Summary
本方案描述了在受控条件下的溶剂型蛋白质沉淀，以便在质谱分析之前稳定快速地回收和纯化蛋白质组样品。
Abstract
虽然质谱（MS）仪器的多项进步改进了蛋白质组的定性和定量分析，但在MS之前分离，富集和处理蛋白质的更可靠的前端方法对于成功的蛋白质组表征至关重要。低且不一致的蛋白质回收率和残留杂质（如表面活性剂）对MS分析有害。与其他样品制备策略相比，蛋白质沉淀通常被认为是不可靠，耗时且技术上具有挑战性的。通过采用最佳的蛋白质沉淀方案可以克服这些问题。对于丙酮沉淀，特定盐的组合、温度控制、溶剂组成和沉淀时间至关重要，而氯仿/甲醇/水沉淀的效率取决于适当的移液和样品瓶操作。或者，这些沉淀方案在一次性旋转墨盒中简化和半自动化。本研究阐述了以传统形式使用一次性两级过滤和提取滤芯的溶剂型蛋白质沉淀的预期结果。这包括通过自下而上的LC-MS / MS分析对蛋白质组学混合物进行详细表征。基于SDS的工作流程相对于未受污染的蛋白质也表现出卓越的性能。
Introduction
由于现代MS仪器的灵敏度，分辨率，扫描速度和多功能性的增强，质谱法的蛋白质组分析变得越来越严格。MS的进步有助于提高蛋白质鉴定效率和更精确的定量1，2，3，4，5。通过改进的MS仪器，研究人员需要一种相应一致的前端样品制备策略，能够在工作流程的所有阶段在最短的时间内定量回收高纯度蛋白质6，7，8，9，10，11.为了准确反映生物系统的蛋白质组状态，必须以高效和无偏倚的方式从天然样品基质中分离蛋白质。为此，包括变性表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），确保蛋白质12的高效提取和增溶。然而，SDS强烈干扰电喷雾电离，如果不能适当地消除13，则引起严重的MS信号抑制。
各种SDS耗尽策略可用于随后的蛋白质组分析，例如保留高于一次性旋转柱14，15，16中包含的分子量截止过滤器的蛋白质。过滤辅助样品制备方法（FASP）受到青睐，因为它有效地将SDS消耗在10 ppm以下，从而促进最佳MS。然而，FASP的蛋白质回收率是可变的，这促使了对其他技术的探索。选择性捕获蛋白质（或表面活性剂）的色谱方法已经演变成各种方便的墨盒或基于磁珠的格式17，18，19，20，21。鉴于这些简单且（理想情况下）一致的蛋白质纯化策略，使用有机溶剂进行蛋白质沉淀的经典方法经常被忽视为一种有前途的蛋白质分离方法。虽然溶剂沉淀被证明可以成功地将SDS消耗到临界水平以下，但蛋白质回收一直是这种方法的长期关注点。多个研究小组观察到蛋白质回收偏倚，沉淀率与蛋白质浓度、分子量和疏水性22，23的函数关系低得令人无法接受。由于文献中报道的降水方案的多样性，开发了标准化的降水条件。2013年，Crowell等人首次报道了离子强度对80%丙酮24中蛋白质沉淀效率的依赖性。对于检查的所有蛋白质，添加高达30 mM的氯化钠对于最大化产量（高达100%回收率）至关重要。最近，Nickerson等人表明，在丙酮沉淀期间，更高的离子强度（高达100mM）与高温（20°C）的组合在2-5 min25内给出了近乎定量的回收。观察到低分子量（LMW）蛋白的回收率略有下降。因此，Baghalabadi等人的后续报告证明，通过将特定盐，特别是硫酸锌与更高水平的有机溶剂（97%丙酮）26结合，可以成功回收LMW蛋白和肽（≤5 kDa）26。
