Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

Het huidige protocol beschrijft eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen onder gecontroleerde omstandigheden voor robuust en snel herstel en zuivering van proteoommonsters voorafgaand aan massaspectrometrie.

Abstract

Hoewel meerdere ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) -instrumenten de kwalitatieve en kwantitatieve proteoomanalyse hebben verbeterd, zijn betrouwbaardere front-endbenaderingen om eiwitten te isoleren, verrijken en verwerken vóór MS van cruciaal belang voor succesvolle proteoomkarakterisering. Lage, inconsistente eiwitterugwinning en resterende onzuiverheden zoals oppervlakteactieve stoffen zijn schadelijk voor MS-analyse. Eiwitprecipitatie wordt vaak als onbetrouwbaar, tijdrovend en technisch uitdagend beschouwd om uit te voeren in vergelijking met andere monstervoorbereidingsstrategieën. Deze zorgen worden overwonnen door gebruik te maken van optimale eiwitprecipitatieprotocollen. Voor acetonprecipitatie is de combinatie van specifieke zouten, temperatuurregeling, oplosmiddelsamenstelling en precipitatietijd van cruciaal belang, terwijl de efficiëntie van chloroform / methanol / waterprecipitatie afhankelijk is van de juiste pipettering en flaconmanipulatie. Als alternatief zijn deze neerslagprotocollen gestroomlijnd en semi-geautomatiseerd in een wegwerpspincartridge. De verwachte resultaten van eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen in het conventionele formaat en met behulp van een wegwerp-, tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon worden in dit werk geïllustreerd. Dit omvat de gedetailleerde karakterisering van proteomische mengsels door bottom-up LC-MS/MS-analyse. De superieure prestaties van sds-gebaseerde workflows worden ook aangetoond ten opzichte van niet-verontreinigde eiwitten.

Introduction

Proteoomanalyse door massaspectrometrie is steeds rigoureuzer geworden, vanwege de verbeterde gevoeligheid, resolutie, scansnelheid en veelzijdigheid van moderne MS-instrumenten. Ms-vooruitgang draagt bij aan een grotere efficiëntie van eiwitidentificatie en nauwkeuriger kwantificering 1,2,3,4,5. Met verbeterde MS-instrumentatie eisen onderzoekers een overeenkomstig consistente front-end monstervoorbereidingsstrategie die in staat is tot kwantitatief herstel van zeer zuivere eiwitten in minimale tijd in alle stadia van de workflow 6,7,8,9,10,11 . Om de proteoomstatus van een biologisch systeem nauwkeurig weer te geven, moeten eiwitten op een efficiënte en onbevooroordeelde manier uit de inheemse monstermatrix worden geïsoleerd. Hiertoe zorgt het opnemen van een denaturerende oppervlakteactieve stof, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS), voor efficiënte eiwitextractie en oplosbaarheid12. SDS interfereert echter sterk met elektrospray-ionisatie, waardoor ernstige MS-signaalonderdrukking ontstaat als het niet goed wordt geëlimineerd13.

Verschillende SDS-depletiestrategieën zijn beschikbaar voor daaropvolgende proteoomanalyse, zoals het vasthouden van eiwitten boven een moleculair gewichtsafsnijdingsfilter in wegwerpspinpatronen 14,15,16. De filterondersteunde monstervoorbereidingsmethode (FASP) heeft de voorkeur omdat het sds effectief onder 10 ppm uitput, waardoor optimale MS mogelijk wordt. Eiwitherstel met FASP is echter variabel, wat leidde tot de verkenning van andere technieken. Chromatografische benaderingen die selectief eiwitten (of oppervlakteactieve stoffen) vastleggen, zijn geëvolueerd naar verschillende handige cartridges of op kralen gebaseerde formaten 17,18,19,20,21. Gezien deze eenvoudige en (idealiter) consistente strategieën voor eiwitzuivering, wordt de klassieke benadering van eiwitprecipitatie met organische oplosmiddelen vaak over het hoofd gezien als een veelbelovende benadering van eiwitisolatie. Hoewel is aangetoond dat oplosmiddelprecipitatie SDS met succes onder kritieke niveaus uitput, is eiwitterugwinning al lang een zorg van deze aanpak. Meerdere groepen hebben een eiwitherstelbias waargenomen, met onaanvaardbaar lage neerslagopbrengsten als functie van eiwitconcentratie, molecuulgewicht en hydrofobiciteit 22,23. Vanwege de diversiteit aan neerslagprotocollen die in de literatuur worden gerapporteerd, werden gestandaardiseerde neerslagcondities ontwikkeld. In 2013 rapporteerden Crowell et al. voor het eerst de afhankelijkheid van ionische sterkte van de neerslagefficiëntie van eiwitten in 80% aceton24. Voor alle onderzochte eiwitten bleek de toevoeging van maximaal 30 mM natriumchloride essentieel om de opbrengsten te maximaliseren (tot 100% herstel). Meer recent toonden Nickerson et al. aan dat de combinatie van nog hogere ionische sterkte (tot 100 mM) met verhoogde temperatuur (20 °C) tijdens acetonprecipitatie bijna kwantitatief herstel gaf in 2-5 min25. Een lichte daling in het herstel van laagmoleculaire gewicht (LMW) eiwitten werd waargenomen. Daarom toonde een daaropvolgend rapport van Baghalabadi et al. de succesvolle terugwinning van LMW-eiwitten en peptiden (≤5 kDa) aan door specifieke zouten, met name zinksulfaat, te combineren met een hoger gehalte aan organisch oplosmiddel (97% aceton)26.

