Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Organisk lösningsmedelsbaserad proteinutfällning för robust proteomrening före masspektrometri

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

Detta protokoll beskriver lösningsmedelsbaserad proteinutfällning under kontrollerade förhållanden för robust och snabb återhämtning och rening av proteomprover före masspektrometri.

Abstract

Medan flera framsteg inom masspektrometri (MS) -instrument har förbättrat kvalitativ och kvantitativ proteomanalys, är mer tillförlitliga front-end-metoder för att isolera, berika och bearbeta proteiner före MS avgörande för framgångsrik proteomkarakterisering. Låg, inkonsekvent proteinåtervinning och kvarvarande föroreningar som ytaktiva ämnen är skadliga för MS-analys. Proteinutfällning anses ofta vara opålitlig, tidskrävande och tekniskt utmanande att utföra jämfört med andra provberedningsstrategier. Dessa problem övervinns genom att använda optimala proteinutfällningsprotokoll. För acetonutfällning är kombinationen av specifika salter, temperaturkontroll, lösningsmedelssammansättning och utfällningstid avgörande, medan effektiviteten hos kloroform / metanol / vattenutfällning beror på korrekt pipettering och injektionsflaska manipulation. Alternativt är dessa utfällningsprotokoll strömlinjeformade och halvautomatiserade i en engångsspinnpatron. De förväntade resultaten av lösningsmedelsbaserad proteinutfällning i konventionellt format och med användning av en engångsfiltrerings- och extraktionspatron i två steg illustreras i detta arbete. Detta inkluderar detaljerad karakterisering av proteomblandningar genom bottom-up LC-MS / MS-analys. Den överlägsna prestandan hos SDS-baserade arbetsflöden demonstreras också i förhållande till icke-förorenat protein.

Introduction

Proteomanalys med masspektrometri har blivit allt strängare på grund av den förbättrade känsligheten, upplösningen, skanningshastigheten och mångsidigheten hos moderna MS-instrument. Ms framsteg bidrar till större proteinidentifieringseffektivitet och mer exakt kvantifiering 1,2,3,4,5. Med förbättrad MS-instrumentering kräver forskare en motsvarande konsekvent front-end-provberedningsstrategi som kan kvantitativ återhämtning av proteiner med hög renhet på minimal tid i alla stadier av arbetsflödet 6,7,8,9,10,11 . För att korrekt återspegla proteomstatusen för ett biologiskt system måste proteiner isoleras från den ursprungliga provmatrisen på ett effektivt och opartiskt sätt. För detta ändamål, inklusive ett denaturerande ytaktivt medel, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), säkerställer effektiv proteinextraktion och solubilisering12. SDS stör emellertid starkt elektrosprayjonisering, vilket orsakar allvarlig MS-signalundertryckning om den inte elimineras ordentligt13.

Olika SDS-utarmningsstrategier är tillgängliga för efterföljande proteomanalys, såsom retention av proteiner över ett molekylviktsavgränsningsfilter som finns i engångsspinnpatroner 14,15,16. Den filterstödda provberedningsmetoden (FASP) gynnas eftersom den effektivt tömmer SDS under 10 ppm, vilket underlättar optimal MS. Proteinåtervinning med FASP är dock variabel, vilket föranledde utforskningen av andra tekniker. Kromatografiska metoder som selektivt fångar protein (eller ytaktivt medel) har utvecklats till olika praktiska patroner eller pärlbaserade format 17,18,19,20,21. Med tanke på dessa enkla och (idealiskt) konsekventa strategier för proteinrening förbises ofta det klassiska tillvägagångssättet för proteinutfällning med organiska lösningsmedel som ett lovande tillvägagångssätt för proteinisolering. Medan lösningsmedelsutfällning har visat sig tömma SDS under kritiska nivåer framgångsrikt, har proteinåtervinning varit ett långvarigt problem för detta tillvägagångssätt. Flera grupper har observerat en proteinåtervinningsbias, med oacceptabelt låga utfällningsutbyten som en funktion av proteinkoncentration, molekylvikt och hydrofobicitet22,23. På grund av mångfalden av nederbördsprotokoll som rapporterats i litteraturen utvecklades standardiserade nederbördsförhållanden. rapporterade först beroendet av jonstyrka på utfällningseffektiviteten hos proteiner i 80% aceton24. För alla undersökta proteiner visade sig tillsatsen av upp till 30 mM natriumklorid vara avgörande för att maximera utbytet (upp till 100% återhämtning). visade nyligen att kombinationen av ännu högre jonstyrka (upp till 100 mM) med förhöjd temperatur (20 ° C) under acetonutfällning gav nära kvantitativ återhämtning på 2-5 min25. En liten minskning av återvinningen av proteiner med låg molekylvikt (LMW) observerades. därför visade en efterföljande rapport från Baghalabadi m.fl. den framgångsrika återhämtningen av LMW-proteiner och peptider (≤5 kDa) genom att kombinera specifika salter, särskilt zinksulfat, med en högre nivå av organiskt lösningsmedel (97% aceton)26.

Medan raffinering av nederbördsprotokollet ger en mer tillförlitlig proteinreningsstrategi för MS-baserad proteomik, är framgången för konventionell nederbörd starkt beroende av användarteknik. Ett primärt mål med detta arbete är att presentera en robust nederbördsstrategi som underlättar isoleringen av proteinpelleten från den förorenande supernatanten. En engångsfiltreringspatron utvecklades för att eliminera pipettering genom att isolera aggregerat protein ovanför ett poröst PTFE-membranfilter27. MS-störande komponenter i supernatanten avlägsnas effektivt i ett kort centrifugeringssteg med låg hastighet. Engångsfilterpatronen erbjuder också en utbytbar SPE-patron, vilket underlättar efterföljande provrensning efter resolubilisering och valfri proteinuppslutning, före masspektrometri.