虽然改进沉淀方案为基于MS的蛋白质组学提供了更可靠的蛋白质纯化策略，但常规沉淀的成功在很大程度上取决于用户技术。这项工作的主要目标是提出一种强大的沉淀策略，有助于从污染的上清液中分离蛋白质沉淀。开发了一种一次性过滤滤芯，通过在多孔PTFE膜过滤器27上方分离聚集的蛋白质来消除移液。上清液中的MS干扰组分在短时间的低速离心步骤中被有效去除。一次性滤芯还提供可互换的 SPE 滤芯，便于在质谱分析之前进行再溶解和可选蛋白质消解后的后续样品清理。
这里介绍了一系列推荐的蛋白质组沉淀工作流程，包括常规（基于小瓶）和半自动格式的常规（基于小瓶）的改性丙酮和氯仿/甲醇/水28 方案，以及一次性双态过滤和提取滤芯中的半自动形式。突出显示了所得的蛋白质回收率和SDS消耗效率，以及自下而上的LC-MS / MS蛋白质组覆盖率，以证明每个方案的预期结果。讨论了与每种方法相关的实际优点和缺点。
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Protocol
1. 材料考虑和样品预制备
- 仅使用高纯度溶剂（丙酮，氯仿，甲醇）（>99.5%）和化学品，不含过量水分。
- 在水中制备氯化钠和硫酸锌溶液（1M）。
注意：盐溶液可以在室温下无限期储存，只要它们没有污染物或微生物生长。 - 使用最小的聚丙烯（PP）微量离心机小瓶，足以保留所需体积的样品和溶剂以诱导沉淀。
- 确保待沉淀样品中的SDS浓度不大于2%（w / v）。如果SDS较高，请用水稀释样品。
- 确保蛋白质浓度在 0.01 至 10 g/L 之间，以实现最佳沉淀效率。
注意：沉淀的最佳质量范围在1-100μg蛋白质之间。 - 使用前确保所有溶剂和溶液不含颗粒物。进行过滤（<0.5μm）或离心步骤（10，000 x g 在室温下1分钟）以除去未溶解的颗粒。
- 如果需要二硫键还原和烷基化，请在蛋白质沉淀之前执行这些步骤。过量的还原和烷化试剂将通过沉淀过程除去。
- 通过选择和执行其中一种方案（步骤2，3，4或5）沉淀蛋白质。
2. 用丙酮快速（基于小瓶）蛋白质沉淀
- 将90μL（无颗粒）蛋白质或蛋白质组溶液移液到PP微量离心管中。然后，加入10μL1M氯化钠水溶液。
注意：如果蛋白质组提取物的离子强度已经超过100 mM，则不需要额外的盐。 - 将400μL丙酮移液到样品中。盖上小瓶盖上盖子，轻轻敲击小瓶以混合溶剂。不需要剧烈混合。
注意：只要保持蛋白质，盐和丙酮的相对比例，就可以增加蛋白质，盐和丙酮的体积。 - 让小瓶在室温下孵育，不受干扰，至少2分钟。
注意：较长的孵育，包括在降低温度下的孵育（例如，传统的丙酮沉淀在冰箱中采用过夜沉淀），可能导致形成更大（可见）的聚集蛋白质颗粒（图1A），这通常不会提高总蛋白质回收率。 - 孵育后，将样品放入离心机中，注意小瓶的方向。在室温下以10，000 x g 或更高的速率旋转至少2分钟。
- 解开小瓶的盖子，轻轻地倒入上清液，将小瓶倒置到废物容器中。将倒置的小瓶碰到纸巾上，以从小瓶中吸取残留溶剂。
注意：应根据适当的方案保留和丢弃废溶剂。 - 对于含SDS的样品，分配400μL新鲜丙酮，注意不要干扰沉淀。
注意：步骤 2.6 是可选的。- 立即离心样品（10，000× g 或更高，室温下1分钟），将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中。倾析洗涤溶剂，如步骤2.5中所述。
- 让样品在盖子打开的情况下完全干燥（约1分钟）。重新盖上小瓶并继续沉淀溶解（步骤6）。
3. 低分子量 （LMW） 肽 （ZnSO4 + 丙酮） 的沉淀