Terwijl het verfijnen van het neerslagprotocol een betrouwbaardere eiwitzuiveringsstrategie biedt voor op MS gebaseerde proteomics, is het succes van conventionele neerslag sterk afhankelijk van de gebruikerstechniek. Een primair doel van dit werk is om een robuuste precipitatiestrategie te presenteren die de isolatie van de eiwitpellet van het verontreinigende supernatant vergemakkelijkt. Een wegwerpfiltratiepatroon werd ontwikkeld om pipetteren te elimineren door geaggregeerd eiwit te isoleren boven een poreusPTFE-membraanfilter 27. MS-storende componenten in het supernatant worden effectief verwijderd in een korte, lage snelheid centrifugatiestap. Het wegwerpfilterpatroon biedt ook een verwisselbare SPE-cartridge, die het mogelijk maakt om monsters op te ruimen na resolubilisatie en optionele eiwitvertering, vóór massaspectrometrie.

Een reeks aanbevolen proteoomprecipitatieworkflows worden hier gepresenteerd, waaronder gemodificeerde aceton- en chloroform / methanol / water28-protocollen , in een conventioneel (op basis van flacons) en een semi-geautomatiseerd formaat in een wegwerp tweetoestandsfiltratie- en extractiepatroon. De resulterende eiwitterugwinningen en SDS-depletie-efficiënties worden benadrukt, samen met bottom-up LC-MS / MS-proteoomdekking, om de verwachte uitkomst van elk protocol aan te tonen. De praktische voor- en nadelen van elke aanpak worden besproken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Materiaaloverwegingen en monstervoorbereiding

  1. Gebruik alleen oplosmiddelen met een hoge zuiverheidsgraad (aceton, chloroform, methanol) (>99,5%) en chemicaliën, vrij van overtollig vocht.
  2. Bereid natriumchloride- en zinksulfaatoplossingen (1 M) in water.
    OPMERKING: Zoutoplossingen kunnen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard, zolang ze vrij zijn van verontreiniging of microbiële groei.
  3. Gebruik de kleinste polypropyleen (PP) microcentrifugeflacon die voldoende is om het vereiste volume monster en oplosmiddelen te behouden om precipitatie te induceren.
  4. Zorg ervoor dat de SDS-concentratie in het te precipiteren monster niet hoger is dan 2% (g/v). Als de SDS hoger is, verdunt u het monster met water.
  5. Zorg voor een eiwitconcentratie tussen 0,01 en 10 g/l voor een optimale neerslagefficiëntie.
    OPMERKING: De optimale massa voor neerslag varieert tussen 1-100 μg eiwit.
  6. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen en oplossingen vrij zijn van deeltjes voor gebruik. Voer een filtratie (<0,5 μm) of centrifugatiestap (10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) uit om onopgeloste deeltjes te verwijderen.
  7. Als disulfidebindingsreductie en alkylering vereist zijn, voer deze stappen dan uit voorafgaand aan eiwitprecipitatie. Overtollige reducerende en alkylerende reagentia worden verwijderd door het precipitatieproces.
  8. Bespoedig de eiwitten door een van de protocollen te selecteren en uit te voeren (stap 2, 3, 4 of 5).

2. Snelle (op injectieflacons gebaseerde) eiwitprecipitatie met aceton

  1. Pipetteer 90 μL (deeltjesvrije) eiwit- of proteoomoplossing in een PP-microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 10 μL van 1 M waterige NaCl toe.
    OPMERKING: Als de ionische sterkte van het proteoomextract al groter is dan 100 mM, is er geen extra zout nodig.
  2. Pipetteer 400 μL aceton in het monster. Sluit de injectieflacon af en tik zachtjes op de injectieflacon om de oplosmiddelen te combineren. Krachtig mengen is niet vereist.
    OPMERKING: Het volume van eiwitten, zout en aceton kan worden verhoogd zolang de relatieve verhouding van elk wordt gehandhaafd.
  3. Laat de injectieflacon ongestoord bij kamertemperatuur incuberen gedurende minimaal 2 minuten.
    OPMERKING: Langere incubaties, inclusief die bij lagere temperatuur (bijv. Conventionele acetonprecipitatie maakt gebruik van nachtelijke neerslag in de vriezer), kunnen leiden tot de vorming van grotere (zichtbare) geaggregeerde eiwitdeeltjes (figuur 1A), die over het algemeen de totale eiwitterugwinning niet verbeteren.
  4. Plaats na incubatie monsters in een centrifuge en noteer de oriëntatie van de injectieflacon. Draai minimaal 2 minuten, bij 10.000 x g of hoger bij kamertemperatuur.
  5. Sluit de injectieflacon af en decanteer het supernatant voorzichtig door de injectieflacon langzaam om te keren naar een afvalcontainer. Raak de omgekeerde injectieflacon aan op een papieren handdoek om het resterende oplosmiddel uit de injectieflacon te halen.
    LET OP: Afvalmiddelen moeten worden bewaard en weggegooid volgens de juiste protocollen.
  6. Voor SDS-bevattende monsters moet u 400 μL verse aceton afgeven, waarbij u moet oppassen dat u de pellet niet verstoort.
    OPMERKING: Stap 2.6 is optioneel.
    1. Centrifugeer het monster onmiddellijk (10.000 x g of hoger gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) en plaats de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor. Decanteer het wasmiddel zoals beschreven in stap 2.5.
  7. Laat het monster volledig drogen met de dop open (~1 min). Vat de injectieflacon samen en ga verder met het oplossen van pellets (stap 6).

3. Precipitatie van peptiden met laag molecuulgewicht (LMW) (ZnSO4 + aceton)

  1. Doseer 54 μL proteoomextract aan een injectieflacon van 2 ml PP en voeg vervolgens 6 μL 1 M ZnSO4 toe.
    OPMERKING: Optimaal herstel van LMW-peptiden (≤5 kDa) wordt verkregen door aceton toe te voegen aan een laatste volumeprocent van 97. Uitgaande van een injectieflacon pp van 2 ml is het maximale initiële monstervolume 54 μl.
  2. Voeg 1940 μL aceton toe aan een laatste 97 volumeprocent. Draai zachtjes om te mengen en laat minimaal 2 minuten ongestoord op de benchtop staan.
  3. Centrifugeer (10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) en verwijder het supernatant door de injectieflacon om te keren en vervolgens de injectieflacon aan te raken op een papieren handdoek.
  4. Voor SDS-bevattende monsters moet u 400 μL verse aceton afgeven, waarbij u moet oppassen dat u de pellet niet verstoort.
    OPMERKING: Stap 3.4 is optioneel.
    1. Centrifugeer het monster onmiddellijk volgens stap 3.3 en plaats de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor. Decanteer het wasmiddel zoals beschreven in stap 3.3.
  5. Re-solubiliteer de resulterende droge pellet in een waterig oplosmiddel met korte vortexing of ultrasoonapparaat (~ 5 min).