En serie rekommenderade arbetsflöden för proteomutfällning presenteras här, inklusive modifierade aceton- och kloroform/metanol/vatten28-protokoll , i ett konventionellt (injektionsflaskabaserat) och ett halvautomatiskt format i en engångsfiltrerings- och extraktionspatron i två tillstånd. De resulterande proteinåtervinningarna och SDS-utarmningseffektiviteten framhävs, tillsammans med bottom-up LC-MS / MS-proteomtäckning, för att visa det förväntade resultatet från varje protokoll. De praktiska fördelarna och nackdelarna med varje tillvägagångssätt diskuteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Materiella överväganden och förberedning av prover

  1. Använd endast lösningsmedel med hög renhet (aceton, kloroform, metanol) (>99,5%) och kemikalier, fria från överskott av fukt.
  2. Förbered natriumklorid- och zinksulfatlösningar (1 M) i vatten.
    OBS: Saltlösningar kan förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur, så länge de är fria från föroreningar eller mikrobiell tillväxt.
  3. Använd den minsta injektionsflaskan med mikrocentrifug av polypropen (PP) som är tillräcklig för att behålla den erforderliga volymen prov och vätska för att inducera utfällning.
  4. Se till att SDS-koncentrationen i provet som ska fällas ut inte är större än 2 % (w/v). Om SDS är högre, späd provet med vatten.
  5. Säkerställ en proteinkoncentration mellan 0,01 och 10 g/l för optimal utfällningseffektivitet.
    OBS: Den optimala massan för utfällning varierar mellan 1-100 μg protein.
  6. Se till att alla lösningsmedel och lösningar är fria från partiklar före användning. Utför antingen ett filtreringssteg (<0,5 μm) eller centrifugeringssteg (10 000 x g i 1 min vid rumstemperatur) för att avlägsna oupplösta partiklar.
  7. Om disulfidbindningsreduktion och alkylering krävs, utför dessa steg före proteinutfällning. Överskott av reducerande och alkylerande reagens kommer att avlägsnas genom utfällningsprocessen.
  8. Fäll ut proteinerna genom att välja och utföra ett av protokollen (steg 2, 3, 4 eller 5).

2. Snabb (injektionsflaska-baserad) proteinutfällning med aceton

  1. Pipettera 90 μL (partikelfritt) protein eller proteomlösning i ett PP-mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan 10 μl 1 M vattenhaltig NaCl.
    OBS: Om proteomextraktets jonstyrka redan överstiger 100 mM behövs inget ytterligare salt.
  2. Pipettera 400 μL aceton i provet. Kapsyl injektionsflaskan och knacka försiktigt på injektionsflaskan för att kombinera spädningsmedlen. Kraftig blandning krävs inte.
    OBS: Volymen protein, salt och aceton kan ökas så länge det relativa förhållandet mellan var och en bibehålls.
  3. Låt injektionsflaskan inkubera ostört i rumstemperatur i minst 2 minuter.
    OBS: Längre inkubationer, inklusive de vid reducerad temperatur (t.ex. konventionell acetonutfällning använder nederbörd över natten i frysen), kan leda till bildandet av större (synliga) aggregerade proteinpartiklar (figur 1A), som i allmänhet inte förbättrar den totala proteinåtervinningen.
  4. Efter inkubation placera proverna i en centrifug och notera injektionsflaskans orientering. Snurra i minst 2 minuter, vid 10 000 x g eller högre vid rumstemperatur.
  5. Lossa injektionsflaskan och dekantera försiktigt supernatanten genom att långsamt vända injektionsflaskan till en avfallsbehållare. Rör den inverterade injektionsflaskan till en pappershandduk för att dra resterande vätska från injektionsflaskan.
    VARNING: Avfallsmedel bör behållas och kasseras enligt lämpliga protokoll.
  6. För SDS-innehållande prover, dispensera 400 μL färsk aceton, var försiktig så att du inte stör pelleten.
    OBS: Steg 2.6 är valfritt.
    1. Centrifugera omedelbart provet (10 000 x g eller mer i 1 min vid rumstemperatur) och placera injektionsflaskan i rotorn i samma riktning som den ursprungliga rotationen. Dekantera tvättmedlet enligt beskrivningen i steg 2.5.
  7. Låt provet torka helt med locket öppet (~ 1 min). Sätt tillbaka injektionsflaskan och fortsätt med pelletslösning (steg 6).