- 将54μL蛋白质组提取物分配到2 mL PP小瓶中，然后加入6μL1 M ZnSO4。
注意：LMW肽（≤5 kDa）的最佳回收率是通过在最终的97%体积中加入丙酮获得的。假设有一个 2 mL PP 小瓶，最大初始样品体积为 54 μL。 - 将1940μL丙酮加入最终的97%体积中。轻轻旋转以混合，并在台面上不受干扰地站立至少2分钟。
- 离心（室温下10，000× g1 分钟）并通过倒置小瓶除去上清液，然后将小瓶接触纸巾。
- 对于含SDS的样品，分配400μL新鲜丙酮，注意不要干扰沉淀。
注意：步骤 3.4 是可选的。- 按照步骤3.3立即离心样品，将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中。倾析洗涤溶剂，如步骤3.3中所述。
- 将所得的干沉淀重新溶解在水溶剂中，并进行短暂的涡旋或超声处理（约5分钟）。
4. 氯仿/甲醇/水（CMW）的蛋白质沉淀
- 将100μL蛋白质或蛋白质组溶液分配到PP小瓶中。加入400μL甲醇，然后加入100μL氯仿。盖上小瓶并短暂涡旋以混合。
注意：对于CMW沉淀，最好使用底部较窄的1.5 mL小瓶（图2A）。
注意：氯仿溶剂应在适当的通风罩中处理。所有与氯仿接触的溶剂在处理时均应作为卤化废物处理。 - 快速将300μL水直接分配到小瓶的中心。盖上小瓶。让样品在台面上不受干扰地放置1分钟。
注：解决方案将立即显示为浑浊的白色。避免在加水后混合小瓶。 - 将PP小瓶放入离心机中并旋转至少5分钟（室温下为10，000× g 或更高）。
注意：离心后，将形成两个可见的溶剂层（顶层=甲醇/水，底部=氯仿）。在溶剂界面处形成固体蛋白质沉淀（图2A）。 - 使用大（1 mL）微量移液器吸头，并将小瓶保持在~45°，以均匀的速率从上层除去~700μL溶剂。
- 使用较小的（200μL）微量移液器吸头继续从〜45°倾斜的小瓶中除去上层溶剂层。以一个连续的运动移液，直到上层溶剂层在小瓶中形成珠子。
- 通过将溶剂从小瓶的侧面分配，向样品瓶中加入400μL新鲜甲醇，而不会干扰沉淀。
- 盖上小瓶。通过轻轻摇动小瓶将溶剂旋转在一起来混合溶剂层。
注意：必须避免破坏颗粒。不要涡旋小瓶。 - 注意转子中小瓶的方向，离心至少10分钟（室温下10，000× g ）。蛋白质沉淀粘附在小瓶的底部（图2B）。
- 将小瓶倾斜45°，颗粒朝下。将移液器吸头沿小瓶的上边缘放置，然后用1 mL微量移液管吸头以缓慢但连续的速率除去上清液。在小瓶中保留约20μL溶剂。
- 通过缓慢分配400μL新鲜甲醇来洗涤含SDS样品的蛋白质沉淀。不要涡旋小瓶。
- 直接离心（在温度下10，000× g 持续2分钟），将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中。
- 按照步骤4.9除去溶剂。让样品在通风橱中风干，直到残留溶剂蒸发。
- 请参阅步骤6中推荐的再溶解程序。
5. 使用一次性过滤滤芯进行蛋白质沉淀
注意：步骤2-5中描述的每个溶剂基沉淀方案都可以在两级过滤和提取滤芯中进行（参见 材料表）。
- 将插头连接到上部过滤盒（图3A），分配所需体积的提取蛋白质组，盐和溶剂，如以下三个选项之一所述。
- （备选案文1）对于用丙酮沉淀蛋白质，将90μL蛋白质或蛋白质组溶液，10μL1M NaCl水和400μL丙酮混合。在台面上孵育至少2分钟。