4. Eiwitprecipitatie door chloroform/methanol/water (CMW)

  1. Doseer 100 μL van het eiwit of de proteoomoplossing in een injectieflacon PP. Voeg 400 μL methanol toe, gevolgd door 100 μL chloroform. Sluit de injectieflacon en vortex kort af om te mengen.
    OPMERKING: Voor CMW-neerslag heeft injectieflacons van 1,5 ml met smalle bodems de voorkeur (figuur 2A).
    LET OP: Chloroform-oplosmiddel moet in een geschikte ventilatiekap worden gehanteerd. Alle oplosmiddelen die in contact komen met chloroform moeten worden behandeld als gehalogeneerd afval wanneer ze worden verwijderd.
  2. Doseer snel 300 μL water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Sluit de injectieflacon af. Laat het monster 1 minuut ongestoord op de benchtop zitten.
    OPMERKING: De oplossing ziet er onmiddellijk troebel wit uit. Vermijd het mengen van de injectieflacon na toevoeging van water.
  3. Plaats de injectieflacon PP in een centrifuge en draai gedurende minimaal 5 minuten (10.000 x g of hoger bij kamertemperatuur).
    OPMERKING: Eenmaal gecentrifugeerd, zullen zich twee zichtbare oplosmiddellagen vormen (bovenste laag = methanol / water; bodem = chloroform). Een vaste eiwitkorrel vormt zich op het oplosmiddelenoppervlak (figuur 2A).
  4. Gebruik een grote (1 ml) micropipettepunt en houd de injectieflacon op ~45° en verwijder ~700 μL van het oplosmiddel uit de bovenste laag met een uniforme snelheid.
  5. Gebruik een kleinere (200 μL) micropipettepunt om door te gaan met het verwijderen van de bovenste oplosmiddellaag uit de ~45° gekantelde injectieflacon. Pipetteer in één continue beweging totdat de bovenste oplosmiddellaag een kraal vormt in de injectieflacon.
  6. Voeg 400 μL verse methanol toe aan de monsterflacon, zonder de pellet te verstoren, door het oplosmiddel langs de zijkant van de injectieflacon af te geven.
  7. Sluit de injectieflacon af. Combineer de oplosmiddellagen door de injectieflacon voorzichtig te wiegen om de oplosmiddelen samen te draaien.
    OPMERKING: Het is essentieel om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord. Draai de injectieflacon niet vortex.
  8. Let op de oriëntatie van de injectieflacon in de rotor, centrifugeer gedurende minimaal 10 minuten (10.000 x g bij kamertemperatuur). De eiwitpellet hecht zich aan de onderkant van de injectieflacon (figuur 2B).
  9. Zet de injectieflacon op 45°, met de pellet naar beneden gericht. Plaats de pipetpunt langs de bovenrand van de injectieflacon en verwijder het supernatant met een micropipettepunt van 1 ml met een langzame maar continue snelheid. Houd ~20 μL oplosmiddel in de injectieflacon.
  10. Was de eiwitkorrel voor SDS-bevattende monsters door langzaam 400 μL verse methanol af te geven. Draai de injectieflacon niet vortex.
    1. Ga direct verder met centrifugatie (10.000 x g gedurende 2 minuten bij temperatuur) en plaats de injectieflacon in de rotor met dezelfde oriëntatie als de initiële spin.
  11. Verwijder het oplosmiddel volgens stap 4.9. Laat het monster in een rookkap aan de lucht drogen totdat het resterende oplosmiddel verdampt.
  12. Raadpleeg de aanbevolen resolubilisatieprocedures in stap 6.

5. Eiwitprecipitatie met behulp van een wegwerpfiltratiepatroon

OPMERKING: Elk op oplosmiddelen gebaseerd precipitatieprotocol dat in stap 2-5 wordt beschreven, kan worden uitgevoerd in een tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon (zie Materiaaltabel).

  1. Met de plug bevestigd aan de bovenste filtratiecartridge (figuur 3A), doseer het gewenste volume van het geëxtraheerde proteoom, zout en oplosmiddel zoals beschreven in een van de drie onderstaande opties.
    1. (Optie 1) Voor eiwitprecipitatie met aceton combineert u 90 μL eiwit of proteoomoplossing, 10 μL 1 M waterige NaCl en 400 μL aceton. Incubeer minimaal 2 minuten op de benchtop.
      OPMERKING: Er zal een zichtbaar neerslag ontstaan voor geconcentreerde eiwitmonsters (1 g/l) (figuur 3B).
    2. (Optie 2) Combineer voor LMW-peptideprecipitatie 15 μL van het monster, 1,5 μL 1 M ZnSO4 en 485 μL aceton. Incubeer minimaal 2 minuten op de benchtop.
      OPMERKING: Een zoutconcentratie van 90 mM in het waterige monster heeft geen invloed op de terugwinning ten opzichte van de in stap 3 aanbevolen 100 mM.
    3. (Optie 3) Voeg voor CMW-precipitatie 50 μL proteoomextract, 200 μL methanol en 50 μL chloroform toe. Sluit de injectieflacon af en vortex kort om te combineren.
      1. Doseer snel 150 μL water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Incubeer gedurende 1 minuut op de benchtop.
  2. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2.500 x g bij kamertemperatuur met de plug nog steeds bevestigd aan de filtratiepatroon.
  3. Keer de cartridge om en schroef de stekker uit de cartridgebasis en verwijder deze.
  4. Plaats de filtratiepatroon in een schone injectieflacon en keer terug naar de centrifuge. Draai gedurende 3 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur. Gooi het doorstroomoplosmiddel uit de onderste injectieflacon weg.
    OPMERKING: Als er een oplosmiddel achterblijft in de bovenste filtratiepatroon, keer dan terug naar de centrifuge en voer een extra spin uit.
  5. Was de eiwitpellet door 400 μL aceton aan de filtratiepatroon toe te voegen (voor CMW-precipitatie, stap 5.1.3, voeg 400 μL methanol toe).
  6. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur of totdat er geen oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft.
  7. Verzacht de neerslagkorrel opnieuw zoals beschreven in stap 6.