3. Utfällning av peptider med låg molekylvikt (LMW) (ZnSO4 + aceton)

  1. Dispensera 54 μl proteomextrakt till en 2 ml PP-injektionsflaska och tillsätt sedan 6 μl 1 M ZnSO4.
    OBS: Optimal återvinning av LMW-peptider (≤5 kDa) erhålls genom tillsats av aceton till en slutlig volym på 97 volymprocent. Om man antar en 2 ml PP-injektionsflaska är den maximala initiala provvolymen 54 μl.
  2. Tillsätt 1940 μl aceton till en slutlig volym på 97 volymprocent. Virvla försiktigt för att blanda och låt stå ostört på bänkskivan i minst 2 min.
  3. Centrifugera (10 000 x g i 1 min vid rumstemperatur) och avlägsna supernatanten genom att vända injektionsflaskan och sedan vidröra injektionsflaskan till en pappershandduk.
  4. För SDS-innehållande prover, dispensera 400 μL färsk aceton, var försiktig så att du inte stör pelleten.
    OBS: Steg 3.4 är valfritt.
    1. Centrifugera omedelbart provet enligt steg 3.3 och placera injektionsflaskan i rotorn i samma riktning som den ursprungliga rotationen. Dekantera tvättmedlet enligt beskrivningen i steg 3.3.
  5. Re-solubilize den resulterande torra pelleten i ett vattenhaltigt lösningsmedel med kort virveling eller ultraljudsbehandling (~ 5 min).

4. Proteinutfällning med kloroform/metanol/vatten (CMW)

  1. Dosera 100 μl av protein- eller proteomlösningen i en PP-injektionsflaska. Tillsätt 400 μl metanol följt av 100 μl kloroform. Täck injektionsflaskan och virveln kort för att blanda.
    OBS: För CMW-nederbörd föredras 1,5 ml injektionsflaskor med smala bottnar (figur 2A).
    VARNING: Kloroformlösningsmedel ska hanteras i en lämplig ventilationshuv. Alla lösningsmedel som kommer i kontakt med kloroform ska behandlas som halogenerat avfall när de bortskaffas.
  2. Dosera snabbt 300 μL vatten direkt i mitten av injektionsflaskan. Kapsylen. Låt provet sitta ostört på bänkskivan i 1 min.
    OBS: Lösningen kommer omedelbart att visas grumlig vit. Undvik att blanda injektionsflaskan efter tillsats av vatten.
  3. Placera injektionsflaskan med PP i en centrifug och snurra i minst 5 minuter (10 000 x g eller högre vid rumstemperatur).
    OBS: När de har centrifugerats kommer två synliga lösningsmedelsskikt att bildas (toppskikt = metanol / vatten; botten = kloroform). En fast proteinpellet bildas vid lösningsmedelsgränssnittet (figur 2A).
  4. Använd en stor (1 ml) mikropipettspets och håll injektionsflaskan vid ~ 45 °, ta bort ~ 700 μL av vätskan från det övre lagret med en jämn hastighet.
  5. Använd en mindre (200 μl) mikropipettspets för att fortsätta ta bort det övre lösningsmedelsskiktet från den ~45° lutande injektionsflaskan. Pipettera i en kontinuerlig rörelse tills det övre lösningsmedelsskiktet bildar en pärla i injektionsflaskan.
  6. Tillsätt 400 μl färsk metanol till injektionsflaskan med provet, utan att störa pelleten, genom att dosera vätskan längs sidan av injektionsflaskan.
  7. Kapsylen. Kombinera lösningsmedelsskikten genom att försiktigt gunga injektionsflaskan för att virvla ihop lösningsmedlen.
    OBS: Det är viktigt att undvika att störa pelleten. Virvla inte injektionsflaskan.
  8. Notera injektionsflaskans orientering i rotorn och centrifugera i minst 10 min (10 000 x g vid rumstemperatur). Proteinpelleten fäster vid injektionsflaskans botten (figur 2B).
  9. Tippa injektionsflaskan i 45°, med pelleten nedåt. Placera pipettspetsen längs injektionsflaskans övre kant och ta bort supernatanten med en 1 ml mikropipettspets i långsam men kontinuerlig takt. Behåll ~20 μl vätska i injektionsflaskan.
  10. Tvätta proteinpelleten för SDS-innehållande prover genom att långsamt dosera 400 μL färsk metanol. Virvla inte injektionsflaskan.
    1. Fortsätt direkt med centrifugering (10 000 x g i 2 minuter vid temperatur) och placera injektionsflaskan i rotorn med samma orientering som det ursprungliga snurret.
  11. Ta bort lösningsmedlet enligt steg 4.9. Låt provet lufttorka i rök tills det kvarvarande lösningsmedlet avdunstar.
  12. Se de rekommenderade resolubiliseringsförfarandena i steg 6.

5. Proteinutfällning med en engångsfiltreringspatron

OBS: Varje lösningsmedelsbaserat utfällningsprotokoll som beskrivs i steg 2-5 kan utföras i en tvåstegs filtrerings- och extraktionspatron (se materialtabell).

  1. Med pluggen ansluten till den övre filtreringspatronen (figur 3A), dispensera önskad volym av det extraherade proteomet, saltet och lösningsmedlet enligt beskrivningen i ett av de tre alternativen nedan.
    1. (Alternativ 1) För proteinutfällning med aceton, kombinera 90 μL protein eller proteomlösning, 10 μL 1 M vattenhaltig NaCl och 400 μL aceton. Inkubera i minst 2 min på bänkskivan.
      OBS: En synlig fällning kommer att utvecklas för koncentrerade proteinprover (1 g / L) (figur 3B).
    2. (Alternativ 2) För LMW-peptidutfällning, kombinera 15 μL av provet, 1,5 μL 1 M ZnSO4 och 485 μL aceton. Inkubera i minst 2 min på bänkskivan.
      OBS: En saltkoncentration på 90 mM i vattenprovet påverkar inte återvinningen i förhållande till de 100 mM som rekommenderas i steg 3.
    3. (Alternativ 3) För CMW-utfällning, tillsätt 50 μL proteomextrakt, 200 μL metanol och 50 μL kloroform. Täck injektionsflaskan och kort virvel för att kombinera.
      1. Dosera snabbt 150 μL vatten direkt i mitten av injektionsflaskan. Inkubera i 1 min på bänkskivan.
  2. Centrifugera i 2 min vid 2 500 x g vid rumstemperatur med kontakten fortfarande ansluten till filtreringspatronen.
  3. Vänd upp patronen och skruva sedan loss och ta bort kontakten från patronbasen.
  4. Placera filtreringspatronen i en ren injektionsflaska och återgå till centrifugen. Snurra i 3 min vid 500 x g vid rumstemperatur. Kassera den genomströmningsvätskan från den nedre injektionsflaskan.
    OBS: Om något lösningsmedel finns kvar i den övre filtreringspatronen, återgå till centrifugen och utför ytterligare en snurrning.
  5. Tvätta proteinpelleten genom att tillsätta 400 μL aceton till filtreringspatronen (för CMW-utfällning, steg 5.1.3, tillsätt 400 μL metanol).
  6. Centrifugera i 3 min vid 500 x g vid rumstemperatur eller tills inget lösningsmedel finns kvar i den övre cylinderampullen.
  7. Solubilisera nederbördspelleten igen enligt beskrivningen i steg 6.

6. Resolubilisering av proteinpellets

  1. Våt membranet vid basen av filtreringspatronen genom att dosera 2-5 μL isopropanol direkt till membranet omedelbart före de resolubiliseringsprotokoll som beskrivs nedan.
  2. Följ någon av följande resolubiliseringsmetoder.
    1. (Alternativ 1) Tillsätt minst 20 μl vattenhaltig buffert innehållande ≥2 % SDS till filtreringspatronen. Keps och virvel kraftigt (~ 1 min). Alternativt, sonikat (>10 min) för att dispergera proteinpelleten.
      1. Värm provet vid 95 °C i 5 min). Upprepa blandningssteget efter uppvärmning.
        OBS: Laemmli gelbelastningsbuffert kan åter solubilisera proteinpelleten. SDS-innehållande prover är dock oförenliga med trypsinsmältning och LC och MS med omvänd fas.
    2. (Alternativ 2) Bered en lösning av 80% (v / v) myrsyra i vatten. Förskjut syralösningen (-20 °C) samt filtreringspatronen som innehåller utfällt protein.
      1. Dispensera 50 μL kall myrsyra i patronen; lock och virvel i 30 s. Återgå till frysen (-20 °C) i 10 min.
      2. Vortex patronen igen i 30 s. Upprepa sedan kylnings- och blandningscykeln en gång till (10 min, -20 °C, 30 s virvel).
      3. Tillsätt vatten till en slutlig 500 μL, späd myrsyran till 8%.
        OBS: Protokollet för kallmyrsyra är oförenligt med efterföljande trypsinsmältning men är kompatibelt med LC-MS.
    3. (Alternativ 3) Tillsätt 50 μL nyberedd 8 M urea i vatten till filtreringspatronen. Ultraljudsbehandling i 30 minuter.
      1. Låt patronen inkubera på bänkskivan i 1 timme (upp till över natten).
      2. Späd 8 M urea minst 5 gånger med vatten eller lämplig buffert.
        OBS: När det har utspätts är urea-solubiliseringsprotokollet kompatibelt med efterföljande trypsinuppslutning, såväl som LC-MS.

7. Protein matsmältning

  1. För MS-analys nedifrån och upp, utsätt de re-solubiliserade proteinerna för enzymatisk matsmältning med hjälp av en av de två metoderna som nämns nedan.
    1. (Alternativ 1) För myrsyraupplösning, minska den initiala volymen av 80% myrsyra i steg 6.2.2.1 till 25 μL. I steg 6.2.2.3, använd 375 μL vatten för att späda myrsyran till 5% (v/v).
    2. Dispensera pepsin i cylinderampullen med ett ungefärligt protein-enzymförhållande på 50:1. Med en plugg ansluten till filtreringspatronen, inkubera provet över natten vid rumstemperatur.
  2. (Alternativ 2) För resolubilisering i urea, säkerställ ett pH mellan 8 och 8,3 med införande av 100 mM Tris eller ammoniumbikarbonat i steg 6.2.3.2.
    1. Tillsätt trypsin vid ett ungefärligt massförhållande mellan protein och enzym på 50:1. Med en plugg fäst på cylinderampullen inkubera provet över natten i ett varmt vattenbad vid 37 °C.
    2. Avsluta matsmältningen genom att surgöra lösningen med 10% TFA till en slutlig 1%.
  3. Återvinn det pepsin- eller trypsinsmälta proteinet genom att ta bort pluggen från filtrets botten och centrifugera cylinderampullen i en ren injektionsflaska (2 min, 5000 x g, rumstemperatur).

8. SPE-sanering

ANMÄRKNING: För ytterligare provavsaltning efter uppslutning eller utbyte av lösningsmedel kan provet genomgå omvänd fassanering enligt beskrivningen.

  1. Grundstöt en SPE-patron (se materialtabell) genom att passera 300 μL metanol (2 min, 400 x g) följt av 300 μl 5% acetonitril/0,1% TFA (2 min, 400 x g).
  2. Anslut den grundade SPE-patronen till basen på filtreringspatronen som innehåller återlösligt eller smält protein.
  3. Snurra proteinet genom SPE-patronen (5 min, 800 x g vid rumstemperatur). Om lösningsmedel kvarstår i den övre patronen, sätt tillbaka patronen till centrifugen och upprepa snurret.
    Obs: Att skicka provet genom SPE-patronen en andra gång kan förbättra återhämtningen.
  4. Tillsätt 300 μL 5% acetonitril/0,1% TFA i vatten till patronen. För att tvätta, strömma genom SPE-patronen (2 min, 2000 x g). Kassera genomströmningen.
  5. För LMW-proteiner eller smälta peptider, eluera provet genom att flöda 300 μL 50% acetonitril/0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
  6. För intakta proteiner, följ steg 8,5 med ytterligare ett elueringssteg med 300 μL 75% acetonitril/0,1% TFA. Kombinera de två resulterande extrakten.
    OBS: Steg 8.6 är valfritt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 sammanfattar den förväntade SDS-utarmningen efter injektionsflaskans eller patronunderstödda utfällning av proteiner i en engångsfilterpatron med aceton. Konventionell inkubation över natten (-20 °C) i aceton jämförs med protokollet för snabb acetonutfällning vid rumstemperatur (steg 2) samt CMW-utfällning (steg 4). Rest sds kvantifierades med analys av metylenblått aktiva substanser (MBAS)29. Kortfattat kombinerades 100 μL prov med 100 μL MBAS-reagens (250 mg metylenblått, 50 g natriumsulfat, 10 ml svavelsyra, utspädd i vatten till 1,0 L), följt av tillsats av 400 μL kloroform och absorbansmätning av det organiska skiktet vid 651 nm på en UV / Vis-spektrofotometer. Alla metoder minskar SDS för att möjliggöra optimal MS-analys.

Kvantitativ och reproducerbar proteinåtervinning uppnås efter snabb acetonutfällning och CMW-utfällning, vilket ses i figur 5 genom SDS PAGE-analys av en bearbetad jäst totalcellslysat. Utfällning i en engångsfiltreringspatron eliminerar behovet av att försiktigt pipettera den SDS-innehållande supernatanten samtidigt som de aggregerade proteinerna behålls ovanför ett membranfilter. Konsekvent återvinning erhålls med alla utfällningsprotokoll, utan att några synliga band detekteras i supernatantfraktionerna över tre oberoende replikat.

Figur 6 kvantifierar de förväntade utbytena, inklusive resolubilisering av utfällda proteinpellets med användning av kall myrsyra (steg 6). CMW-nederbörd ger kvantitativ återhämtning genom att försiktigt bevara pelleten i en injektionsflaskabaserad metod (steg 5), vilket är lika med det som erhålls med patronen (100 ± 4% mot 101 ± 3% respektive). Återvinning av acetonutfällda proteinpellets drar nytta av en filtreringspatron, med en 15-20% förbättring av utbytet observerad. I injektionsflaskor är isolering av acetonsupnatanten från det aggregerade proteinet i huvudsak beroende av pelletens vidhäftning till PP-rörytan; filtreringspatronen eliminerar denna oro eftersom filtret säkerställer hög återvinning av utfällt protein utan pipettering.

För att effektivt återvinna LMW-proteiner och peptider modifieras acetonutfällningsprotokollet genom att ersätta ZnSO4 med NaCl och höja lösningsmedelsprocenten till 97%. Att kombinera detta specifika salt och högre nivåer av organiskt lösningsmedel krävs för hög återvinning av LMW-proteiner och peptider26. Som framgår av figur 7 visar patronbaserad proteinutfällning överlägsen återhämtning av ett pepsin-smält prov av bovin plasma i förhållande till injektionsflaskabaserad utfällning. Engångsspinnpatronen kan återvinna över 90% av LMW-peptiderna. Mer signifikanta skillnader i utbyte noteras i patronen vid användning av NaCl, vilket bekräftar vikten av salttyp för att maximera utbytet. Att inkludera ZnSO4 i motsats till NaCl resulterar i en aggregerad proteinpellet som lättare fångas av spinnpatronfiltret.

För att bedöma effekten av utfällningsproteiner över ett brett dynamiskt område bearbetades en blandning av tre standardproteiner: β-galaktosidas (β-gal) från E. coli, cytokrom c (Cyt c) från nötkreatur och enolas (Eno) från S. cerevisiae. Massförhållandet för β-gal: Cyt c: Eno var 10 000: 10: 1. Proverna innehöll initialt 2% av SDS före patronbaserad nederbörd (steg 5) och solubiliserades och smältes med trypsin (steg 6 och 7). Prover framställda i injektionsflaskor fungerade som en kontroll, hade ingen SDS och utelämnade utfällningen. Alla prover var föremål för motsvarande SPE-sanering (steg 8). Bottom-up MS genomfördes, där MS/MS-spektra sökte mot en kombinerad databas som innehöll alla proteiner från de tre inblandade arterna (se Materialtabell för instrument- och mjukvaruplattformar). En peptid falsk upptäcktsgrad på 1% användes. Alla tre proteinerna identifierades av MS, med 666, 28 och 35 unika peptider för β-gal, Cyt c respektive Eno. Figur 8 kvantifierar det relativa förhållandet (peptidtoppens intensitet) från varje prov, med ett förhållande över 1 som återspeglar en högre peptidförekomst för prover som bearbetas i engångsfilterpatronerna. Resultaten visar fördelarna med att införliva SDS i ett proteomikarbetsflöde, minimera proteinförlust (t.ex. från potentiell adsorption till provflaskan) och maximera peptidutbytet.

Nötkreaturlever anskaffades i en lokal livsmedelsbutik. Proteinerna isolerades genom att extrahera vävnaden med en lösning av 1% SDS. Därefter utfälldes det återvunna proteomet, solubiliserades (urea) och smältes med trypsin, allt i en engångspatron. Bottom-up LC-MS/MS genomfördes, vilket resulterade i identifiering av i genomsnitt ~8 000 proteiner (~30 000 peptider). Falska upptäcktshastigheter på 0,5% och 1,0% för peptidspektra och proteingrupper användes och sökte i bovindatabasen. Den tekniska reproducerbarheten av detta patronbaserade arbetsflöde bedöms genom överlappande proteinidentifieringar. De replikerade MS-injektionerna i ett vanligt smält prov uppnår i genomsnitt 78 ± 0,5% överlappning med de identifierade proteinerna. Som jämförelse uppnådde prover oberoende framställda i diskreta patroner 76 ± 0, 5% överlappning. Dessa data tyder på att bidraget från provberedningen till analysens totala variabilitet är mindre, i förhållande till det som redan bidragit med LC-MS-instrumentmetoden. De bovina proteiner som identifierades från tre tekniska replikat (bearbetade oberoende av varandra i tre engångspatroner) karakteriserades ytterligare med avseende på deras molekylvikt, hydrofobicitet och isoelektriska punkt, som visas i figur 9. En tvåvägs ANOVA kunde inte bestämma statistiska skillnader i de identifierade proteomerna mellan de tekniska replikaten. Slutligen jämför figur 10 antalet identifierade peptider per protein mellan de tre replikerade provpreparaten. Korrelationskoefficienterna i dessa diagram (0,94-0,95) visar den höga konsistensen hos provberedningsmetoden för MS-analys nedifrån och upp.

Figure 1
Figur 1: Acetonutfällda proteiner. Prover innehållande 100 och 1 000 μg protein kombinerat med 100 mM NaCl och utfällt med 80 % aceton (A) efter 5 minuters utfällningstid och (B) efter utfällning och efterföljande centrifugering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Proteinutfällning med kloroform/metanol/vatten. Ett prov innehållande 50 μg protein utfällt enligt steg 4. A) Omedelbart efter steg 4.4. B) Omedelbart efter steg 4.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Foton av en engångs tvåstegsfiltrerings- och extraktionspatron för proteinutfällning. Ett prov innehållande 100 μg protein kombinerades med 100 mM NaCl och 80% aceton i (A) den monterade filtrerings- och SPE-patronen och (B) fälldes ut i 5 min tills proteinaggregat blev synliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: SDS-utarmningseffektivitet efter proteinutfällning. Procentandelen SDS som avlägsnas visas från acetonutfällning med det konventionella protokollet (över natten vid -20 °C), snabbprotokollet (2 min inkubation vid rumstemperatur) eller genom kloroform/metanol/vatten (CMW) utfällning av en S. cerevisiae lysat, både i konventionellt (injektionsflaska) och patronformat. Dessa prover innehöll initialt 0,5% SDS (5 000 ppm), vilket innebär >99,8% SDS-borttagning krävs för optimal MS-analys. Rest SDS kvantifieras med metylenblått aktivt ämne (MBAS). Felstaplar representerar standardavvikelsen från tekniska replikat (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Total proteomåtervinning genom utfällning. SDS PAGE visar återvinningen av S. cerevisiae total proteinlysat, utfälld av (A) konventionell acetonutfällning, (B) kloroform / metanol / vattenutfällning och (C) snabb acetonutfällning. Proteinband observeras uteslutande i pelletsfraktionen, utan synliga band i supernatanten (Super.). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Överlägsen proteinåtervinning i en filtreringspatron. För utfällning av S. cerevisiae totala proteinlysat underlättar engångsspinnpatronen kvantitativ återhämtning med aceton- och CMW-utfällning. Hög återvinning är också möjlig med injektionsflaskabaserad utfällning, även om noggrann provmanipulation och pipettering krävs. LC-UV-bedömd proteinåtervinning efter resolubilisering av pelleten med kall myrsyra visas här. Felstaplar representerar standardavvikelsen från tekniska replikat (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Höga nederbördsutbyten för peptider med låg molekylvikt. Ett modifierat acetonutfällningsprotokoll för peptider och proteiner ≤5 kDa innebär att 100 mM ZnSO4 kopplas med 97% aceton för att uppnå högsta avkastning. Nederbörd som underlättas av en engångsfiltreringspatron visar förbättrad återvinning jämfört med konventionell injektionsflaskabaserad nederbörd under alla tre nederbördsförhållanden. Felstaplar representerar standardavvikelsen från tekniska replikat (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Högre återvinning av standardproteiner i SDS-baserat arbetsflöde. Tukey Box-and-Whisker plottar30 av relativ MS-signalintensitet för peptider som återvunnits från SDS-innehållande proteiner som bearbetats i en engångsfiltreringspatron i förhållande till ett kontrollprov (ingen SDS, ingen utfällning). De använda proteinerna spänner över ett dynamiskt omfång med bred koncentration β-galaktosidas: cytokrom c: enolas = 10 000: 10: 1. Varje kvartil i rutorna innehåller 25% av fördelningen, medan felstaplar omfattar 95% av fördelningen. Medelvärdet indikeras med "+" och medianen med en horisontell linje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Identifierade proteinfördelningar från tekniska replikat. Tukey Box-and-Whisker-diagram karakteriserar (A) molekylvikten, (B) hydrofobiciteten och (C) isoelektrisk punkt för proteiner som identifieras av bottom-up LC-MS / MS efter tredubbla beredningar av en bovin leverlysat i en tvåstegs filtrerings- och extraktionspatron. Det fanns ingen statistisk skillnad i dessa egenskaper med tvåvägs ANOVA (p < 0,05). Varje kvartil i rutorna innehåller 25% av fördelningen, medan felstaplar omfattar 95% av fördelningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: Korrelation av peptid-ID per protein genom det SDS-baserade beredningsarbetsflödet över preparativa replikat. Analys av bottom-up proteom reproducerbarhet över (A) prov 1 och 2, (B) prov 2 och 3 och (C) prover 1 och 3 baserat på antalet peptid MS-identifieringar per protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optimal MS-karakterisering uppnås när kvarvarande SDS är uttömt under 10 ppm. Medan alternativa metoder, såsom FASP och matsmältning på pärlor, erbjuder kvantitativ SDS-utarmning med variabel återhämtning 31,32,33, är det primära målet med nederbörd att maximera renhet och avkastning samtidigt. Detta beror på att effektivt isolera supernatanten (som innehåller SDS) utan att störa proteinpelleten. Med flaskbaserad nederbörd, när huvuddelen av supernatanten har avlägsnats genom pipettering, är det alltmer troligt att några av de aggregerade pelletsna av misstag går förlorade. Av denna anledning är det viktigt att lämna en mer betydande fraktion av det kvarvarande lösningsmedlet (~ 20 μL) och att lägga till ett tvättsteg34. Tvättsteget späds ut och tar bort det återstående vätskan från injektionsflaskan. Särskilt med CMW är det onödigt att virvla provflaskan när pelleten har bildats. Att störa pelleten genom kraftig omrörning har den oönskade effekten att öka sannolikheten för förlust från oavsiktlig pipettering. Om virveling ingår (som rekommenderats av tidigare protokoll)35 finns det potential för att delar av CMW-pelleten fäster på undersidan av injektionsflaskans lock. När pelleten har centrifugerats förblir den fixerad på injektionsflaskans lock och kan resultera i ~ 50% förlust.

Snabb utfällning kan utföras med hög återvinning av utspädda proteomprover, helst mellan 0,01-2 mg / ml, eller en motsvarande proteinmassa mellan 1-200 μg. Kvantitativa och reproducerbara återvinningar som börjar från under 0,01 mg / ml protein kan dock dra nytta av längre nederbördstider från 10 min till 1 timme, vilket visar genomströmningsbegränsningar för nederbördsarbetsflödet. Överraskande nog visar mer koncentrerade prover (10 mg / ml) en statistisk minskning av utbytet, förmodligen från oavsiktliga pipetteringsförluster. Förutsatt att > 10 μg protein bör en synlig pellet observeras på sidan av injektionsflaskan (figur 1B). Mindre mängder, ner till 1 μg, är utmanande att se. Detta utmanar förmågan att pipettera supernatanten utan att störa proteinpelleten. Injektionsflaskan kan inverteras (långsamt) med aceton för att separera vätskan från pelleten. För CMW fäster pelleten inte tillräckligt tillförlitligt på injektionsflaskan, vilket gynnar pipettering framför dekantering av supernatanten. För injektionsflaskabaserad utfällning rekommenderas arbete med minsta möjliga mikrocentrifugrör för att underlätta de avsedda prov- och lösningsmedelsvolymerna. Utfällning i engångsfiltreringspatronen som används i detta arbete ger en maximal volymkapacitet på 500 μL, vilket möjliggör proteinutfällning med 80% aceton på provvolymer upp till 100 μL. Prov-, salt- och lösningsmedelsvolymer kan justeras i enlighet därmed om de rekommenderade koncentrationerna bibehålls.

Renheten hos proteinpelleten som återvinns från organisk lösningsmedelsbaserad utfällning begränsas av komplexiteten hos provmatrisen, buffertkomponenterna och utfällningsförhållandena. Till exempel har specifika buffertkomponenter såsom glycin (används för SDS PAGE-separationer) visat sig fälla ut tillsammans med protein med 80% aceton. Glycin förblir emellertid lösligt genom CMW-utfällning. Aceton har rapporterats fälla ut DNA-fragment36,37, vilket potentiellt tillför oönskade bakgrundsföroreningar till den återvunna pelleten. Utfällning av proteiner och peptider med låg molekylvikt kräver en förhöjd nivå av organiskt lösningsmedel och en specifik salttyp för att maximera utbytet. Medan flera salter har utforskats, ger ZnSO4 konsekvent höga produkter. Detta salt kommer att fällas ut i 97% aceton i frånvaro av protein. Således innehåller den resulterande proteinpelleten en hög koncentration av salt. Det noteras att användning av 90% aceton i volym också kommer att uppnå höga peptidutbyten, även om en statistiskt signifikant minskning (~ 5%) i återhämtning förväntas. Detta möjliggör emellertid bearbetning av en mer signifikant provvolym (upp till 180 μL, med 20 μL 1 M ZnSO4) i varje 2 ml injektionsflaska. Utöver matrisföroreningar som fälls ut tillsammans med proteinpelleten måste det anges att lösningsmedelsutfällning i sig orsakar denaturering av provet38,39. Därför är detta protokoll inte tillämpligt för beredningar av funktionella proteiner eller inhemska MS-arbetsflöden. Aceton har också rapporterats orsaka kovalenta proteinmodifieringar vid glycinrester40 och inducera en +98 u massförskjutning, spekuleras vara en biprodukt av aldolkondensation aceton41.

Vid användning av en filtreringspatron för proteinutfällning är isolering av proteinpelleten beroende av retention av aggregat ovanför ett PTFE-membranfilter. Porositeten hos detta membran överstiger den hos ett molekylviktsavgränsningsfilter (som ses i FASP), vilket möjliggör proteinisolering med reducerade rotationstider. Snabb lösningsöverföring vid låga rotationshastigheter är beroende av korrekt vätning av PTFE-membranet; organiska lösningsmedel strömmar lätt igenom, även om ett torrt PTFE-filter hindrar vattenhaltiga lösningsmedel. Om filtreringspatronen verkar vara igensatt ska membranet fuktas igen genom att direkt applicera en liten volym organiskt lösningsmedel (t.ex. isopropanol) på filtret. Beroende på proteinpelletens storlek och volymen av det använda provet kan ytterligare centrifugering eller snurr vid högre hastigheter (upp till 3 000 x g) krävas för att säkerställa att allt lösningsmedel har passerat genom filtreringspatronen.

Proteinåtervinning från nederbörd med optimala förhållanden begränsas i slutändan av utmaningen med pelletsåterlösning, med få lösningsmedelsalternativ som är kompatibla med nedströms bearbetning och LC-MS. Dessutom bidrar flera nederbördsförhållanden som långa exponeringar för låga temperaturer och övertorkning av en tätt packad pellet till återlöslighetsutmaningar40. Det noteras att CMW-proteinpellets i allmänhet är mindre lösliga än acetonpellets. Maximerad återlösningseffektivitet av utfällt protein med 80% kall myrsyra (steg 6.2.2) har tidigare rapporterats42; den kalla temperaturen förhindrar proteinmodifiering, som annars sker i koncentrerad myrsyra43,44. Utspädning av syrakoncentrationen saktar också modifieringsreaktionen. Myrsyra rekommenderas för top-down MS-metoder eller före enzymatisk matsmältning med pepsin. Att använda detta lösningsmedel kräver liten fysisk behandling; tillsatsen av endast 5 μL (tillräckligt för att täcka proteinpelleten) kan vara tillräcklig i kombination med virvel, kort ultraljudsbehandling eller upprepa pipettering. På samma sätt, för prover som är avsedda att analyseras med SDS PAGE, är återupplösning i SDS-innehållande Laemmli-buffert mycket effektiv när den kombineras med blygsam blandning av provet före uppvärmning. Dessa lösningsmedel är emellertid båda oförenliga med trypsin. Resolubilisering med 8 M urea rekommenderas före trypsinsmältning, vilket säkerställer att urean är nyberedd (samma dag). En minsta volym på 50 μL buffert rekommenderas för protein-re-solubilization i filtreringspatronen för att maximera kontakten mellan det chaotropa lösningsmedlet och pelleten, samt för att underlätta upplösning under ultraljudsbehandling, upprepa pipettering och / eller virvel. Alternativa metoder utnyttjar trypsin för att återstå proteinet, vilket innebär att proteinet inte behöver lösas upp helt före enzymtillsats. Detta tillvägagångssätt kan dock förspänna matsmältningen, vilket gynnar de mer lösliga arterna medan hydrofoba proteiner upplever kortare matsmältningstid45. Tillsats av 8 M urea, tillsammans med basiska buffertar som Tris eller ammoniumbikarbonat, kräver ett rengöringssteg efter matsmältningen. För sådana provtillsatser är rengöring av omvänd faskolonn idealisk. Engångsfiltreringspatronen som används i denna studie kompletteras med en utbytbar SPE-patron med omvänd fas. Denna patron är också idealisk för lösningsmedelsutbyte, i fallet med myrsyraupplösningsprotokollet. Det är viktigt att notera att varje fastfasutvinningsmetod är förknippad med inneboende förlust vid provåtervinning. Därför bör användaren väga fördelarna med återhämtning och ytterligare rening för deras experiment.

Det förväntas att dessa protokoll kommer att göra det möjligt för proteomikforskare att effektivisera sina tvättmedelsbaserade arbetsflöden och dra nytta av SDS för proteomextraktion. Preparativa strategier som underlättar konsekvent återhämtning av hela proteomet är kritiska. En tvåstegs spinnpatron förenklar möjligheten till snabb, robust och reproducerbar isolering av proteomprover. Ett sådant tillvägagångssätt skulle vara mottagligt för tillämpningar som kräver noggrann analys utan att offra provgenomströmningen, såsom kliniska miljöer eller storskaliga forskningsinitiativ46. Framtida tillämpningar av dessa metoder kan inkludera upptäckt, detektion, exakt kvantifiering och upptäckt av läkemedel och läkemedelsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Doucette-laboratoriet utformade och patenterade ProTrap XG som användes i denna studie. AAD är också en av grundarna av Proteoform Scientific, som kommersialiserade provberedningspatronen.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. (Waterloo, Kanada) och SPARC BioCentre (Molecular Analysis) vid Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) för deras bidrag till förvärvet av MS-data.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Tags

Kemi Utgåva 180 Masspektrometri proteomik provberedning natriumdodecylsulfat utfällning proteinsmältning aceton kloroform/metanol/vatten
Organisk lösningsmedelsbaserad proteinutfällning för robust proteomrening före masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter