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Chemistry

Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

O presente protocolo descreve a precipitação de proteínas à base de solventes em condições controladas para recuperação e purificação robustas e rápidas de amostras de proteome antes da espectrometria de massa.

Abstract

Embora os múltiplos avanços nos instrumentos de espectrometria de massa (MS) tenham melhorado a análise qualitativa e quantitativa do proteome, abordagens front-end mais confiáveis para isolar, enriquecer e processar proteínas à frente da ES são fundamentais para uma caracterização proteome bem-sucedida. Recuperação de proteínas baixas e inconsistentes e impurezas residuais, como surfactantes, são prejudiciais à análise de ESM. A precipitação proteica é muitas vezes considerada não confiável, demorada e tecnicamente desafiadora de executar em comparação com outras estratégias de preparação da amostra. Essas preocupações são superadas pela utilização de protocolos ideais de precipitação de proteínas. Para precipitação de acetona, a combinação de sais específicos, controle de temperatura, composição de solventes e tempo de precipitação é crítica, enquanto a eficiência da precipitação de clorofórmio/metanol/água depende da manipulação adequada da tubulação e do frasco. Alternativamente, esses protocolos de precipitação são simplificados e semi-automatizados dentro de um cartucho de spin descartável. Os resultados esperados da precipitação proteica à base de solventes no formato convencional e utilizando um cartucho descartável de filtragem e extração em dois estágios são ilustrados neste trabalho. Isso inclui a caracterização detalhada das misturas proteômicas por análise de LC-MS/MS de baixo para cima. O desempenho superior dos fluxos de trabalho baseados em SDS também é demonstrado em relação à proteína não contaminada.

Introduction

A análise proteome por espectrometria de massa tornou-se cada vez mais rigorosa, devido à sensibilidade, resolução, velocidade de varredura aprimorada e versatilidade dos instrumentos modernos de ESM. Os avanços em MS contribuem para maior eficiência de identificação de proteínas e uma quantitação mais precisa 1,2,3,4,5. Com a melhor instrumentação de ES, os pesquisadores exigem uma estratégia de preparação de amostra frontal correspondentemente consistente capaz de recuperação quantitativa de proteínas de alta pureza em tempo mínimo em todas as etapas do fluxo de trabalho 6,7,8,9,10,11 . Para refletir com precisão o estado proteome de um sistema biológico, as proteínas devem ser isoladas da matriz amostral nativa de forma eficiente e imparcial. Para isso, incluir um surfactante de desnaturação, como sulfato de dodecil de sódio (SDS), garante a extração eficiente de proteínas e solubilização12. No entanto, a SDS interfere fortemente na ionização de eletrospray, causando supressão severa de sinal de MS se não for devidamente eliminada13.

Várias estratégias de esgotamento do SDS estão disponíveis para análises proteome subsequentes, como a retenção de proteínas acima de um filtro de corte de peso molecular contido dentro de cartuchos de spin descartáveis 14,15,16. O método de preparação da amostra auxiliado por filtro (FASP) é favorecido, pois efetivamente esgota o SDS abaixo de 10 ppm, facilitando a MS ideal. No entanto, a recuperação de proteínas com FASP é variável, o que motivou a exploração de outras técnicas. Abordagens cromatográficas que capturam seletivamente proteína (ou surfactante) evoluíram em vários cartuchos convenientes ou formatos baseados em contas 17,18,19,20,21. Dadas essas estratégias simples e (idealmente) consistentes para a purificação de proteínas, a abordagem clássica da precipitação de proteínas com solventes orgânicos é muitas vezes negligenciada como uma abordagem promissora para o isolamento proteico. Embora a precipitação de solventes seja demonstrada para esgotar a SDS abaixo dos níveis críticos com sucesso, a recuperação de proteínas tem sido uma preocupação de longa data dessa abordagem. Vários grupos observaram um viés de recuperação de proteínas, com rendimentos inaceitáveis de baixa precipitação em função da concentração de proteínas, peso molecular e hidrofobitude22,23. Devido à diversidade de protocolos de precipitação relatados na literatura, foram desenvolvidas condições padronizadas de precipitação. Em 2013, Crowell et al. relataram pela primeira vez a dependência da força iônica na eficiência de precipitação das proteínas em 80% de acetona24. Para todas as proteínas examinadas, a adição de até 30 mM de cloreto de sódio mostrou-se essencial para maximizar os rendimentos (até 100% de recuperação). Mais recentemente, Nickerson et al. mostraram que a combinação de força iônica ainda maior (até 100 mM) com temperatura elevada (20 °C) durante a precipitação de acetona deu recuperação quase quantitativa em 2-5 min25. Observou-se uma ligeira queda na recuperação de proteínas de baixo peso molecular (LMW). Portanto, um relatório subsequente de Baghalabadi et al. demonstrou a recuperação bem sucedida de proteínas LMW e peptídeos (≤5 kDa) combinando sais específicos, particularmente sulfato de zinco, com um nível mais alto de solvente orgânico (97% acetona)26.

Embora o refino do protocolo de precipitação dê uma estratégia de purificação de proteínas mais confiável para a proteômica baseada em MS, o sucesso da precipitação convencional depende fortemente da técnica do usuário. O objetivo principal deste trabalho é apresentar uma estratégia robusta de precipitação que facilite o isolamento da pelota de proteína do supernanato contaminante. Um cartucho de filtragem descartável foi desenvolvido para eliminar a pipetação isolando a proteína agregada acima de um filtro de membrana PTFE porosa27. Os componentes que interferem em MS no supernante são efetivamente removidos em uma etapa de centrifugação de baixa velocidade. O cartucho de filtro descartável também oferece um cartucho SPE intercambiável, o que facilita a limpeza subsequente da amostra após a resolubilização e digestão de proteínas opcionais, à frente da espectrometria de massa.

Uma série de fluxos de trabalho recomendados de precipitação proteome são apresentados aqui, incluindo protocolos modificados de acetona e clorofórmio/metanol/água28 , em um formato convencional (à base de frasco) e um formato semi-automatizado em um cartucho descartável de filtragem e extração de dois estados. Destacam-se as recuperações de proteínas resultantes e a eficiência de esgotamento do SDS, juntamente com a cobertura proteome LC-MS/MS de baixo para cima, para demonstrar o resultado esperado de cada protocolo. São discutidos os benefícios práticos e as desvantagens associados a cada abordagem.

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Protocol

1. Considerações materiais e pré-preparação da amostra

  1. Utilize apenas solventes de alta pureza (acetona, clorofórmio, metanol) (>99,5%) e produtos químicos, livres de excesso de umidade.
  2. Prepare as soluções de cloreto de sódio e sulfato de zinco (1 M) na água.
    NOTA: As soluções de sal podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, desde que estejam livres de contaminantes ou crescimento microbiano.
  3. Use o menor frasco de microcentrífugo de polipropileno (PP) suficiente para reter o volume necessário de amostra e solventes para induzir a precipitação.
  4. Certifique-se de que a concentração de SDS na amostra a ser precipitada não seja superior a 2% (c/v). Se o SDS for maior, dilui a amostra com água.
  5. Garanta uma concentração proteica entre 0,01 e 10 g/L para a eficiência ideal de precipitação.
    NOTA: A massa ideal para precipitação varia entre 1-100 μg de proteína.
  6. Certifique-se de que todos os solventes e soluções estejam livres de material particulado antes de usar. Realize uma filtragem (<0,5 μm) ou uma etapa de centrifugação (10.000 x g por 1 min à temperatura ambiente) para remover partículas não resolvidas.
  7. Se for necessária a redução da ligação de dissulfeto e a alquilação, conduza essas etapas antes da precipitação proteica. O excesso de reagentes de redução e alquilação será removido através do processo de precipitação.
  8. Precipitar as proteínas selecionando e realizando um dos protocolos (etapas 2, 3, 4 ou 5).

2. Precipitação de proteína rápida (à base de frasco) com acetona

  1. Pipet 90 μL de proteína (livre de partículas) ou solução proteome em um tubo de microcentrifuge PP. Em seguida, adicione 10 μL de 1 M aquoso NaCl.
    NOTA: Se a força iônica do extrato de proteome já exceder 100 mM, não é necessário mais sal.
  2. Pipet 400 μL de acetona na amostra. Tampe o frasco e toque o frasco suavemente para combinar os solventes. Não é necessária uma mistura vigorosa.
    NOTA: O volume de proteína, sal e acetona pode ser aumentado desde que a razão relativa de cada um seja mantida.
  3. Deixe o frasco incubar à temperatura ambiente, sem ser perturbado, por um mínimo de 2 minutos.
    NOTA: Incubações mais longas, incluindo aquelas em temperatura reduzida (por exemplo, a precipitação convencional de acetona emprega precipitação durante a noite no congelador), podem resultar na formação de partículas proteicas agregadas maiores (visíveis) (Figura 1A), que geralmente não melhoram a recuperação total da proteína.
  4. Após a incubação, coloque amostras em uma centrífuga, observando a orientação do frasco. Gire por um mínimo de 2 min, a 10.000 x g ou mais a temperatura ambiente.
  5. Despreite o frasco e decante suavemente o supernaspetivo invertendo lentamente o frasco para um recipiente de lixo. Toque no frasco invertido em uma toalha de papel para retirar solvente residual do frasco.
    ATENÇÃO: Os solventes de resíduos devem ser retidos e descartados conforme protocolos apropriados.
  6. Para amostras contendo SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
    NOTA: O passo 2.6 é opcional.
    1. Imediatamente centrifugar a amostra (10.000 x g ou superior por 1 min a temperatura ambiente), colocando o frasco no rotor na mesma orientação do giro inicial. Decante o solvente de lavagem como descrito na etapa 2.5.
  7. Deixe a amostra secar totalmente com a tampa aberta (~1 min). Recapitulando o frasco e proceda com solubilização de pelotas (etapa 6).

3. Precipitação de peptídeos de baixo peso molecular (LMW) (ZnSO4 + acetona)

  1. Dispense 54 μL de extrato de proteome a um frasco PP de 2 mL e, em seguida, adicione 6 μL de 1 M ZnSO4.
    NOTA: A recuperação ideal dos peptídeos LMW (≤5 kDa) é obtida adicionando acetona a 97% finais em volume. Assumindo um frasco PP de 2 mL, o volume máximo da amostra inicial é de 54 μL.
  2. Adicione 1940 μL de acetona a um volume final de 97%. Gire suavemente para misturar, e deixe ficar imperturbável no banco por um mínimo de 2 minutos.
  3. Centrífuga (10.000 x g por 1 min à temperatura ambiente) e remova o supernatante invertendo o frasco e, em seguida, tocando o frasco em uma toalha de papel.
  4. Para amostras contendo SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
    NOTA: O passo 3.4 é opcional.
    1. Imediatamente centrifufique a amostra conforme a etapa 3.3, colocando o frasco no rotor na mesma orientação do giro inicial. Decante o solvente de lavagem como descrito na etapa 3.3.
  5. Re-solubilize a pelota seca resultante em um solvente aquoso com breve vórtice ou sônica (~5 min).

4. Precipitação proteica por clorofórmio/metanol/água (CMW)

  1. Dispense 100 μL da solução de proteína ou proteome em um frasco PP. Adicione 400 μL de metanol, seguido por 100 μL de clorofórmio. Tampe o frasco e o vórtice brevemente para misturar.
    NOTA: Para precipitação cmw, são preferidos frascos de 1,5 mL com fundo estreito (Figura 2A).
    ATENÇÃO: O solvente de clorofórmio deve ser manuseado em uma coifa de ventilação apropriada. Todos os solventes que entram em contato com o clorofórmio devem ser tratados como resíduos halogenados quando descartados.
  2. Dispense rapidamente 300 μL de água diretamente para o centro do frasco. Tampe o frasco. Deixe a amostra sentar-se no banco sem ser perturbada por 1 min.
    NOTA: A solução aparecerá imediatamente em branco nublado. Evite misturar o frasco após a adição de água.
  3. Coloque o frasco PP em uma centrífuga e gire por um mínimo de 5 min (10.000 x g ou mais a temperatura ambiente).
    NOTA: Uma vez centrifadas, duas camadas de solventes visíveis se formarão (camada superior = metanol/água; fundo = clorofórmio). Uma pelota de proteína sólida se forma na interface solvente (Figura 2A).
  4. Usando uma ponta de micropipette grande (1 mL) e segurando o frasco a ~45°, remova ~700 μL do solvente da camada superior a uma taxa uniforme.
  5. Use uma ponta micropipette menor (200 μL) para continuar removendo a camada de solvente superior do frasco inclinado de ~45°. Pipeta em um movimento contínuo até que a camada de solvente superior forme uma conta no frasco.
  6. Adicione 400 μL de metanol fresco ao frasco de amostra, sem perturbar a pelota, dispensando o solvente pelo lado do frasco.
  7. Tampe o frasco. Combine as camadas de solventes balançando suavemente o frasco para girar os solventes juntos.
    NOTA: É essencial evitar interromper a pelota. Não vórtice o frasco.
  8. Observando a orientação do frasco no rotor, centrífuga por um mínimo de 10 min (10.000 x g em temperatura ambiente). A pelota de proteína adere ao fundo do frasco (Figura 2B).
  9. Coloque o frasco em 45°, com a pelota virada para baixo. Coloque a ponta da pipeta ao longo da borda superior do frasco e remova o supernascer com uma ponta de micropipette de 1 mL a uma velocidade lenta, mas contínua. Retenha ~20 μL de solvente no frasco.
  10. Lave a pelota de proteína para amostras contendo SDS, distribuindo lentamente 400 μL de metanol fresco. Não vórtice o frasco.
    1. Prossiga diretamente com centrifugação (10.000 x g por 2 min de temperatura), colocando o frasco no rotor com a mesma orientação do giro inicial.
  11. Remova o solvente, conforme a etapa 4.9. Deixe a amostra secar em uma fumehood até que o solvente residual evapore.
  12. Consulte os procedimentos de resolutização recomendados na etapa 6.

5. Precipitação de proteína usando um cartucho de filtragem descartável

NOTA: Cada protocolo de precipitação baseado em solvente descrito nas etapas 2-5 pode ser realizado em um cartucho de filtragem e extração de dois estágios (ver Tabela de Materiais).

  1. Com o plugue ligado ao cartucho de filtragem superior (Figura 3A), dispense o volume desejado do proteome, sal e solvente extraídos conforme descrito em uma das três opções abaixo.
    1. (Opção 1) Para precipitação proteica com acetona, combine 90 μL de proteína ou solução proteome, 10 μL de 1 M aquoso NaCl, e 400 μL de acetona. Incubar por um mínimo de 2 minutos no banco.
      NOTA: Um precipitado visível se desenvolverá para amostras concentradas de proteína (1 g/L) (Figura 3B).
    2. (Opção 2) Para precipitação de peptídeo LMW, combine 15 μL da amostra, 1,5 μL de 1 M ZnSO4 e 485 μL de acetona. Incubar por um mínimo de 2 minutos no banco.
      NOTA: Uma concentração de sal de 90 mM na amostra aquosa não afetará a recuperação em relação aos 100 mM recomendados na etapa 3.
    3. (Opção 3) Para precipitação cmw, adicione 50 μL de extrato de proteome, 200 μL de metanol e 50 μL de clorofórmio. Tampe o frasco e brevemente vórtice para combinar.
      1. Dispense rapidamente 150 μL de água diretamente para o centro do frasco. Incubar por 1 min no banco.
  2. Centrifugar por 2 min a 2.500 x g em temperatura ambiente com o plugue ainda ligado ao cartucho de filtragem.
  3. Inverta o cartucho e, em seguida, desaparafusar e remova o plugue da base do cartucho.
  4. Coloque o cartucho de filtragem em um frasco limpo e retorne à centrífuga. Gire por 3 min a 500 x g em temperatura ambiente. Descarte o solvente de fluxo do frasco inferior.
    NOTA: Se algum solvente permanecer no cartucho de filtragem superior, retorne à centrífuga e realize um giro adicional.
  5. Lave a pelota de proteína adicionando 400 μL de acetona ao cartucho de filtragem (para precipitação CMW, passo 5.1.3, adicione 400 μL de metanol).
  6. Centrifugar por 3 min a 500 x g em temperatura ambiente ou até que nenhum solvente permaneça no cartucho superior.
  7. Re-solubilize a pelota de precipitação conforme descrito na etapa 6.

6. Resolubilização da pelota de proteína

  1. Molhe a membrana na base do cartucho de filtragem dispensando 2-5 μL de isopropanol diretamente à membrana imediatamente antes dos protocolos de resolubilização descritos abaixo.
  2. Siga um dos seguintes métodos de resolubilização.
    1. (Opção 1) Adicione um mínimo de 20 μL de tampão aquoso contendo ≥2% de SDS ao cartucho de filtragem. Cap e vórtice vigorosamente (~1 min). Alternativamente, sonicato (>10 min) para dispersar a pelota de proteína.
      1. Aqueça a amostra a 95 °C por 5 minutos). Repita o passo de mistura após o aquecimento.
        NOTA: O tampão de carregamento de gel laemmli pode ressusolubilizar a pelota de proteína. No entanto, as amostras contendo SDS são incompatíveis com a digestão de trippsina e LC e MS de fase invertida.
    2. (Opção 2) Prepare uma solução de 80% (v/v) ácido fórmico na água. Prechill a solução ácida (-20 °C), bem como o cartucho de filtragem contendo proteína precipitada.
      1. Dispensar 50 μL de ácido fórmico frio no cartucho; tampa e vórtice para 30 s. Volte ao congelador (-20 °C) por 10 min.
      2. Vórtice o cartucho novamente para 30 s. Em seguida, repita o ciclo de refrigeração e mistura mais uma vez (10 min, -20 °C, vórtice de 30 s).
      3. Adicione água a 500 μL finais, diluindo o ácido fórmico para 8%.
        NOTA: O protocolo de ácido fórmico frio é incompatível com a digestão subsequente da trippsina, mas é compatível com LC-MS.
    3. (Opção 3) Adicione 50 μL de ureia recém-preparada de 8 M em água ao cartucho de filtragem. Sonicate por 30 min.
      1. Deixe o cartucho incubar no banco por 1h (até durante a noite).
      2. Diluir a ureia de 8 M um mínimo de 5 vezes com água ou tampão apropriado.
        NOTA: Uma vez diluído, o protocolo de solubilização da ureia é compatível com a digestão de trippsina subsequente, bem como LC-MS.

7. Digestão de proteínas

  1. Para análise de ESM de baixo para cima, sujeito as proteínas re-solubilizadas à digestão enzimática utilizando um dos dois métodos mencionados abaixo.
    1. (Opção 1) Para resolutização do ácido fórmico, reduza o volume inicial de 80% de ácido fórmico na etapa 6.2.2.1 a 25 μL. Na etapa 6.2.2.3, use 375 μL de água para diluir o ácido fórmico para 5% (v/v).
    2. Distribua pepsina no cartucho em uma relação proteica aproximada para enzima de 50:1. Com um plugue ligado ao cartucho de filtragem, incubar a amostra durante a noite à temperatura ambiente.
  2. (Opção 2) Para resolutização em ureia, garanta um pH entre 8 e 8,3 com a inclusão de 100 mM de Tris ou bicarbonato de amônio na etapa 6.2.3.2.
    1. Adicione trippsina em uma proteína aproximada à relação de massa enzimática de 50:1. Com um plugue ligado ao cartucho, incubar a amostra durante a noite em um banho de água morna a 37 °C.
    2. Termine a digestão acidificando a solução com 10% de TFA para um 1% final.
  3. Recupere a proteína digerida por pepsina ou trippsina removendo o plugue da base do filtro e centrifugando o cartucho contido dentro de um frasco limpo (2 min, 5000 x g, temperatura ambiente).

8. Limpeza da SPE

NOTA: Para desalar amostras adicionais após a digestão ou troca de solventes, a amostra pode estar sujeita à limpeza de fase inversa, conforme descrito.

  1. Prime um cartucho SPE (ver Tabela de Materiais) passando 300 μL de metanol (2 min, 400 x g) seguido por 300 μL de 5% acetonitrilo/0,1% de TFA (2 min, 400 x g).
  2. Conecte o cartucho SPE preparado à base do cartucho de filtragem contendo proteína resolubilizada ou digerida.
  3. Gire a proteína através do cartucho SPE (5 min, 800 x g em temperatura ambiente). Se o solvente permanecer no cartucho superior, devolva o cartucho à centrífuga e repita o giro.
    NOTA: Passar a amostra pelo cartucho SPE uma segunda vez pode melhorar a recuperação.
  4. Adicione 300 μL de acetonitrila/0,1% de TFA em água ao cartucho. Para lavar, flua através do cartucho SPE (2 min, 2000 x g). Descarte o fluxo.
  5. Para proteínas LMW ou peptídeos digeridos, elute a amostra fluindo 300 μL de 50% acetonitrilo /0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
  6. Para proteínas intactas, siga o passo 8.5 com uma etapa de eluição adicional usando 300 μL de acetonitrilo/0,1% TFA. Combine os dois extratos resultantes.
    NOTA: O passo 8.6 é opcional.

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Representative Results

A Figura 4 resume o esgotamento esperado do SDS após a precipitação facilitada por frascos ou cartuchos de proteínas em um cartucho de filtro descartável usando acetona. A incubação noturna convencional (-20 °C) em acetona é comparada com o protocolo de precipitação de acetona rápida à temperatura ambiente (passo 2), bem como a precipitação cmw (passo 4). A SDS residual foi quantificada pelo ensaio 29 das substâncias ativas azul-metileno (MBAS). Resumidamente, a amostra de 100 μL foi combinada com o reagente MBAS de 100 μL (250 mg de azul metileno, 50 g de sulfato de sódio, ácido sulfúrico de 10 mL, diluído em água a 1,0 L), seguido pela adição de 400 μL de clorofórmio e medição de absorvância da camada orgânica a 651 nm em um espectrotômetro UV/Vis. Todas as abordagens reduzem os SDS para permitir a análise ótima de MS.

A recuperação quantitativa e reprodutível da proteína é alcançada após precipitação rápida de acetona e precipitação de CMW, como visto na Figura 5 através da análise da PÁGINA da SDS de um liseto celular total de levedura processada. A precipitação em um cartucho de filtragem descartável elimina a necessidade de canalizar cuidadosamente o supernanato contendo SDS, mantendo as proteínas agregadas acima de um filtro de membrana. A recuperação consistente é obtida com todos os protocolos de precipitação, sem bandas visíveis detectadas nas frações supernantes em três réplicas independentes.

A Figura 6 quantifica os rendimentos esperados, incluindo a resolubilização das pelotas de proteína precipitada utilizando ácido fórmico frio (passo 6). A precipitação cmw proporciona recuperação quantitativa preservando cuidadosamente a pelota em uma abordagem baseada em frasco (etapa 5), o que é igual ao obtido usando o cartucho (100 ± 4% vs. 101 ± 3%, respectivamente). A recuperação de pelotas de proteína com precipitação de acetona beneficia-se de um cartucho de filtragem, com uma melhora de 15-20 % no rendimento observado. Em frascos, o isolamento do supernanato acetona da proteína agregada depende essencialmente da adesão da pelota à superfície do tubo PP; o cartucho de filtragem elimina essa preocupação, pois o filtro garante alta recuperação de proteína precipitada sem pipetação.

Para recuperar eficientemente proteínas LMW e peptídeos, o protocolo de precipitação de acetona é modificado substituindo NaCl por ZnSO4 e elevando o percentual de solvente para 97%. A combinação deste sal específico e níveis mais elevados de solvente orgânico são necessários para a alta recuperação de proteínas LMW e peptídeos26. Como visto na Figura 7, a precipitação de proteína à base de cartuchos demonstra uma recuperação superior de uma amostra digerida por pepsina de plasma bovino em relação à precipitação à base de frascos. O cartucho de spin descartável pode recuperar mais de 90% dos peptídeos LMW. Diferenças mais significativas no rendimento são notadas no cartucho ao empregar NaCl, confirmando a importância do tipo de sal para maximizar o rendimento. Incluir o ZnSO4 em oposição ao NaCl resulta em uma pelota de proteína agregada que é mais facilmente presa pelo filtro do cartucho de spin.

Para avaliar a eficácia das proteínas precipitantes em uma ampla faixa dinâmica, foi processada uma mistura de três proteínas padrão: β-galactosidase (β-gal) de E. coli, citocromo c (Cyt c) de bovino, e enolase (Eno) de S. cerevisiae. A proporção de massa de β-gal:Cyt c:Eno foi de 10.000:10:1. As amostras continham inicialmente 2% de SDS antes da precipitação à base de cartuchos (etapa 5) e foram ressolubilizadas e digeridas com trippsina (etapas 6 e 7). Amostras preparadas em frascos atuavam como controle, sem SDS e omitindo a precipitação. Todas as amostras foram submetidas à limpeza equivalente da SPE (etapa 8). Foi realizado o MS de baixo para cima, com espectros de MS/MS pesquisados em um banco de dados combinado contendo todas as proteínas das três espécies envolvidas (ver Tabela de Materiais para plataformas de instrumentos e software). Uma taxa de descoberta falsa de peptídeo de 1% foi empregada. Todas as três proteínas foram identificadas por MS, com 666, 28 e 35 peptídeos únicos para β-gal, Cyt c e Eno, respectivamente. A Figura 8 quantifica a razão relativa (intensidade máxima de peptídeo) de cada amostra, com uma razão acima de 1 refletindo uma maior abundância de peptídeos para amostras processadas nos cartuchos de filtro descartáveis. Os resultados demonstram os benefícios de incorporar SDS em um fluxo de trabalho de proteômica, minimizando a perda de proteínas (por exemplo, da potencial adsorção ao frasco amostral) e maximizando os rendimentos do peptídeo.

Fígado bovino foi adquirido em um supermercado local. As proteínas foram isoladas por extrair o tecido com uma solução de 1% de SDS. Posteriormente, o proteome recuperado foi precipitado, ressolubilizado (ureia) e digerido com trippsina, tudo dentro de um cartucho descartável. O LC-MS/MS de baixo para cima foi realizado, resultando na identificação de uma média de ~8.000 proteínas (~30.000 peptídeos). Foram empregadas taxas de descoberta falsa de 0,5% e 1,0% para espectros de peptídeos e grupos proteicos, pesquisando o banco de dados bovino. A reprodutibilidade técnica deste fluxo de trabalho baseado em cartuchos é avaliada através de identificações de proteínas sobrepostas. As injeções de ME de uma amostra digerida comum alcançam, em média, 78± 0,5% de sobreposição com as proteínas identificadas. Em comparação, as amostras preparadas independentemente em cartuchos discretos alcançaram 76 ± sobreposição de 0,5%. Esses dados sugerem que a contribuição da preparação amostral para a variabilidade total da análise é menor, em relação à já contribuida pela abordagem instrumental da LC-MS. As proteínas bovinas identificadas a partir de três réplicas técnicas (processadas independentemente em três cartuchos descartáveis) foram ainda caracterizadas em relação ao seu peso molecular, hidroofobidade e ponto isoelétrico, mostrado na Figura 9. A ANOVA bidirecional não conseguiu determinar diferenças estatísticas nos proteomes identificados nas réplicas técnicas. Finalmente, a Figura 10 compara o número de peptídeos identificados por proteína nas três preparações amostrais de réplica. Os coeficientes de correlação nestes gráficos (0,94-0,95) demonstram a alta consistência da abordagem de preparação da amostra para análise de MS de baixo para cima.

Figure 1
Figura 1: Proteínas precipitadas com acetona. Amostras contendo 100 e 1.000 μg de proteína combinadas com 100 mM NaCl e precipitadas com 80% de acetona (A) após 5 min de tempo de precipitação e (B) após precipitação e centrifugação subsequente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Precipitação proteica por clorofórmio/metanol/água. Uma amostra contendo 50 μg de proteína precipitada conforme o passo 4. (A) Imediatamente após a etapa 4.4. (B) Imediatamente após a etapa 4.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Fotos de um cartucho descartável de filtragem e extração de dois estágios para precipitação proteica. Uma amostra contendo 100 μg de proteína foi combinada com 100 mM de NaCl e 80% de acetona em (A) a filtração montada e cartucho SPE e (B) precipitado por 5 min até que os agregados proteicos se tornassem visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Eficiência de esgotamento da SDS após precipitação proteica. A porcentagem de SDS removido é mostrada a partir da precipitação de acetona com o protocolo convencional (durante a noite a -20 °C), o protocolo rápido (incubação de 2 min à temperatura ambiente) ou pela precipitação de clorofórmio/metanol/água (CMW) de um lysato de S. cerevisiae , tanto no formato convencional (frasco) quanto no formato do cartucho. Essas amostras continham inicialmente 0,5% de SDS (5.000 ppm), inferindo > 99,8% de remoção de SDS é necessária para a análise ideal de MS. A SDS residual é quantificada por substâncias ativas azuis de metileno (MBAS). As barras de erro representam o desvio padrão das réplicas técnicas (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Recuperação total do proteome através da precipitação. A PÁGINA da SDS mostra a recuperação do liseto de proteína total de S. cerevisiae , precipitado por (A) precipitação convencional de acetona, (B) clorofórmio/precipitação de metanol/água e (C) precipitação rápida de acetona. As bandas proteicas são observadas exclusivamente na fração de pelotas, sem faixas visíveis no supernatante (Super.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Recuperação de proteínas superiores dentro de um cartucho de filtragem. Para a precipitação do s. cerevisiae total de proteína lysate, o cartucho de spin descartável facilita a recuperação quantitativa com precipitação de acetona e CMW. A alta recuperação também é possível com precipitação à base de frascos, embora sejam necessárias manipulações cuidadosas de amostras e pipetamento. LC-UV avaliou a recuperação da proteína após a resolubilização da pelota com ácido fórmico frio são mostrados aqui. As barras de erro representam o desvio padrão das réplicas técnicas (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Alto rendimento de precipitação para peptídeos de baixo peso molecular. Um protocolo de precipitação de acetona modificada para peptídeos e proteínas ≤5 kDa envolve acoplamento de 100 mM de ZnSO4 com 97% de acetona para alcançar os maiores rendimentos. A precipitação facilitada por um cartucho de filtragem descartável demonstra uma recuperação melhorada em comparação com a precipitação convencional à base de frascos em todas as três condições de precipitação. As barras de erro representam o desvio padrão das réplicas técnicas (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Maior recuperação de proteínas padrão no fluxo de trabalho baseado em SDS. Tukey Box-and-Whisker parcela30 de intensidade relativa de sinal ms para peptídeos recuperados de proteínas contendo SDS processadas em um cartucho de filtragem descartável relativo a uma amostra de controle (sem SDS, sem precipitação). As proteínas empregadas abrangem uma ampla concentração dinâmica de alcance-β-galactosidase:citocromo c:enolase = 10.000:10:1. Cada quartil dentro das caixas contém 25% da distribuição, enquanto as barras de erro abrangem 95% da distribuição. A média é indicada por "+" e mediana por uma linha horizontal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Distribuições de proteínas identificadas a partir de réplicas técnicas. As parcelas tukey box-and-whisker caracterizam (A) o peso molecular, (B) hidrofobiidade e (C) ponto isoelétrico de proteínas identificadas por LC-MS/MS de baixo para cima após preparações triplicadas de um licosato hepático bovino em um cartucho de filtragem e extração de dois estágios. Não houve diferença estatística nessas características por ANOVA bidirecional (p < 0,05). Cada quartil dentro das caixas contém 25% da distribuição, enquanto as barras de erro abrangem 95% da distribuição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Correlação de IDs de peptídeos por proteína através do fluxo de trabalho de preparação baseado em SDS através de réplicas preparatórias. Análise da reprodutibilidade proteome de baixo para cima nas amostras 1 e 2, (B) amostras 2 e 3 e (C) amostras 1 e 3 com base no número de identificações de Peptídeos por proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A caracterização ótima de MS é alcançada quando o SDS residual é esgotado abaixo de 10 ppm. Enquanto abordagens alternativas, como FASP e digestão on-bead, oferecem esgotamento quantitativo de SDS com recuperação variável 31,32,33, o objetivo principal da precipitação é maximizar a pureza e o rendimento simultaneamente. Isso depende de isolar efetivamente o supernasce (contendo o SDS) sem perturbar a pelota de proteína. Com precipitação à base de frasco, uma vez que a maior parte do supernante é removida por pipetação, é cada vez mais provável que algumas das pelotas agregadas sejam acidentalmente perdidas. Por essa razão, é essencial deixar para trás uma fração mais significativa do solvente residual (~20 μL) e adicionar uma etapa de lavagem34. A etapa de lavagem dilui e remove o solvente residual do frasco. Particularmente com cmw, é desnecessário vórtice o frasco amostral uma vez que a pelota se formou. Interromper a pelota através de agitação vigorosa tem o efeito indesejado de aumentar a probabilidade de perda de tubulação acidental. Se o vórtice estiver incluído (conforme recomendado pelos protocolos anteriores)35, existe o potencial de que porções da pelota CMW aderam à parte inferior da tampa do frasco; uma vez centrifada, a pelota permanece fixa na tampa do frasco e pode resultar em perda de ~50%.

A precipitação rápida pode ser realizada com alta recuperação de amostras de proteome diluídas, idealmente entre 0,01-2 mg/mL, ou uma massa proteica correspondente entre 1-200 μg. No entanto, recuperações quantitativas e reprodutíveis a partir de menos de 0,01 mg/mL de proteína podem se beneficiar de tempos de precipitação mais longos que variam de 10 min a 1h, demonstrando limitações de throughput do fluxo de trabalho de precipitação. Surpreendentemente, amostras mais concentradas (10 mg/mL) mostram uma redução estatística no rendimento, presumivelmente de perdas acidentais de pipetting. Supondo > 10 μg de proteína, deve-se observar uma pelota visível na lateral do frasco (Figura 1B). Quantidades menores, até 1 μg, são desafiadoras de se ver. Isso desafia a capacidade de pipeta do supernaente sem interromper a pelota de proteína. O frasco pode ser invertido (lentamente) com acetona para separar o solvente da pelota. Para cmw, a pelota não adere de forma confiável suficiente ao frasco, favorecendo assim a pipetação sobre o decantamento do supernante. Para precipitação à base de frascos, recomenda-se trabalhar com o menor tubo de microcentrifuuuagem possível para facilitar os volumes de amostra e solvente pretendidos. A precipitação no cartucho de filtragem descartável empregado neste trabalho fornece uma capacidade máxima de volume de 500 μL, permitindo a precipitação de proteínas com 80% de acetona em volumes amostrais até 100 μL. Os volumes de amostra, sal e solvente podem ser ajustados de acordo se as concentrações recomendadas forem mantidas.

A pureza da pelota de proteína recuperada da precipitação orgânica à base de solventes é limitada pela complexidade da matriz amostral, componentes tampão e condições de precipitação. Por exemplo, componentes tampão específicos, como a glicina (usada para separações de SDS PAGE) têm sido mostrados como co-precipitados com proteína usando 80% de acetona. No entanto, a glicina permanece solúvel através da precipitação cmw. Foi relatado que a acetona precipita fragmentosde DNA 36,37, potencialmente adicionando impurezas de fundo indesejadas à pelota recuperada. A precipitação de proteínas e peptídeos de baixo peso molecular requer um nível elevado de solvente orgânico e um tipo específico de sal para maximizar o rendimento. Embora vários sais tenham sido explorados, o ZnSO4 fornece produtos consistentemente altos. Este sal precipitará em 97% de acetona na ausência de proteína. Assim, a pelota de proteína resultante contém uma alta concentração de sal. Nota-se que empregar 90% de acetona por volume também alcançará altos rendimentos de peptídeos, embora se espere uma queda estatisticamente significativa (~5%) na recuperação. No entanto, isso permite processar um volume amostral mais significativo (até 180 μL, com 20 μL de 1 M ZnSO4) em cada frasco de 2 mL. Além das impurezas matriciais co-precipitadas com a pelota de proteína, deve-se afirmar que a precipitação de solventes inerentemente causa a desnaturação da amostra38,39. Portanto, este protocolo não é aplicável para as preparações de proteínas funcionais ou fluxos de trabalho nativos de ESM. A acetona também foi relatada para causar modificações de proteína covalente nos resíduos de glicina40 e induzir uma mudança de massa de +98 u, especulada como um subproduto da acetona de condensação aldol41.

Ao empregar um cartucho de filtragem para precipitação proteica, o isolamento da pelota proteica depende da retenção de agregados acima de um filtro de membrana PTFE. A porosidade dessa membrana excede a de um filtro de corte de peso molecular (como visto no FASP), permitindo o isolamento proteico com tempos de giro reduzidos. A transferência rápida de soluções em baixas velocidades de giro depende da adequada motação da membrana PTFE; solventes orgânicos fluem prontamente, embora um filtro PTFE seco impeça solventes aquosos. Se o cartucho de filtragem parecer entupido, a membrana deve ser re-molhada aplicando diretamente um pequeno volume de solvente orgânico (por exemplo, isopropanol) ao filtro. Dependendo do tamanho da pelota de proteína e do volume da amostra empregada, podem ser necessárias centrifugações adicionais ou giros em velocidades mais altas (até 3.000 x g) para garantir que todo solvente tenha passado pelo cartucho de filtragem.

A recuperação proteica da precipitação com condições ideais é, em última análise, limitada pelo desafio da ress solubilização da pelota, com poucas opções de solventes sendo compatíveis com o processamento a jusante e LC-MS. Além disso, várias condições de precipitação, como exposições longas a baixas temperaturas e secagem excessiva de uma pelota bem embalada contribuem para os desafios de re-solubilização40. Nota-se que as pelotas de proteína CMW são geralmente menos solúveis do que as pelotas de acetona. A eficiência maximizada de ressubilização da proteína precipitada em ácido fórmico 80% frio (etapa 6.2.2) foi relatada anteriormente42; a temperatura fria previne a modificação da proteína, que de outra forma ocorre no ácido fórmicoconcentrado 43,44. Diluir a concentração de ácido também retarda a reação de modificação. O ácido fórmico é recomendado para abordagens de ESM de cima para baixo ou antes da digestão enzimática com pepsina. Empregar este solvente exige pouco tratamento físico; a adição de apenas 5 μL (suficiente para cobrir a pelota proteica) pode ser suficiente quando combinado com vórtice, sônica breve ou tubulação repetida. Da mesma forma, para amostras destinadas a serem analisadas pelo SDS PAGE, a re dissolveção no buffer Laemmli contendo SDS é altamente eficaz, quando combinada com uma mistura modesta da amostra antes do aquecimento. No entanto, esses solventes são ambos incompatíveis com a trippsina. A resolubilização com 8 M de ureia é recomendada antes da digestão da trippsina, garantindo que a ureia tenha sido preparada recentemente (no mesmo dia). Recomenda-se um volume mínimo de tampão de 50 μL para re-solubilização de proteínas dentro do cartucho de filtragem para maximizar o contato entre o solvente chaotrópico e a pelota, bem como para auxiliar a dissolução durante a sônicação, a repartição e/ou o vórtice. Abordagens alternativas exploram trippsina para re-solubilizar a proteína, o que significa que a proteína não precisa ser totalmente dissolvida antes da adição de enzimas. No entanto, essa abordagem pode viés de digestão, favorecendo as espécies mais solúveis, enquanto as proteínas hidrofóbicas experimentam menor tempo de digestão45. A adição de 8 M de ureia, juntamente com buffers básicos como Tris ou bicarbonato de amônio, exige um passo de limpeza da amostra pós-digestão. Para esses aditivos amostrais, a limpeza da coluna de fase invertida é ideal. O cartucho de filtragem descartável empregado neste estudo é complementado com um cartucho SPE de fase reversa intercambiável. Este cartucho também é ideal para troca de solventes, no caso do protocolo de resolubilização do ácido fórmico. É importante notar que qualquer abordagem de extração de fase sólida está associada à perda inerente na recuperação da amostra. Portanto, o usuário deve pesar os benefícios da recuperação e a purificação adicional para o seu experimento.

Espera-se que esses protocolos permitam aos pesquisadores de proteômica simplificar seus fluxos de trabalho baseados em detergente, capitalizando o SDS para extração de proteome. Estratégias preparatórias que facilitem a recuperação consistente do proteome completo são críticas. Um cartucho de giro de dois estágios simplifica a oportunidade de isolamento rápido, robusto e reprodutível da amostra proteome. Tal abordagem seria acessível a aplicações que requerem análises rigorosas sem sacrificar os throughputs amostrais, como configurações clínicas ou iniciativas de pesquisa em larga escala46. Aplicações futuras dessas abordagens podem incluir descoberta de biomarcadores, detecção, quantitação precisa e descoberta de alvos de drogas e drogas.

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Disclosures

O laboratório Doucette concebeu e patenteou o ProTrap XG empregado neste estudo. A AAD também é sócia-fundadora da Proteoform Scientific, que comercializou o cartucho de preparação da amostra.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá. Os autores agradecem à Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canadá) e ao SPARC BioCentre (Análise Molecular) no Hospital para Crianças Doentes (Toronto, Canadá) por suas contribuições para a aquisição de dados de MS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

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References

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Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa
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