6. Resolubilisatie van eiwitpellet

  1. Maak het membraan aan de basis van de filtratiepatroon nat door 2-5 μL isopropanol rechtstreeks op het membraan af te geven onmiddellijk vóór de hieronder beschreven resolubilisatieprotocollen.
  2. Volg een van de volgende resolubilisatiemethoden.
    1. (Optie 1) Voeg minimaal 20 μL waterige buffer met ≥ 2% SDS toe aan de filtratiecartridge. Dop en vortex krachtig (~1 min). U kunt ook ultrasoonapparaat (>10 min) om de eiwitpellet te dispergeren.
      1. Verwarm het monster gedurende 5 minuten op 95 °C). Herhaal de mengstap na het verwarmen.
        OPMERKING: Laemmli gel laadbuffer kan de eiwitkorrel opnieuw oplossen. SDS-bevattende monsters zijn echter onverenigbaar met trypsinevertering en omgekeerde fase LC en MS.
    2. (Optie 2) Bereid een oplossing van 80% (v/v) mierenzuur in water. Prechill de zure oplossing (-20 °C), evenals de filtratiepatroon met neergeslagen eiwit.
      1. Doseer 50 μL koud mierenzuur in de patroon; dop en vortex gedurende 30 s. Terug naar de vriezer (-20 °C) gedurende 10 min.
      2. Vortex de cartridge opnieuw voor 30 s. Herhaal vervolgens de koel- en mengcyclus nog een keer (10 min, -20 °C, 30 s vortex).
      3. Voeg water toe aan een laatste 500 μL en verdun het mierenzuur tot 8%.
        OPMERKING: Het koude mierenzuurprotocol is onverenigbaar met de daaropvolgende trypsinevertering, maar is compatibel met LC-MS.
    3. (Optie 3) Voeg 50 μL vers bereid 8 M ureum in water toe aan de filterpatroon. Soniceer gedurende 30 minuten.
      1. Laat de patroon 1 uur (tot een nacht) incuberen op de benchtop.
      2. Verdun het ureum van 8 M minimaal 5 keer met water of een geschikte buffer.
        OPMERKING: Eenmaal verdund, is het ureumoplosbaarheidsprotocol compatibel met de daaropvolgende trypsinevertering, evenals LC-MS.

7. Eiwitvertering

  1. Voor bottom-up MS-analyse, onderwerp de opnieuw opgeloste eiwitten aan enzymatische spijsvertering met behulp van een van de twee onderstaande methoden.
    1. (Optie 1) Voor mierenzuurrelubilisatie verlaagt u het initiële volume van 80% mierenzuur in stap 6.2.2.1 tot 25 μL. Gebruik in stap 6.2.2.3 3 375 μL water om het mierenzuur te verdunnen tot 5% (v/v).
    2. Doseer pepsine in de patroon met een geschatte eiwit-enzymverhouding van 50:1. Met een plug bevestigd aan de filtratiecartridge, incubeer het monster 's nachts bij kamertemperatuur.
  2. (Optie 2) Voor resolubilisatie in ureum moet u zorgen voor een pH tussen 8 en 8,3 met inbegrip van 100 mM Tris of ammoniumbicarbonaat in stap 6.2.3.2.
    1. Voeg trypsine toe bij een geschatte verhouding tussen eiwit en enzymmassa van 50:1. Met een plug die aan de patroon is bevestigd, incubeer het monster een nacht in een warmwaterbad bij 37 °C.
    2. Beëindig de spijsvertering door de oplossing met 10% TFA te verzuren tot een laatste 1%.
  3. Herstel het pepsine- of trypsine-verteerde eiwit door de plug van de basis van het filter te verwijderen en de patroon in een schone injectieflacon (2 min, 5000 x g, kamertemperatuur) te centrificeren.

8. SPE opruimen

OPMERKING: Voor extra monsterontzouting na vertering of oplosmiddeluitwisseling kan het monster worden onderworpen aan omgekeerde fasereiniging zoals beschreven.

  1. Primeer een SPE-patroon (zie materiaaltabel) door 300 μL methanol (2 min, 400 x g) door te geven, gevolgd door 300 μL 5% acetonitril/0,1% TFA (2 min, 400 x g).
  2. Sluit de geprimeerde SPE-cartridge aan op de basis van de filtratiecartridge met opnieuw opgelost of verteerd eiwit.
  3. Spin het eiwit door de SPE cartridge (5 min, 800 x g bij kamertemperatuur). Als er oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft, brengt u de patroon terug naar de centrifuge en herhaalt u de centrifuge.
    OPMERKING: Als u het monster een tweede keer door de SPE-cartridge laat gaan, kan het herstel worden verbeterd.
  4. Voeg 300 μL 5% acetonitril/0,1% TFA in water toe aan de patroon. Om te wassen, stroomt u door de SPE-cartridge (2 min, 2000 x g). Gooi de doorstroom weg.
  5. Voor LMW-eiwitten of verteerde peptiden elueert u het monster door 300 μL 50% acetonitril / 0,1% TFA (5 min, 2500 x g) te laten stromen.
  6. Volg voor intacte eiwitten stap 8,5 met een extra elutiestap met 300 μL van 75% acetonitril/0,1% TFA. Combineer de twee resulterende extracten.
    OPMERKING: Stap 8.6 is optioneel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 4 geeft een overzicht van de verwachte SDS-uitputting na injectieflacongebaseerde of patroongefaciliteerde precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon met behulp van aceton. Conventionele nachtelijke incubatie (-20 °C) in aceton wordt vergeleken met het snelle acetonprecipitatieprotocol bij kamertemperatuur (stap 2), evenals CMW-neerslag (stap 4). Residueel SDS werd gekwantificeerd door de methyleenblauwactieve stoffen (MBAS) assay29. In het kort werd 100 μL monster gecombineerd met 100 μL MBAS-reagens (250 mg methyleenblauw, 50 g natriumsulfaat, 10 ml zwavelzuur, verdund in water tot 1,0 l), gevolgd door de toevoeging van 400 μL chloroform en absorptiemeting van de organische laag bij 651 nm op een UV/Vis-spectrofotometer. Alle benaderingen verminderen SDS om optimale MS-analyse mogelijk te maken.

Kwantitatief en reproduceerbaar eiwitherstel wordt bereikt na snelle acetonprecipitatie en CMW-precipitatie, zoals te zien is in figuur 5 tot en met SDS PAGE-analyse van een verwerkt gisttotaal cellysaat. Precipitatie in een wegwerpfiltratiepatroon elimineert de noodzaak om het SDS-bevattende supernatant zorgvuldig te pipetteren met behoud van de geaggregeerde eiwitten boven een membraanfilter. Consistent herstel wordt verkregen met alle neerslagprotocollen, zonder zichtbare banden gedetecteerd in de supernatantfracties over drie onafhankelijke replicaties.

Figuur 6 kwantificeert de verwachte opbrengsten, inclusief de resolubilisatie van neergeslagen eiwitpellets met koud mierenzuur (stap 6). CMW-neerslag biedt kwantitatief herstel door de pellet zorgvuldig te bewaren in een op injectieflacons gebaseerde benadering (stap 5), die gelijk is aan die verkregen met behulp van de patroon (respectievelijk 100 ± 4% versus 101 ± 3%). Terugwinning van aceton-geprecipiteerde eiwitpellets profiteert van een filtratiepatroon, waarbij een verbetering van de opbrengst met 15-20% wordt waargenomen. In injectieflacons is de isolatie van het acetonsupernatant uit het geaggregeerde eiwit in wezen afhankelijk van de hechting van de pellet aan het oppervlak van de PP-buis; de filtratiepatroon elimineert deze zorg omdat het filter zorgt voor een hoog herstel van neergeslagen eiwit zonder pipetteren.

Om LMW-eiwitten en peptiden efficiënt te herstellen, wordt het acetonprecipitatieprotocol gewijzigd door NaCl te vervangen door ZnSO4 en het oplosmiddelpercentage te verhogen tot 97%. Het combineren van dit specifieke zout en hogere niveaus van organisch oplosmiddel zijn vereist voor de hoge terugwinning van LMW-eiwitten en peptiden26. Zoals te zien is in figuur 7, toont cartridge-gebaseerde eiwitprecipitatie een superieur herstel van een pepsine-verteerd monster van runderplasma ten opzichte van precipitatie op basis van injectieflacons. De wegwerp spin cartridge kan meer dan 90% van de LMW peptiden herstellen. Meer significante verschillen in opbrengst worden opgemerkt in de cartridge bij gebruik van NaCl, wat het belang van het zouttype bevestigt om de opbrengst te maximaliseren. Het opnemen van ZnSO4 in tegenstelling tot NaCl resulteert in een geaggregeerde eiwitkorrel die gemakkelijker wordt gevangen door het spinpatroonfilter.

Om de werkzaamheid van neerslaande eiwitten over een breed dynamisch bereik te beoordelen, werd een mengsel van drie standaardeiwitten verwerkt: β-galactosidase (β-gal) uit E. coli, cytochroom c (Cyt c) uit rund en enolase (Eno) uit S. cerevisiae. De massaverhouding van β-gal:Cyt c:Eno was 10.000:10:1. Monsters bevatten aanvankelijk 2% SDS voorafgaand aan op cartridges gebaseerde precipitatie (stap 5) en werden opnieuw opgelost en verteerd met trypsine (stappen 6 en 7). Monsters bereid in injectieflacons fungeerden als een controle, hadden geen SDS en lieten de neerslag weg. Alle monsters werden onderworpen aan een gelijkwaardige SPE-opruiming (stap 8). Bottom-up MS werd uitgevoerd, waarbij MS/MS-spectra werden doorzocht aan de hand van een gecombineerde database met alle eiwitten van de drie betrokken soorten (zie Materiaaltabel voor instrument- en softwareplatforms). Een peptide valse ontdekkingspercentage van 1% werd gebruikt. Alle drie de eiwitten werden geïdentificeerd door MS, met respectievelijk 666, 28 en 35 unieke peptiden voor β-gal, Cyt c en Eno. Figuur 8 kwantificeert de relatieve ratio (peptide piekintensiteit) van elk monster, met een verhouding van meer dan 1 die een hogere peptide-abundantie weerspiegelt voor monsters die zijn verwerkt in de wegwerpfilterpatronen. De resultaten tonen de voordelen aan van het opnemen van SDS in een proteomics-workflow, het minimaliseren van eiwitverlies (bijvoorbeeld van potentiële adsorptie aan de monsterflacon) en het maximaliseren van de peptideopbrengsten.

Runderlever werd verkregen in een plaatselijke supermarkt. De eiwitten werden geïsoleerd door het weefsel te extraheren met een oplossing van 1% SDS. Vervolgens werd het teruggewonnen proteoom neergeslagen, opnieuw opgelost (ureum) en verteerd met trypsine, allemaal in een wegwerppatroon. Bottom-up LC-MS/MS werd uitgevoerd, wat resulteerde in de identificatie van gemiddeld ~8.000 eiwitten (~30.000 peptiden). Valse ontdekkingspercentages van 0,5% en 1,0% voor peptidespectra en eiwitgroepen, werd gebruikt, zoekend in de runderdatabase. De technische reproduceerbaarheid van deze cartridge-gebaseerde workflow wordt beoordeeld door middel van overlappende eiwitidentificaties. De replicerende MS-injecties van een gemeenschappelijk verteerd monster bereiken gemiddeld 78 ± 0,5% overlap met de geïdentificeerde eiwitten. Ter vergelijking: monsters die onafhankelijk van elkaar in discrete cartridges werden bereid, behaalden 76 ± overlap van 0,5%. Deze gegevens suggereren dat de bijdrage van de monstervoorbereiding aan de totale variabiliteit van de analyse gering is, in vergelijking met de bijdrage die al is bijgedragen door de instrumentele benadering van LC-MS. De rundereiwitten geïdentificeerd uit drie technische replicaties (onafhankelijk van elkaar verwerkt in drie wegwerppatronen) werden verder gekarakteriseerd met betrekking tot hun molecuulgewicht, hydrofobiciteit en iso-elektrisch punt, weergegeven in figuur 9. Een tweerichtings-ANOVA kon geen statistische verschillen in de geïdentificeerde proteomen over de technische replicaties bepalen. Ten slotte vergelijkt figuur 10 het aantal geïdentificeerde peptiden per eiwit over de drie replicaatmonsterpreparaten. De correlatiecoëfficiënten in deze grafieken (0,94-0,95) tonen de hoge consistentie aan van de monstervoorbereidingsbenadering voor bottom-up MS-analyse.

Figure 1
Figuur 1: Aceton-neergeslagen eiwitten. Monsters met 100 en 1.000 μg eiwit gecombineerd met 100 mM NaCl en neergeslagen met 80% aceton (A) na 5 minuten precipitatietijd en (B) na neerslag en daaropvolgende centrifugatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Eiwitprecipitatie door chloroform/methanol/water. Een monster met 50 μg eiwit neergeslagen volgens stap 4. (A) Onmiddellijk na stap 4.4. (B) Onmiddellijk na stap 4.8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Foto's van een wegwerp tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon voor eiwitprecipitatie. Een monster met 100 μg eiwit werd gecombineerd met 100 mM NaCl en 80% aceton in (A) de geassembleerde filtratie- en SPE-patroon en (B) neergeslagen gedurende 5 minuten totdat eiwitaggregaten zichtbaar werden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: SDS-depletie-efficiëntie na eiwitprecipitatie. Het percentage verwijderde SDS wordt weergegeven uit acetonprecipitatie met het conventionele protocol ('s nachts bij -20 °C), het snelle protocol (2 minuten incubatie bij kamertemperatuur), of door chloroform/methanol/water (CMW) precipitatie van een S. cerevisiae-lysaat , zowel in conventioneel (injectieflacon) als in patroonformaat. Deze monsters bevatten aanvankelijk 0,5% SDS (5.000 ppm), wat impliceert >99,8% SDS-verwijdering nodig is voor optimale MS-analyse. Residueel SDS wordt gekwantificeerd door methyleenblauwe werkzame stoffen (MBAS) assay. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van technische replicaties (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Totaal proteoomherstel door neerslag. SDS PAGE toont het herstel van S. cerevisiae totaal eiwit lysaat, neergeslagen door (A) conventionele acetonprecipitatie, (B) chloroform / methanol / waterprecipitatie en (C) snelle acetonprecipitatie. Eiwitbanden worden uitsluitend waargenomen in de pelletfractie, zonder zichtbare banden in het supernatant (Super.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Superieur eiwitherstel in een filtratiepatroon. Voor precipitatie van het totale eiwit lysaat van S. cerevisiae vergemakkelijkt de wegwerpspinpatroon kwantitatief herstel met aceton- en CMW-precipitatie. Een hoog herstel is ook mogelijk met neerslag op basis van injectieflacons, hoewel zorgvuldige monstermanipulatie en pipettering vereist zijn. LC-UV-beoordeeld eiwitherstel na resolubilisatie van de pellet met koud mierenzuur wordt hier weergegeven. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van technische replicaties (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Hoge neerslagopbrengsten voor peptiden met een laag molecuulgewicht. Een aangepast acetonprecipitatieprotocol voor peptiden en eiwitten ≤5 kDa omvat het koppelen van 100 mM ZnSO4 met 97% aceton om de hoogste opbrengsten te bereiken. Neerslag gefaciliteerd door een wegwerpfiltratiepatroon toont een verbeterd herstel in vergelijking met conventionele op injectieflacons gebaseerde neerslag in alle drie de neerslagomstandigheden. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van technische replicaties (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Hoger herstel van standaardeiwitten in sds-gebaseerde workflow. Tukey Box-and-Whisker plot30 van de relatieve MS-signaalintensiteit voor peptiden die zijn teruggewonnen uit SDS-bevattende eiwitten die zijn verwerkt in een wegwerpfiltratiepatroon ten opzichte van een controlemonster (geen SDS, geen precipitatie). De gebruikte eiwitten bestrijken een dynamisch bereik met een brede concentratie- β-galactosidase:cytochroom c:enolase = 10.000:10:1. Elk kwartiel in de vakken bevat 25% van de verdeling, terwijl foutbalken 95% van de verdeling omvatten. Het gemiddelde wordt aangegeven met "+" en de mediaan met een horizontale lijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Geïdentificeerde eiwitverdelingen uit technische replicaties. Tukey Box-and-Whisker-plots karakteriseren (A) het molecuulgewicht, (B) hydrofobiciteit en (C) iso-elektrisch punt van eiwitten geïdentificeerd door bottom-up LC-MS / MS na drievoudige preparaten van een runderleverlysaat in een tweetraps filtratie- en extractiepatroon. Er was geen statistisch verschil in deze kenmerken door tweeweg ANOVA (p < 0,05). Elk kwartiel in de vakken bevat 25% van de verdeling, terwijl foutbalken 95% van de verdeling omvatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Correlatie van peptide-ID's per eiwit via de op SDS gebaseerde voorbereidingsworkflow over preparatieve replicaties. Analyse van bottom-up proteoomreproduceerbaarheid in (A) monsters 1 en 2, (B) monsters 2 en 3, en (C) monsters 1 en 3 op basis van het aantal peptide MS identificaties per eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optimale MS-karakterisering wordt bereikt wanneer het resterende SDS onder 10 ppm wordt uitgeput. Terwijl alternatieve benaderingen, zoals FASP en on-bead digestion, kwantitatieve SDS-uitputting bieden met variabel herstel 31,32,33, is het primaire doel van neerslag om de zuiverheid en opbrengst tegelijkertijd te maximaliseren. Dit hangt af van het effectief isoleren van het supernatant (dat de SDS bevat) zonder de eiwitkorrel te verstoren. Bij neerslag op basis van injectieflacons, zodra het grootste deel van het supernatant is verwijderd door pipetteren, wordt het steeds waarschijnlijker dat sommige van de geaggregeerde pellets per ongeluk verloren gaan. Om deze reden is het essentieel om een groter deel van het resterende oplosmiddel (~ 20 μL) achter te laten en een wasstap34 toe te voegen. De wasstap verdunt en verwijdert het resterende oplosmiddel uit de injectieflacon. Vooral bij CMW is het niet nodig om de monsterflacon te vortexen zodra de pellet zich heeft gevormd. Het verstoren van de pellet door krachtige agitatie heeft het ongewenste effect van het vergroten van de kans op verlies door onbedoeld pipetteren. Als vortexing is opgenomen (zoals aanbevolen door eerdere protocollen)35, bestaat de mogelijkheid dat delen van de CMW-pellet zich hechten aan de onderkant van de dop van de injectieflacon; eenmaal gecentrifugeerd, blijft de pellet vastzitten op de dop van de injectieflacon en kan dit leiden tot ~ 50% verlies.