注意：对于浓缩蛋白质样品（1 g / L），将形成可见的沉淀物（图3B）。 - （备选案文2）对于 LMW 肽沉淀，将 15 μL 样品、1.5 μL 1 M ZnSO4 和 485 μL 丙酮混合。在台面上孵育至少2分钟。
注意：与步骤3中推荐的100 mM相比，水样中90 mM的盐浓度不会影响回收率。 - （备选案文3）对于CMW沉淀，加入50μL蛋白质组提取物，200μL甲醇和50μL氯仿。盖上小瓶并短暂涡旋合并。
- 快速将150μL水直接分配到小瓶的中心。在台面上孵育1分钟。
- （备选案文1）对于用丙酮沉淀蛋白质，将90μL蛋白质或蛋白质组溶液，10μL1M NaCl水和400μL丙酮混合。在台面上孵育至少2分钟。
- 在室温下以2，500× g 离心2分钟，插头仍附着在过滤盒上。
- 反转墨盒，然后从墨盒底座上拧下并卸下插头。
- 将过滤滤芯放入干净的小瓶中，然后返回离心机。在室温下以500 x g 旋转3分钟。丢弃下小瓶中的流通溶剂。
注：如果上部过滤滤芯中残留任何溶剂，请返回离心机并进行额外的旋转。 - 通过向过滤盒中加入400μL丙酮来洗涤蛋白质沉淀（对于CMW沉淀，步骤5.1.3，加入400μL甲醇）。
- 在室温下以500× g 离心3分钟，或直到上部滤芯中没有残留溶剂。
- 重新溶解沉淀沉淀如步骤6所述。
6. 蛋白质沉淀的再溶解
- 通过在下面描述的再溶解方案之前立即将2-5μL异丙醇直接分配到膜上来润湿过滤盒底部的膜。
- 遵循以下重解方法之一。
- （备选案文1）向过滤柱中加入至少20μL含有≥2%SDS的水性缓冲液。盖子并剧烈涡旋（约1分钟）。或者，超声处理（>10分钟）以分散蛋白质沉淀。
- 将样品在95°C下加热5分钟）。加热后重复混合步骤。
注意：Laemmli凝胶上样缓冲液可以重新溶解蛋白质沉淀。然而，含SDS的样品与胰蛋白酶消化和反相LC和MS不相容。
- 将样品在95°C下加热5分钟）。加热后重复混合步骤。
- （备选案文2）在水中制备80%（v / v）甲酸的溶液。预冻酸溶液（-20°C），以及含有沉淀蛋白的过滤盒。
- 将50μL冷甲酸分配到墨盒中;盖子和涡旋30秒。返回冰箱（-20°C）10分钟。
- 再次涡旋墨盒 30 秒。然后，再次重复冷却和混合循环（10分钟，-20°C，30秒涡流）。
- 将水加入最终的500μL中，将甲酸稀释至8%。
注意：冷甲酸方案与随后的胰蛋白酶消化不兼容，但与LC-MS兼容。
- （备选案文3）将50μL新鲜制备的8 M尿素加入水中至过滤盒中。超声处理30分钟。
- 让墨盒在台面上孵育1小时（最多过夜）。
- 用水或适当的缓冲液将8M尿素稀释至少5倍。
注意：一旦稀释，尿素增溶方案与随后的胰蛋白酶消化以及LC-MS兼容。
- （备选案文1）向过滤柱中加入至少20μL含有≥2%SDS的水性缓冲液。盖子并剧烈涡旋（约1分钟）。或者，超声处理（>10分钟）以分散蛋白质沉淀。
7. 蛋白质消化
- 对于自下而上的MS分析，请使用下面提到的两种方法之一对重新溶解的蛋白质进行酶消化。
- （备选案文1）对于甲酸再溶解，在步骤6.2.2.1中将80%甲酸的初始体积减少到25μL。在步骤6.2.2.3中，使用375μL水将甲酸稀释至5%（v / v）。
- 将胃蛋白酶以大约50：1的蛋白质/酶比例分配到墨盒中。将插头连接到过滤盒上，将样品在室温下孵育过夜。
- （备选案文2）为了在尿素中重新溶解，在步骤6.2.3.2中加入100 mM的Tris或碳酸氢铵，确保pH值在8和8.3之间。
