Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ترسيب البروتين العضوي القائم على المذيبات لتنقية البروتيوم القوية قبل قياس الطيف الكتلي

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

يصف هذا البروتوكول هطول البروتين القائم على المذيبات في ظل ظروف خاضعة للرقابة من أجل الاسترداد والتنقية القويين والسريعين لعينات البروتيوم قبل قياس الطيف الكتلي.

Abstract

في حين أن التطورات المتعددة في أدوات قياس الطيف الكتلي (MS) قد حسنت التحليل النوعي والكمي للبروتينات، فإن النهج الأمامية الأكثر موثوقية لعزل البروتينات وإثرائها ومعالجتها قبل التصلب المتعدد أمر بالغ الأهمية لتوصيف البروتيوم الناجح. إن استرداد البروتين المنخفض وغير المتناسق والشوائب المتبقية مثل المواد الخافضة للتوتر السطحي تضر بتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. غالبا ما يعتبر هطول الأمطار البروتينية غير موثوق به ، ويستغرق وقتا طويلا ، ويمثل تحديا تقنيا للأداء مقارنة باستراتيجيات إعداد العينات الأخرى. يتم التغلب على هذه المخاوف من خلال استخدام بروتوكولات هطول الأمطار البروتينية المثلى. بالنسبة لهطول الأمطار الأسيتون ، فإن الجمع بين أملاح محددة ، والتحكم في درجة الحرارة ، وتكوين المذيبات ، ووقت هطول الأمطار أمر بالغ الأهمية ، في حين أن كفاءة ترسيب الكلوروفورم / الميثانول / الماء تعتمد على السحب السليم والتلاعب بالقارورة. بدلا من ذلك ، يتم تبسيط بروتوكولات هطول الأمطار هذه وشبه آلية داخل خرطوشة دوران يمكن التخلص منها. يتم توضيح النتائج المتوقعة من ترسيب البروتين القائم على المذيبات في الشكل التقليدي واستخدام خرطوشة ترشيح واستخراج يمكن التخلص منها على مرحلتين. ويشمل ذلك التوصيف التفصيلي للمخاليط البروتينية عن طريق تحليل LC-MS/MS من أسفل إلى أعلى. كما يظهر الأداء المتفوق لسير العمل القائم على SDS بالنسبة للبروتين غير الملوث.

Introduction

أصبح تحليل البروتيوم بواسطة مطياف الكتلة صارما بشكل متزايد ، نظرا للحساسية المحسنة والدقة وسرعة المسح الضوئي وتعدد استخدامات أجهزة MS الحديثة. تساهم تطورات التصلب المتعدد في زيادة كفاءة تحديد البروتين وزيادة دقة الكمية1،2،3،4،5. مع تحسين أجهزة MS ، يطلب الباحثون استراتيجية متسقة لإعداد العينات الأمامية قادرة على الاسترداد الكمي للبروتينات عالية النقاء في أقل وقت ممكن عبر جميع مراحل سير العمل 6,7,8,9,10,11 . لتعكس بدقة حالة البروتيوم للنظام البيولوجي ، يجب عزل البروتينات من مصفوفة العينة الأصلية بطريقة فعالة وغير متحيزة. تحقيقا لهذه الغاية ، بما في ذلك الفاعل بالسطح ، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، يضمن استخراج البروتين الفعال والذوبان12. ومع ذلك ، فإن SDS تتداخل بشدة مع تأين الرش الكهربائي ، مما يتسبب في قمع إشارة MS الشديد إذا لم يتم القضاء عليها بشكل صحيح13.

تتوفر استراتيجيات استنفاد SDS مختلفة لتحليل البروتيوم اللاحق ، مثل الاحتفاظ بالبروتينات فوق مرشح قطع الوزن الجزيئي الموجود داخل خراطيش الدوران التي يمكن التخلص منها 14،15،16. يفضل استخدام طريقة تحضير العينات بمساعدة المرشح (FASP) لأنها تستنفد SDS بشكل فعال أقل من 10 جزء في المليون ، مما يسهل MS الأمثل. ومع ذلك ، فإن استعادة البروتين باستخدام FASP متغيرة ، مما دفع إلى استكشاف تقنيات أخرى. تطورت الأساليب الكروماتوغرافية التي تلتقط البروتين (أو الفاعل بالسطح) بشكل انتقائي إلى خراطيش مريحة مختلفة أو تنسيقات قائمة على الخرز17،18،19،20،21. بالنظر إلى هذه الاستراتيجيات البسيطة والمتسقة (من الناحية المثالية) لتنقية البروتين ، غالبا ما يتم تجاهل النهج الكلاسيكي لهطول الأمطار بالبروتين باستخدام المذيبات العضوية كنهج واعد لعزل البروتين. في حين تبين أن هطول الأمطار المذيبات يستنفد SDS إلى ما دون المستويات الحرجة بنجاح ، فإن استعادة البروتين كانت مصدر قلق طويل الأمد لهذا النهج. لاحظت مجموعات متعددة تحيزا في استعادة البروتين ، مع غلة هطول الأمطار المنخفضة بشكل غير مقبول كدالة لتركيز البروتين والوزن الجزيئي وكره الماء22,23. نظرا لتنوع بروتوكولات هطول الأمطار المبلغ عنها في الأدبيات ، تم تطوير ظروف هطول الأمطار الموحدة. في عام 2013 ، أبلغ Crowell et al. لأول مرة عن اعتماد القوة الأيونية على كفاءة هطول الأمطار للبروتينات في 80٪ من الأسيتون24. بالنسبة لجميع البروتينات التي تم فحصها ، تبين أن إضافة ما يصل إلى 30 ملليمتر كلوريد الصوديوم ضرورية لتحقيق أقصى قدر من الغلة (ما يصل إلى 100٪ من الانتعاش). في الآونة الأخيرة ، أظهر نيكرسون وآخرون أن الجمع بين قوة أيونية أعلى (تصل إلى 100 ملليمتر) مع درجة حرارة مرتفعة (20 درجة مئوية) أثناء هطول الأمطار الأسيتون أعطى استردادا كميا قريبا في 2-5 دقيقة25. لوحظ انخفاض طفيف في استعادة البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW). ولذلك، أظهر تقرير لاحق أعده باغالابادي وآخرون الاسترداد الناجح لبروتينات الكائنات الحية المحورة وببتيدات (≤5 كيلوداد) عن طريق الجمع بين أملاح محددة، ولا سيما كبريتات الزنك، مع مستوى أعلى من المذيبات العضوية (97٪ من الأسيتون)26.

