Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר משקעי חלבונים מבוססי ממסים בתנאים מבוקרים להתאוששות וטיהור חזקים ומהירים של דגימות פרוטאום לפני ספקטרומטריית מסות.

Abstract

בעוד שהתקדמות מרובה במכשירי ספקטרומטריית מסות (MS) שיפרה את ניתוח הפרוטאומים האיכותי והכמותי, גישות חזיתיות אמינות יותר לבודד, להעשיר ולעבד חלבונים לפני טרשת נפוצה הן קריטיות לאפיון מוצלח של פרוטאומים. התאוששות חלבון נמוכה ולא עקבית וזיהומים שיוריים כגון חומרים פעילי שטח מזיקים לניתוח טרשת נפוצה. משקעים בחלבון נחשבים לעתים קרובות כלא אמינים, גוזלים זמן ומאתגרים מבחינה טכנית לביצוע בהשוואה לאסטרטגיות אחרות להכנת דגימות. על חששות אלה מתגברים על ידי שימוש בפרוטוקולים אופטימליים של משקעי חלבונים. עבור משקעי אצטון, השילוב של מלחים ספציפיים, בקרת טמפרטורה, הרכב ממסים וזמן משקעים הוא קריטי, בעוד שהיעילות של משקעי כלורופורם/מתנול/מים תלויה בצנרת נכונה ובמניפולציה של בקבוקון. לחלופין, פרוטוקולי משקעים אלה יעילים ואוטומטיים למחצה בתוך מחסנית ספין חד פעמית. התוצאות הצפויות של משקעי חלבון מבוססי ממס בפורמט הקונבנציונלי ושימוש במחסנית סינון ומיצוי חד-שלבית דו-שלבית מודגמות בעבודה זו. זה כולל את האפיון המפורט של תערובות פרוטאומיות על ידי ניתוח LC-MS/MS מלמטה למעלה. הביצועים המעולים של זרימות עבודה מבוססות SDS מודגמים גם ביחס לחלבון שאינו מזוהם.

Introduction

ניתוח פרוטאומים על ידי ספקטרומטריית מסות הפך לקפדני יותר ויותר, בשל הרגישות, הרזולוציה, מהירות הסריקה והרב-תכליתיות המשופרות של מכשירי MS מודרניים. התקדמות הטרשת הנפוצה תורמת ליעילות גדולה יותר של זיהוי חלבונים ולכמות מדויקת יותרשל 1,2,3,4,5. עם מכשור משופר לטרשת נפוצה, החוקרים דורשים אסטרטגיית הכנת דגימות חזיתית עקבית המתאימה, המסוגלת לשחזר כמותית של חלבונים בעלי טוהר גבוה בזמן מינימלי בכל שלבי זרימת העבודה 6,7,8,8,9,10,11 . כדי לשקף במדויק את מצב הפרוטאום של מערכת ביולוגית, יש לבודד חלבונים ממטריצת הדגימה המקומית בצורה יעילה ובלתי משוחדת. לשם כך, כולל חומר פעילי שטח דנטורינג, כגון נתרן דודציל סולפט (SDS), מבטיח מיצוי חלבונים יעיל וסולוביליזציה12. עם זאת, SDS מפריע מאוד ליינון אלקטרוספריי, וגורם לדיכוי אות חמור של טרשת נפוצה אם לא בוטל כראוי13.

אסטרטגיות שונות של דלדול SDS זמינות לניתוח פרוטאומים לאחר מכן, כגון שימור חלבונים מעל מסנן ניתוק משקל מולקולרי הכלול בתוך מחסניות ספין חד פעמיות 14,15,16. שיטת הכנת הדגימה בסיוע מסנן (FASP) מועדפת מכיוון שהיא מדלדלת ביעילות SDS מתחת ל-10 עמודים לדקה, ומאפשרת טרשת נפוצה אופטימלית. עם זאת, התאוששות חלבונים עם FASP היא משתנה, מה שהניע את חקר הטכניקות האחרות. גישות כרומטוגרפיות הלוכדות באופן סלקטיבי חלבון (או פעילי שטח) התפתחו למחסניות נוחות שונות או לפורמטים מבוססי חרוזים 17,18,19,20,21. בהתחשב באסטרטגיות הפשוטות והעקביות (האידיאליות) הללו לטיהור חלבונים, לעתים קרובות מתעלמים מהגישה הקלאסית של משקעי חלבונים עם ממסים אורגניים כגישה מבטיחה לבידוד חלבונים. בעוד שמשקעים ממסים הוכחו כמדלדלים SDS מתחת לרמות קריטיות בהצלחה, התאוששות חלבונים היא דאגה ארוכת שנים של גישה זו. קבוצות רבות הבחינו בהטיית התאוששות חלבונים, עם תפוקת משקעים נמוכה באופן בלתי מתקבל על הדעת כפונקציה של ריכוז חלבונים, משקל מולקולרי והידרופוביות22,23. בשל מגוון פרוטוקולי המשקעים המדווחים בספרות, פותחו תנאי משקעים סטנדרטיים. בשנת 2013, Crowell et al. דיווחו לראשונה על התלות של חוזק יוני ביעילות המשקעים של חלבונים ב-80% אצטון24. עבור כל החלבונים שנבדקו, תוספת של עד 30 mM נתרן כלורי הוכחה כחיונית כדי למקסם את היבולים (עד 100% התאוששות). לאחרונה, ניקרסון ואחרים הראו כי השילוב של חוזק יוני גבוה עוד יותר (עד 100 מ"מ) עם טמפרטורה גבוהה (20 מעלות צלזיוס) במהלך משקעי אצטון נתן כמעט התאוששות כמותית תוך 2-5 דקות25. נצפתה ירידה קלה בהתאוששות של חלבוני משקל מולקולרי נמוך (LMW). לכן, דו"ח מאוחר יותר של Baghalabadi et al. הדגים את ההתאוששות המוצלחת של חלבוני LMW ופפטידים (≤5 kDa) על ידי שילוב של מלחים ספציפיים, במיוחד אבץ גופרתי, עם רמה גבוהה יותר של ממס אורגני (97% אצטון)26.

בעוד שעידון פרוטוקול המשקעים מעניק אסטרטגיה אמינה יותר לטיהור חלבונים עבור פרוטאומיקה מבוססת טרשת נפוצה, ההצלחה של משקעים קונבנציונליים מסתמכת במידה רבה על טכניקת המשתמש. אחת המטרות העיקריות של עבודה זו היא להציג אסטרטגיית משקעים חזקה המאפשרת את הבידוד של גלולת החלבון מהסופרנטנט המזהם. מחסנית סינון חד פעמית פותחה כדי למנוע צנרת על ידי בידוד חלבון מצטבר מעל מסנן קרום PTFE נקבובי27. רכיבים המפריעים ל-MS בסופרנטנט מוסרים ביעילות בשלב צנטריפוגה קצר במהירות נמוכה. מחסנית המסנן החד פעמית מציעה גם מחסנית SPE הניתנת להחלפה, המאפשרת ניקוי דגימות לאחר מכן לאחר רה-lubilization ועיכול חלבונים אופציונלי, לפני ספקטרומטריית מסה.

סדרה של תהליכי עבודה מומלצים של משקעי פרוטאום מוצגים כאן, כולל פרוטוקולים מותאמים של אצטון וכלורופורם/מתנול/מים28 , בפורמט קונבנציונלי (מבוסס בקבוקון) ובפורמט חצי אוטומטי במחסנית סינון ומיצוי חד-פעמית של שני מצבים. התאוששות החלבון המתקבלת ויעילות דלדול ה-SDS מודגשים, יחד עם כיסוי פרוטאום LC-MS/MS מלמטה למעלה, כדי להדגים את התוצאה הצפויה מכל פרוטוקול. היתרונות המעשיים והחסרונות הקשורים לכל גישה נדונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיקולים חומריים והכנה לדוגמה מראש

  1. השתמש רק בממסים בטוהר גבוה (אצטון, כלורופורם, מתנול) (>99.5%) ובכימיקלים, ללא לחות עודפת.
  2. מכינים תמיסות נתרן כלורי ואבץ גופרתי (1 M) במים.
    הערה: ניתן לאחסן תמיסות מלח ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, כל עוד הן נקיות מזיהומים או מצמיחה מיקרוביאלית.
  3. השתמש בבקבוקון המיקרו-צנטריפוגה הקטן ביותר של פוליפרופילן (PP) המספיק כדי לשמור על נפח הדגימה והממסים הנדרשים כדי לגרום למשקעים.
  4. ודא שריכוז ה-SDS במדגם שיש לזרז אינו עולה על 2% (w/v). אם SDS גבוה יותר, דיללו את הדגימה במים.
  5. הקפידו על ריכוז חלבון בין 0.01 ל-10 גרם לליטר ליעילות משקעים אופטימלית.
    הערה: המסה האופטימלית למשקעים נעה בין 1-100 מיקרוגרם חלבון.
  6. ודא שכל הממסים והפתרונות נקיים מחומר חלקיקי לפני השימוש. בצע סינון (<0.5 מיקרומטר) או שלב צנטריפוגה (10,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר) כדי להסיר חלקיקים לא פתורים.
  7. אם נדרשת הפחתת קשרים דיסולפידיים ואלקילציה, בצעו את השלבים הבאים לפני משקעי החלבון. עודף ריאגנטים מפחיתים ואלקילטיים יוסרו בתהליך המשקעים.
  8. זרז את החלבונים על ידי בחירה וביצוע של אחד הפרוטוקולים (שלבים 2, 3, 4 או 5).

2. משקעי חלבון מהירים (על בסיס בקבוקון) עם אצטון

  1. Pipet 90 μL של חלבון (ללא חלקיקים) או תמיסת פרוטאום לתוך צינור מיקרוצנטריפוג PP. לאחר מכן, הוסף 10 μL של 1 M NaCl מימי.
    הערה: אם העוצמה היונית של תמצית הפרוטאום כבר עולה על 100 mM, אין צורך במלח נוסף.
  2. Pipet 400 μL של אצטון לתוך הדגימה. מכסים את הבקבוקון ומקישים על הבקבוקון בעדינות כדי לשלב את הממסים. ערבוב נמרץ אינו נדרש.
    הערה: ניתן להגדיל את נפח החלבון, המלח והאצטון כל עוד נשמר היחס היחסי של כל אחד מהם.
  3. אפשרו לבקבוקון לדגור בטמפרטורת החדר, באין מפריע, למשך 2 דקות לפחות.
    הערה: דגירות ארוכות יותר, כולל אלה בטמפרטורה מופחתת (למשל, משקעי אצטון קונבנציונליים משתמשים במשקעי לילה במקפיא), עשויים לגרום להיווצרות של חלקיקי חלבון מצטברים גדולים יותר (גלויים לעין) (איור 1A), שבדרך כלל אינם משפרים את התאוששות החלבון הכוללת.
  4. לאחר הדגירה, למקם דגימות בצנטריפוגה, תוך ציון כיוון הבקבוקון. סובבו למשך 2 דקות לפחות, בטמפרטורה של 10,000 x g ומעלה בטמפרטורת החדר.
  5. שחררו את הבקבוקון ופרקו בעדינות את ה-supernatant על ידי היפוך איטי של הבקבוקון למיכל פסולת. גע בבקבוקון ההפוך במגבת נייר כדי לשאוב שאריות ממס מהבקבוקון.
    אזהרה: יש לשמור ולהשליך ממסים לפסולת בהתאם לפרוטוקולים המתאימים.
  6. עבור דגימות המכילות SDS, מחלקים 400 μL של אצטון טרי, נזהרים שלא להפריע לכדור.
    הערה: שלב 2.6 הוא אופציונלי.
    1. מיד צנטריפוגה של הדגימה (10,000 x g ומעלה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר), ומניחים את הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. דקאנט את ממס הכביסה כמתואר בשלב 2.5.
  7. אפשרו לדגימה להתייבש באופן מלא כשהכובע פתוח (כדקה אחת). לסכם את הבקבוקון ולהמשיך עם סולוביליזציה של כדוריות (שלב 6).

3. משקעים של פפטידים במשקל מולקולרי נמוך (LMW) (ZnSO4 + אצטון)

  1. מחלקים 54 μL של תמצית פרוטאום לבקבוקון 2 מ"ל PP, ולאחר מכן מוסיפים 6 μL של 1 M ZnSO4.
    הערה: התאוששות אופטימלית של פפטידי LMW (≤5 kDa) מתקבלת על ידי הוספת אצטון ל-97% הסופי לפי נפח. בהנחה של בקבוקון PP של 2 מ"ל, נפח הדגימה הראשוני המקסימלי הוא 54 μL.
  2. הוסף 1940 μL של אצטון ל-97% סופי לפי נפח. מערבלים בעדינות כדי לערבב, ומניחים לעמוד באין מפריע על הספסל למשך 2 דקות לפחות.
  3. צנטריפוגה (10,000 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר) ולהסיר את supernatant על ידי היפוך הבקבוקון, ולאחר מכן לגעת בקבוקון למגבת נייר.
  4. עבור דגימות המכילות SDS, מחלקים 400 μL של אצטון טרי, נזהרים שלא להפריע לכדור.
    הערה: שלב 3.4 הוא אופציונלי.
    1. מיד צנטריפוגה של הדגימה לפי שלב 3.3, תוך הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. נקו את ממס הכביסה כמתואר בשלב 3.3.
  5. יש לסלול מחדש את הכדור היבש שנוצר בממס מימי עם מערבולת קצרה או סאונדציה (כ-5 דקות).

4. משקעי חלבון על ידי כלורופורם/מתנול/מים (CMW)

  1. מחלקים 100 μL של תמיסת החלבון או הפרוטאום לבקבוקון PP. מוסיפים 400 μL של מתנול, ואחריו 100 μL של כלורופורם. מכסים את הבקבוקון והמערבולת לזמן קצר כדי לערבב.
    הערה: עבור משקעי CMW, עדיפות לבקבוקונים של 1.5 מ"ל עם תחתית צרה (איור 2A).
    אזהרה: יש לטפל בממס כלורופורם במכסה אוורור מתאים. יש להתייחס לכל הממסים המגעים עם כלורופורם כאל פסולת הלוגנית כאשר הם מושלכים.
  2. מחלקים במהירות 300 μL של מים ישירות למרכז הבקבוקון. מכסה את הבקבוקון. אפשרו לדגימה לשבת על הספסל באין מפריע במשך דקה אחת.
    הערה: הפתרון ייראה מיד לבן מעונן. הימנעו מערבוב הבקבוקון לאחר הוספת מים.
  3. ממקמים את בקבוקון ה-PP בצנטריפוגה ומסובבים למשך 5 דקות לפחות (10,000 x גרם ומעלה בטמפרטורת החדר).
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, שתי שכבות ממס נראות לעין ייווצרו (שכבה עליונה = מתנול/מים; תחתית = כלורופורם). כדור חלבון מוצק נוצר בממשק הממס (איור 2A).
  4. באמצעות קצה מיקרופיפט גדול (1 מ"ל), והחזקת הבקבוקון בטמפרטורה של כ-45°, הסר כ-700 μL של הממס מהשכבה העליונה בקצב אחיד.
  5. השתמש בקצה מיקרופיפט קטן יותר (200 μL) כדי להמשיך להסיר את שכבת הממס העליונה מהבקבוקון המוטה ~ 45°. פיפט בתנועה רציפה אחת עד ששכבת הממס העליונה יוצרת חרוז בבקבוקון.
  6. הוסיפו 400 μL של מתנול טרי לבקבוקון המדגם, מבלי להפריע לכדור, על ידי חלוקת הממס בצד הבקבוקון.
  7. מכסה את הבקבוקון. שלב את שכבות הממס על ידי נדנדה עדינה של הבקבוקון כדי לסובב את הממסים יחד.
    הערה: חיוני להימנע משיבוש הכדור. אין לסובב את הבקבוקון.
  8. תוך ציון כיוון הבקבוקון ברוטור, צנטריפוגה למשך מינימום של 10 דקות (10,000 x גרם בטמפרטורת החדר). גלולת החלבון נדבקת לתחתית הבקבוקון (איור 2B).
  9. הטה את הבקבוקון ב-45°, כאשר הכדור פונה כלפי מטה. מניחים את קצה הפיפטה לאורך הקצה העליון של הבקבוקון ומסירים את הסופרנטנט עם קצה מיקרופיפטה של 1 מ"ל בקצב איטי אך רציף. שמור על ~ 20 μL של ממס בבקבוקון.
  10. שטפו את גלולת החלבון עבור דגימות המכילות SDS על ידי חלוקה איטית של 400 μL של מתנול טרי. אין לסובב את הבקבוקון.
    1. המשך ישירות עם צנטריפוגה (10,000 x g במשך 2 דקות בטמפרטורה), תוך הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור עם אותו כיוון כמו הספין הראשוני.
  11. הסר את הממס, לפי שלב 4.9. אפשרו לדגימה להתייבש באוויר באדים עד שהממס השיורי יתאדה.
  12. התייעץ עם נהלי ההרגעה המומלצים בשלב 6.

5. משקעי חלבון באמצעות מחסנית סינון חד פעמית

הערה: כל פרוטוקול משקעים מבוסס ממס המתואר בשלבים 2-5 יכול להתבצע במחסנית סינון ומיצוי דו-שלבית (ראה טבלת חומרים).

  1. כאשר התקע מחובר למחסנית הסינון העליונה (איור 3A), הוציאו את הנפח הרצוי של הפרוטאום, המלח והממס המופקים, כפי שמתואר באחת משלוש האפשרויות הבאות.
    1. (אפשרות 1) עבור משקעי חלבון עם אצטון, שלבו 90 μL של תמיסת חלבון או פרוטאום, 10 μL של 1 M NaCl מימי, ו-400 μL של אצטון. דגירה למשך 2 דקות לפחות על הספסל.
      הערה: משקע נראה לעין יתפתח עבור דגימות חלבון מרוכזות (1 גרם/ליטר) (איור 3B).
    2. (אפשרות 2) עבור משקעים פפטידיים של LMW, שלב 15 μL של הדגימה, 1.5 μL של 1 M ZnSO4, ו 485 μL של אצטון. דגירה למשך 2 דקות לפחות על הספסל.
      הערה: ריכוז מלח של 90 mM בדגימה מימית לא ישפיע על ההתאוששות ביחס ל-100 mM המומלצים בשלב 3.
    3. (אפשרות 3) עבור משקעי CMW, הוסיפו 50 μL של תמצית פרוטאום, 200 μL של מתנול ו-50 μL של כלורופורם. מכסה את הבקבוקון ולזמן קצר מערבולת לשילוב.
      1. מחלקים במהירות 150 μL של מים ישירות למרכז הבקבוקון. דגירה במשך דקה אחת על הספסל.
  2. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,500 x g בטמפרטורת החדר עם התקע עדיין מחובר למחסנית הסינון.
  3. הפוך את המחסנית ולאחר מכן פתח את התקע והסר את התקע מבסיס המחסנית.
  4. מניחים את מחסנית הסינון בבקבוקון נקי וחוזרים לצנטריפוגה. סובבו במשך 3 דקות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את ממס הזרימה מהבקבוקון התחתון.
    הערה: אם ממס כלשהו נשאר במחסנית הסינון העליונה, חזור לצנטריפוגה ובצע סיבוב נוסף.
  5. לשטוף את גלולת החלבון על ידי הוספת 400 μL של אצטון למחסנית הסינון (עבור משקעי CMW, שלב 5.1.3, להוסיף 400 μL של מתנול).
  6. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 500 x g בטמפרטורת החדר או עד שלא נשאר ממס במחסנית העליונה.
  7. בצעו מחדש את גלולת המשקעים כמתואר בשלב 6.

6. התפשטות מחדש של גלולת החלבון

  1. הרטיבו את הממברנה בבסיס מחסנית הסינון על ידי חלוקת 2-5 μL של איזופרופנול ישירות לממברנה מיד לפני פרוטוקולי ההרגעה המתוארים להלן.
  2. עקוב אחר אחת משיטות ה- resolubilization הבאות.
    1. (אפשרות 1) הוסף מינימום של 20 μL של מאגר מימי המכיל ≥2% SDS למחסנית הסינון. כובע ומערבולת במרץ (כדקה אחת). לחלופין, sonicate (>10 דקות) כדי לפזר את גלולת החלבון.
      1. מחממים את הדגימה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות). חזור על שלב הערבוב לאחר החימום.
        הערה: מאגר העמסת ג'ל Laemmli יכול לבודד מחדש את גלולת החלבון. עם זאת, דגימות המכילות SDS אינן תואמות לעיכול טריפסין ול-LC ו-MS בפאזה הפוכה.
    2. (אפשרות 2) הכינו תמיסה של 80% (v/v) חומצה פורמית במים. Prechill את תמיסת חומצה (-20 °C), כמו גם את מחסנית הסינון המכילה חלבון מזורז.
      1. מחלקים 50 μL של חומצה פורמית קרה לתוך המחסנית; כובע ומערבולת במשך 30 שניות. חזרו למקפיא (-20 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
      2. מערבולת את המחסנית שוב במשך 30 שניות. לאחר מכן, חזור על מחזור הקירור והערבוב פעם נוספת (10 דקות, -20 מעלות צלזיוס, מערבולת של 30 שניות).
      3. מוסיפים מים ל-500 מיקרול' סופיים, ומדללים את החומצה הפורמית ל-8%.
        הערה: פרוטוקול החומצה הפורמית הקרה אינו תואם לעיכול טריפסין הבא, אך הוא תואם ל- LC-MS.
    3. (אפשרות 3) הוסיפו 50 μL של אוריאה 8 M במים שהוכנו זה עתה למחסנית הסינון. סוניקט למשך 30 דקות.
      1. אפשרו למחסנית לדגור על הספסל למשך שעה אחת (עד הלילה).
      2. דיללו את האוריאה 8 M לפחות פי 5 עם מים או חיץ מתאים.
        הערה: לאחר מדולל, פרוטוקול ה-urea solubilization תואם לעיכול טריפסין הבא, כמו גם ל-LC-MS.

7. עיכול חלבונים

  1. לצורך ניתוח טרשת נפוצה מלמטה למעלה, הכפיפו את החלבונים שעברו ספיגה מחדש לעיכול אנזימטי באמצעות אחת משתי השיטות המוזכרות להלן.
    1. (אפשרות 1) עבור resolubilization חומצה פורמית, להפחית את הנפח הראשוני של 80% חומצה פורמית בשלב 6.2.2.1 עד 25 μL. בשלב 6.2.2.3, השתמש ב-375 μL של מים כדי לדלל את החומצה הפורמית ל-5% (v/v).
    2. מחלקים פפסין למחסנית ביחס חלבון לאנזים משוער של 50:1. עם תקע המחובר למחסנית הסינון, דגירה של הדגימה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  2. (אפשרות 2) עבור resolubilization באוריאה, להבטיח pH בין 8 ל 8.3 עם הכללה של 100 mM של Tris או אמוניום ביקרבונט בשלב 6.2.3.2.
    1. מוסיפים טריפסין ביחס מסה משוער של חלבון לאנזים של 50:1. עם תקע מחובר למחסנית, דגירה של הדגימה למשך הלילה באמבט מים חמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. סיימו את העיכול על ידי החמצת התמיסה עם 10% TFA ל-1% סופיים.
  3. שחזרו את החלבון המעוכל של פפסין או טריפסין על ידי הסרת התקע מבסיס המסנן וצנטריפוגה של המחסנית הכלולה בתוך בקבוקון נקי (2 דקות, 5000 x גרם, טמפרטורת החדר).

8. ניקוי SPE

הערה: עבור התפלת דגימה נוספת לאחר עיכול או החלפת ממסים, הדגימה יכולה להיות כפופה לניקוי פאזה הפוכה כמתואר.

  1. ראש מחסנית SPE (ראה טבלת חומרים) על ידי העברת 300 μL של מתנול (2 דקות, 400 x גרם) ואחריו 300 μL של 5% אצטוניטריל / 0.1% של TFA (2 דקות, 400 x גרם).
  2. חבר את מחסנית ה-SPE הראשונית לבסיס מחסנית הסינון המכילה חלבון שעבר ספיגה מחדש או עיכול.
  3. סובבו את החלבון דרך מחסנית ה-SPE (5 דקות, 800 x גרם בטמפרטורת החדר). אם הממס נשאר במחסנית העליונה, החזר את המחסנית לצנטריפוגה וחזור על הסיבוב.
    הערה: העברת הדגימה דרך מחסנית ה- SPE בפעם השנייה עשויה לשפר את ההתאוששות.
  4. הוסף 300 μL של 5% אצטוניטריל / 0.1% של TFA במים למחסנית. כדי לשטוף, לזרום דרך מחסנית SPE (2 דקות, 2000 x גרם). השליכו את הזרימה-דרך.
  5. עבור חלבוני LMW או פפטידים מעוכלים, יש ללקט את הדגימה על ידי זרימה של 300 μL של 50% אצטוניטריל/0.1% TFA (5 דקות, 2500 x גרם).
  6. עבור חלבונים שלמים, עקוב אחר שלב 8.5 עם שלב אלוטיון נוסף באמצעות 300 μL של 75% אצטוניטריל / 0.1% TFA. שלבו את שתי התמציות המתקבלות.
    הערה: שלב 8.6 הוא אופציונלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 4 מסכם את הידלדלות ה-SDS הצפויה בעקבות משקעים מבוססי בקבוקון או מקלים על מחסנית של חלבונים במחסנית מסנן חד פעמית באמצעות אצטון. דגירה קונבנציונלית בלילה (-20 מעלות צלזיוס) באצטון מושווית לפרוטוקול משקעי האצטון המהיר בטמפרטורת החדר (שלב 2), כמו גם למשקעי CMW (שלב 4). שאריות SDS כומתו על ידי בדיקת החומרים הפעילים הכחולים של מתילן (MBAS)29. בקצרה, דגימת 100 μL שולבה עם ריאגנט 100 μL MBAS (250 מ"ג מתילן כחול, 50 גרם נתרן גופרתי, 10 מ"ל חומצה גופרתית, מדוללת במים ל-1.0 ליטר), ולאחר מכן תוספת של 400 μL כלורופורם ומדידת ספיגה של השכבה האורגנית ב-651 ננומטר בספקטרופוטומטר UV/Vis. כל הגישות מפחיתות את ה-SDS כדי לאפשר ניתוח מיטבי של טרשת נפוצה.

התאוששות חלבונים כמותית וניתנת לשחזור מושגת לאחר משקעי אצטון מהירים ומשקעי CMW, כפי שניתן לראות באיור 5 באמצעות ניתוח SDS PAGE של ליזט תא כולל של שמרים מעובדים. משקעים במחסנית סינון חד פעמית מבטלים את הצורך לטפטף בזהירות את הסופרנטנט המכיל SDS תוך שמירה על החלבונים המצטברים מעל מסנן ממברנה. התאוששות עקבית מתקבלת עם כל פרוטוקולי המשקעים, ללא פסים נראים לעין שזוהו בשברים הסופר-נטנטים על פני שלושה שכפולים בלתי תלויים.

איור 6 מכמת את היבולים הצפויים, כולל התפשטות מחדש של כדורי חלבון מזרזים באמצעות חומצה פורמית קרה (שלב 6). משקעי CMW מאפשרים התאוששות כמותית על ידי שמירה קפדנית על הכדור בגישה מבוססת בקבוקון (שלב 5), השווה לזו המתקבלת באמצעות המחסנית (100 ± 4% לעומת 101 ± 3%, בהתאמה). התאוששות של כדורי חלבון מצודדים באצטון נהנית ממחסנית סינון, עם שיפור של 15-20% בתפוקה שנצפה. בבקבוקונים, בידודו של האצטון סופרנאטנט מהחלבון המצטבר מסתמך למעשה על היצמדות הכדור למשטח צינור ה-PP; מחסנית הסינון מבטלת חשש זה מכיוון שהמסנן מבטיח התאוששות גבוהה של חלבון מזורז ללא צנרת.

כדי לשחזר ביעילות חלבונים ופפטידים של LMW, פרוטוקול המשקעים של האצטון משתנה על ידי החלפת NaCl ב-ZnSO4 והעלאת אחוז הממסים ל-97%. שילוב של מלח ספציפי זה ורמות גבוהות יותר של ממס אורגני נדרשים להתאוששות גבוהה של חלבוני LMW ופפטידים26. כפי שניתן לראות באיור 7, משקעי חלבון מבוססי מחסניות מדגימים התאוששות מעולה של דגימה מעוכלת של פלזמת שור שעברה פפסין ביחס למשקעים על בסיס בקבוקון. מחסנית הספין החד-פעמית יכולה לשחזר יותר מ-90% מהפפטידים של LMW. הבדלים משמעותיים יותר בתפוקה מצוינים במחסנית בעת שימוש ב- NaCl, המאשרים את החשיבות של סוג המלח כדי למקסם את התשואה. הכללת ZnSO4 בניגוד ל-NaCl גורמת לכדור חלבון מצטבר הנלכד ביתר קלות על ידי מסנן מחסנית הספין.

כדי להעריך את היעילות של חלבונים מזרזים בטווח דינמי רחב, עובדה תערובת של שלושה חלבונים סטנדרטיים: β-גלקטוזידאז (β-גל) מ-E. coli, ציטוכרום c (Cyt c) משור, ואנולאז (Eno) מ-S. cerevisiae. יחס המסה של β-גל:Cyt c:Eno היה 10,000:10:1. הדגימות הכילו בתחילה 2% מה-SDS לפני משקעים מבוססי מחסניות (שלב 5) וסולובליות מחדש ועוכלו עם טריפסין (שלבים 6 ו-7). דגימות שהוכנו בבקבוקונים שימשו כבקרה, ללא SDS והשמטת המשקעים. כל הדגימות היו כפופות לניקוי SPE שווה ערך (שלב 8). נערכה טרשת נפוצה מלמטה למעלה, כאשר ספקטרום MS/MS נערך חיפוש מול מסד נתונים משולב המכיל את כל החלבונים משלושת המינים המעורבים (ראו טבלת חומרים עבור פלטפורמות מכשירים ותוכנה). נעשה שימוש בשיעור גילוי כוזב של פפטידים של 1%. כל שלושת החלבונים זוהו על ידי טרשת נפוצה, עם 666, 28 ו-35 פפטידים ייחודיים עבור β-gal, Cyt c ו-Eno, בהתאמה. איור 8 מכמת את היחס היחסי (עוצמת השיא של הפפטיד) מכל דגימה, כאשר יחס מעל 1 משקף שפע פפטידים גבוה יותר עבור דגימות המעובדות במחסניות המסנן החד-פעמיות. התוצאות מדגימות את היתרונות של שילוב SDS בזרימת עבודה של פרוטאומיקה, מזעור אובדן חלבונים (למשל, מספיחה פוטנציאלית לבקבוקון הדגימה) ומקסום תפוקת הפפטידים.

כבד בקר נרכש במכולת מקומית. החלבונים בודדו על ידי חילוץ הרקמה בתמיסה של 1% SDS. לאחר מכן, הפרוטאום שהתאושש היה מזרז, סולוביליזציה מחדש (אוריאה), ומעוכל עם טריפסין, הכל בתוך מחסנית חד פעמית. בוצע LC-MS/MS מלמטה למעלה, וכתוצאה מכך זוהה כ-8,000 חלבונים בממוצע (כ-30,000 פפטידים). נעשה שימוש בשיעורי גילוי שווא של 0.5% ו-1.0% עבור ספקטרום פפטידים וקבוצות חלבונים, בחיפוש אחר מסד הנתונים של הבקר. יכולת השכפול הטכנית של זרימת עבודה מבוססת מחסנית זו מוערכת באמצעות זיהויי חלבונים חופפים. זריקות הטרשת הנפוצות המשוכפלות של דגימה מעושעת נפוצה משיגות בממוצע 78 ± 0.5% חפיפה עם החלבונים שזוהו. לשם השוואה, דגימות שהוכנו באופן עצמאי במחסניות בדידות השיגו חפיפה של 76 ± 0.5%. נתונים אלה מצביעים על כך שתרומת הכנת המדגם לשונות הכוללת של הניתוח היא מינורית, ביחס לזו שכבר תרמה על ידי הגישה האינסטרומנטלית של LC-MS. חלבוני הבקר שזוהו משלושה שכפולים טכניים (שעובדו באופן עצמאי בשלוש מחסניות חד-פעמיות) התאפיינו עוד יותר לגבי המשקל המולקולרי שלהם, ההידרופוביות והנקודה האיזואלקטרית שלהם, המוצגים באיור 9. ANOVA דו-כיווני לא הצליח לקבוע הבדלים סטטיסטיים בפרוטאומים שזוהו על פני השכפולים הטכניים. לבסוף, איור 10 משווה את מספר הפפטידים שזוהו לכל חלבון בשלושת תכשירי הדגימה המשוכפלת. מקדמי המתאם בגרפים אלה (0.94-0.95) מדגימים את העקביות הגבוהה של גישת הכנת המדגם לניתוח טרשת נפוצה מלמטה למעלה.

Figure 1
איור 1: חלבונים בעלי אצטון. דגימות המכילות 100 ו-1,000 מיקרוגרם של חלבון בשילוב עם 100 mM NaCl וזרז עם 80% אצטון (A) לאחר זמן משקעים של 5 דקות ו-(B) לאחר משקעים וצנטריפוגה שלאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: משקעי חלבון על ידי כלורופורם/מתנול/מים. דגימה המכילה 50 מיקרוגרם חלבון זירזה לפי שלב 4. (א) מיד לאחר שלב 4.4. (ב) מיד לאחר שלב 4.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונות של מחסנית סינון ומיצוי חד-שלבית דו-שלבית למשקעי חלבון. דגימה שהכילה 100 מיקרוגרם חלבון שולבה עם 100 mM של NaCl ו-80% אצטון ב-(A) הסינון המורכב ומחסנית ה-SPE ו-(B) הואצה במשך 5 דקות עד שאגרגירי חלבונים הפכו גלויים לעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: יעילות דלדול SDS בעקבות משקעי חלבון. אחוז ה-SDS שהוסר מוצג משקעי אצטון עם הפרוטוקול הקונבנציונלי (לילה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס), הפרוטוקול המהיר (2 דקות דגירה בטמפרטורת החדר), או על ידי משקעי כלורופורם/מתנול/מים (CMW) של ליזט S. cerevisiae , הן בפורמט קונבנציונלי (בקבוקון) והן בפורמט מחסנית. דגימות אלה הכילו בתחילה 0.5% SDS (5,000 ppm), והסיקו >99.8% הסרת SDS נדרשת לניתוח מיטבי של טרשת נפוצה. שאריות SDS כומתות על ידי בדיקת חומרים פעילים כחולים של מתילן (MBAS). פסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן משכפולים טכניים (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: התאוששות פרוטאום כוללת באמצעות משקעים. SDS PAGE מראה את ההתאוששות של S. cerevisiae סה"כ חלבון lysate, המואצת על ידי (A) משקעי אצטון קונבנציונליים, (B) משקעי כלורופורם/מתנול/מים, ו-(C) משקעי אצטון מהירים. רצועות חלבון נצפות באופן בלעדי בשבר הכדור, ללא רצועות נראות לעין בסופרנטנט (Super.). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: שחזור חלבון מעולה בתוך מחסנית סינון. עבור משקעים של S. cerevisiae סה"כ חלבון lysate, מחסנית הספין החד פעמית מאפשרת התאוששות כמותית עם משקעים אצטון ו- CMW. התאוששות גבוהה אפשרית גם עם משקעים על בסיס בקבוקון, אם כי נדרשת מניפולציה זהירה של דגימה וצנרת. התאוששות חלבונים מוערכת LC-UV לאחר resolubilization של הכדור עם חומצה פורמית קרה מוצגים כאן. פסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן משכפולים טכניים (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: תפוקת משקעים גבוהה עבור פפטידים במשקל מולקולרי נמוך. פרוטוקול משקעים אצטון שונה עבור פפטידים וחלבונים ≤5 kDa כרוך בצימוד של 100 mM של ZnSO4 עם 97% אצטון כדי להשיג את התשואות הגבוהות ביותר. משקעים המתאפשרים על ידי מחסנית סינון חד פעמית מדגימים התאוששות משופרת בהשוואה למשקעים קונבנציונליים מבוססי בקבוקון בכל שלושת תנאי המשקעים. פסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן משכפולים טכניים (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: התאוששות גבוהה יותר של חלבונים סטנדרטיים בתהליך עבודה מבוסס SDS. Tukey Box-and-Whisker מתווה30 של עוצמת האותות היחסית של טרשת נפוצה עבור פפטידים שהתאוששו מחלבונים המכילים SDS שעובדו במחסנית סינון חד פעמית ביחס לדגימת בקרה (ללא SDS, ללא משקעים). החלבונים המועסקים משתרעים על פני טווח דינמי רחב של ריכוזים-β-גלקטוזידאז:ציטוכרום c:enolase = 10,000:10:1. כל רבעון בתוך התיבות מכיל 25% מההתפלגות, בעוד שפסי שגיאה מקיפים 95% מההתפלגות. הממוצע מסומן על ידי "+" וחציון על ידי קו אופקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: התפלגויות חלבונים מזוהות משכפולים טכניים. חלקות Tukey Box-and-Whisker מאפיינות (A) את המשקל המולקולרי, (B) הידרופוביות, ו-(C) את הנקודה האיזואלקטרית של חלבונים שזוהו על-ידי LC-MS/MS מלמטה למעלה בעקבות תכשירים משולשים של ליזאט כבד בקר במחסנית סינון ומיצוי דו-שלבית. לא היה הבדל סטטיסטי במאפיינים אלה על ידי ANOVA דו-כיווני (עמ' < 0.05). כל רבעון בתוך התיבות מכיל 25% מההתפלגות, בעוד שפסי שגיאה מקיפים 95% מההתפלגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: מתאם של מזהי פפטידים לחלבון באמצעות תהליך הכנה מבוסס SDS על פני שכפולים מכינים. ניתוח של שכפול פרוטאום מלמטה למעלה בדגימות (A) 1 ו-2, (B) דגימות 2 ו-3, ו-(C) דגימות 1 ו-3 בהתבסס על מספר הזיהויים של פפטידי MS לכל חלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אפיון מיטבי של טרשת נפוצה מושג כאשר SDS שיורי מתרוקן מתחת ל-10 עמודים לדקה. בעוד שגישות חלופיות, כגון FASP ועיכול על חרוזים, מציעות דלדול כמותי של SDS עם התאוששות משתנה 31,32,33, המטרה העיקרית של משקעים היא למקסם את הטוהר והתפוקה בו זמנית. זה תלוי בבידוד יעיל של הסופרנטנט (המכיל את ה-SDS) מבלי להפריע לכדור החלבון. עם משקעים על בסיס בקבוקון, ברגע שחלק הארי של הסופרנאטנט מוסר על ידי צנרת, סביר יותר ויותר שחלק מהכדורים המצטברים הולכים לאיבוד בטעות. מסיבה זו, חיוני להשאיר מאחור חלק משמעותי יותר של הממס השיורי (~ 20 μL) ולהוסיף שלב כביסה34. שלב הכביסה מדלל ומסיר את שאריות הממס מהבקבוקון. במיוחד עם CMW, אין צורך לסובב את בקבוקון הדגימה לאחר שהכדור נוצר. לשיבוש הכדור באמצעות תסיסה נמרצת יש השפעה לא רצויה של הגדלת הסבירות לאובדן מצנרת מקרית. אם מערבולת כלולה (כפי שהומלץ על ידי פרוטוקולים קודמים)35, קיים הפוטנציאל של חלקים מכדור ה- CMW לדבוק בחלק התחתון של מכסה הבקבוקון; לאחר צנטריפוגה, הכדור נשאר קבוע על מכסה הבקבוקון ועלול לגרום לאובדן של כ-50%.

משקעים מהירים יכולים להתבצע עם התאוששות גבוהה של דגימות פרוטאום מדוללות, באופן אידיאלי בין 0.01-2 מ"ג /מ"ל, או מסת חלבון מקבילה בין 1-200 מיקרוגרם. עם זאת, התאוששות כמותית וניתנת לשחזור החל מפחות מ-0.01 מ"ג/מ"ל חלבון עשויה להפיק תועלת מזמני משקע ארוכים יותר הנעים בין 10 דקות לשעה אחת, מה שמדגים את מגבלות התפוקה של זרימת העבודה של המשקעים. באופן מפתיע, דגימות מרוכזות יותר (10 מ"ג/מ"ל) מראות ירידה סטטיסטית בתפוקה, ככל הנראה כתוצאה מהפסדי צנרת מקריים. בהנחה >-10 מיקרוגרם חלבון, יש לראות כדור נראה לעין בצד הבקבוקון (איור 1B). כמויות קטנות יותר, עד 1 מיקרוגרם, הן מאתגרות לצפייה. זה מאתגר את היכולת לטפטף את הסופרנאטנט מבלי לשבש את גלולת החלבון. ניתן להפוך את הבקבוקון (לאט) עם אצטון כדי להפריד את הממס מהכדור. עבור CMW, הכדור אינו נצמד באופן אמין מספיק לבקבוקון, ובכך מעדיף צנרת על פני דקאנטינג של הסופרנאטנט. עבור משקעים מבוססי בקבוקון, עבודה עם צינור microcentrifuge הקטן ביותר האפשרי מומלץ כדי להקל על נפחי הדגימה והממס המיועדים. משקעים במחסנית הסינון החד פעמית המשמשת בעבודה זו מספקים קיבולת נפח מקסימלית של 500 μL, ומאפשרת משקעי חלבון עם 80% אצטון על נפחי דגימה של עד 100 μL. ניתן להתאים את נפחי הדגימה, המלח והממס בהתאם אם הריכוזים המומלצים נשמרים.

טוהר כדור החלבון שהתאושש ממשקעים מבוססי ממס אורגני מוגבל על ידי המורכבות של מטריצת הדגימה, רכיבי החיץ ותנאי המשקעים. לדוגמה, רכיבי חיץ ספציפיים כגון גליצין (המשמשים להפרדות SDS PAGE) הוכחו כמזרזים יחד עם חלבון באמצעות 80% אצטון. עם זאת, גליצין נשאר מסיס באמצעות משקעי CMW. דווח כי אצטון מזרז מקטעי דנ"א36,37, מה שעלול להוסיף זיהומי רקע לא רצויים לכדורית שהתאוששה. משקעים של חלבונים ופפטידים במשקל מולקולרי נמוך דורשים רמה גבוהה של ממס אורגני וסוג מלח מסוים כדי למקסם את התפוקה. בעוד מספר מלחים נחקרו, ZnSO4 מספק מוצרים גבוהים באופן עקבי. מלח זה יזרז ב-97% אצטון בהיעדר חלבון. לפיכך, גלולת החלבון המתקבלת מכילה ריכוז גבוה של מלח. יש לציין כי שימוש ב-90% אצטון לפי נפח ישיג גם הוא תפוקת פפטידים גבוהה, אם כי צפויה ירידה מובהקת סטטיסטית (כ-5%) בהתאוששות. עם זאת, זה מאפשר עיבוד נפח דגימה משמעותי יותר (עד 180 μL, עם 20 μL של 1 M ZnSO4) בכל בקבוקון 2 מ"ל. מעבר לזיהומי מטריצה המתמזגים עם גלולת החלבון, יש לציין כי משקעים ממסים גורמים מטבעם לדנטורציה של הדגימה38,39. לכן, פרוטוקול זה אינו ישים להכנות של חלבונים פונקציונליים או זרימות עבודה מקוריות של טרשת נפוצה. כמו כן, דווח כי אצטון גורם לשינויים קוולנטיים בחלבון קוולנטי בשאריות גליצין40 ומשרה תזוזת מסה של +98 u, שהוערך כתוצר לוואי של אצטון עיבוי אלדול41.

בעת שימוש במחסנית סינון למשקעי חלבונים, בידוד גלולת החלבון מסתמך על שימור אגרגטים מעל מסנן ממברנת PTFE. הנקבוביות של קרום זה עולה על זו של מסנן ניתוק משקל מולקולרי (כפי שניתן לראות ב-FASP), ומאפשרת בידוד חלבונים עם זמני ספין מופחתים. העברת תמיסה מהירה במהירויות ספין נמוכות מסתמכת על הרטבה נכונה של קרום ה-PTFE; ממיסים אורגניים זורמים בקלות, אם כי מסנן PTFE יבש מעכב ממיסים מימיים. אם מחסנית הסינון נראית סתומה, יש להרטיב מחדש את הממברנה על ידי החלת נפח קטן של ממס אורגני (למשל, איזופרופנול) על המסנן. בהתאם לגודל גלולת החלבון ולנפח הדגימה שבה נעשה שימוש, ייתכן שיידרשו צנטריפוגות או ספינים נוספים במהירויות גבוהות יותר (עד 3,000 x גרם) כדי להבטיח שכל הממסים עברו דרך מחסנית הסינון.

התאוששות חלבונים ממשקעים עם תנאים אופטימליים מוגבלת בסופו של דבר על ידי האתגר של ספיגה מחדש של כדוריות, כאשר מעט אפשרויות ממס תואמות לעיבוד במורד הזרם ול- LC-MS. בנוסף, מספר תנאי משקעים כגון חשיפות ארוכות לטמפרטורות נמוכות וייבוש יתר של גלולה צפופה תורמים לאתגרי ספיגה מחדש40. הוא ציין כי כדורי חלבון CMW הם בדרך כלל פחות מסיסים מאשר כדורי אצטון. יעילות מקסימלית של סולוביליזציה מחדש של חלבון מזורז על ידי 80% חומצה פורמית קרה (שלב 6.2.2) דווחה בעבר42; הטמפרטורה הקרה מונעת שינוי חלבון, אשר אחרת מתרחשת בחומצה פורמית מרוכזת43,44. דילול ריכוז החומצה גם מאט את תגובת השינוי. חומצה פורמית מומלצת לגישות טרשת נפוצה מלמעלה למטה או לפני עיכול אנזימטי עם פפסין. שימוש בממס זה דורש טיפול פיזי מועט; תוספת של 5 μL בלבד (מספיק כדי לכסות את גלולת החלבון) עשויה להספיק בשילוב עם מערבולות, צלילה קצרה או צנרת חוזרת. באופן דומה, עבור דגימות המיועדות לניתוח על ידי SDS PAGE, המסה מחדש במאגר Laemmli המכיל SDS יעילה ביותר, בשילוב עם ערבוב צנוע של הדגימה לפני החימום. עם זאת, ממסים אלה אינם עולים בקנה אחד עם טריפסין. מומלץ להרגיע עם 8 M אוריאה לפני העיכול של טריפסין, מה שמבטיח שהאוריאה הוכנה זה עתה (באותו יום). נפח מינימלי של 50 μL buffer מומלץ עבור re-solubilization של חלבונים בתוך מחסנית הסינון כדי למקסם את המגע בין הממס הכאוטרופי לכדור, כמו גם כדי לסייע בהתמוססות במהלך סוניקציה, צנרת חוזרת ו /או מערבולת. גישות חלופיות מנצלות את הטריפסין כדי להמיס מחדש את החלבון, כלומר אין צורך להמיס מחדש את החלבון באופן מלא לפני הוספת האנזים. עם זאת, גישה זו יכולה להטות את העיכול, ולהעדיף את המינים המסיסים יותר בעוד חלבונים הידרופוביים חווים זמן עיכול קצר יותר45. תוספת של 8 M אוריאה, יחד עם מאגרים בסיסיים כגון Tris או אמוניום ביקרבונט, דורשת שלב ניקוי דגימה לאחר העיכול. עבור תוספים לדוגמה כאלה, ניקוי עמודת פאזה הפוכה הוא אידיאלי. מחסנית הסינון החד פעמית ששימשה במחקר זה מתווספת למחסנית SPE פאזה הפוכה הניתנת להחלפה. מחסנית זו מתאימה גם באופן אידיאלי להחלפת ממסים, במקרה של פרוטוקול resolubilization חומצה פורמית. חשוב לציין כי כל גישת מיצוי פאזה מוצקה קשורה לאובדן אינהרנטי בהתאוששות הדגימה. לכן, המשתמש צריך לשקול את היתרונות של התאוששות ואת הטיהור הנוסף עבור הניסוי שלהם.

הצפי הוא שפרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרי פרוטאומיקה לייעל את תהליכי העבודה מבוססי חומרי הניקוי שלהם, תוך ניצול SDS להפקת פרוטאומים. אסטרטגיות הכנה המאפשרות התאוששות עקבית של הפרוטאום המלא הן קריטיות. מחסנית ספין דו-שלבית מפשטת את ההזדמנות לבידוד דגימות פרוטאום מהיר, חזק וניתן לשחזור. גישה כזו תהיה מקובלת על יישומים הדורשים ניתוח קפדני מבלי להקריב תפוקות דגימה, כגון הגדרות קליניות או יוזמות מחקר בקנה מידה גדול46. יישומים עתידיים של גישות אלה עשויים לכלול גילוי סמנים ביולוגיים, זיהוי, כמות מדויקת וגילוי מטרות של תרופות ותרופות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מעבדת Doucette הגתה ורשמה פטנט על ProTrap XG שהועסק במחקר זה. AAD הוא גם שותף מייסד של Proteoform Scientific, אשר מסחור מחסנית הכנת הדגימה.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה. המחברים מודים לביואינפורמטיקה סולושנס בע"מ (ווטרלו, קנדה) ול-SPARC BioCentre (אנליזה מולקולרית) בבית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה) על תרומתם לרכישת נתוני טרשת נפוצה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Tags

כימיה גיליון 180 ספקטרומטריית מסות פרוטאומיקה הכנת דגימות נתרן דודציל סולפט משקעים עיכול חלבונים אצטון כלורופורם/מתנול/מים
משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter