Summary
本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。
Abstract
質量分析(MS)機器の複数の進歩により、定性的および定量的プロテオーム分析が改善されましたが、MSに先んじてタンパク質を単離、濃縮、および処理するためのより信頼性の高いフロントエンドアプローチは、プロテオーム特性評価を成功させるために不可欠です。低く、一貫性のないタンパク質回収率および界面活性剤などの残留不純物は、MS分析に有害である。タンパク質沈殿は、他のサンプル調製戦略と比較して、信頼性が低く、時間がかかり、技術的に実行が難しいと考えられがちです。これらの懸念は、最適なタンパク質沈殿プロトコルを採用することによって克服されます。アセトン沈殿の場合、特定の塩、温度制御、溶媒組成、および沈殿時間の組み合わせが重要ですが、クロロホルム/メタノール/水沈殿の効率は適切なピペッティングとバイアル操作に依存します。あるいは、これらの沈殿プロトコルは、使い捨てスピンカートリッジ内で合理化され、半自動化されています。従来の形式で、使い捨ての2段階ろ過および抽出カートリッジを使用した溶媒ベースのタンパク質沈殿の予想される結果を、この研究で示します。これには、ボトムアップのLC-MS/MS 分析によるプロテオーム混合物の詳細な特性評価が含まれます。SDSベースのワークフローの優れた性能は、非汚染タンパク質と比較しても実証されています。
Introduction
質量分析によるプロテオーム分析は、最新のMS機器の感度、分解能、スキャン速度、汎用性の向上により、ますます厳格になっています。MSの進歩は、より高いタンパク質同定効率およびより正確な定量1,2,3,4,5に寄与する。改善されたMS機器により、研究者は、ワークフローのすべての段階で最小限の時間で高純度タンパク質を定量回収できる、それに対応して一貫したフロントエンドサンプル調製戦略を求めています6,7,8,9,10,11 .生物学的系のプロテオーム状態を正確に反映するには、タンパク質を効率的かつ偏りのない方法で天然のサンプルマトリックスから単離する必要があります。この目的のために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの変性界面活性剤を含む、効率的なタンパク質抽出および可溶化12を保証する。しかし、SDSはエレクトロスプレーイオン化を強く妨害し、適切に排除しないと厳しいMS信号抑制を引き起こす13。
使い捨てスピンカートリッジ14、15、16内に含まれる分子量カットオフフィルターを超えるタンパク質の保持など、その後のプロテオーム分析のために様々なSDS枯渇戦略が利用可能である。フィルター支援サンプル調製法(FASP)は、10ppm未満のSDSを効果的に枯渇させ、最適なMSを容易にするため、好まれています。しかし、FASPによるタンパク質回収は可変であり、これが他の技術の探求を促した。タンパク質(または界面活性剤)を選択的に捕捉するクロマトグラフィーアプローチは、様々な便利なカートリッジまたはビーズベースのフォーマットに進化してきた17、18、19、20、21。タンパク質精製に対するこれらの単純で(理想的には)一貫した戦略を考えると、有機溶媒によるタンパク質沈殿の古典的なアプローチは、タンパク質単離への有望なアプローチとして見過ごされがちです。溶媒沈殿はSDSを臨界レベル以下に正常に枯渇させることが示されていますが、タンパク質回収はこのアプローチの長年の懸念事項でした。複数のグループがタンパク質回収バイアスを観察しており、タンパク質濃度、分子量、疎水性の関数として許容できないほど低い沈殿収率で22,23。文献で報告された沈殿プロトコルの多様性のために、標準化された沈殿条件が開発された。2013年、Crowellらは、80%アセトン24中のタンパク質の沈殿効率に対するイオン強度の依存性を最初に報告した。調べたすべてのタンパク質について、最大30mM塩化ナトリウムの添加は、収量を最大化する(最大100%回収)ために不可欠であることが示された。より最近では、Nickersonらは、アセトン沈殿中のさらに高いイオン強度(最大100mM)と高温(20°C)の組み合わせが、2〜5分25分でほぼ定量的な回復をもたらすことを示した。低分子量(LMW)タンパク質の回収率のわずかな低下が観察された。したがって、Baghalabadiらによるその後の報告では、特定の塩、特に硫酸亜鉛をより高いレベルの有機溶媒(97%アセトン)と組み合わせることによって、LMWタンパク質およびペプチド(≤5kDa)の回収に成功したことが実証されました26。
沈殿プロトコルを精製することで、MSベースのプロテオミクスのタンパク質精製戦略がより信頼性の高いものになりますが、従来の沈殿の成功はユーザーの技術に大きく依存しています。この研究の主な目的は、汚染上清からのタンパク質ペレットの単離を容易にする堅牢な沈殿戦略を提示することです。使い捨てろ過カートリッジは、多孔質PTFEメンブレンフィルター27の上に凝集タンパク質を単離することによってピペッティングを排除するために開発された。上清中のMS干渉成分は、短時間の低速遠心分離工程で効果的に除去されます。使い捨てフィルターカートリッジは、交換可能なSPEカートリッジも提供しており、質量分析に先立って、再可溶化とオプションのタンパク質消化後の後続のサンプルクリーンアップを容易にします。
ここでは、修正アセトンおよびクロロホルム/メタノール/水28 プロトコルを含む一連の推奨プロテオーム沈殿ワークフローを、従来の(バイアルベース)および使い捨ての2状態ろ過および抽出カートリッジの半自動形式で紹介します。得られたタンパク質回収率とSDS枯渇効率をボトムアップのLC-MS/MSプロテオームカバレッジとともに強調し、各プロトコルから期待される結果を実証します。各アプローチに関連する実用的な利点と欠点について説明します。
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Protocol
1. 材料に関する考慮事項とサンプルの事前準備
- 高純度の溶媒(アセトン、クロロホルム、メタノール)(>99.5%)と化学薬品のみを使用し、余分な水分を含まない。
- 水に塩化ナトリウムと硫酸亜鉛の溶液(1 M)を調製する。
注:塩溶液は、汚染物質または微生物の増殖がない限り、室温で無期限に保存することができます。 - 沈殿を誘導するために必要な量のサンプルと溶媒を保持するのに十分な最小のポリプロピレン(PP)微量遠心分離バイアルを使用してください。
- 沈殿させるサンプル中のSDS濃度が2%(w/v)以下であることを確認します。SDSが高い場合は、サンプルを水で希釈します。
- 最適な沈殿効率を得るために、0.01 ~ 10 g/L のタンパク質濃度を確保します。
注:沈殿に最適な質量は、1〜100μgのタンパク質の範囲です。 - 使用前に、すべての溶媒および溶液に粒子状物質がないことを確認してください。ろ過(<0.5 μm)または遠心分離工程(室温で10,000 x g で1分間)のいずれかを実行して、未溶解の微粒子を除去します。
- ジスルフィド結合還元およびアルキル化が必要な場合は、タンパク質沈殿の前にこれらのステップを実施してください。過剰な還元試薬およびアルキル化試薬は、沈殿プロセスを通じて除去されるであろう。
- プロトコールのいずれかを選択して実行することにより、タンパク質を沈殿させる(ステップ2、3、4、または5)。
2. アセトンによる迅速な(バイアルベースの)タンパク質沈殿
- ピペット90 μLの(微粒子フリー)タンパク質またはプロテオーム溶液をPP微量遠心チューブに入れます。次いで、10 μLの1 MNaCl水溶液を加える。
注:プロテオーム抽出物のイオン強度がすでに100mMを超える場合、追加の塩は必要ありません。 - ピペット400 μLのアセトンをサンプルに含む。バイアルにキャップを付け、バイアルを静かにタップして溶媒を結合します。激しい混合は必要ありません。
注:タンパク質、塩、およびアセトンの体積は、それぞれの相対比が維持されている限り、増加させることができる。 - バイアルを室温で、乱されずに、最低2分間インキュベートする。
注:低温でのインキュベーションを含むより長いインキュベーション(例えば、従来のアセトン沈殿は冷凍庫での一晩沈殿を使用する)は、より大きな(目に見える)凝集タンパク質微粒子の形成をもたらし(図1A)、一般に総タンパク質回収率を改善しない。 - インキュベーション後、サンプルを遠心分離機に入れ、バイアルの向きに注意します。室温で10,000 x g 以上で最低2分間回転します。
- バイアルのキャップを外し、バイアルをゆっくりと廃棄物容器に反転させて上清を静かにデカントします。反転したバイアルをペーパータオルにタッチして、バイアルから残留溶媒を引き出します。
警告: 廃溶剤は、適切なプロトコルに従って保管し、廃棄してください。 - SDS含有サンプルの場合は、ペレットを乱さないように注意しながら、400μLの新鮮なアセトンを分注してください。
メモ: ステップ 2.6 はオプションです。- 直ちにサンプルを遠心分離し(室温で10,000 x g 以上で1分間)、バイアルを初期スピンと同じ向きでローターに入れます。ステップ2.5で説明したように洗浄溶媒をデカントする。
- キャップを開けたままサンプルを完全に乾燥させます(約1分)。バイアルを要約し、ペレット可溶化を進める(ステップ6)。
低分子量(LMW)ペプチド(ZnSO4+アセトン)の沈殿
- 54 μL のプロテオーム抽出物を 2 mL の PP バイアルに分注し、次いで 6 μL の 1 M ZnSO4 を加える。
注:LMWペプチド(≤5kDa)の最適な回収率は、最終的に97体積%にアセトンを添加することによって得られる。2 mL PP バイアルを仮定すると、最大初期サンプル量は 54 μL です。 - 1940 μLのアセトンを最終的な97容量%に加える。静かに渦巻いて混ぜ合わせ、ベンチトップに乱れずに最低2分間放置します。
- 遠心分離機(室温で10,000 x g で1分間)し、バイアルを反転させて上清を除去し、次いでバイアルをペーパータオルに接触させた。
- SDS含有サンプルの場合は、ペレットを乱さないように注意しながら、400μLの新鮮なアセトンを分注してください。
メモ: ステップ 3.4 はオプションです。- ステップ3.3に従ってサンプルを直ちに遠心分離し、バイアルを初期スピンと同じ向きでローターに入れる。ステップ3.3で説明したように洗浄溶媒をデカントする。
- 得られた乾燥ペレットを、短時間のボルテックスまたは超音波処理(〜5分)で水性溶媒に再可溶化する。
4. クロロホルム/メタノール/水(CMW)によるタンパク質沈殿
- 100 μLのタンパク質またはプロテオーム溶液をPPバイアルに分配します。400 μLのメタノールを加え、続いて100 μLのクロロホルムを加えます。バイアルと渦を短くキャップして混合します。
注: CMW 沈殿の場合、底が狭い 1.5 mL バイアルが好まれます(図 2A)。
警告: クロロホルム溶剤は、適切な換気フードで取り扱う必要があります。クロロホルムと接触するすべての溶媒は、廃棄時にハロゲン化廃棄物として処理する必要があります。 - 300μLの水をバイアルの中央に直接素早く分配する。バイアルにキャップを付けます。サンプルをベンチトップに1分間邪魔されずに座らせます。
注:ソリューションはすぐに白く濁って表示されます。水を加えた後にバイアルを混ぜないでください。 - PPバイアルを遠心分離機に入れ、最低5分間(室温で10,000 x g 以上)回転させます。
注:遠心分離すると、2つの可視溶媒層が形成されます(上層=メタノール/水、下層=クロロホルム)。固体タンパク質ペレットは、溶媒界面で形成される(図2A)。 - 大きな(1mL)マイクロピペットチップを使用して、バイアルを〜45°に保持し、上層から約700μLの溶媒を均一な速度で除去する。
- より小さい(200 μL)マイクロピペットチップを使用して、〜45°傾けたバイアルから上部溶媒層を除去し続けます。ピペットは、上部溶媒層がバイアル内でビーズを形成するまで1回の連続運動で起こる。
- 400 μLの新鮮なメタノールをサンプルバイアルに加え、ペレットを乱すことなく、溶媒をバイアルの側面に分配することによって。
- バイアルにキャップを付けます。バイアルを静かに揺らして溶媒層を結合し、溶媒を一緒に渦巻きます。
注:ペレットを乱さないようにすることが不可欠です。バイアルを渦巻きにしないでください。 - ローター内のバイアルの向きに注目して、最低10分間遠心分離機(室温で10,000 x g )します。タンパク質ペレットはバイアルの底に付着する(図2B)。
- ペレットを下に向けてバイアルを45°傾けます。ピペットチップをバイアルの上端に沿って置き、1mLのマイクロピペットチップで上清をゆっくりと連続した速度で除去する。バイアル中に約20μLの溶媒を保持する。
- SDS含有サンプル用のタンパク質ペレットを、400μLの新鮮なメタノールをゆっくりと分配して洗浄する。バイアルを渦巻きにしないでください。
- 遠心分離(温度で2分間10,000 x g )を直接進め、バイアルを最初のスピンと同じ向きでローターに入れます。
- ステップ4.9に従って溶媒を除去する。残留溶媒が蒸発するまで、サンプルを煙道で空気乾燥させます。
- ステップ 6 で推奨されている再可溶化手順を参照してください。
5. 使い捨てろ過カートリッジを使用したタンパク質沈殿
注: ステップ 2 ~ 5 で説明する各溶媒ベースの沈殿プロトコルは、2 段階のろ過および抽出カートリッジで実行できます ( 材料表を参照)。
- 上部のろ過カートリッジにプラグを取り付けた状態で(図3A)、以下の3つのオプションのいずれかで概説されているように、抽出されたプロテオーム、塩、および溶媒の所望の体積を分配します。
- (オプション1)アセトンによるタンパク質沈殿の場合は、90 μL のタンパク質またはプロテオーム溶液、10 μL の 1 M NaCl 水溶液、および 400 μL のアセトンを組み合わせてください。ベンチトップで最低2分間インキュベートします。
注:濃縮タンパク質サンプル(1 g/L)では、目に見える沈殿物が発生します(図3B)。 - (オプション2)LMW ペプチド沈殿の場合は、15 μL のサンプル、1.5 μL の 1 M ZnSO4、および 485 μL のアセトンを組み合わせます。ベンチトップで最低2分間インキュベートします。
注: 水性サンプル中の塩濃度が 90 mM であっても、ステップ 3 で推奨されている 100 mM と比較して回復率には影響しません。 - (オプション3)CMW 沈殿の場合は、プロテオーム抽出物 50 μL、メタノール 200 μL、クロロホルム 50 μL を追加します。バイアルをキャップし、簡単に渦を合わせます。
- 150μLの水をバイアルの中央に直接素早く分配します。ベンチトップで1分間インキュベートします。
- (オプション1)アセトンによるタンパク質沈殿の場合は、90 μL のタンパク質またはプロテオーム溶液、10 μL の 1 M NaCl 水溶液、および 400 μL のアセトンを組み合わせてください。ベンチトップで最低2分間インキュベートします。
- プラグをろ過カートリッジに取り付けたまま、室温で2,500 x g で2分間遠心分離します。
- カートリッジを反転させ、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外します。
- ろ過カートリッジを清潔なバイアルに入れ、遠心分離機に戻します。室温で500 x g で3分間スピンします。フロースルー溶媒を下部バイアルから廃棄する。
メモ: 上部のろ過カートリッジに溶媒が残っている場合は、遠心分離機に戻り、さらにスピンを実行します。 - ろ過カートリッジに 400 μL のアセトンを加えてタンパク質ペレットを洗浄します (CMW 沈殿の場合、ステップ 5.1.3、メタノール 400 μL を追加します)。
- 室温で500 x g で3分間、または上部カートリッジに溶媒が残らなくなるまで遠心分離します。
- ステップ6で説明したように沈殿ペレットを再可溶化する。
6. タンパク質ペレットの再可溶化
- 以下に記載する再可溶化プロトコールの直前に2〜5μLのイソプロパノールを膜に直接分配することによって、濾過カートリッジの基部にある膜を濡らす。
- 以下のいずれかの再可溶化方法に従う。
- (オプション1)≥2% SDSを含む水性緩衝液を少なくとも20μLをろ過カートリッジに加えます。キャップと渦を激しく(〜1分)。あるいは、超音波処理(>10分)してタンパク質ペレットを分散させる。
- 試料を95°Cで5分間加熱する)。加熱後に混合工程を繰り返す。
注:Laemmliゲルローディングバッファーは、タンパク質ペレットを再可溶化することができます。しかしながら、SDS含有試料は、トリプシン消化および逆相LCおよびMSと互換性がない。
- 試料を95°Cで5分間加熱する)。加熱後に混合工程を繰り返す。
- (オプション2)水中に80%(v / v)ギ酸の溶液を調製する。酸溶液(-20°C)、並びに沈殿したタンパク質を含む濾過カートリッジをプレチルする。
- 50μLの冷たいギ酸をカートリッジに分注する。キャップと渦を30秒間。冷凍庫(-20°C)に10分間戻します。
- カートリッジをもう一度 30 秒間押し込みます。その後、冷却混合サイクルをもう1回繰り返す(10分、-20°C、30秒ボルテックス)。
- 最後の500μLに水を加え、ギ酸を8%に希釈する。
注:コールドギ酸プロトコルは、その後のトリプシン消化と互換性がありませんが、LC-MSと互換性があります。
- (オプション3)50 μLの新しく調製した8 M尿素を水中でろ過カートリッジに加えます。30分間超音波処理する。
- カートリッジをベンチトップで1時間(一晩まで)インキュベートします。
- 8 M尿素を水または適切な緩衝液で最低5倍に希釈する。
注:一度希釈されると、尿素可溶化プロトコルは、その後のトリプシン消化およびLC-MSと互換性があります。
- (オプション1)≥2% SDSを含む水性緩衝液を少なくとも20μLをろ過カートリッジに加えます。キャップと渦を激しく(〜1分)。あるいは、超音波処理(>10分)してタンパク質ペレットを分散させる。
7. タンパク質消化
- ボトムアップMS分析のために、以下に述べる2つの方法のうちの1つを用いて、再可溶化タンパク質を酵素消化に供する。
- (オプション1)ギ酸再可溶化の場合は、ステップ6.2.2.1で80%ギ酸の初期容量を25 μLに減らします。ステップ6.2.2.3では、375μLの水を使用してギ酸を5%(v/v)に希釈します。
- ペプシンをタンパク質と酵素のおおよその比率50:1でカートリッジに分配します。ろ過カートリッジにプラグを取り付けて、サンプルを室温で一晩インキュベートします。
- (オプション2)尿素中での再可溶化のために、ステップ6.2.3.2で100mMのトリスまたは炭酸水素アンモニウムを含有させて、8〜8.3の間のpHを確保する。
- トリプシンをおおよそのタンパク質対酵素質量比50:1で加える。プラグをカートリッジに取り付けて、サンプルを37°Cの温水浴中で一晩インキュベートする。
- 溶液を10%TFAで酸性化して消化を最終1%まで終了させる。
- フィルターのベースからプラグを取り外し、清潔なバイアル(2分、5000 x g、室温)に含まれるカートリッジを遠心分離して、ペプシンまたはトリプシン消化タンパク質を回収します。
8. SPE クリーンアップ
注: 消化または溶媒交換後の追加のサンプル脱塩の場合、サンプルは説明されているように逆相クリーンアップの対象となる可能性があります。
- SPEカートリッジ(材料表を参照)を300 μLのメタノール(2分、400 x g)に、続いて300 μLの5%アセトニトリル/0.1%のTFA(2分、400 x g)を通してプライムします。
- プライミングされたSPEカートリッジを、再可溶化または消化されたタンパク質を含む濾過カートリッジのベースに接続します。
- SPEカートリッジを通してタンパク質を回転させます(5分、室温で800 x g )。上部のカートリッジに溶媒が残っている場合は、カートリッジを遠心分離機に戻してスピンを繰り返します。
メモ: サンプルを SPE カートリッジに 2 度目に通すと、回復率が向上する場合があります。 - 300 μL の 5% アセトニトリル/0.1% の TFA を水に浸してカートリッジに加えます。洗浄するには、SPEカートリッジ(2分、2000 x g)を流します。フロースルーを破棄します。
- LMWタンパク質または消化ペプチドの場合は、50%アセトニトリル/0.1%TFA(5分、2500 x g)を300μL流してサンプルを溶出します。
- インタクトなタンパク質の場合は、ステップ8.5に従い、300 μL の 75% アセトニトリル/0.1% TFA を使用した追加の溶出ステップを実行します。得られた 2 つの抽出物を結合します。
メモ: ステップ 8.6 はオプションです。
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Representative Results
図4 は、アセトンを用いた使い捨てフィルターカートリッジ中のタンパク質のバイアルベースまたはカートリッジ促進沈殿に続く予想されるSDS枯渇を要約する。アセトン中での従来の一晩インキュベーション(−20°C)は、室温での迅速なアセトン沈殿プロトコル(ステップ2)、ならびにCMW沈殿(ステップ4)と比較される。残留SDSは、メチレンブルー活性物質(MBAS)アッセイ29によって定量した。簡単に説明すると、100 μLサンプルを100 μLのMBAS試薬(250 mgメチレンブルー、50 g硫酸ナトリウム、10 mL硫酸、水で1.0 Lに希釈)と組み合わせ、続いて400 μLのクロロホルムを添加し、UV/Vis分光光度計で651 nmの有機層の吸光度を測定しました。すべてのアプローチは、最適なMS分析を可能にするためにSDSを削減します。
定量的かつ再現性のあるタンパク質回収は、処理された酵母全細胞溶解物のSDS PAGE分析を通じて 図5 に見られるように、迅速なアセトン沈殿およびCMW沈殿の後に達成される。使い捨てろ過カートリッジで沈殿させると、凝集タンパク質をメンブレンフィルターの上に保持しながら、SDS 含有上清を慎重にピペッティングする必要がなくなります。すべての沈殿プロトコルで一貫した回収が得られ、3つの独立した反復にわたって上清画分に目に見えるバンドが検出されません。
図6は 、冷ギ酸を用いた沈殿タンパク質ペレットの再可溶化を含む期待収率を定量化する(ステップ6)。CMW沈殿は、バイアルベースのアプローチ(ステップ5)でペレットを慎重に保存することによって定量的回収をもたらし、これはカートリッジを使用して得られたものと等しい(それぞれ100±4%対101±3%)。アセトン沈殿タンパク質ペレットの回収は、ろ過カートリッジの恩恵を受け、収率の15〜20%の改善が観察される。バイアルにおいて、凝集タンパク質からのアセトン上清の単離は、本質的にペレットのPPチューブ表面への付着に依存する。ろ過カートリッジは、フィルターがピペッティングなしで沈殿したタンパク質の高い回収率を保証するため、この懸念を排除します。
LMWタンパク質およびペプチドを効率的に回収するために、アセトン沈殿プロトコルは、ZnSO4の代わりにNaClを置換し、溶媒の割合を97%に上げることによって変更される。この特定の塩とより高いレベルの有機溶媒を組み合わせることは、LMWタンパク質およびペプチドの高い回収のために必要とされる26。図7に見られるように、カートリッジベースのタンパク質沈殿は、バイアルベースの沈殿と比較して、ウシ血漿のペプシン消化サンプルの優れた回収率を示しています。使い捨てスピンカートリッジは、LMWペプチドの90%以上を回収することができます。NaClを使用する場合、カートリッジでは収率のより有意な違いが認められ、収率を最大化するための塩タイプの重要性が確認される。NaClとは対照的にZnSO4を含むと、スピンカートリッジフィルターによってより容易に捕捉される凝集タンパク質ペレットが得られる。
広いダイナミックレンジにわたって沈殿タンパク質の有効性を評価するために、大 腸 菌由来のβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)、ウシ由来のシトクロムc(Cyt c)、および セレビシエ菌由来のエノラーゼ(Eno)の3つの標準タンパク質の混合物を処理した。β-gal:Cyt c:Enoの質量比は10,000:10:1であった。サンプルは、カートリッジベースの沈殿の前に最初に2%のSDSを含み(ステップ5)、再可溶化され、トリプシンで消化された(ステップ6および7)。バイアルで調製したサンプルは対照として作用し、SDSを有さず、沈殿を省略した。全てのサンプルは、同等のSPEクリーンアップの対象となった(ステップ8)。ボトムアップMSを実施し、MS/MSスペクトルを、関係する3種のすべてのタンパク質を含む結合データベースに対して検索した(機器およびソフトウェアプラットフォームについては 、材料表 を参照)。1%のペプチド偽発見率を採用した。3つのタンパク質はすべてMSによって同定され、それぞれβ-gal、Cyt c、およびEnoについて666、28、および35のユニークなペプチドが同定された。 図8 は、使い捨てフィルターカートリッジで処理されたサンプルに対するより高いペプチド存在量を反映して、各サンプルからの相対比(ペプチドピーク強度)を1より上に定量化します。この結果は、SDSをプロテオミクスワークフローに組み込み、タンパク質損失(例えば、潜在的な吸着からサンプルバイアルへの吸着)を最小限に抑え、ペプチド収率を最大化することの利点を実証しています。
牛の肝臓は地元の食料品店で調達されました。タンパク質を、1%SDSの溶液で組織を抽出することによって単離した。続いて、回収されたプロテオームを沈殿させ、再可溶化(尿素)し、トリプシンで消化し、すべて使い捨てカートリッジ内で行った。ボトムアップのLC-MS/MS を実施し、平均 8,000 個のタンパク質 (約 30,000 個のペプチド) を同定しました。ペプチドスペクトルおよびタンパク質群について0.5%および1.0%の偽発見率を採用し、ウシデータベースを検索した。このカートリッジベースのワークフローの技術的再現性は、重複するタンパク質同定によって評価されます。一般的な消化サンプルの複製MS注射は、同定されたタンパク質と平均78±0.5%の重複を達成します。対照的に、ディスクリートカートリッジで独立して調製されたサンプルは、76±0.5%のオーバーラップを達成しました。これらのデータは、分析の全変動性に対するサンプル調製の寄与が、LC-MS機器アプローチによって既に寄与されているものと比較して、軽微であることを示唆している。3つの技術的複製物(3つの使い捨てカートリッジで独立して処理)から同定されたウシタンパク質は、その分子量、疎水性、および等電点に関してさらに特徴付けられ、 図9に示した。二元配置分散分析では、技術的反復にわたって同定されたプロテオームの統計的差異を決定することができませんでした。最後に、 図10 は、3つの複製サンプル調製物にわたるタンパク質当たりの同定ペプチドの数を比較する。これらのグラフの相関係数(0.94~0.95)は、ボトムアップMS分析のためのサンプル調製アプローチの高い一貫性を示しています。
図1:アセトン沈殿タンパク質。 100および1,000μgのタンパク質を含むサンプルを100mM NaClと組み合わせ、80%アセトンで沈殿させ(A)沈殿時間(A)以下の5分間および(B)以下の沈殿およびその後の遠心分離。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:クロロホルム/メタノール/水によるタンパク質沈殿 工程4に従って沈殿した50μgのタンパク質を含む試料。(A) ステップ4.4の直後。(B) ステップ 4.8 の直後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:タンパク質沈殿用の使い捨て2段ろ過および抽出カートリッジの写真。 100 μgのタンパク質を含むサンプルを、(A)組み立てたろ過およびSPEカートリッジ中で100 mMのNaClおよび80%アセトンと組み合わせ、(B)タンパク質凝集体が見えるまで5分間沈殿させた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:タンパク質沈殿後のSDS枯渇効率。 除去されたSDSの割合は、従来のプロトコル(-20°Cで一晩)、迅速なプロトコル(室温で2分間のインキュベーション)、または従来の(バイアル)およびカートリッジ形式の両方で、 S. cerevisiae 溶解物のクロロホルム/メタノール/水(CMW)沈殿によるアセトン沈殿から示される。これらのサンプルは当初0.5%SDS(5,000ppm)を含んでいたため、最適なMS分析には>99.8%SDS除去が必要であると推測されます。残留SDSは、メチレンブルー活性物質(MBAS)アッセイによって定量される。エラーバーは、テクニカル反復からの標準偏差(n=3)を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:沈殿による全プロテオーム回収率 SDS PAGEは、(A)従来のアセトン沈殿、(B)クロロホルム/メタノール/水沈殿、および(C)アセトン急速沈殿によって沈殿したS. cerevisiae総タンパク質溶解物の回収率を示す。タンパク質バンドはペレット画分中にのみ観察され、上清中に目に見えるバンドはない(Super。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ろ過カートリッジ内の優れたタンパク質回収率S. cerevisiae総タンパク質溶解物の沈殿のために、使い捨てスピンカートリッジはアセトンおよびCMW沈殿による定量的回収を容易にする。バイアルベースの沈殿でも高い回収が可能ですが、慎重なサンプル操作とピペッティングが必要です。LC−UVは、冷たいギ酸によるペレットの再可溶化後のタンパク質回収率を評価した。エラーバーは、テクニカル反復からの標準偏差(n=3)を表す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:低分子量ペプチドの高い沈殿収率。 ペプチドおよびタンパク質 ≤5 kDaの修飾アセトン沈殿プロトコールでは、100 mM の ZnSO4 を 97% アセトンと結合させて、最高の収率を達成します。使い捨てろ過カートリッジによって促進される沈殿は、3つの沈殿条件すべてにわたって従来のバイアルベースの沈殿と比較して改善された回収率を示す。エラーバーは、テクニカル反復からの標準偏差(n=3)を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:SDSベースのワークフローにおける標準タンパク質のより高い回収率。 Tukey Box-and-Whiskerは、使い捨てろ過カートリッジで処理されたSDS含有タンパク質から回収されたペプチドについて、対照試料(SDSなし、沈殿なし)に対する相対MSシグナル強度の30 をプロットします。使用されるタンパク質は、広い濃度ダイナミックレンジβ-ガラクトシダーゼ:シトクロムc:エノラーゼ= 10,000:10:1にまたがる。ボックス内の各四分位数には分布の25%が含まれ、エラーバーは分布の95%を囲みます。平均は「+」で示され、中央値は水平線で示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:技術複製から同定されたタンパク質分布。 Tukey Box-and-Whisker プロットは、2 段階のろ過および抽出カートリッジでウシ肝臓溶解液を 3 連調製した後のボトムアップ LC-MS/MS によって同定されるタンパク質の (A) 分子量、(B) 疎水性、および (C) 等電点を特徴付けます。二元配置分散分析によるこれらの特性に統計的差異はなかった(p <0.05)。ボックス内の各四分位数には分布の25%が含まれ、エラーバーは分布の95%を囲みます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:分取複製物全体にわたるSDSベースの調製ワークフローを通じたタンパク質あたりのペプチドIDの相関。 タンパク質あたりのペプチドMS同定数に基づいて、(A)サンプル1および2、(B)サンプル2および3、および(C)サンプル1および3にわたるボトムアッププロテオーム再現性の分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
最適なMS特性評価は、残留SDSが10ppm未満で枯渇すると達成されます。FASPやビーズ上消化などの代替アプローチは、可変回収率31、32、33で定量的なSDS枯渇を提供しますが、沈殿の主な目的は純度と収率を同時に最大化することです。これは、タンパク質ペレットを乱すことなく上清(SDSを含む)を効果的に単離することに依存する。バイアルベースの沈殿では、上清の大部分がピペッティングによって除去されると、凝集したペレットの一部が誤って失われる可能性がますます高まります。このため、残留溶媒のより有意な画分(〜20μL)を残し、洗浄工程34を追加することが不可欠である。洗浄工程では、バイアルから残留溶媒を希釈して除去します。特にCMWでは、ペレットが形成されると試料バイアルを渦巻く必要がない。激しい攪拌によってペレットを破壊すると、偶発的なピペッティングによる損失の可能性を高めるという望ましくない効果があります。ボルテックスが含まれる場合(以前のプロトコルで推奨されているように)35、CMWペレットの一部がバイアルキャップの下側に付着する可能性がある。遠心分離されると、ペレットはバイアルキャップに固定されたままであり、〜50%の損失をもたらす可能性がある。
迅速な沈殿は、希薄なプロテオームサンプルの高い回収率(理想的には0.01〜2 mg/mL、または対応するタンパク質質量1〜200 μg)で実行できます。しかし、0.01 mg/mL タンパク質未満から始まる定量的かつ再現性のある回収は、10 分から 1 時間の範囲のより長い沈殿時間の恩恵を受ける可能性があり、沈殿ワークフローのスループットの制限を実証します。驚くべきことに、より濃縮されたサンプル(10 mg/mL)は、おそらく偶発的なピペッティング損失による収量の統計的減少を示しています。>10μgのタンパク質を仮定すると、バイアルの側面に目に見えるペレットが観察されるはずです(図1B)。1 μgまでの少量は、見るのが難しいです。これは、タンパク質ペレットを破壊することなく上清をピペットする能力に挑戦する。バイアルをアセトンで(ゆっくりと)反転させて、ペレットから溶媒を分離することができる。CMWの場合、ペレットはバイアルに十分に確実に付着しないため、上清のデカントよりもピペッティングが有利になります。バイアルベースの沈殿の場合、意図したサンプルおよび溶媒量を容易にするために、可能な限り最小の微量遠心チューブで作業することが推奨されます。この作業で採用されている使い捨てろ過カートリッジ内の沈殿は、500 μLの最大容量容量を提供し、最大100 μLのサンプル量に対して80%アセトンによるタンパク質沈殿を可能にします。
有機溶媒ベースの沈殿から回収されるタンパク質ペレットの純度は、サンプルマトリックス、バッファー成分、および沈殿条件の複雑さによって制限されます。例えば、グリシン(SDS PAGE分離に使用される)などの特定の緩衝液成分は、80%アセトンを使用してタンパク質と共沈することが示されている。しかしながら、グリシンはCMW沈殿を通して可溶性のままである。アセトンはDNA断片36、37を沈殿させることが報告されており、回収されたペレットに望ましくないバックグラウンド不純物を添加する可能性がある。低分子量タンパク質およびペプチドの沈殿には、収率を最大化するために、より高いレベルの有機溶媒および特定の塩タイプが必要である。いくつかの塩が検討されているが、ZnSO4は一貫して高い製品を提供している。この塩は、タンパク質の非存在下で97%アセトン中で沈殿する。これにより、得られるタンパク質ペレットは、高濃度の塩を含有する。体積基準で90%のアセトンを採用すると、高いペプチド収率も達成されるが、統計的に有意な回収率の低下(〜5%)が予想されることに留意されたい。しかし、これにより、各2mLバイアルでより有意なサンプル量(最大180μL、1M ZnSO4の20μLで)を処理することができます。タンパク質ペレットと共沈するマトリックス不純物を超えて、溶媒沈殿が本質的に試料38、39の変性を引き起こすと述べなければならない。したがって、このプロトコルは、機能性タンパク質の調製または天然MSワークフローには適用されない。アセトンはまた、グリシン残基40で共有結合タンパク質修飾を引き起こし、+98uの質量シフトを誘導することが報告されており、アセトン41のアルドール縮合の副産物であると推測される。
タンパク質沈殿に濾過カートリッジを採用する場合、タンパク質ペレットの単離は、PTFEメンブレンフィルターの上方の凝集体の保持に依存する。この膜の空隙率は、(FASPに見られるように)分子量カットオフフィルターの空隙率を超えており、スピン時間を短縮してタンパク質単離を可能にします。低スピン速度での迅速な溶液移動は、PTFE膜の適切な濡れに依存します。有機溶剤は容易に流れますが、乾燥PTFEフィルターは水性溶剤を妨げます。ろ過カートリッジが目詰まりしているように見える場合は、少量の有機溶媒(例えば、イソプロパノール)をフィルターに直接塗布することによって、膜を再濡らす必要があります。タンパク質ペレットのサイズと使用するサンプルの量によっては、すべての溶媒がろ過カートリッジを通過したことを確認するために、追加の遠心分離または高速(最大 3,000 x g)でのスピンが必要になる場合があります。
最適な条件での沈殿からのタンパク質回収は、最終的にペレット再可溶化の課題によって制限され、下流処理およびLC-MSと互換性のある溶媒オプションはほとんどありません。さらに、低温への長時間の暴露や密に充填されたペレットの過乾燥などのいくつかの沈殿条件は、再可溶化の課題40に寄与する。CMWタンパク質ペレットは、一般にアセトンペレットよりも溶解性が低いことに留意されたい。80%冷ギ酸による沈殿タンパク質の最大化再可溶化効率(ステップ6.2.2)は、以前に報告されている42;低温は、そうでなければ濃ギ酸43,44で起こるタンパク質修飾を防止する。酸濃度を希釈すると、修飾反応も遅くなる。ギ酸は、トップダウンMSアプローチまたはペプシンによる酵素消化の前に推奨されます。この溶媒を使用しても、物理的な処理はほとんど必要ありません。わずか5μL(タンパク質ペレットを覆うのに十分)の添加は、ボルテックス、短時間の超音波処理、またはピペッティングの繰り返しと組み合わせるのに十分であり得る。同様に、SDS PAGEによって分析されることを意図したサンプルの場合、SDS含有Laemmli緩衝液への再溶解は、加熱前のサンプルの適度な混合と組み合わせると、非常に有効である。しかしながら、これらの溶媒は、いずれもトリプシンと相溶性ではない。トリプシン消化の前に8 M尿素による再可溶化が推奨され、尿素が新鮮に調製された(同じ日)ことを確認する。50 μLのバッファーの最小容量は、カオトロピック溶媒とペレットとの間の接触を最大化するだけでなく、超音波処理中の溶解を助けるために、ろ過カートリッジ内のタンパク質の再可溶化のために推奨されます, ピペッティングおよび/またはボルテックスを繰り返します.代替アプローチは、トリプシンを利用してタンパク質を再可溶化し、酵素添加前にタンパク質を完全に再溶解する必要はないことを意味する。しかし、このアプローチは消化を偏らせる可能性があり、疎水性タンパク質がより短い消化時間を経験する一方で、より可溶性の種を好む45。8 M 尿素を、トリスや重炭酸アンモニウムなどの塩基性緩衝液と共に添加するには、消化後のサンプルクリーンアップステップが必要です。このようなサンプル添加剤の場合、逆相カラムクリーンアップが理想的です。この研究で採用された使い捨てろ過カートリッジには、交換可能な逆相SPEカートリッジが補足されています。このカートリッジは、ギ酸再可溶化プロトコルの場合の溶媒交換にも理想的です。固相抽出アプローチは、サンプル回収における固有の損失と関連していることに注意することが重要です。したがって、ユーザーは、回収の利点と実験のための追加の精製を比較検討する必要があります。
これらのプロトコルにより、プロテオミクス研究者は洗剤ベースのワークフローを合理化し、プロテオーム抽出にSDSを活用することが期待されています。完全なプロテオームの一貫した回復を促進する分取戦略が重要である。2段スピンカートリッジは、迅速で堅牢で再現性のあるプロテオームサンプル単離の機会を簡素化します。このようなアプローチは、臨床現場や大規模な研究イニシアチブ46など、サンプルスループットを犠牲にすることなく厳密な分析を必要とするアプリケーションに適しているであろう。これらのアプローチの将来の用途には、バイオマーカーの発見、検出、正確な定量、および薬物および薬物標的の発見が含まれ得る。
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Disclosures
Doucette研究所は、この研究で採用されたProTrap XGを考案し、特許を取得しました。AADはまた、サンプル調製カートリッジを商品化したプロテオフォーム・サイエンティフィックの創設パートナーでもあります。
Acknowledgments
この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会から資金提供を受けました。著者らは、MSデータの取得に貢献してくれたBioinformatics Solutions Inc.(カナダ、ウォータールー)とHospital for Sick Children(トロント、カナダ)のSPARC BioCenter(Molecular Analysis)に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
References
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