في حين أن تحسين بروتوكول هطول الأمطار يضفي استراتيجية أكثر موثوقية لتنقية البروتين للبروتينات القائمة على MS ، فإن نجاح هطول الأمطار التقليدي يعتمد بشكل كبير على تقنية المستخدم. الهدف الأساسي من هذا العمل هو تقديم استراتيجية قوية لهطول الأمطار تسهل عزل حبيبات البروتين عن المادة الفائقة الملوثة. تم تطوير خرطوشة ترشيح يمكن التخلص منها للقضاء على السحب عن طريق عزل البروتين المجمع فوق مرشح غشاء PTFE المسامي27. تتم إزالة مكونات التداخل MS في supernatant بشكل فعال في خطوة طرد مركزي قصيرة ومنخفضة السرعة. توفر خرطوشة المرشح التي يمكن التخلص منها أيضا خرطوشة SPE قابلة للتبديل، مما يسهل تنظيف العينات لاحقا بعد إعادة الذوبان وهضم البروتين الاختياري، قبل قياس الطيف الكتلي.

يتم عرض سلسلة من سير عمل هطول الأمطار البروتيني الموصى به هنا ، بما في ذلك بروتوكولات الأسيتون والكلوروفورم / الميثانول / الماءالمعدلة 28 ، في شكل تقليدي (قائم على القارورة) وشبه آلي في خرطوشة ترشيح واستخراج ثنائية الحالة يمكن التخلص منها. يتم تسليط الضوء على عمليات استرداد البروتين الناتجة وكفاءة استنفاد SDS ، إلى جانب تغطية LC-MS / MS البروتينية من أسفل إلى أعلى ، لإظهار النتيجة المتوقعة من كل بروتوكول. وتناقش الفوائد والعيوب العملية المرتبطة بكل نهج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاعتبارات المادية وإعداد العينات مسبقا

  1. استخدم فقط المذيبات عالية النقاء (الأسيتون والكلوروفورم والميثانول) (>99.5٪) والمواد الكيميائية الخالية من الرطوبة الزائدة.
  2. تحضير محاليل كلوريد الصوديوم وكبريتات الزنك (1 م) في الماء.
    ملاحظة: يمكن تخزين محاليل الملح إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة، طالما أنها خالية من الملوثات أو النمو الميكروبي.
  3. استخدم أصغر قارورة طرد مركزي دقيق من البولي بروبيلين (PP) كافية للاحتفاظ بالحجم المطلوب من العينات والمذيبات للحث على هطول الأمطار.
  4. تأكد من أن تركيز SDS في العينة المراد ترسيبها لا يزيد عن 2٪ (ث / v). إذا كان SDS أعلى ، فقم بتخفيف العينة بالماء.
  5. ضمان تركيز البروتين بين 0.01 و 10 جم / لتر لتحقيق الكفاءة المثلى لهطول الأمطار.
    ملاحظة: تتراوح الكتلة المثلى لهطول الأمطار بين 1-100 ميكروغرام من البروتين.
  6. تأكد من خلو جميع المذيبات والمحاليل من الجسيمات قبل الاستخدام. قم بإجراء إما الترشيح (<0.5 ميكرومتر) أو خطوة الطرد المركزي (10000 × g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة) لإزالة الجسيمات غير الذائبة.
  7. إذا كانت هناك حاجة إلى تقليل رابطة ثاني كبريتيد والألكلة ، فقم بإجراء هذه الخطوات قبل هطول الأمطار من البروتين. ستتم إزالة كواشف الحد والألكلة الزائدة من خلال عملية هطول الأمطار.
  8. قم بترسيب البروتينات عن طريق اختيار وتنفيذ أحد البروتوكولات (الخطوات 2 أو 3 أو 4 أو 5).

2. هطول الأمطار السريع (القائم على القارورة) البروتين مع الأسيتون

  1. Pipet 90 ميكرولتر من البروتين (الخالي من الجسيمات) أو محلول البروتينات في أنبوب الطرد المركزي الدقيق PP. ثم أضف 10 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المائي 1 M.
    ملاحظة: إذا كانت القوة الأيونية لمستخلص البروتيوم تتجاوز بالفعل 100 مللي متر ، فلا يلزم ملح إضافي.
  2. Pipet 400 ميكرولتر من الأسيتون في العينة. قم بتغطية القارورة واضغط على القارورة بلطف لدمج المذيبات. الخلط القوي غير مطلوب.
    ملاحظة: يمكن زيادة حجم البروتين والملح والأسيتون طالما تم الحفاظ على النسبة النسبية لكل منها.
  3. اسمح للقارورة بالاحتضان في درجة حرارة الغرفة ، دون إزعاج ، لمدة لا تقل عن 2 دقيقة.
    ملاحظة: قد تؤدي الحضانات الأطول، بما في ذلك تلك التي تكون في درجة حرارة منخفضة (على سبيل المثال، يستخدم هطول الأمطار التقليدي من الأسيتون هطول الأمطار بين عشية وضحاها في الثلاجة)، إلى تكوين جسيمات بروتين مجمعة أكبر (مرئية) (الشكل 1A)، والتي لا تحسن عموما الاسترداد الكلي للبروتين.
  4. بعد الحضانة ، ضع عينات في جهاز طرد مركزي ، مع ملاحظة اتجاه القارورة. تدور لمدة لا تقل عن 2 دقيقة ، عند 10000 × g أو أعلى في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بفك غطاء القارورة وصب العارضة بلطف عن طريق عكس القارورة ببطء إلى حاوية نفايات. المس القارورة المقلوبة بمنشفة ورقية لسحب المذيبات المتبقية من القارورة.
    تنبيه: يجب الاحتفاظ بمذيبات النفايات والتخلص منها وفقا للبروتوكولات المناسبة.
  6. بالنسبة للعينات التي تحتوي على SDS ، قم بتوزيع 400 ميكرولتر من الأسيتون الطازج ، مع الحرص على عدم إزعاج الكريات.
    ملاحظة: الخطوة 2.6 اختيارية.
    1. قم على الفور بالطرد المركزي للعينة (10000 × g أو أعلى لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة) ، مع وضع القارورة في الدوار في نفس اتجاه الدوران الأولي. قم بتزيين مذيب الغسيل كما هو موضح في الخطوة 2.5.
  7. اترك العينة لتجف تماما مع فتح الغطاء (~ 1 دقيقة). تلخيص القارورة والمضي قدما في ذوبان الكريات (الخطوة 6).

3. هطول الأمطار من الببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW) (ZnSO4 + الأسيتون)

  1. استغني عن 54 ميكرولتر من مستخلص البروتيوم إلى قارورة PP سعة 2 مل ، ثم أضف 6 ميكرولتر من 1 M ZnSO4.
    ملاحظة: يتم الحصول على الاسترداد الأمثل للببتيدات LMW (≤5 kDa) عن طريق إضافة الأسيتون إلى 97٪ النهائي من حيث الحجم. بافتراض قارورة PP 2 مل ، فإن الحد الأقصى لحجم العينة الأولية هو 54 ميكرولتر.
  2. أضف 1940 ميكرولتر من الأسيتون إلى 97٪ نهائية من حيث الحجم. قم بالتدوير بلطف للخلط ، واتركه يقف دون إزعاج على سطح الطاولة لمدة لا تقل عن 2 دقيقة.
  3. جهاز طرد مركزي (10000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة) وإزالة السوبرنات عن طريق عكس القارورة ، ثم لمس القارورة إلى منشفة ورقية.
  4. بالنسبة للعينات التي تحتوي على SDS ، قم بتوزيع 400 ميكرولتر من الأسيتون الطازج ، مع الحرص على عدم إزعاج الكريات.
    ملاحظة: الخطوة 3.4 اختيارية.
    1. قم على الفور بالطرد المركزي للعينة وفقا للخطوة 3.3 ، مع وضع القارورة في الدوار في نفس اتجاه الدوران الأولي. قم بتزيين مذيب الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3.3.
  5. أعد إذابة الكريات الجافة الناتجة في مذيب مائي مع دوامة قصيرة أو صوتنة (~ 5 دقائق).

4. هطول الأمطار البروتين عن طريق الكلوروفورم / الميثانول / الماء (CMW)

  1. استغني عن 100 ميكرولتر من محلول البروتين أو البروتيوم في قارورة PP. أضف 400 ميكرولتر من الميثانول ، متبوعا ب 100 ميكرولتر من الكلوروفورم. قم بتغطية القارورة والدوامة لفترة وجيزة للخلط.
    ملاحظة: بالنسبة لهطول الأمطار CMW ، يفضل قوارير 1.5 مل ذات القيعان الضيقة (الشكل 2A).
    تنبيه: يجب التعامل مع مذيب الكلوروفورم في غطاء تهوية مناسب. يجب التعامل مع جميع المذيبات التي تلامس الكلوروفورم كنفايات مهلجنة عند التخلص منها.
  2. قم بتوزيع 300 ميكرولتر من الماء بسرعة مباشرة في وسط القارورة. قم بتغطية القارورة. اسمح للعينة بالجلوس على سطح الطاولة دون إزعاج لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: سيظهر الحل على الفور باللون الأبيض الغائم. تجنب خلط القارورة بعد إضافة الماء.
  3. ضع قارورة PP في جهاز طرد مركزي وقم بالدوران لمدة لا تقل عن 5 دقائق (10000 × g أو أعلى في درجة حرارة الغرفة).
    ملاحظة: بمجرد الطرد المركزي ، ستتشكل طبقتان مرئيتان من المذيبات (الطبقة العليا = الميثانول / الماء ؛ القاع = الكلوروفورم). تتشكل حبيبات البروتين الصلبة في واجهة المذيبات (الشكل 2A).
  4. باستخدام طرف ماصة دقيقة كبير (1 مل) ، وعقد القارورة عند ~ 45 درجة ، قم بإزالة ~ 700 ميكرولتر من المذيب من الطبقة العليا بمعدل موحد.
  5. استخدم طرف ماصة صغيرة (200 ميكرولتر) لمواصلة إزالة طبقة المذيبات العلوية من القارورة المائلة ~ 45 درجة. Pipet في حركة واحدة مستمرة حتى تشكل طبقة المذيبات العليا خرزة في القارورة.
  6. أضف 400 ميكرولتر من الميثانول الطازج إلى قارورة العينة ، دون إزعاج الكريات ، عن طريق توزيع المذيب على جانب القارورة.
  7. قم بتغطية القارورة. امزج طبقات المذيبات عن طريق هز القارورة بلطف لتدوير المذيبات معا.
    ملاحظة: من الضروري تجنب تعطيل الكريات. لا دوامة القارورة.
  8. مع ملاحظة اتجاه القارورة في الدوار ، جهاز طرد مركزي لمدة لا تقل عن 10 دقائق (10000 × جم في درجة حرارة الغرفة). تلتصق بيليه البروتين بقاع القارورة (الشكل 2B).
  9. قم بقلب القارورة عند 45 درجة ، مع توجيه الكريات لأسفل. ضع طرف الماصة على طول الحافة العلوية للقارورة وقم بإزالة السوبرناتانت بطرف ماصة دقيقة 1 مل بمعدل بطيء ولكن مستمر. الاحتفاظ ~ 20 ميكرولتر من المذيبات في القارورة.
  10. اغسل حبيبات البروتين للعينات المحتوية على SDS عن طريق الاستغناء ببطء عن 400 ميكرولتر من الميثانول الطازج. لا دوامة القارورة.
    1. تابع مباشرة الطرد المركزي (10000 × g لمدة 2 دقيقة عند درجة الحرارة) ، ووضع القارورة في الدوار بنفس اتجاه الدوران الأولي.
  11. قم بإزالة المذيب ، وفقا للخطوة 4.9. اترك العينة لتجف في الهواء في الدخان حتى يتبخر المذيب المتبقي.
  12. راجع إجراءات إعادة الذوبان الموصى بها في الخطوة 6.

5. هطول الأمطار البروتين باستخدام خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها

ملاحظة: يمكن تنفيذ كل بروتوكول لهطول الأمطار يستند إلى المذيبات موصوف في الخطوات من 2 إلى 5 في خرطوشة ترشيح واستخراج من مرحلتين (انظر جدول المواد).

  1. مع توصيل القابس بخرطوشة الترشيح العلوية (الشكل 3A) ، قم بتوزيع الحجم المطلوب من البروتيوم المستخرج والملح والمذيب كما هو موضح في أحد الخيارات الثلاثة أدناه.
    1. (الخيار 1) لهطول البروتين مع الأسيتون ، اجمع بين 90 ميكرولتر من البروتين أو محلول البروتين ، و 10 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المائي 1 متر ، و 400 ميكرولتر من الأسيتون. احتضان لمدة لا تقل عن 2 دقيقة على سطح الطاولة.
      ملاحظة: سيتطور راسب مرئي لعينات البروتين المركز (1 جم/لتر) (الشكل 3B).
    2. (الخيار 2) بالنسبة لهطول الأمطار من الببتيد LMW ، اجمع بين 15 ميكرولتر من العينة ، و 1.5 ميكرولتر من 1 M ZnSO4 ، و 485 ميكرولتر من الأسيتون. احتضان لمدة لا تقل عن 2 دقيقة على سطح الطاولة.
      ملاحظة: لن يؤثر تركيز الملح البالغ 90 مللي متر في العينة المائية على الاسترداد بالنسبة إلى 100 مللي متر الموصى بها في الخطوة 3.
    3. (الخيار 3) لهطول الأمطار CMW ، أضف 50 ميكرولتر من مستخلص البروتيوم ، و 200 ميكرولتر من الميثانول ، و 50 ميكرولتر من الكلوروفورم. قم بتغطية القارورة والدوامة لفترة وجيزة للمزج.
      1. قم بتوزيع 150 ميكرولتر من الماء بسرعة مباشرة في وسط القارورة. احتضان لمدة 1 دقيقة على سطح الطاولة.
  2. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 2500 × g في درجة حرارة الغرفة مع استمرار توصيل القابس بخرطوشة الترشيح.
  3. قم بعكس الخرطوشة، ثم قم بفك القابس وإزالته من قاعدة الخرطوشة.
  4. ضع خرطوشة الترشيح في قارورة نظيفة وأعد إلى جهاز الطرد المركزي. تدور لمدة 3 دقائق عند 500 × g في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المذيب المتدفق من القارورة السفلية.
    ملاحظة: إذا بقي أي مذيب في خرطوشة الترشيح العلوية، فارجع إلى جهاز الطرد المركزي وقم بإجراء دوران إضافي.
  5. اغسل حبيبات البروتين بإضافة 400 ميكرولتر من الأسيتون إلى خرطوشة الترشيح (لهطول الأمطار CMW ، الخطوة 5.1.3 ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول).
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة أو حتى لا يبقى أي مذيب في الخرطوشة العلوية.
  7. إعادة إذابة بيليه هطول الأمطار كما هو موضح في الخطوة 6.

6. إعادة إذابة بيليه البروتين

  1. بلل الغشاء الموجود في قاعدة خرطوشة الترشيح عن طريق توزيع 2-5 ميكرولتر من الأيزوبروبانول مباشرة على الغشاء مباشرة قبل بروتوكولات إعادة الذوبان الموضحة أدناه.
  2. اتبع إحدى طرق إعادة الذوبان التالية.
    1. (الخيار 1) أضف ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت المائي الذي يحتوي على SDS بنسبة ≥2٪ إلى خرطوشة الترشيح. غطاء ودوامة بقوة (~ 1 دقيقة). بدلا من ذلك ، سونيكات (>10 دقائق) لتفريق بيليه البروتين.
      1. سخني العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). كرر خطوة الخلط بعد التسخين.
        ملاحظة: يمكن للمخزن المؤقت لتحميل هلام Laemmli إعادة إذابة بيليه البروتين. ومع ذلك ، فإن العينات التي تحتوي على SDS غير متوافقة مع هضم التربسين و LC و MS في الطور المعكوس.
    2. (الخيار 2) تحضير محلول من 80 ٪ (v / v) حمض الفورميك في الماء. قم بتبريد المحلول الحمضي (-20 درجة مئوية) ، وكذلك خرطوشة الترشيح التي تحتوي على البروتين المترسب.
      1. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من حمض الفورميك البارد في خرطوشة ؛ غطاء ودوامة لمدة 30 ثانية. أعد إلى الفريزر (-20 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
      2. دوامة خرطوشة مرة أخرى لمدة 30 ثانية. ثم كرر دورة التبريد والخلط مرة أخرى (10 دقائق ، -20 درجة مئوية ، دوامة 30 ثانية).
      3. أضف الماء إلى 500 ميكرولتر نهائي ، مع تخفيف حمض الفورميك إلى 8٪.
        ملاحظة: بروتوكول حمض الفورميك البارد غير متوافق مع هضم التربسين اللاحق ولكنه متوافق مع LC-MS.
    3. (الخيار 3) أضف 50 ميكرولتر من اليوريا الطازجة 8 م في الماء إلى خرطوشة الترشيح. سونيكات لمدة 30 دقيقة.
      1. اسمح للخرطوشة بالاحتضان على سطح الطاولة لمدة 1 ساعة (حتى الليل).
      2. تمييع اليوريا 8M لا يقل عن 5 أضعاف بالماء أو العازلة المناسبة.
        ملاحظة: بمجرد تخفيفه ، يتوافق بروتوكول ذوبان اليوريا مع هضم التربسين اللاحق ، وكذلك LC-MS.

7. هضم البروتين

  1. لتحليل التصلب المتعدد من أسفل إلى أعلى، إخضاع البروتينات المعاد ذوبانها للهضم الأنزيمي باستخدام إحدى الطريقتين المذكورتين أدناه.
    1. (الخيار 1) لإعادة إذابة حمض الفورميك ، قلل الحجم الأولي من حمض الفورميك بنسبة 80٪ في الخطوة 6.2.2.1 إلى 25 ميكرولتر. في الخطوة 6.2.2.3 ، استخدم 375 ميكرولتر من الماء لتخفيف حمض الفورميك إلى 5٪ (v / v).
    2. قم بتوزيع البيبسين في الخرطوشة بنسبة بروتين إلى إنزيم تقريبية تبلغ 50: 1. باستخدام قابس متصل بخرطوشة الترشيح، احتضن العينة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  2. (الخيار 2) لإعادة الذوبان في اليوريا ، تأكد من درجة الحموضة بين 8 و 8.3 مع تضمين 100 mM من Tris أو بيكربونات الأمونيوم في الخطوة 6.2.3.2.
    1. أضف التربسين بنسبة كتلة البروتين إلى الإنزيم التقريبية 50: 1. باستخدام قابس متصل بالخرطوشة ، احتضن العينة بين عشية وضحاها في حمام مائي دافئ عند 37 درجة مئوية.
    2. إنهاء عملية الهضم عن طريق تحمض المحلول بنسبة 10٪ TFA إلى 1٪ نهائية.
  3. استرجع البروتين المهضوم بالبيبسين أو التربسين عن طريق إزالة القابس من قاعدة الفلتر والطرد المركزي للخرطوشة الموجودة داخل قارورة نظيفة (2 دقيقة، 5000 × جم، درجة حرارة الغرفة).

8. تنظيف SPE

ملاحظة: بالنسبة لإزالة الملح الإضافي للعينات بعد الهضم أو تبادل المذيبات، يمكن أن تخضع العينة لتنظيف الطور المعكوس كما هو موضح.

  1. قم بتعبئة خرطوشة SPE (انظر جدول المواد) عن طريق تمرير 300 ميكرولتر من الميثانول (2 دقيقة ، 400 × جم) متبوعة ب 300 ميكرولتر من 5٪ acetonitrile / 0.1٪ من TFA (2 دقيقة ، 400 × جم).
  2. قم بتوصيل خرطوشة SPE المعدة بقاعدة خرطوشة الترشيح التي تحتوي على بروتين معاد ذوبانه أو مهضوم.
  3. قم بتدوير البروتين من خلال خرطوشة SPE (5 دقائق، 800 × جم في درجة حرارة الغرفة). إذا بقي المذيب في الخرطوشة العلوية، فأعد الخرطوشة إلى جهاز الطرد المركزي وكرر الدوران.
    ملاحظة: قد يؤدي تمرير العينة عبر خرطوشة SPE مرة ثانية إلى تحسين الاسترداد.
  4. أضف 300 ميكرولتر من 5٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ من TFA في الماء إلى الخرطوشة. للغسل، اتدفق عبر خرطوشة SPE (2 دقيقة، 2000 × جم). تجاهل التدفق من خلال.
  5. بالنسبة لبروتينات LMW أو الببتيدات المهضومة ، قم بإخراج العينة عن طريق تدفق 300 ميكرولتر من 50٪ acetonitrile / 0.1٪ TFA (5 دقائق ، 2500 × جم).
  6. بالنسبة للبروتينات السليمة، اتبع الخطوة 8.5 مع خطوة إزالة إضافية باستخدام 300 ميكرولتر من 75٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ TFA. الجمع بين اثنين من المستخلصات الناتجة.
    ملاحظة: الخطوة 8.6 اختيارية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويلخص الشكل 4 استنفاد SDS المتوقع بعد هطول البروتينات على أساس القارورة أو الخرطوشة في خرطوشة مرشح يمكن التخلص منها باستخدام الأسيتون. تتم مقارنة الحضانة التقليدية بين عشية وضحاها (-20 درجة مئوية) في الأسيتون ببروتوكول هطول الأمطار السريع للأسيتون في درجة حرارة الغرفة (الخطوة 2) ، وكذلك هطول الأمطار CMW (الخطوة 4). تم تحديد SDS المتبقي كميا بواسطة فحص المواد الفعالة الزرقاء الميثيلين (MBAS)29. باختصار ، تم الجمع بين عينة 100 ميكرولتر مع كاشف MBAS 100 ميكرولتر (250 ملغ من الميثيلين الأزرق ، 50 جم من كبريتات الصوديوم ، 10 مل من حمض الكبريتيك ، المخفف في الماء إلى 1.0 لتر) ، تليها إضافة 400 ميكرولتر كلوروفورم وقياس امتصاص الطبقة العضوية عند 651 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية / Vis. تقلل جميع الأساليب من SDS للسماح بالتحليل الأمثل للتصلب المتعدد.

يتم تحقيق استعادة البروتين الكمي والقابل للتكاثر بعد هطول الأمطار السريع من الأسيتون وهطول الأمطار CMW ، كما هو موضح في الشكل 5 من خلال تحليل SDS PAGE لتحليل إجمالي خلايا الخميرة المعالجة. يلغي هطول الأمطار في خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها الحاجة إلى سحب السوبر ناتانت المحتوي على SDS بعناية مع الاحتفاظ بالبروتينات المجمعة فوق مرشح الغشاء. يتم الحصول على استرداد متسق مع جميع بروتوكولات هطول الأمطار ، مع عدم اكتشاف نطاقات مرئية في الكسور الفائقة عبر ثلاثة نسخ متماثلة مستقلة.

ويبين الشكل 6 كميا الغلة المتوقعة، بما في ذلك إعادة إذابة كريات البروتين المترسبة باستخدام حمض الفورميك البارد (الخطوة 6). يوفر هطول الأمطار CMW الاسترداد الكمي من خلال الحفاظ بعناية على الكريات في نهج قائم على القارورة (الخطوة 5) ، والذي يساوي ذلك الذي تم الحصول عليه باستخدام الخرطوشة (100 ± 4٪ مقابل 101 ± 3٪ على التوالي). يستفيد استرداد كريات البروتين المترسبة بالأسيتون من خرطوشة الترشيح ، مع ملاحظة تحسن بنسبة 15-20٪ في الإنتاجية. في القوارير ، يعتمد عزل الأسيتون الفائق عن البروتين المجمع بشكل أساسي على التصاق الكريات بسطح أنبوب PP ؛ تزيل خرطوشة الترشيح هذا القلق لأن المرشح يضمن استردادا عاليا للبروتين المترسب دون سحب.

لاستعادة بروتينات LMW والببتيدات بكفاءة ، يتم تعديل بروتوكول هطول الأمطار الأسيتون عن طريق استبدال كلوريد الصوديوم ب ZnSO4 ورفع نسبة المذيبات إلى 97٪. الجمع بين هذا الملح المحدد ومستويات أعلى من المذيبات العضوية مطلوبة للاسترداد العالي لبروتينات LMW والببتيدات26. وكما هو مبين في الشكل 7، فإن هطول الأمطار البروتينية القائم على الخرطوشة يدل على التعافي المتفوق لعينة من البلازما البقرية المهضومة بواسطة البيبسين مقارنة بهطول الأمطار القائم على القارورة. يمكن لخرطوشة الدوران التي يمكن التخلص منها استرداد أكثر من 90٪ من ببتيدات LMW. ويلاحظ وجود اختلافات أكثر أهمية في الإنتاجية في الخرطوشة عند استخدام كلوريد الصوديوم، مما يؤكد أهمية نوع الملح لزيادة الإنتاجية إلى أقصى حد. بما في ذلك ZnSO4 بدلا من كلوريد الصوديوم ينتج عنه بيليه بروتين مجمع يتم احتجازه بسهولة أكبر بواسطة مرشح خرطوشة الدوران.

لتقييم فعالية البروتينات المترسبة على نطاق ديناميكي واسع ، تمت معالجة مزيج من ثلاثة بروتينات قياسية: β-galactosidase (β-gal) من E. coli ، والسيتوكروم c (Cyt c) من البقري ، و enolase (Eno) من S. cerevisiae. كانت نسبة كتلة β-gal:Cyt c:Eno 10,000:10:1. احتوت العينات في البداية على 2٪ من SDS قبل هطول الأمطار القائم على الخرطوشة (الخطوة 5) وتم إعادة حلها وهضمها باستخدام التربسين (الخطوتان 6 و 7). كانت العينات المحضرة في قوارير بمثابة عنصر تحكم ، حيث لم يكن لها SDS وحذفت هطول الأمطار. خضعت جميع العينات لتنظيف SPE مكافئ (الخطوة 8). وأجريت التصلب المتعدد من القاعدة إلى القمة، حيث تم البحث في أطياف التصلب المتعدد/التصلب المتعدد مقابل قاعدة بيانات مشتركة تحتوي على جميع البروتينات من الأنواع الثلاثة المعنية (انظر جدول المواد للاطلاع على منصات الأدوات والبرمجيات). تم استخدام معدل اكتشاف كاذب للببتيد بنسبة 1٪. تم تحديد جميع البروتينات الثلاثة بواسطة MS ، مع 666 و 28 و 35 ببتيدات فريدة من نوعها ل β-gal و Cyt c و Eno ، على التوالي. ويبين الشكل 8 كميا النسبة النسبية (كثافة ذروة الببتيد) من كل عينة، مع نسبة أعلى من 1 تعكس وفرة أعلى من الببتيد للعينات المعالجة في خراطيش المرشحات التي يمكن التخلص منها. تظهر النتائج فوائد دمج SDS في سير عمل البروتينات ، وتقليل فقدان البروتين (على سبيل المثال ، من الامتزاز المحتمل إلى قارورة العينة) ، وزيادة غلة الببتيد إلى أقصى حد.

تم شراء كبد البقر من متجر بقالة محلي. تم عزل البروتينات عن طريق استخراج الأنسجة بمحلول 1٪ SDS. في وقت لاحق ، تم ترسيب البروتيوم المسترد ، وإعادة ذوبانه (اليوريا) ، وهضمه بالتريبسين ، كل ذلك داخل خرطوشة يمكن التخلص منها. تم إجراء LC-MS / MS من أسفل إلى أعلى ، مما أدى إلى تحديد متوسط ~ 8000 بروتين (~ 30000 ببتيد). تم استخدام معدلات اكتشاف خاطئة بنسبة 0.5٪ و 1.0٪ لأطياف الببتيد ومجموعات البروتين ، والبحث في قاعدة بيانات الأبقار. يتم تقييم قابلية التكرار التقني لسير العمل القائم على خرطوشة هذا من خلال تحديد البروتين المتداخل. تحقق حقن MS المكررة لعينة مشتركة مهضومة في المتوسط 78 ± 0.5٪ من التداخل مع البروتينات المحددة. وبالمقارنة، حققت العينات المعدة بشكل مستقل في خراطيش منفصلة 76 ± 0.5٪ من التداخل. تشير هذه البيانات إلى أن مساهمة إعداد العينة في التباين الكلي للتحليل طفيفة ، مقارنة بتلك التي ساهم بها بالفعل نهج LC-MS الفعال. تم وصف البروتينات البقرية التي تم تحديدها من ثلاث نسخ متماثلة تقنية (تمت معالجتها بشكل مستقل في ثلاث خراطيش يمكن التخلص منها) فيما يتعلق بوزنها الجزيئي ، وكره الماء ، والنقطة الكهربية المتساوية ، كما هو موضح في الشكل 9. لم تتمكن ANOVA ثنائية الاتجاه من تحديد الفروق الإحصائية في البروتينات المحددة عبر النسخ المتماثلة التقنية. وأخيرا، يقارن الشكل 10 عدد الببتيدات المحددة لكل بروتين عبر مستحضرات العينات الثلاثة المكررة. توضح معاملات الارتباط في هذه الرسوم البيانية (0.94-0.95) الاتساق العالي لنهج إعداد العينات لتحليل MS من أسفل إلى أعلى.

Figure 1
الشكل 1: البروتينات المترسبة بالأسيتون. عينات تحتوي على 100 و 1000 ميكروغرام من البروتين جنبا إلى جنب مع 100 mM NaCl وترسبت مع 80٪ من الأسيتون (A) بعد 5 دقائق من وقت هطول الأمطار و (B) بعد هطول الأمطار والطرد المركزي اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: هطول البروتين بواسطة الكلوروفورم / الميثانول / الماء. عينة تحتوي على 50 ميكروغرام من البروتين عجلت وفقا للخطوة 4. (أ) مباشرة بعد الخطوة 4.4. (ب) مباشرة بعد الخطوة 4.8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور لخرطوشة ترشيح واستخراج على مرحلتين يمكن التخلص منها لهطول الأمطار البروتينية. تم دمج عينة تحتوي على 100 ميكروغرام من البروتين مع 100 mM من كلوريد الصوديوم و 80٪ من الأسيتون في (A) الترشيح المجمع وخرطوشة SPE و (B) عجلت لمدة 5 دقائق حتى أصبحت مجاميع البروتين مرئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: كفاءة استنفاد SDS بعد هطول الأمطار البروتينية. تظهر النسبة المئوية ل SDS التي تمت إزالتها من هطول الأمطار الأسيتون باستخدام البروتوكول التقليدي (بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية) ، أو البروتوكول السريع (حضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة) ، أو عن طريق ترسيب الكلوروفورم / الميثانول / الماء (CMW) من محلل S. cerevisiae ، سواء في شكل تقليدي (قارورة) أو خرطوشة. احتوت هذه العينات في البداية على 0.5٪ SDS (5000 جزء في المليون) ، مما يستنتج >99.8٪ يلزم إزالة SDS لتحليل MS الأمثل. يتم تحديد كمية SDS المتبقية عن طريق فحص المواد الفعالة الزرقاء الميثيلين (MBAS). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن النسخ المتماثلة التقنية (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إجمالي استرداد البروتينات من خلال هطول الأمطار. تظهر صفحة SDS استرداد تحلل البروتين الكلي S. cerevisiae ، الذي عجل به (أ) هطول الأسيتون التقليدي ، (ب) كلوروفورم / ميثانول / ترسيب الماء ، و (ج) هطول الأسيتون السريع. يتم ملاحظة نطاقات البروتين حصريا في جزء الكريات ، مع عدم وجود نطاقات مرئية في supernatant (Super). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: استعادة فائقة للبروتين داخل خرطوشة ترشيح. لهطول الأمطار من S. cerevisiae الكلي البروتين lysate ، خرطوشة الدوران التي يمكن التخلص منها يسهل الاسترداد الكمي مع هطول الأمطار الأسيتون و CMW. من الممكن أيضا استرداد كميات كبيرة مع هطول الأمطار القائم على القارورة ، على الرغم من الحاجة إلى معالجة العينات بعناية وسحب السحب. يتم عرض استعادة البروتين LC-UV المقيمة بعد إعادة إذابة الكريات مع حمض الفورميك البارد هنا. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن النسخ المتماثلة التقنية (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: غلة هطول الأمطار العالية للببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي. يتضمن بروتوكول هطول الأسيتون المعدل للببتيدات والبروتينات ≤5 كيلو دالون اقتران 100 mM من ZnSO4 مع 97٪ من الأسيتون لتحقيق أعلى الغلة. يوضح هطول الأمطار الذي تسهله خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها تحسنا في الاسترداد مقارنة بهطول الأمطار التقليدي القائم على القارورة عبر جميع ظروف هطول الأمطار الثلاثة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن النسخ المتماثلة التقنية (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: استرداد أعلى للبروتينات القياسية في سير العمل القائم على SDS. يقوم Tukey Box-and-Whisker برسم30 من كثافة إشارة MS النسبية للببتيدات المستردة من البروتينات المحتوية على SDS والتي تمت معالجتها في خرطوشة ترشيح يمكن التخلص منها بالنسبة لعينة التحكم (بدون SDS ، ولا هطول الأمطار). تمتد البروتينات المستخدمة على نطاق ديناميكي واسع التركيز β-galactosidase:cytochrome c:enolase = 10,000:10:1. يحتوي كل ربع داخل المربعات على 25٪ من التوزيع ، بينما تشمل أشرطة الخطأ 95٪ من التوزيع. يشار إلى الوسط ب "+" والوسيط بخط أفقي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: توزيعات البروتين المحددة من النسخ المتماثلة التقنية. تميز مخططات Tukey Box-and-Whisker (A) الوزن الجزيئي ، (B) كره الماء ، و (C) نقطة متساوية الكهربية للبروتينات التي تم تحديدها بواسطة LC-MS / MS من أسفل إلى أعلى بعد الاستعدادات الثلاثية لتحلل الكبد البقري في خرطوشة ترشيح واستخراج على مرحلتين. لم يكن هناك فرق إحصائي في هذه الخصائص بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه (p < 0.05). يحتوي كل ربع داخل المربعات على 25٪ من التوزيع ، بينما تشمل أشرطة الخطأ 95٪ من التوزيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: ارتباط معرفات الببتيد لكل بروتين من خلال سير عمل التحضير القائم على SDS عبر النسخ المتماثلة التحضيرية. تحليل قابلية استنساخ البروتينات من أسفل إلى أعلى عبر (أ) العينتين 1 و 2 ، (ب) العينتين 2 و 3 ، و (ج) العينتين 1 و 3 استنادا إلى عدد تحديدات الببتيد MS لكل بروتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم تحقيق التوصيف الأمثل للتصلب المتعدد عند استنفاد SDS المتبقي أقل من 10 أجزاء في المليون. في حين أن النهج البديلة ، مثل FASP والهضم على الخرز ، توفر استنفاد SDS الكمي مع الاسترداد المتغير31،32،33 ، فإن الهدف الأساسي من هطول الأمطار هو تحقيق أقصى قدر من النقاء والعائد في وقت واحد. هذا يعتمد على عزل السوبرناتانت بشكل فعال (الذي يحتوي على SDS) دون إزعاج بيليه البروتين. مع هطول الأمطار القائم على القارورة ، بمجرد إزالة الجزء الأكبر من supernatant عن طريق السحب ، فمن المرجح بشكل متزايد أن يتم فقدان بعض الكريات المجمعة عن طريق الخطأ. لهذا السبب ، من الضروري أن تترك وراءها جزءا أكثر أهمية من المذيب المتبقي (~ 20 ميكرولتر) وإضافة خطوة غسيل34. تعمل خطوة الغسيل على تخفيف وإزالة المذيب المتبقي من القارورة. خاصة مع CMW ، من غير الضروري دوامة قارورة العينة بمجرد تشكيل الكرية. تعطيل الكريات من خلال التحريض القوي له تأثير غير مرغوب فيه لزيادة احتمال الخسارة من السحب العرضي. وإذا أدرجت الدوامة (على النحو الموصى به في البروتوكولات السابقة)(35)، فإن هناك إمكانية لأجزاء من حبيبات CMW للالتصاق بالجانب السفلي من غطاء القارورة؛ بمجرد الطرد المركزي ، تظل الكريات ثابتة على غطاء القارورة ويمكن أن تؤدي إلى خسارة ~ 50٪.

يمكن إجراء هطول الأمطار السريع مع استرداد عال لعينات البروتينات المخففة ، من الناحية المثالية بين 0.01-2 ملغ / مل ، أو كتلة بروتين مقابلة بين 1-200 ميكروغرام. ومع ذلك ، قد تستفيد عمليات الاسترداد الكمية والقابلة للتكرار التي تبدأ من أقل من 0.01 مجم / مل من البروتين من أوقات هطول الأمطار الأطول التي تتراوح من 10 دقائق إلى 1 ساعة ، مما يدل على قيود الإنتاجية لسير عمل هطول الأمطار. والمثير للدهشة أن العينات الأكثر تركيزا (10 ملغم/مل) تظهر انخفاضا إحصائيا في الغلة، يفترض أنه ناتج عن خسائر السحب العرضية. بافتراض >10 ميكروغرام من البروتين ، يجب ملاحظة حبيبة مرئية على جانب القارورة (الشكل 1B). كميات أصغر ، وصولا إلى 1 ميكروغرام ، من الصعب رؤيتها. هذا يتحدى القدرة على ماصة supernatant دون تعطيل بيليه البروتين. يمكن عكس القارورة (ببطء) باستخدام الأسيتون لفصل المذيب عن الكريات. بالنسبة ل CMW ، لا تلتصق الكريات بشكل موثوق بما فيه الكفاية بالقارورة ، وبالتالي تفضل السحب على صب supernatant. بالنسبة لهطول الأمطار القائم على القارورة ، يوصى بالعمل مع أصغر أنبوب طرد مركزي دقيق ممكن لتسهيل أحجام العينة والمذيبات المقصودة. يوفر هطول الأمطار في خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها المستخدمة في هذا العمل سعة حجم قصوى تبلغ 500 ميكرولتر ، مما يتيح هطول الأمطار البروتينية بنسبة 80٪ من الأسيتون على أحجام العينات حتى 100 ميكرولتر.

نقاء بيليه البروتين المستعاد من هطول الأمطار العضوي القائم على المذيبات محدود بسبب تعقيد مصفوفة العينة ومكونات المخزن المؤقت وظروف هطول الأمطار. على سبيل المثال ، ثبت أن مكونات المخزن المؤقت المحددة مثل الجلايسين (المستخدم في فصل SDS PAGE) تترسب مع البروتين باستخدام 80٪ من الأسيتون. ومع ذلك ، لا يزال الجلايسين قابلا للذوبان من خلال هطول الأمطار CMW. تم الإبلاغ عن أن الأسيتون يعجل بشظايا الحمض النووي36,37 ، مما قد يضيف شوائب خلفية غير مرغوب فيها إلى الكريات المستردة. يتطلب هطول الأمطار من البروتينات والببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي مستوى مرتفعا من المذيبات العضوية ونوع ملح محدد لزيادة الغلة إلى أقصى حد. في حين تم استكشاف العديد من الأملاح ، يوفر ZnSO4 منتجات عالية باستمرار. سوف يترسب هذا الملح في 97 ٪ من الأسيتون في غياب البروتين. وبالتالي ، فإن بيليه البروتين الناتج يحتوي على تركيز عال من الملح. ومن الملاحظ أن استخدام 90٪ من الأسيتون من حيث الحجم سيحقق أيضا غلة عالية من الببتيد، على الرغم من أنه من المتوقع حدوث انخفاض كبير إحصائيا (~ 5٪) في الانتعاش. ومع ذلك ، يسمح هذا بمعالجة حجم عينة أكثر أهمية (يصل إلى 180 ميكرولتر ، مع 20 ميكرولتر من 1 M ZnSO4) في كل قارورة 2 مل. بالإضافة إلى شوائب المصفوفة التي تترسب مع حبيبات البروتين ، يجب الإشارة إلى أن هطول الأمطار المذيب يسبب بطبيعته تمسخ العينة38,39. لذلك ، لا ينطبق هذا البروتوكول على مستحضرات البروتينات الوظيفية أو سير عمل MS الأصلي. كما تم الإبلاغ عن أن الأسيتون يسبب تعديلات البروتين التساهمي في بقايا الجلايسين40 ويحفز تحولا كتليا +98 u ، ويتوقع أن يكون منتجا ثانويا لأسيتون تكثيف الألدول41.

عند استخدام خرطوشة ترشيح لهطول الأمطار البروتينية ، يعتمد عزل حبيبات البروتين على الاحتفاظ بالركام فوق مرشح غشاء PTFE. تتجاوز مسامية هذا الغشاء تلك الموجودة في مرشح قطع الوزن الجزيئي (كما هو موضح في FASP) ، مما يسمح بعزل البروتين مع تقليل أوقات الدوران. يعتمد نقل المحلول السريع بسرعات دوران منخفضة على الترطيب السليم لغشاء PTFE ؛ تتدفق المذيبات العضوية بسهولة ، على الرغم من أن مرشح PTFE الجاف يعيق المذيبات المائية. إذا بدا أن خرطوشة الترشيح مسدودة ، فيجب إعادة ترطيب الغشاء عن طريق تطبيق حجم صغير من المذيب العضوي مباشرة (على سبيل المثال ، الأيزوبروبانول) على الفلتر. اعتمادا على حجم بيليه البروتين وحجم العينة المستخدمة ، قد تكون هناك حاجة إلى طرد مركزي إضافي أو يدور بسرعات أعلى (تصل إلى 3000 × جم) لضمان مرور جميع المذيبات عبر خرطوشة الترشيح.

إن استعادة البروتين من هطول الأمطار في ظل الظروف المثلى محدودة في نهاية المطاف بسبب التحدي المتمثل في إعادة إذابة الكريات ، مع وجود عدد قليل من خيارات المذيبات المتوافقة مع المعالجة النهائية و LC-MS. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم العديد من ظروف هطول الأمطار مثل التعرض الطويل لدرجات الحرارة المنخفضة والإفراط في تجفيف حبيبات معبأة بإحكام في تحديات إعادة الذوبان40. ويلاحظ أن كريات بروتين CMW أقل قابلية للذوبان بشكل عام من كريات الأسيتون. تم الإبلاغ سابقا عن زيادة كفاءة إعادة الذوبان للبروتين المترسب بنسبة 80٪ من حمض الفورميك البارد (الخطوة 6.2.2)42 ؛ درجة الحرارة الباردة تمنع تعديل البروتين ، والذي يحدث بخلاف ذلك في حمض الفورميك المركز43,44. تخفيف تركيز الحمض يبطئ أيضا تفاعل التعديل. يوصى باستخدام حمض الفورميك لنهج التصلب المتعدد من أعلى إلى أسفل أو قبل الهضم الأنزيمي باستخدام البيبسين. يتطلب استخدام هذا المذيب القليل من العلاج الطبيعي. قد تكون إضافة 5 ميكرولتر فقط (كافية لتغطية حبيبات البروتين) كافية عند دمجها مع الدوامة أو الصوتنة القصيرة أو السحب المتكرر. وبالمثل ، بالنسبة للعينات المزمع تحليلها بواسطة SDS PAGE ، فإن إعادة الذوبان في مخزن Laemmli المخزن المؤقت المحتوي على SDS يكون فعالا للغاية ، عندما يقترن بخلط متواضع للعينة قبل التسخين. ومع ذلك ، فإن هذه المذيبات غير متوافقة مع التربسين. يوصى بإعادة الذوبان مع 8 مليون يوريا قبل هضم التربسين ، مما يضمن تحضير اليوريا طازجة (في نفس اليوم). يوصى باستخدام مخزن مؤقت لا يقل عن 50 ميكرولتر لإعادة ذوبان البروتين داخل خرطوشة الترشيح لزيادة الاتصال بين المذيب الفوضوي والكريات إلى أقصى حد ، وكذلك للمساعدة في الذوبان أثناء الصوتنة وتكرار السحب و / أو الدوامة. تستغل الأساليب البديلة التربسين لإعادة إذابة البروتين ، مما يعني أنه لا يلزم إعادة إذابة البروتين بالكامل قبل إضافة الإنزيم. ومع ذلك ، يمكن لهذا النهج أن ينحاز إلى الهضم ، ويفضل الأنواع الأكثر قابلية للذوبان بينما تواجه البروتينات الكارهة للماء وقت هضم أقصر45. تتطلب إضافة 8 مليون يوريا ، إلى جانب المخازن المؤقتة الأساسية مثل Tris أو بيكربونات الأمونيوم ، خطوة تنظيف عينة ما بعد الهضم. بالنسبة لإضافات العينات هذه ، يعد تنظيف عمود الطور المعكوس مثاليا. يتم استكمال خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها المستخدمة في هذه الدراسة بخرطوشة SPE قابلة للتبديل ذات مرحلة عكسية. هذه الخرطوشة مناسبة أيضا بشكل مثالي لتبادل المذيبات ، في حالة بروتوكول إعادة إذابة حمض الفورميك. من المهم ملاحظة أن أي نهج لاستخراج الطور الصلب يرتبط بالخسارة المتأصلة في استعادة العينة. لذلك ، يجب على المستخدم أن يزن فوائد الاسترداد والتنقية الإضافية لتجربته.

ومن المتوقع أن تمكن هذه البروتوكولات الباحثين في علم البروتينات من تبسيط سير عملهم القائم على المنظفات، والاستفادة من SDS لاستخراج البروتينات. الاستراتيجيات التحضيرية التي تسهل الاسترداد المستمر للبروتين الكامل أمر بالغ الأهمية. تعمل خرطوشة الدوران ثنائية المراحل على تبسيط فرصة عزل عينة البروتيوم بسرعة وقوة وقابلية للتكرار. وسيكون هذا النهج قابلا للتطبيقات التي تتطلب تحليلا دقيقا دون التضحية بإنتاجية العينات، مثل الإعدادات السريرية أو المبادرات البحثية واسعة النطاق46. قد تشمل التطبيقات المستقبلية لهذه النهج اكتشاف المؤشرات الحيوية والكشف عنها وتحديدها كميا بدقة واكتشاف الأدوية والأدوية المستهدفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

صمم مختبر دوسيت ProTrap XG المستخدم في هذه الدراسة وحصل على براءة اختراعه. AAD هي أيضا شريك مؤسس لشركة Proteoform Scientific ، التي قامت بتسويق خرطوشة تحضير العينات.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا. يشكر المؤلفون شركة Bioinformatics Solutions Inc. (واترلو ، كندا) و SPARC BioCentre (التحليل الجزيئي) في مستشفى الأطفال المرضى (تورونتو ، كندا) لمساهماتهم في الحصول على بيانات MS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Tags

الكيمياء ، العدد 180 ، قياس الطيف الكتلي ، البروتيوميات ، إعداد العينات ، كبريتات دوديسيل الصوديوم ، هطول الأمطار ، هضم البروتين ، الأسيتون ، الكلوروفورم / الميثانول / الماء
ترسيب البروتين العضوي القائم على المذيبات لتنقية البروتيوم القوية قبل قياس الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter