av ett litet antal valda plan. Den här volymetriska metoden tillämpas sedan på de andra kanalerna i bilden. Atomkärnorna upptäcktes och segmenterades baserat på Hoechst 33342 färgning, och samma kanal kan användas för att upptäcka cellen cytoplasma, eftersom det finns kvarvarande Hoechst 33342 närvarande på låga nivåer (figur 3B). Om nedströmsanalys av enskilda celler inom sfäroiden behövs kan de andra kanalerna (till exempel lysosomer immunstained med anti-LAMP1-antikroppar) också bearbetas på ett liknande sätt. Den volymetriska metoden gör det möjligt att visualisera alla fluorescerande märkta strukturer från alla vyer (figur 3C).
Efter att ha identifierat sfäroiden som ett distinkt objekt kan olika morfologiska mätningar på sfäroidnivå göras. Dessa mätningar omfattar beräkning av antalet kärnor per sfäroid (figur 4A), liksom sfäriciteten (figur 4B), volymen (figur 4C) och ytan (figur 4D) i sfäroiden. Beroende på vilken HCA-programvara som används kan andra morfologiska funktioner som tvärsnittsområde, inre diskradie och inre sfärradie också beräknas. I exemplen som visas här kasserades sfäroider under 75 000 μm3 och över 900 000 μm3 från mätningarna, men dessa parametrar kan ställas in av användaren, beroende på önskade sfäroidegenskaper för analys. Kalkylblad genererades av bildanalysprogramvaran och importerades till RStudio för analys. Boxplot grafer producerades för att visa de morfologiska egenskaperna hos de olika typerna av sfäroider (figur 4). Dessa boxplots avslöjar nivån av sfäroid heterogenitet i befolkningen, varför det är viktigt att kvantifiera ett stort antal sfäroider i ett enda experiment. Detta är en viktig fördel jämfört med metoder som genererar en enda sfäroid per brunn. De tre sfäroidtyperna som visas här visar en hög nivå av likhet med avseende på deras volym och yta, även om det är anmärkningsvärt att sfäriciteten hos HepG2-sfäroider är något lägre än för de andra typerna som visas här (figur 4B).
Imaging sfäroider med ett högupplöst mål, såsom 63x vatten nedsänkning mål som används här, gör det möjligt att subcellulär upplösning av enskilda celler inom sfäroiden uppnås. De olika organellerna kan segmenteras beroende på vilka antikroppar som används. I exemplet som visas här identifierades lysosomer baserade på immunstainering med anti-LAMP1-antikroppar, följt av sekundär antikroppstillskott (figur 3C). Segmenteringen av varje organell i varje cell möjliggör sedan kvantifiering av cellnivåmätningar. Den typiska volymen för varje cell i de tre sfäroidtyperna (figur 5A) samt antalet lysosomer per cell (bild 5B) visas. Behovet av sådana subcellulära detaljer bestäms av den analys där sfäroiderna kommer att användas.
Att optimera den ursprungliga cellsåddtätheten i början av sfäroidgenereringen är ett kritiskt steg. Att lägga till för många celler tillåter fortfarande sfäroidbildning; Detta kan dock leda till fusion av sfäroider (figur 6). Detta leder till generering av oregelbundet formade sammansättningar, vilket i sin tur kan vara mycket problematiskt för nedströmsidentifiering av sfäroiderna. När sfäroider felaktigt identifieras som distinkta strukturer kan det också finnas problem med analysen av de enskilda cellerna. Därför är noggrann optimering av varje cellinje som används för sfäroidgenereringen, inklusive cellsåddtätheten och tillväxttidens längd, kritiska parametrar att fastställa.
Figur 1: Schematiska detaljer om det protokoll som används för att generera sfäroider för HCS och HCA. 96-brunnsplattor är belagda med ett lager ecm-källarmaterial, följt av sådd av celler, som sedan initierar sfäroidbildning. Medium byts ut följande dag och varannan dag därefter. Som förberedelse för avbildning är sfäroider fasta, permeabiliserade och immunstained med specifika antikroppar. Sfäroider avbildas sedan med hjälp av ett konfokalt HCS-mikroskop. Grafik skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Exempelbilder av sfäroider av H358, HepG2 och HT-29. Helautomatisk HCS konfokal avbildning av (A) H358, (B) HepG2 och (C) HT-29 sfäroider. Paneler visar en enda välöversikt, samt tre exempel på konfokala segment och den volymetriska rekonstruktionen av en sfäroid från varje cellinje. Kärnor färgade med Hoechst 33342 visas i blått, aktin färgat med fluorescerande konjugerat falloidin i rött och lysosomer immunstained för LAMP1 i grönt. Bilder av brunnsöversikten förvärvades med ett 20x vattensänkningsmål (NA 1.0). Bilder av enskilda sfäroider förvärvades med ett 63x vatten nedsänkning mål (NA 1.15). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Exempel på viktiga steg i bildanalysen. A) Varje sfäroid identifieras först i volymetriskt läge genom påvisande av den fluorescerande konjugerade phalloidinfärgningen. (B) Med hjälp av denna information som mask segmenteras cytoplasmans cytoplasma i varje cell av den kvarvarande Hoechst 33342-fläcken som finns i cellcytoplasma. Kärnorna är segmenterade av Hoechst 33342 fläcken. Lysosomerna segmenteras med hjälp av antikroppen (anti-LAMP1) immunstaining. Volymetriska vyer visas. C) 3-planvyer av samma sfäroid. Exemplet som visas är en H358-cellsferoid. Bilder förvärvades med ett 63x vattensänkningsmål (NA 1.15) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Exempel på mätningar på sfäroidnivå. Alla mätningar gjordes med hjälp av en automatiserad bildanalyspipeline, och för tre typer av sfäroider, nämligen H358, HepG2 och HT-29, avbildade med ett 20x-mål. Visas (A) medelvärdet av kärnor per sfäroid, (B) sfäroid sfäricitet, C) sfäroid volym och (D) sfäroid yta. Alla boxplots visar medianvärdet och kvartiilerna för varje sfäroidtyp. Data kommer från 3 replikera brunnar; det totala antalet analyserade sfäroider var 1259 (H358), 1522 (HepG2) och 1326 (HT-29). Bilder förvärvades med ett 20x vatten nedsänkningsmål (NA 1.0). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Exempel på mätningar på cellnivå från sfäroider. Alla mätningar gjordes med hjälp av en automatiserad bildanalys pipeline, och för tre typer av sfäroider, nämligen H358, HepG2 och HT-29, avbildade med ett 63x mål. Visas är (A) volymer av enskilda celler och (B) medelvärdet av lysosomer per cell. Det totala antalet analyserade celler var 1410 (H358), 1625 (HepG2) och 1401 (HT-29), från 20 sfäroider av varje cellinje. Bilder förvärvades med ett 63x vattensänkningsmål (NA 1.15) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Exempelbilder som visar effekter av överplätering av celler på sfäroidbildning. Exempelbilder visas för sfäroider av H358, HepG2 och HT-29. Pilar anger platser där sfäroider troligen har smält samman. Bilder förvärvades med ett 20x vatten nedsänkningsmål (NA 1.0). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs här beskriver en plattform för att generera flera hundra sfäroider per brunn på ett sätt som är lämpligt för HCS och HCA. I jämförelse med andra populära metoder, såsom användning av plattbottnade och rundbottnade ULA-plattor, som tillåter bildandet av endast en sfäroid per brunn18,19, ger denna metod möjlighet för högupplöst information att extraheras från ett stort antal sfäroider i ett screeningformat. Denna metod har visats i 3 olika cellinjer, som representerar olika tumörtyper, vilket belyser dess breda lämplighet att studera en rad cellulära processer i olika modeller. Även om de sfäroider som genereras med den här metoden visar viss variation i storlek och form, kan HCA enkelt klassificera dem efter storlek (eller andra parametrar av intresse). Vårt labb har framgångsrikt använt detta tillvägagångssätt för att studera nanopartikelinducerad toxicitet som en funktion av sfäroid storlek. Viktigt är att alla olika storleksklasser av sfäroider kan studeras i samma brunn, vilket innebär att alla utsattes för identiska behandlingar, vilket ger mycket robusta utgångar från en stor sfäroidpopulation17. Metoden som beskrivs här kan enkelt anpassas för användning med andra celltyper som representerar olika vävnader. Dessutom skulle sådana sfäroider kunna användas för att bedöma olika biologiska processer14. Om sfäroiderna genereras med celler som stabilt uttrycker fluorescerande märkta proteiner är levande cellavbildning också möjlig.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är produktionen av ECM-källarmaterialets skikt på vilket cellerna är pläterade. När skiktet är för tjockt kan det bilda en menisk20 som främjar tillväxten av monolayers i mitten av brunnen och sfäroider endast vid brunnens yttre kanter. Därför är det viktigt att rätt koncentration och volym av ECM-källarmaterialet väljs för att möjliggöra enhetlig sfäroidbildning i hela brunnen; Detta är alltid celllinjeberoende. Observera också att överskott av ECM-källarmaterial kan orsaka problem under immunupptaineringsprocessen, eftersom det inte är lätt att lösas upp. Detta kan i sin tur leda till komplikationer vid bildförvärv vid användning av ett HCS-konfokalt mikroskopsystem. En annan faktor är att olika cellinjer kan kräva olika ECM-formuleringar. HepG2-sfäroider kräver till exempel ECM-källarmaterial med minskad koncentration av tillväxtfaktorer, jämfört med den som används av H358 och HT-29 sfäroider. Metoden för cellplätering är också viktig, eftersom det bestämmer hur cellerna fördelas i brunnen. När antingen för många celler sås eller när de är dåligt fördelade kan detta leda till sfäroidfusion (figur 6). En annan utmaning med att använda ECM-ställningar är att de måste hanteras vid låga temperaturer (under 10 °C), vilket är särskilt problematiskt vid användning av automatisering för HCS. Detta problem löstes dock nyligen av Eismann och kollegor (2020), som använde mikroarrayteknik för att upptäcka 0,2 μL droppar ECM-källarmaterial och celler i kammade diabilder. Detta var tillräckligt med material för att underlätta tillväxten av små sfäroider21. Huruvida ett sådant tillvägagångssätt också skulle fungera för att plätera större volymer ecm-källarmaterial i brunnar av flerbrunnplattor återstår att visa.
Ett problem i samband med analys av 3D-cellmodeller med mikroskopi är förmågan att extrahera information från de centrala planen i dessa enheter. I detta avseende kan permeabilisering och antikroppsåtkomst under immunupptaineringsprocessen vara problematisk. Protokollet som publicerats av Nürnberg och kollegor15 möjliggör dock mycket konsekvent immunstaining av hela sfäroiden. Med hjälp av små modifieringar av detta protokoll kan denna teknik immunstain även små subcellulära strukturer (till exempel lysosomer), med en hög grad av konsistens, oavsett om cellerna är centrala eller perifera med avseende på den övergripande sfäroidstrukturen. Det är viktigt att detta steg optimeras noggrant vid användning av nya antikroppar.
Ett annat kritiskt steg är den valda bildbehandlingsregimen. Att avbilda lämpligt antal z-segment genom sfäroiden är viktigt, eftersom detta bestämmer mängden data som behöver analyseras och lagras. Om du till exempel avbildning av ett begränsat antal z-plan med för stort intervall kan resultera i en underskattning av den totala sfäroidstorleken och volymen. Å andra sidan kan det leda till dataanalys och lagringsproblem om du fångar för många z-plan. Mycket stora data uppsättningar kräver också mer intensiv beräknings kraft för sin analys, särskilt i volymetriskt läge. Det optimala provtagningsintervallet i z-planet dikteras till stor del av objektivets egenskaper, men för de exempel som visas här krävs ca 40 konfokala skivor med ett intervall på 1,5 μm för att underlätta avbildning genom hela sfäroidens djup.
Som nämnts rekommenderas starkt användningen av en volymetriskbaserad bildanalysmetod för att minska partiskhet från analys av utvalda plan. Detta gör det inte bara möjligt att extrahera information på sfäroidnivå utan även data på cellnivå från varje enskild sfäroid. I slutändan måste HCA-rörledningarna utformas på ett sådant sätt att de tar itu med den specifika biologiska fråga som ställs. Multiparametriska utdata gör det möjligt att beskriva komplexa fenotyper kvantitativt. Detta har visat sig fungera för 3D-cellenheter med kommersiell HCA-programvara16,17, samt fritt tillgänglig programvara som CellProfiler22,23. Volymetrisk analysmetoder har potential att tillämpas på andra 3D-cellmodelltyper, såsom organoider och ex vivo patient-härledda explanter (PDEs), som ännu bättre replikerar in vivo villkor. Nyligen har en pipeline med hög genomströmning för produktion av hjärnorganoider beskrivits24. Detta innebär att generera organoider i en 96-brunnsplatta och därefter avbilda dem med hjälp av ett högkvalitativt screeningmikroskop24. PDEs är mycket fördelaktiga genom att de uppvisar den ursprungliga histologin från tumören, vilket ger en cellmodell som rekapitulerar in vivo-förhållanden, inklusive funktioner som tumörmikromiljön25. Dessa modeller kan också i princip immunostained, avbildas och analyseras med hjälp av det tillvägagångssätt som beskrivs här26,27.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en tillgänglig och robust metod för storskalig produktion av sfäroider för HCS- och HCA-applikationer. Dess tillämplighet visas med tre olika cellinjer, vilket producerar sfäroider som kan avbildas med hög upplösning. Detta protokoll visar också att volymetrisk analys kan ge kvantitativ information om sfäroidpopulationen, liksom på encelliga och subcellulära nivåer, vilket gör det användbart för en mängd olika analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande intressen i samband med detta arbete.
Acknowledgments
Författarna erkänner stödet från ett infrastrukturforskningsbidrag från Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) till JCS. Arbetet i UCD Cell Screening Laboratory stöds av UCD College of Science. ASC finansieras av Irish Research Council (IRC) Government of Ireland Postgraduate Scholarship (GOIPG/2019/68). Författarna tackar också alla medlemmar i labbet för deras input och hjälpsamma diskussioner. Konstverket i figur 1 genererades i BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