Snelle neerslag kan worden uitgevoerd met een hoog herstel van verdunde proteoommonsters, idealiter tussen 0,01-2 mg / ml, of een overeenkomstige eiwitmassa tussen 1-200 μg. Kwantitatieve en reproduceerbare terugvorderingen vanaf minder dan 0,01 mg / ml eiwit kunnen echter profiteren van langere neerslagtijden variërend van 10 minuten tot 1 uur, wat doorvoerbeperkingen van de neerslagworkflow aantoont. Verrassend genoeg laten meer geconcentreerde monsters (10 mg / ml) een statistische vermindering van de opbrengst zien, vermoedelijk door accidentele pipetteerverliezen. Ervan uitgaande >10 μg eiwit, moet een zichtbare pellet worden waargenomen aan de zijkant van de injectieflacon (figuur 1B). Kleinere hoeveelheden, tot 1 μg, zijn moeilijk te zien. Dit daagt het vermogen uit om het supernatant te pipeten zonder de eiwitpellet te verstoren. De injectieflacon kan (langzaam) worden omgekeerd met aceton om het oplosmiddel van de pellet te scheiden. Voor CMW hecht de pellet zich niet betrouwbaar voldoende aan de injectieflacon, waardoor pipetteren wordt bevorderd boven het decanteren van het supernatant. Voor precipitatie op basis van injectieflacons wordt aanbevolen om met de kleinst mogelijke microcentrifugebuis te werken om de beoogde monster- en oplosmiddelvolumes te vergemakkelijken. Precipitatie in de wegwerpfiltratiepatroon die in dit werk wordt gebruikt, biedt een maximale volumecapaciteit van 500 μL, waardoor eiwitprecipitatie met 80% aceton mogelijk is op monstervolumes tot 100 μL. Monster-, zout- en oplosmiddelvolumes kunnen dienovereenkomstig worden aangepast als de aanbevolen concentraties worden gehandhaafd.

De zuiverheid van de eiwitpellet die wordt teruggewonnen uit precipitatie op basis van organische oplosmiddelen wordt beperkt door de complexiteit van de monstermatrix, buffercomponenten en neerslagomstandigheden. Van specifieke buffercomponenten zoals glycine (gebruikt voor SDS PAGE-scheidingen) is bijvoorbeeld aangetoond dat ze samenslaan met eiwit met behulp van 80% aceton. Glycine blijft echter oplosbaar door CMW-neerslag. Van aceton is gemeld dat het DNA-fragmentenneerslaat 36,37, waardoor mogelijk ongewenste achtergrondonzuiverheden aan de teruggewonnen pellet worden toegevoegd. Precipitatie van eiwitten en peptiden met een laag molecuulgewicht vereist een verhoogd niveau van organisch oplosmiddel en een specifiek zouttype om de opbrengst te maximaliseren. Hoewel verschillende zouten zijn onderzocht, biedt ZnSO4 consistent hoge producten. Dit zout zal neerslaan in 97% aceton bij afwezigheid van eiwit. De resulterende eiwitpellet bevat dus een hoge concentratie zout. Opgemerkt wordt dat het gebruik van 90% aceton per volume ook hoge peptideopbrengsten zal bereiken, hoewel een statistisch significante daling (~ 5%) in herstel wordt verwacht. Dit maakt het echter mogelijk om een significanter monstervolume (tot 180 μL, met 20 μL van 1 M ZnSO4) in elke injectieflacon van 2 ml te verwerken. Afgezien van matrixonzuiverheden die samen met de eiwitpellet neerslaan, moet worden vermeld dat precipitatie van oplosmiddelen inherent denaturatie van het monster veroorzaakt38,39. Daarom is dit protocol niet van toepassing op de preparaten van functionele eiwitten of native MS-workflows. Van aceton is ook gemeld dat het covalente eiwitmodificaties veroorzaakt bij glycineresiduen40 en een massaverschuiving van +98 u induceert, waarvan wordt gespeculeerd dat het een bijproduct is van aldolcondensatie aceton41.

Bij het gebruik van een filtratiepatroon voor eiwitprecipitatie is de isolatie van de eiwitpellet afhankelijk van het vasthouden van aggregaten boven een PTFE-membraanfilter. De porositeit van dit membraan overtreft die van een moleculair gewichtsafsnijdingsfilter (zoals te zien in FASP), waardoor eiwitisolatie met kortere spintijden mogelijk is. Snelle oplossingsoverdracht bij lage spinsnelheden is afhankelijk van een goede bevochtiging van het PTFE-membraan; organische oplosmiddelen stromen er gemakkelijk doorheen, hoewel een droog PTFE-filter waterige oplosmiddelen belemmert. Als de filtratiepatroon verstopt lijkt te zijn, moet het membraan opnieuw worden bevochtigd door rechtstreeks een klein volume organisch oplosmiddel (bijv. isopropanol) op het filter aan te brengen. Afhankelijk van de grootte van de eiwitpellet en het gebruikte monstervolume, kan extra centrifugatie of spins bij hogere snelheden (tot 3.000 x g) nodig zijn om ervoor te zorgen dat al het oplosmiddel door de filtratiepatroon is gegaan.

Eiwitterugwinning uit neerslag met optimale omstandigheden wordt uiteindelijk beperkt door de uitdaging van pelletheroplosbaarheid, waarbij weinig oplosmiddelopties compatibel zijn met downstream-verwerking en LC-MS. Bovendien dragen verschillende neerslagomstandigheden, zoals lange blootstellingen aan lage temperaturen en het overdrogen van een dicht opeengepakte pellet, bij aan heroplosbaarheidsuitdagingen40. Opgemerkt wordt dat CMW-eiwitpellets over het algemeen minder oplosbaar zijn dan acetonpellets. Gemaximaliseerde re-solubilisatie-efficiëntie van neergeslagen eiwit door 80% koud mierenzuur (stap 6.2.2) is eerder gemeld42; de koude temperatuur voorkomt eiwitmodificatie, die anders optreedt in geconcentreerd mierenzuur43,44. Het verdunnen van de zuurconcentratie vertraagt ook de modificatiereactie. Mierenzuur wordt aanbevolen voor top-down MS-benaderingen of vóór enzymatische spijsvertering met pepsine. Het gebruik van dit oplosmiddel vereist weinig fysieke behandeling; de toevoeging van slechts 5 μL (genoeg om de eiwitpellet te bedekken) kan voldoende zijn in combinatie met vortexing, korte ultrasoonapparaat of herhaald pipetteren. Evenzo is voor monsters die bedoeld zijn om door SDS PAGE te worden geanalyseerd, het opnieuw oplossen in SDS-bevattende Laemmli-buffer zeer effectief, in combinatie met een bescheiden menging van het monster voorafgaand aan de verhitting. Deze oplosmiddelen zijn echter beide onverenigbaar met trypsine. Resolubilisatie met 8 M ureum wordt aanbevolen voorafgaand aan de trypsinevertering, zodat het ureum vers is bereid (dezelfde dag). Een minimaal volume van 50 μL buffer wordt aanbevolen voor eiwitheroplosbaarheid in de filtratiepatroon om het contact tussen het chaotische oplosmiddel en de pellet te maximaliseren, evenals om het oplossen tijdens ultrasoonapparaat, herhaald pipetteren en / of vortexen te bevorderen. Alternatieve benaderingen maken gebruik van trypsine om het eiwit opnieuw op te lossen, wat betekent dat het eiwit niet volledig opnieuw hoeft te worden opgelost voorafgaand aan enzymtoevoeging. Deze aanpak kan echter de spijsvertering vertekenen, ten gunste van de meer oplosbare soorten, terwijl hydrofobe eiwitten een kortere verteringstijd ervaren45. Toevoeging van 8 M ureum, samen met basisbuffers zoals Tris of ammoniumbicarbonaat, vereist een opruimstap van het monster na de vertering. Voor dergelijke monsteradditieven is het opruimen van omgekeerde fasekolommen ideaal. De wegwerpfiltratiepatroon die in dit onderzoek wordt gebruikt, wordt aangevuld met een verwisselbare omgekeerde fase SPE-cartridge. Deze patroon is ook bij uitstek geschikt voor oplosmiddeluitwisseling, in het geval van het mierenzuurrelubilisatieprotocol. Het is belangrijk op te merken dat elke benadering van vaste fase-extractie geassocieerd is met inherent verlies bij monsterherstel. Daarom moet de gebruiker de voordelen van herstel en de extra zuivering voor zijn experiment afwegen.

Verwacht wordt dat deze protocollen proteomics-onderzoekers in staat zullen stellen hun op detergenten gebaseerde workflows te stroomlijnen, gebruikmakend van SDS voor proteoomextractie. Preparatieve strategieën die consistent herstel van het volledige proteoom vergemakkelijken, zijn van cruciaal belang. Een tweetraps spincartridge vereenvoudigt de mogelijkheid voor snelle, robuuste en reproduceerbare proteoommonsterisolatie. Een dergelijke aanpak zou geschikt zijn voor toepassingen die een rigoureuze analyse vereisen zonder dat dit ten koste gaat van de monsterdoorvoer, zoals klinische instellingen of grootschalige onderzoeksinitiatieven46. Toekomstige toepassingen van deze benaderingen kunnen biomarkerontdekking, detectie, nauwkeurige kwantificering en ontdekking van geneesmiddelen en geneesmiddelendoelen omvatten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Het Doucette-laboratorium bedacht en patenteerde de ProTrap XG die in deze studie werd gebruikt. AAD is ook een van de oprichters van Proteoform Scientific, dat de monstervoorbereidingscartridge op de markt bracht.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. De auteurs bedanken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) en SPARC BioCentre (Molecular Analysis) van het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) voor hun bijdragen aan de verwerving van MS-gegevens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Tags

Chemie Nummer 180 Massaspectrometrie proteomics monstervoorbereiding natriumdodecylsulfaat precipitatie eiwitvertering aceton chloroform/methanol/water
Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter