Summary
본 프로토콜은 질량 분광법 전에 프로테옴 샘플의 견고하고 신속한 회수 및 정제를 위한 조절된 조건 하에서의 용매-기반 단백질 침전을 기술한다.
Abstract
질량 분광법(MS) 장비의 여러 발전으로 정성 및 정량적 프로테옴 분석이 개선되었지만, MS보다 앞서 단백질을 분리, 농축 및 처리하기 위한 보다 신뢰할 수 있는 프런트 엔드 접근법은 성공적인 프로테옴 특성화를 위해 매우 중요합니다. 낮고 일관성 없는 단백질 회수 및 계면활성제와 같은 잔류 불순물은 MS 분석에 해롭다. 단백질 침전은 종종 다른 샘플 준비 전략에 비해 신뢰할 수 없고, 시간이 많이 걸리며, 기술적으로 수행하기가 어려운 것으로 간주됩니다. 이러한 우려는 최적의 단백질 침전 프로토콜을 사용하여 극복됩니다. 아세톤 침전의 경우 특정 염, 온도 조절, 용매 조성 및 침전 시간의 조합이 중요하지만 클로로포름 / 메탄올 / 물 침전의 효율은 적절한 피펫팅 및 바이알 조작에 달려 있습니다. 대안적으로, 이들 침전 프로토콜은 일회용 스핀 카트리지 내에서 간소화되고 반자동화된다. 용매 기반 단백질 침전의 예상된 결과를 통상적인 포맷으로 그리고 일회용, 이단계 여과 및 추출 카트리지를 사용하여 본 작업에 예시한다. 여기에는 상향식 LC-MS/MS 분석에 의한 프로테오믹 혼합물의 상세한 특성화가 포함됩니다. SDS 기반 워크플로우의 우수한 성능은 오염되지 않은 단백질에 비해 입증되었습니다.
Introduction
질량 분광법에 의한 프로테옴 분석은 현대 MS 기기의 향상된 감도, 해상도, 스캔 속도 및 다양성으로 인해 점점 더 엄격 해지고 있습니다. MS의 발전은 단백질 식별 효율을 높이고 1,2,3,4,5를 더 정밀하게 정량하는 데 기여합니다. 향상된 MS 계측을 통해 연구자들은 워크플로우 6,7,8,9,10,11의 모든 단계에서 최소한의 시간 내에 고순도 단백질을 정량적으로 회수할 수 있는 상응하는 일관된 프런트 엔드 샘플 준비 전략을 요구합니다. . 생물학적 시스템의 프로테옴 상태를 정확하게 반영하기 위해, 단백질은 효율적이고 편향되지 않은 방식으로 천연 샘플 매트릭스로부터 분리되어야 한다. 이를 위해, 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 같은 변성 계면활성제를 포함하여, 효율적인 단백질 추출 및 가용화(12)를 보장한다. 그러나, SDS는 전기 분무 이온화를 강하게 방해하여, 적절하게 제거되지 않을 경우 심각한 MS 신호 억제를 야기한다(13).
다양한 SDS 고갈 전략이 일회용 스핀 카트리지14,15,16 내에 포함된 분자량 컷오프 필터 이상의 단백질의 보유와 같은 후속 프로테옴 분석을 위해 이용가능하다. 필터 지원 샘플 준비 방법(FASP)은 SDS를 10ppm 이하로 효과적으로 고갈시켜 최적의 MS를 용이하게 하기 때문에 선호됩니다. 그러나 FASP를 사용한 단백질 회수는 가변적이어서 다른 기술의 탐구를 촉발시켰다. 단백질(또는 계면활성제)을 선택적으로 포획하는 크로마토그래피 접근법은 다양한 편리한 카트리지 또는 비드 기반 포맷17,18,19,20,21로 진화했다. 단백질 정제에 대한 이러한 간단하고 (이상적으로) 일관된 전략을 감안할 때, 유기 용매를 사용한 단백질 침전의 고전적인 접근법은 종종 단백질 분리에 대한 유망한 접근법으로 간과됩니다. 용매 침전이 SDS를 임계 수준 이하로 성공적으로 고갈시키는 것으로 밝혀졌지만, 단백질 회수는 이러한 접근법의 오랜 관심사였습니다. 여러 그룹은 단백질 농도, 분자량 및 소수성22,23의 함수로서 용납 할 수 없을 정도로 낮은 침전 수율로 단백질 회수 편향을 관찰했습니다. 문헌에보고 된 강수 프로토콜의 다양성으로 인해 표준화 된 강수량 조건이 개발되었습니다. 2013 년 Crowell et al.은 80 % 아세톤24에서 단백질의 침전 효율에 대한 이온 강도의 의존성을 처음 보고했습니다. 조사된 모든 단백질에 대해, 최대 30 mM 염화나트륨의 첨가는 수율을 최대화하는데 필수적인 것으로 나타났다(최대 100% 회수). 보다 최근에, Nickerson et al.은 아세톤 침전 동안 더 높은 이온 강도 (최대 100 mM)와 상승 온도 (20 °C)의 조합이 2-5 분 25 분에 거의 정량적회복을 주었다는 것을 보여주었다. 저분자량(LMW) 단백질의 회수율에서 약간의 감소가 관찰되었다. 따라서, Baghalabadi et al.에 의한 후속 보고서는 특정 염, 특히 황산아연을 더 높은 수준의 유기 용매 (97 % 아세톤)와 결합시킴으로써 LMW 단백질 및 펩티드 (≤5 kDa)의 성공적인 회수를 입증했다.
침전 프로토콜을 정제하는 것은 MS 기반 프로테오믹스에 대해 보다 신뢰할 수 있는 단백질 정제 전략을 제공하지만, 기존의 침전의 성공은 사용자 기술에 크게 의존합니다. 이 연구의 주요 목표는 오염 상청액으로부터 단백질 펠릿의 분리를 용이하게하는 강력한 침전 전략을 제시하는 것입니다. 다공성 PTFE 멤브레인 필터(27) 위에 응집된 단백질을 분리함으로써 피펫팅을 제거하기 위해 일회용 여과 카트리지가 개발되었다. 상청액 내의 MS 간섭 성분은 짧고 저속 원심분리 단계에서 효과적으로 제거된다. 일회용 필터 카트리지는 또한 교체 가능한 SPE 카트리지를 제공하여 질량 분광법에 앞서 가용화 및 선택적 단백질 소화 후 후속 샘플 정리를 용이하게합니다.
변형된 아세톤 및 클로로포름/메탄올/물28 프로토콜을 포함한 일련의 권장 프로테옴 침전 워크플로우가 기존 (바이알 기반) 및 일회용 2 상태 여과 및 추출 카트리지의 반자동 형식으로 제공됩니다. 결과 단백질 회수 및 SDS 고갈 효율은 상향식 LC-MS/MS 프로테옴 커버리지와 함께 강조되어 각 프로토콜에서 예상되는 결과를 입증합니다. 각 접근법과 관련된 실질적인 이점과 단점이 논의됩니다.
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Protocol
1. 재료 고려 사항 및 샘플 사전 준비
- 과도한 수분이없는 고순도 용매 (아세톤, 클로로포름, 메탄올) (>99.5 %)와 화학 물질 만 사용하십시오.
- 물에 염화나트륨과 황산아연 용액 (1 M)을 준비하십시오.
참고: 소금 용액은 오염물질이나 미생물 성장이 없는 한 실온에서 무기한으로 보관할 수 있습니다. - 침전을 유도하기 위해 필요한 부피의 샘플 및 용매를 보유하기에 충분한 가장 작은 폴리프로필렌(PP) 마이크로원심분리 바이알을 사용하십시오.
- 침전될 샘플의 SDS 농도가 2%(w/v)를 넘지 않는지 확인하십시오. SDS가 더 높으면 샘플을 물로 희석하십시오.
- 최적의 침전 효율을 위해 단백질 농도를 0.01 ~ 10 g/L 사이로 유지하십시오.
참고: 침전에 대한 최적의 질량은 단백질의 1-100 μg 사이입니다. - 사용하기 전에 모든 용매와 용액에 미립자 물질이 없는지 확인하십시오. 여과 (<0.5 μm) 또는 원심분리 단계 (실온에서 1 분 동안 10,000 x g )를 수행하여 용해되지 않은 미립자를 제거하십시오.
- 디술피드 결합 환원 및 알킬화가 필요한 경우, 단백질 침전 전에 이러한 단계를 수행하십시오. 과량의 환원 및 알킬화 시약은 침전 과정을 통해 제거될 것이다.
- 프로토콜 중 하나를 선택하고 수행하여 단백질을 침전시킨다(단계 2, 3, 4, 또는 5).
2. 아세톤을 이용한 신속한 (바이알 기반) 단백질 침전
- 90 μL의 (미립자 프리) 단백질 또는 프로테옴 용액을 PP 마이크로원심분리 튜브에 피펫팅한다. 이어서, 10 μL의 1 M 수성 NaCl을 첨가한다.
참고: 프로테옴 추출물의 이온 강도가 이미 100mM을 초과하는 경우, 추가적인 염은 필요하지 않습니다. - 아세톤 400 μL를 피펫팅하여 시료에 넣었다. 바이알을 캡하고 바이알을 부드럽게 두드려 용매를 결합합니다. 격렬한 혼합은 필요하지 않습니다.
참고 : 단백질, 소금 및 아세톤의 부피는 각각의 상대 비율이 유지되는 한 증가 할 수 있습니다. - 바이알을 최소 2 분 동안 방해받지 않고 실온에서 배양하도록하십시오.
참고: 감소된 온도에서의 것들을 포함하는 더 긴 인큐베이션(예를 들어, 종래의 아세톤 침전은 냉동실에서 하룻밤 침전을 이용함), 더 큰(가시적인) 응집된 단백질 미립자의 형성을 초래할 수 있으며(도 1A), 이는 일반적으로 총 단백질 회수를 개선하지 않는다. - 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리기에 넣고 바이알의 방향을 확인합니다. 실온에서 10,000 x g 이상에서 최소 2 분 동안 회전하십시오.
- 바이알의 뚜껑을 풀고 바이알을 폐기물 용기에 천천히 뒤집어 상청액을 부드럽게 데시닝하십시오. 거꾸로 된 바이알을 종이 타월에 대고 바이알에서 잔류 용매를 뽑습니다.
주의: 폐기물 용제는 적절한 프로토콜에 따라 보관하고 폐기해야 합니다. - SDS 함유 샘플의 경우, 400 μL의 신선한 아세톤을 분주하고, 펠렛을 방해하지 않도록 주의한다.
참고: 2.6단계는 선택 사항입니다.- 샘플을 즉시 원심분리하고(실온에서 1분 동안 10,000 x g 이상), 바이알을 초기 스핀과 동일한 배향의 로터 내로 위치시킨다. 세척 용매를 데칸트는 단계 2.5에 기재된 바와 같다.
- 뚜껑을 연 상태에서 샘플을 완전히 말리십시오 (~ 1 분). 바이알을 요약하고 펠릿 가용화를 진행한다(단계 6).
3. 저분자량(LMW) 펩타이드(ZnSO4 + 아세톤)의 침전
- 54 μL의 프로테옴 추출물을 2 mL PP 바이알에 분주하고, 이어서 6 μL의 1 MZnSO4를 첨가한다.
참고: LMW 펩티드 (≤5 kDa)의 최적 회수는 아세톤을 최종 97 부피%에 첨가함으로써 얻어진다. 2 mL PP 바이알을 가정하면, 최대 초기 샘플 부피는 54 μL이다. - 1940 μL의 아세톤을 최종 97 부피%에 첨가한다. 부드럽게 소용돌이 치며 섞어서 벤치 탑에 최소 2 분 동안 방해받지 않고 서있게하십시오.
- 원심분리기(실온에서 1분 동안 10,000 x g )하고, 바이알을 뒤집고, 이어서 바이알을 종이 타월에 만짐으로써 상층액을 제거하였다.
- SDS 함유 샘플의 경우, 400 μL의 신선한 아세톤을 분주하고, 펠렛을 방해하지 않도록 주의한다.
참고: 3.4단계는 선택 사항입니다.- 단계 3.3에 따라 샘플을 즉시 원심분리하고, 바이알을 초기 스핀과 동일한 배향으로 로터 내로 배치한다. 세척 용매를 데칸트는 단계 3.3에 기재된 바와 같다.
- 생성된 건조 펠렛을 간단한 볼텍싱 또는 초음파 처리 (~ 5 분)로 수성 용매에 다시 가용화하십시오.
4. 클로로포름/메탄올/물 (CMW)에 의한 단백질 침전
- 단백질 또는 프로테옴 용액 100 μL를 PP 바이알에 분주한다. 메탄올 400 μL를 첨가하고, 이어서 클로로포름 100 μL를 첨가하였다. 바이알과 와류를 잠깐 섞어서 섞는다.
참고: CMW 강수량의 경우 바닥이 좁은 1.5mL 바이알이 선호됩니다(그림 2A).
주의: 클로로포름 용제는 적절한 환기 후드에서 취급해야 합니다. 클로로포름과 접촉하는 모든 용매는 폐기 시 할로겐화 폐기물로 취급되어야 합니다. - 300μL의 물을 바이알 중앙에 직접 빠르게 분주하십시오. 바이알을 뚜껑을 덮으십시오. 샘플이 1 분 동안 방해받지 않고 벤치 탑에 앉을 수 있도록하십시오.
참고: 솔루션은 즉시 흐린 흰색으로 나타납니다. 물을 첨가 한 후 바이알을 혼합하지 마십시오. - PP 바이알을 원심분리기에 넣고 최소 5분 동안 회전시킨다(실온에서 10,000 x g 이상).
참고 : 원심분리되면 두 개의 보이는 용매 층이 형성됩니다 (최상층 = 메탄올 / 물, 하단 = 클로로포름). 고체 단백질 펠릿은 용매 계면에서 형성된다(도 2A). - 큰 (1 mL) 마이크로피펫 팁을 사용하여, 바이알을 ∼45°에서 유지하고, 균일한 속도로 상층으로부터 ∼700 μL의 용매를 제거하였다.
- 더 작은(200μL) 마이크로피펫 팁을 사용하여 ~45° 기울어진 바이알에서 상부 용매층을 계속 제거한다. 상부 용매층이 바이알 내에 비드를 형성할 때까지 하나의 연속 운동으로 피펫.
- 400 μL의 신선한 메탄올을 샘플 바이알에 첨가하고, 펠렛을 교란시키지 않고, 용매를 바이알의 측면 아래로 분주한다.
- 바이알을 뚜껑을 덮으십시오. 바이알을 부드럽게 흔들어 용매를 함께 소용돌이 치면서 용매 층을 결합하십시오.
참고 : 펠릿을 방해하지 않도록하는 것이 중요합니다. 바이알을 와류하지 마십시오. - 로터에서 바이알의 배향을 주목하고, 최소 10 분 동안 원심 분리하십시오 (실온에서 10,000 x g ). 단백질 펠릿은 바이알의 바닥에 부착된다(도 2B).
- 펠릿을 아래로 향하게 하여 바이알을 45°로 향하게 합니다. 바이알의 상단 가장자리를 따라 피펫 팁을 놓고 느리지만 연속적인 속도로 1 mL 마이크로피펫 팁으로 상청액을 제거한다. 바이알에 ~20 μL의 용매를 보관한다.
- SDS 함유 샘플에 대한 단백질 펠릿을 400 μL의 신선한 메탄올을 천천히 분주하여 세척한다. 바이알을 와류하지 마십시오.
- 원심분리 (온도에서 2 분 동안 10,000 x g )로 직접 진행하고, 바이알을 초기 스핀과 동일한 배향으로 로터 내로 놓습니다.
- 단계 4.9에 따라 용매를 제거한다. 잔류 용매가 증발할 때까지 샘플을 흄후드에서 공기 건조시키도록 허용한다.
- 6단계에서 권장하는 가용화 절차를 참조하십시오.
5. 일회용 여과 카트리지를 사용한 단백질 침전
참고: 단계 2-5에 설명된 각 용매 기반 침전 프로토콜은 2단계 여과 및 추출 카트리지에서 수행될 수 있다( 표 참조).
- 상부 여과 카트리지에 플러그를 부착한 상태(도 3A)로, 아래의 세 가지 옵션 중 하나에 요약된 대로 추출된 프로테옴, 염 및 용매의 원하는 부피를 분배한다.
- (옵션 1) 아세톤을 사용한 단백질 침전을 위해, 90 μL의 단백질 또는 프로테옴 용액, 10 μL의 1 M 수성 NaCl 및 400 μL의 아세톤을 결합한다. 벤치 탑에서 최소 2 분 동안 배양하십시오.
참고: 농축된 단백질 샘플(1g/L)에 대해 가시적인 침전물이 발생합니다(그림 3B). - (옵션 2) LMW 펩티드 침전을 위해, 15 μL의 샘플, 1.5 μL의 1 M ZnSO4, 및485 μL의 아세톤을 조합한다. 벤치 탑에서 최소 2 분 동안 배양하십시오.
참고: 수성 샘플에서 90mM의 염 농도는 단계 3에서 권장하는 100mM에 비해 회복에 영향을 미치지 않습니다. - (옵션 3) CMW 침전을 위해, 50 μL의 프로테옴 추출물, 200 μL의 메탄올 및 50 μL의 클로로포름을 첨가한다. 바이알을 뚜껑을 덮고 간단히 와류하여 결합하십시오.
- 150μL의 물을 바이알 중앙에 직접 빠르게 분주하십시오. 벤치 탑에서 1 분 동안 배양하십시오.
- (옵션 1) 아세톤을 사용한 단백질 침전을 위해, 90 μL의 단백질 또는 프로테옴 용액, 10 μL의 1 M 수성 NaCl 및 400 μL의 아세톤을 결합한다. 벤치 탑에서 최소 2 분 동안 배양하십시오.
- 플러그가 여과 카트리지에 여전히 부착된 상태에서 실온에서 2,500 x g 에서 2분 동안 원심분리한다.
- 카트리지를 반전시킨 다음 나사를 풀고 카트리지 받침대에서 플러그를 분리합니다.
- 여과 카트리지를 깨끗한 바이알에 넣고 원심분리기로 돌아갑니다. 실온에서 500 x g 에서 3 분 동안 회전하십시오. 유동 관통 용매를 하부 바이알에서 버리십시오.
참고: 상부 여과 카트리지에 용매가 남아 있으면 원심분리기로 돌아가서 추가 스핀을 수행하십시오. - 400 μL의 아세톤을 여과 카트리지에 첨가하여 단백질 펠릿을 세척한다(CMW 침전을 위해, 단계 5.1.3, 메탄올 400 μL를 첨가).
- 실온에서 500 x g 에서 3분 동안 또는 상부 카트리지에 용매가 남아 있지 않을 때까지 원심분리한다.
- 단계 6에 기재된 바와 같이 침전 펠릿을 재가용화한다.
6. 단백질 펠릿의 재가용화
- 2-5 μL의 이소프로판올을 후술하는 재가용화 프로토콜 직전에 멤브레인에 직접 분주함으로써 여과 카트리지의 기저부에 멤브레인을 적셔라.
- 다음 재가용화 방법 중 하나를 따르십시오.
- (옵션 1) ≥2% SDS를 함유하는 최소 20 μL의 수성 완충액을 여과 카트리지에 첨가한다. 뚜껑과 소용돌이가 격렬하게 (~ 1 분). 대안적으로, 초음파 처리 (>10 분)는 단백질 펠릿을 분산시킨다.
- 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열한다). 가열 후 혼합 단계를 반복하십시오.
참고: Laemmli 겔 로딩 완충액은 단백질 펠릿을 재가용화할 수 있다. 그러나, SDS 함유 샘플은 트립신 소화 및 역상 LC 및 MS와 양립할 수 없다.
- 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열한다). 가열 후 혼합 단계를 반복하십시오.
- (옵션 2) 물에 80 % (v / v) 포름산 용액을 준비하십시오. 산 용액(-20°C)을 예냉하고, 침전된 단백질을 함유하는 여과 카트리지를 포함한다.
- 50 μL의 차가운 포름산을 카트리지에 분배하십시오; 캡과 와류는 30 초입니다. 10분 동안 냉동고(-20°C)로 복귀시킨다.
- 카트리지를 30초 동안 다시 소용돌이치십시오. 이어서, 냉장 및 혼합 사이클을 한 번 더 반복한다(10분, -20°C, 30s 와류).
- 최종 500 μL에 물을 첨가하고, 포름산을 8%로 희석한다.
참고: 차가운 포름산 프로토콜은 후속 트립신 소화와 호환되지 않지만 LC-MS와 호환됩니다.
- (옵션 3) 물에 새로 준비된 8 M 요소 50 μL를 여과 카트리지에 첨가한다. 30 분 동안 초음파 처리.
- 카트리지가 벤치탑에서 1시간 동안(최대 하룻밤까지) 인큐베이션되도록 합니다.
- 8 M 우레아를 물 또는 적절한 완충액으로 최소 5 배 희석하십시오.
참고: 일단 희석되면, 우레아 가용화 프로토콜은 LC-MS뿐만 아니라 후속 트립신 소화와 호환된다.
- (옵션 1) ≥2% SDS를 함유하는 최소 20 μL의 수성 완충액을 여과 카트리지에 첨가한다. 뚜껑과 소용돌이가 격렬하게 (~ 1 분). 대안적으로, 초음파 처리 (>10 분)는 단백질 펠릿을 분산시킨다.
7. 단백질 소화
- 상향식 MS 분석을 위해, 재가용화된 단백질을 효소적 소화를 위해 대상은 하기에 언급된 두 가지 방법 중 하나를 사용한다.
- (옵션 1) 포름산 재가용화를 위해, 단계에서 80% 포름산의 초기 부피를 6.2.2.1 내지 25 μL로 감소시킨다. 단계 6.2.2.3에서, 375 μL의 물을 사용하여 포름산을 5%(v/v)로 희석한다.
- 펩신을 대략 단백질 대 효소 비율 50:1로 카트리지에 분배하십시오. 여과 카트리지에 플러그가 부착된 상태에서 샘플을 실온에서 밤새 인큐베이션한다.
- (옵션 2) 요소에서의 재가용화를 위해, 단계 6.2.3.2에서 100 mM의 트리스 또는 중탄산암모늄을 포함시켜 8과 8.3 사이의 pH를 보장한다.
- 트립신을 단백질 대 효소 질량비 50:1의 대략적인 비율로 첨가하십시오. 카트리지에 플러그가 부착된 상태에서, 샘플을 37°C의 온수 욕조에서 밤새 인큐베이션한다.
- 용액을 10% TFA로 최종 1%까지 산성화시켜 소화를 종료한다.
- 필터의 베이스로부터 플러그를 제거하고 깨끗한 바이알 내에 포함된 카트리지를 원심분리하여 펩신- 또는 트립신-소화된 단백질을 회수한다(2분, 5000 x g, 실온).
8. SPE 정리
참고: 소화 또는 용매 교환 후 추가적인 샘플 탈염의 경우, 샘플은 설명된 바와 같이 역상 클러업의 대상이 될 수 있다.
- 300 μL의 메탄올 (2 분, 400 x g)을 통과시켜 SPE 카트리지 (물질의 표 참조)를 프라임한 다음 300 μL의 5% 아세토니트릴 / 0.1 % TFA (2 분, 400 x g)를 첨가하였다.
- 프라이밍된 SPE 카트리지를 재가용화 또는 소화된 단백질을 함유하는 여과 카트리지의 베이스에 연결한다.
- 단백질을 SPE 카트리지를 통해 스핀한다(실온에서 5분, 800 x g ). 용매가 상부 카트리지에 남아 있으면 카트리지를 원심분리기로 되돌리고 스핀을 반복하십시오.
주: SPE 카트리지를 통해 샘플을 두 번 통과시키면 복구가 향상될 수 있습니다. - 물에 5% 아세토니트릴/0.1%의 TFA 300μL를 카트리지에 넣습니다. 세척하려면 SPE 카트리지를 통해 흐르십시오 (2 분, 2000 x g). 흐름 통과를 버립니다.
- LMW 단백질 또는 소화된 펩티드의 경우, 50% 아세토니트릴/0.1% TFA (5분, 2500 x g)의 300 μL를 흘려서 샘플을 용출시킨다.
- 무손상 단백질의 경우, 75% 아세토니트릴/0.1% TFA의 300μL를 사용하는 추가 용출 단계와 함께 단계 8.5를 따르십시오. 두 개의 결과 추출물을 결합하십시오.
참고: 8.6단계는 선택 사항입니다.
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Representative Results
도 4 는 아세톤을 사용하는 일회용 필터 카트리지에서 바이알 기반 또는 카트리지-촉진된 단백질 침전에 따른 예상되는 SDS 고갈을 요약한 것이다. 아세톤에서의 종래의 밤새 인큐베이션(-20°C)은 CMW 침전뿐만 아니라 실온에서 신속한 아세톤 침전 프로토콜(단계 2)과 비교된다(단계 4). 잔류 SDS는 메틸렌 블루 활성 물질(MBAS) 분석29에 의해 정량화되었다. 간략하게, 100 μL 샘플을 100 μL MBAS 시약 (메틸렌 블루 250 mg, 황산나트륨 50 g, 황산 10 mL, 물에 희석 1.0 L)과 합한 다음, 400 μL 클로로포름을 첨가하고 UV/Vis 분광광도계 상에서 651 nm에서 유기층의 흡광도를 측정하였다. 모든 접근법은 SDS를 줄여 최적의 MS 분석을 가능하게 합니다.
정량적 및 재현성 단백질 회수는 처리된 효모 총 세포 용해물의 SDS PAGE 분석을 통해 도 5 에서 보이는 바와 같이 아세톤 침전 및 CMW 침전에 이어 달성된다. 일회용 여과 카트리지에서의 침전은 응집된 단백질을 멤브레인 필터 위에 유지하면서 SDS 함유 상청액을 조심스럽게 피펫팅할 필요가 없다. 일관된 회수는 모든 침전 프로토콜로 얻어지며, 세 개의 독립적인 반복실험에 걸쳐 상청액 분획에서 가시적인 밴드가 검출되지 않는다.
도 6은 차가운 포름산을 이용한 침전된 단백질 펠릿의 재가용화를 포함하는 예상 수율을 정량화한다(단계 6). CMW 침전은 펠렛을 바이알 기반 접근법으로 조심스럽게 보존함으로써 정량적 회수를 제공한다 (단계 5), 이는 카트리지를 사용하여 얻은 것과 동일하다 (각각 100 ± 4 % 대 101 ± 3 %). 아세톤-침전된 단백질 펠릿의 회수는 여과 카트리지로부터 이익을 얻으며, 수율의 15-20% 향상이 관찰된다. 바이알에서, 응집된 단백질로부터 아세톤 상청액의 단리는 본질적으로 PP 튜브 표면에 대한 펠릿의 부착에 의존한다; 여과 카트리지는 필터가 피펫팅없이 침전 된 단백질의 높은 회복을 보장하기 때문에 이러한 우려를 제거합니다.
LMW 단백질 및 펩티드를 효율적으로 회수하기 위해, 아세톤 침전 프로토콜은 NaCl을 ZnSO4로 치환하고 용매 백분율을 97%로 상승시킴으로써 변형된다. 이러한 특정 염과 더 높은 수준의 유기 용매를 결합하는 것은 LMW 단백질 및 펩티드26의 높은 회수를 위해 요구된다. 도 7에서 보이는 바와 같이, 카트리지-기반 단백질 침전은 바이알-기반 침전에 비해 소 혈장의 펩신-소화된 샘플의 우수한 회수를 입증한다. 일회용 스핀 카트리지는 LMW 펩티드의 90% 이상을 회수할 수 있다. NaCl을 사용할 때 카트리지에서 수율의 더 중요한 차이가 나타나 수율을 극대화하기 위해 소금 유형의 중요성을 확인합니다. NaCl과 반대로ZnSO4를 포함하면 스핀 카트리지 필터에 의해 보다 쉽게 포획되는 응집된 단백질 펠릿이 생긴다.
넓은 동적 범위에 걸쳐 단백질을 침전시키는 효능을 평가하기 위해, 세 가지 표준 단백질의 혼합물을 처리하였다: 대장균 의 β-갈락토시다제(β-gal), 소로부터의 시토크롬 c(Cyt c), S. cerevisiae로부터의 에놀라제(Eno). β-gal:Cyt c:Eno의 질량비는 10,000:10:1이었다. 샘플은 카트리지 기반 침전 전에 초기에 2%의 SDS를 함유하였고(단계 5), 트립신으로 재가용화되고 소화되었다(단계 6 및 7). 바이알에서 제조된 샘플은 대조군으로서 작용하였고, SDS가 없고 침전을 생략하였다. 모든 샘플은 동등한 SPE 클린업을 받았다(단계 8). 상향식 MS가 수행되었으며, MS/MS 스펙트럼은 관련된 세 종의 모든 단백질을 포함하는 결합된 데이터베이스에 대해 검색되었습니다(기기 및 소프트웨어 플랫폼에 대한 재료 표 참조). 1%의 펩티드 허위 발견률이 이용되었다. 세 단백질 모두 MS에 의해 확인되었고, 각각 β-gal, Cyt c 및 Eno에 대해 666, 28 및 35개의 독특한 펩티드가 있었다. 도 8 은 각 샘플로부터의 상대적 비율(펩티드 피크 강도)을 정량화하고, 1 이상의 비율은 일회용 필터 카트리지에서 처리된 샘플에 대한 더 높은 펩티드 풍부도를 반영한다. 이 결과는 SDS를 프로테오믹스 워크플로우에 통합하고, 단백질 손실을 최소화하고(예를 들어, 잠재적 흡착에서 샘플 바이알로) 펩티드 수율을 최대화하는 이점을 입증한다.
소 간은 지역 식료품 점에서 조달되었습니다. 단백질을 1% SDS의 용액으로 추출하여 조직을 분리하였다. 이어서, 회수된 프로테옴을 침전시키고, 재가용화시키고(urea), 트립신으로 소화시키고, 모두 일회용 카트리지 내에서 분해시켰다. 상향식 LC-MS/MS가 수행되어 평균 ~8,000개의 단백질(~30,000개의 펩티드)이 확인되었습니다. 펩티드 스펙트럼 및 단백질 그룹에 대해 0.5% 및 1.0%의 거짓 발견률을 이용하여, 소 데이터베이스를 검색하였다. 이 카트리지 기반 워크플로우의 기술적 재현성은 겹치는 단백질 식별을 통해 평가됩니다. 일반적인 소화된 샘플의 복제 MS 주사는 확인된 단백질과 평균 78± 0.5% 중첩을 달성한다. 비교해 보면, 개별 카트리지에서 독립적으로 제조된 샘플은 0.5% 겹침± 76개를 달성했습니다. 이들 데이터는 분석의 전체 가변성에 대한 샘플 준비의 기여가 LC-MS 도구적 접근법에 의해 이미 기여된 것에 비해 미미하다는 것을 시사한다. 세 가지 기술적 반복실험(세 개의 일회용 카트리지에서 독립적으로 처리됨)으로부터 확인된 소 단백질은 도 9에 도시된 그들의 분자량, 소수성 및 등전점에 관하여 추가로 특성화되었다. 양방향 ANOVA는 기술적 반복실험에 걸쳐 확인된 프로테옴의 통계적 차이를 결정할 수 없었다. 마지막으로, 도 10 은 세 개의 복제 샘플 제제에 걸쳐 단백질 당 확인된 펩티드의 수를 비교한다. 이 그래프의 상관 계수 (0.94-0.95)는 상향식 MS 분석을위한 샘플 준비 접근법의 높은 일관성을 보여줍니다.
도 1: 아세톤-침전된 단백질. 100 mM NaCl과 결합된 100 및 1,000 μg의 단백질을 함유하는 샘플은 (A) 5분 침전 시간 후 및 (B) 침전 및 후속 원심분리 후 80% 아세톤으로 침전되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 클로로포름/메탄올/물에 의한 단백질 침전. 단계 4에 따라 침전된 단백질 50 μg을 함유하는 샘플. (A) 단계 4.4 직후. (b) 단계 4.8 직후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단백질 침전을 위한 일회용 2단계 여과 및 추출 카트리지의 사진. 100 μg 단백질을 함유하는 샘플을 (A) 조립된 여과 및 SPE 카트리지 중의 100 mM의 NaCl 및 80% 아세톤과 결합시키고, (B) 단백질 응집체가 보일 때까지 5분 동안 침전시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 단백질 침전에 따른 SDS 고갈 효율. SDS 제거의 백분율은 통상적인 프로토콜(-20°C에서 하룻밤 동안), 신속한 프로토콜(실온에서 2분 인큐베이션), 또는 S. cerevisiae 용해물의 클로로포름/메탄올/물(CMW) 침전에 의한 아세톤 침전으로부터 보여진다(바이알) 및 카트리지 포맷 둘 다. 이들 샘플은 초기에 0.5% SDS (5,000 ppm)를 함유하였고, 추론>99.8% SDS 제거가 최적의 MS 분석을 위해 요구된다. 잔류 SDS는 메틸렌 블루 활성 물질 (MBAS) 분석에 의해 정량화된다. 오차 막대는 기술 반복실험으로부터의 표준 편차(n=3)를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 침전을 통한 총 프로테옴 회수. SDS PAGE는 (A) 통상적인 아세톤 침전, (B) 클로로포름/메탄올/물 침전 및 (C) 빠른 아세톤 침전에 의해 침전된 S. cerevisiae 총 단백질 용해물의 회수를 보여준다. 단백질 밴드는 펠릿 분획에서 독점적으로 관찰되며, 상청액 (Super.)에 가시적 인 밴드가 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 여과 카트리지 내의 우수한 단백질 회수. S. cerevisiae 총 단백질 용해물의 침전을 위해, 일회용 스핀 카트리지는 아세톤 및 CMW 침전으로 정량적 회복을 용이하게 한다. 바이알 기반 강수량으로도 높은 회수가 가능하지만 신중한 샘플 조작 및 피펫팅이 필요합니다. LC-UV는 펠렛을 차가운 포름산으로 재용해시킨 후 평가된 단백질 회수를 여기에 나타내었다. 오차 막대는 기술 반복실험으로부터의 표준 편차(n=3)를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 저분자량 펩티드에 대한 높은 침전 수율. 펩티드 및 단백질 ≤5 kDa에 대한 변형된 아세톤 침전 프로토콜은 최고 수율을 달성하기 위해 100 mM의 ZnSO4를 97% 아세톤과 결합하는 것을 포함한다. 일회용 여과 카트리지에 의해 촉진된 침전은 세 가지 침전 조건 모두에서 기존의 바이알 기반 침전에 비해 향상된 회수율을 입증한다. 오차 막대는 기술 반복실험으로부터의 표준 편차(n=3)를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: SDS 기반 워크플로우에서 표준 단백질의 높은 회수율. Tukey Box-and-Whisker는 대조군 샘플에 대하여 일회용 여과 카트리지에서 처리된 SDS 함유 단백질로부터 회수된 펩티드에 대한 상대적 MS 신호 강도의30 을 플롯한다(SDS 없음, 침전 없음). 사용된 단백질은 광범위한 농도 동적 범위-β-갈락토시다제:시토크롬 c:에놀라제 = 10,000:10:1에 걸쳐 있다. 상자 내의 각 사분위수는 분포의 25%를 포함하고 오류 막대는 분포의 95%를 포함합니다. 평균은 "+"로 표시되고 중앙값은 수평선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 기술적 반복실험에서 단백질 분포 확인. Tukey Box-and-Whisker 플롯은 (A) 분자량, (B) 소수성 및 (C) 상향식 LC-MS/MS로 식별된 단백질의 등전점을 두 단계 여과 및 추출 카트리지에서 소 간 용해물의 삼중 제제에 따라 특성화합니다. 양방향 ANOVA에 의한 이들 특성에는 통계적 차이가 없었다 (p < 0.05). 상자 내의 각 사분위수는 분포의 25%를 포함하고 오류 막대는 분포의 95%를 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 분취 반복실험에 걸친 SDS 기반 준비 워크플로우를 통한 단백질당 펩티드 ID의 상관관계. 단백질 당 펩티드 MS 식별의 수에 기초하여 (A) 샘플 1 및 2, (B) 샘플 2 및 3, 및 (C) 샘플 1 및 3에 걸친 상향식 프로테옴 재현성의 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최적의 MS 특성화는 잔류 SDS가 10ppm 미만으로 고갈될 때 달성된다. FASP 및 온비드 소화와 같은 대안적인 접근법은 가변 회수31,32,33으로 정량적 SDS 고갈을 제공하지만, 침전의 주요 목적은 순도와 수율을 동시에 극대화하는 것입니다. 이는 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상청액(SDS 함유)을 효과적으로 단리하는 것에 의존한다. 바이알 기반 침전의 경우, 일단 상청액의 대부분이 피펫팅에 의해 제거되면, 응집 된 펠릿 중 일부가 실수로 손실 될 가능성이 점점 커지고 있습니다. 이러한 이유로, 잔류 용매(∼20 μL)의 보다 중요한 분획을 뒤에 남겨두고 세척 단계(34)를 추가하는 것이 필수적이다. 세척 단계는 바이알로부터 잔류 용매를 희석하고 제거한다. 특히 CMW의 경우, 펠릿이 형성되면 샘플 바이알을 와류하는 것이 불필요합니다. 격렬한 교반을 통해 펠릿을 파괴하면 우발적 인 피펫팅으로 인한 손실 가능성을 높이는 원치 않는 효과가 있습니다. 볼텍싱이 포함되면(이전 프로토콜에 의해 권고된 바와 같이)35, CMW 펠릿의 일부가 바이알 캡의 하측에 부착될 가능성이 존재하고; 일단 원심분리되면, 펠릿은 바이알 캡에 고정된 상태로 유지되며 ~50% 손실을 초래할 수 있다.
신속한 침전은 0.01-2 mg / mL 사이의 희석 된 프로테옴 샘플의 높은 회수율 또는 1-200 μg 사이의 상응하는 단백질 질량으로 수행 될 수 있습니다. 그러나 0.01mg/mL 단백질 미만에서 시작하는 정량적 및 재현 가능한 회수는 10분에서 1시간 사이의 더 긴 침전 시간으로 인해 이점을 얻을 수 있으며, 이는 침전 워크플로우의 처리량 한계를 입증합니다. 놀랍게도, 더 농축 된 샘플 (10 mg / mL)은 우발적 인 피펫팅 손실로 인한 것으로 추정되는 수율의 통계적 감소를 보여줍니다. >10 μg 단백질을 가정하면, 바이알의 측면에서 가시적 인 펠렛이 관찰되어야합니다 (그림 1B). 1 μg에 이르는 소량은 보기가 어렵습니다. 이것은 단백질 펠릿을 파괴하지 않고 상청액을 피펫하는 능력에 도전한다. 바이알은 펠릿으로부터 용매를 분리하기 위해 아세톤으로 반전(천천히) 될 수 있다. CMW의 경우, 펠릿은 바이알에 충분히 안정적으로 부착되지 않아 상청액의 디캔팅보다 피펫팅을 선호합니다. 바이알 기반 침전의 경우, 의도 된 샘플 및 용매 부피를 용이하게하기 위해 가능한 가장 작은 마이크로 원심분리 튜브로 작업하는 것이 좋습니다. 이 작업에 사용된 일회용 여과 카트리지에서의 침전은 500 μL의 최대 부피 용량을 제공하여 최대 100 μL의 샘플 부피에서 80% 아세톤으로 단백질 침전을 가능하게 합니다. 권장 농도가 유지되는 경우 샘플, 소금 및 용매 부피를 적절하게 조정할 수 있습니다.
유기 용매 기반 침전으로부터 회수된 단백질 펠릿의 순도는 샘플 매트릭스, 버퍼 성분 및 침전 조건의 복잡성에 의해 제한된다. 예를 들어, 글리신(SDS PAGE 분리에 사용됨)과 같은 특정 완충액 성분은 80% 아세톤을 사용하여 단백질과 공동 침전하는 것으로 나타났다. 그러나 글리신은 CMW 침전을 통해 용해 된 상태로 남아 있습니다. 아세톤은 DNA 단편36,37을 침전시키고, 회수된 펠릿에 바람직하지 않은 배경 불순물을 잠재적으로 첨가하는 것으로 보고되었다. 저분자량 단백질 및 펩티드의 침전은 수율을 최대화하기 위해 상승된 수준의 유기 용매 및 특정 염 유형을 필요로 한다. 여러 가지 염이 탐구되었지만, ZnSO4는 지속적으로 높은 제품을 제공합니다. 이 염은 단백질이없는 상태에서 97 % 아세톤에서 침전됩니다. 따라서, 생성된 단백질 펠릿은 고농도의 염을 함유한다. 90 % 아세톤을 부피로 사용하면 높은 펩티드 수율을 얻을 수 있지만 통계적으로 유의미한 회복 (~ 5 %)이 예상됩니다. 그러나, 이것은 각각의 2 mL 바이알에서 보다 유의한 샘플 부피 (최대 180 μL, 1 M ZnSO4의 20 μL와 함께)를 처리할 수 있게 한다. 매트릭스 불순물이 단백질 펠릿과 공침하는 것 외에도, 용매 침전은 본질적으로 샘플38,39의 변성을 야기한다는 것을 언급해야 한다. 따라서, 이 프로토콜은 기능적 단백질 또는 천연 MS 워크플로우의 제조에 적용되지 않는다. 아세톤은 또한 글리신 잔기40에서 공유 단백질 변형을 일으키고 +98 u 질량 이동을 유도하는 것으로 보고되었으며, 아세톤41의 알돌 축합 부산물로 추측된다.
단백질 침전을 위해 여과 카트리지를 사용할 때, 단백질 펠릿의 분리는 PTFE 멤브레인 필터 위의 응집체의 보유에 의존한다. 이 멤브레인의 다공성은 분자량 컷오프 필터 (FASP에서 볼 수 있듯이)의 다공도를 초과하여 스핀 시간이 감소하면서 단백질 분리를 허용합니다. 낮은 스핀 속도에서의 신속한 용액 전달은 PTFE 멤브레인의 적절한 습윤에 의존합니다. 유기 용매는 쉽게 흐르지만 건조한 PTFE 필터는 수성 용매를 방해합니다. 여과 카트리지가 막히는 것처럼 보이면, 막은 소량의 유기 용매 (예를 들어, 이소프로판올)를 필터에 직접 적용함으로써 재습윤되어야 한다. 단백질 펠릿의 크기 및 사용된 샘플의 부피에 따라, 모든 용매가 여과 카트리지를 통과했는지 확인하기 위해 더 빠른 속도(최대 3,000 x g)에서의 추가적인 원심분리 또는 스핀이 필요할 수 있습니다.
최적의 조건을 갖는 침전으로부터의 단백질 회수는 궁극적으로 펠릿 재가용화의 도전에 의해 제한되며, 하류 처리 및 LC-MS와 호환되는 용매 옵션은 거의 없다. 추가적으로, 저온에 장시간 노출되고 단단히 패킹된 펠릿을 과도하게 건조시키는 것과 같은 몇몇 침전 조건은 재가용화 과제(40)에 기여한다. CMW 단백질 펠릿은 일반적으로 아세톤 펠릿보다 덜 용해된다는 것이 주목된다. 80% 차가운 포름산에 의해 침전된 단백질의 재가용화 효율 극대화(단계 6.2.2)는 이전에 보고된바 있다 42; 저온은 단백질 변형을 방지하며, 그렇지 않으면 농축 포름산43,44에서 발생합니다. 산 농도를 희석하면 또한 개질 반응이 느려진다. 포름산은 하향식 MS 접근법 또는 펩신을 사용한 효소 소화 전에 권장됩니다. 이 용매를 사용하는 것은 물리적 인 치료가 거의 필요하지 않습니다. 단지 5 μL의 첨가 (단백질 펠릿을 덮기에 충분함)는 볼텍싱, 짧은 초음파 처리 또는 반복 피펫팅과 조합될 때 충분할 수 있다. 유사하게, SDS PAGE에 의해 분석되도록 의도된 샘플의 경우, SDS 함유 Laemmli 완충액 중에 재용해는 가열 전에 샘플의 겸손한 혼합과 조합될 때 매우 효과적이다. 그러나, 이들 용매는 둘 다 트립신과 양립할 수 없다. 트립신 소화 전에 8 M 우레아로 재 용해하는 것이 권장되며, 우레아가 신선하게 준비되었는지 확인하십시오 (같은 날). 최소 부피 50μL 버퍼는 여과 카트리지 내에서 단백질 재가용화를 위해 카오트로픽 용매와 펠릿 사이의 접촉을 최대화하고 초음파 처리, 반복 피펫팅 및/또는 볼텍싱 동안 용해를 돕기 위해 권장됩니다. 대안적인 접근법은 트립신을 이용하여 단백질을 재가용화하는데, 이는 단백질이 효소 첨가 전에 완전히 재용해될 필요가 없다는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 접근법은 소화를 편향시킬 수 있고, 소수성 단백질이 더 짧은 소화 시간을 경험하는 동안 더 용해성 종을 선호한다(45). 트리스 또는 중탄산 암모늄과 같은 기본 완충액과 함께 8 M 우레아를 첨가하려면 소화 후 샘플 정리 단계가 필요합니다. 이러한 샘플 첨가제의 경우, 역상 컬럼 정리가 이상적입니다. 이 연구에 사용된 일회용 여과 카트리지는 교환가능한 역상 SPE 카트리지로 보충된다. 이 카트리지는 또한 포름산 재가용화 프로토콜의 경우 용매 교환에 이상적으로 적합하다. 모든 고체상 추출 접근법은 샘플 회수의 고유 손실과 관련이 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 사용자는 그들의 실험을 위한 회복 및 추가적인 정제의 이점을 가늠해야 한다.
이러한 프로토콜을 통해 프로테오믹스 연구원들은 프로테옴 추출을 위해 SDS를 활용하여 세제 기반 워크플로우를 간소화할 수 있을 것으로 예상됩니다. 완전한 프로테옴의 일관된 회복을 촉진하는 준비 전략이 중요합니다. 두 단계 스핀 카트리지는 빠르고 견고하며 재현 가능한 프로테옴 시료 분리의 기회를 단순화합니다. 이러한 접근법은 임상 설정 또는 대규모 연구 이니셔티브(46)와 같은 샘플 처리량을 희생하지 않고 엄격한 분석을 필요로 하는 애플리케이션에 적용될 수 있을 것이다. 이러한 접근법의 향후 응용은 바이오마커 발견, 검출, 정확한 정량화, 및 약물 및 약물 표적 발견을 포함할 수 있다.
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Disclosures
Doucette 실험실은이 연구에 사용 된 ProTrap XG를 구상하고 특허를 취득했습니다. AAD는 또한 샘플 준비 카트리지를 상용화한 Proteoform Scientific의 창립 파트너이기도 합니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)가 자금을 지원했습니다. 저자들은 MS 데이터 수집에 기여한 Bioinformatics Solutions Inc. (캐나다 워털루)와 SPARC BioCentre (Molecular Analysis)에게 아픈 어린이 병원 (캐나다 토론토)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
References
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