- 以近似50：1的蛋白质/酶质量比加入胰蛋白酶。将插头连接到墨盒上，将样品在37°C的温水浴中孵育过夜。
- 通过将溶液用10%TFA酸化至最终的1%来终止消化。
- 通过从过滤器的底部取下塞子并离心干净小瓶（2分钟，5000× g，室温）中含有的墨盒来回收胃蛋白酶或胰蛋白酶消化的蛋白质。
8. 扫描优化
注意：对于消解或溶剂交换后的其他样品脱盐，样品可以按所述进行反相清理。
- 通过通入300μL甲醇（2分钟，400×g），然后通过300μL5%乙腈/ 0.1%TFA（2分钟，400 x g）来启动SPE柱（参见材料表）。
- 将底漆的SPE滤芯连接到含有再溶解或消化的蛋白质的过滤滤芯的底部。
- 将蛋白质旋转通过SPE盒（5分钟，室温下800× g ）。如果溶剂残留在上部滤芯中，请将滤芯放回离心机并重复旋转。
注：再次将样品通过SPE墨盒可能会提高恢复率。 - 向滤筒中加入300μL5%乙腈/ 0.1%TFA。要清洗，请流过 SPE 滤芯（2 分钟，2000 x g）。丢弃流出物。
- 对于LMW蛋白或消化的肽，通过流动300μL50%乙腈/ 0.1%TFA（5分钟，2500× g）洗脱样品。
- 对于完整的蛋白质，按照步骤8.5，使用300μL 75%乙腈/ 0.1%TFA进行额外的洗脱步骤。合并两个结果提取物。
注意：步骤 8.6 是可选的。
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Representative Results
图4 总结了使用丙酮在一次性滤芯中基于小瓶或盒式促进的蛋白质沉淀后预期的SDS耗尽。将常规的丙酮过夜孵育（-20°C）与室温下的快速丙酮沉淀方案（步骤2）以及CMW沉淀（步骤4）进行比较。残余SDS通过亚甲基蓝活性物质（MBAS）测定29进行定量。简而言之，将100μL样品与100μLMBAS试剂（250mg亚甲基蓝，50g硫酸钠，10mL硫酸，在水中稀释至1.0L）混合，然后加入400μL氯仿并在紫外可见分光光度计上测量651nm处有机层的吸光度。所有方法均可降低 SDS，从而实现最佳的 MS 分析。
在快速丙酮沉淀和CMW沉淀之后，通过对加工酵母总细胞裂解物进行SDS PAGE分析，实现了定量和可重复的蛋白质回收，如图 5 所示。一次性过滤滤芯中的沉淀消除了仔细移取含SDS的上清液的需要，同时将聚集的蛋白质保留在膜过滤器上方。所有沉淀方案均获得一致的回收率，在三个独立重复的上清液馏分中未检测到可见条带。
图6 量化了预期产量，包括使用冷甲酸沉淀蛋白质沉淀的再溶解（步骤6）。CMW沉淀通过在基于小瓶的方法（步骤5）中小心保存沉淀物来提供定量回收，这等于使用墨盒获得的沉淀（分别为100±4%与101±3%）。丙酮沉淀蛋白颗粒的回收受益于过滤滤芯，观察到产率提高了15-20%。在小瓶中，从聚集的蛋白质中分离丙酮上清液基本上依赖于沉淀对PP管表面的粘附;过滤滤芯消除了这种担忧，因为过滤器可确保沉淀蛋白的高回收率，而无需移液。
为了有效地回收LMW蛋白和肽，通过将NaCl替换为ZnSO4 并将溶剂百分比提高到97%，对丙酮沉淀方案进行了修改。结合这种特定的盐和更高水平的有机溶剂是LMW蛋白和肽26的高回收率所必需的。如图 7所示，与基于小瓶的沉淀相比，基于柱体的蛋白质沉淀显示出胃蛋白酶消化的牛血浆样品的回收率更高。一次性旋转滤芯可以回收超过90%的LMW肽。当使用NaCl时，在墨盒中注意到更显着的产量差异，证实了盐型对最大化产量的重要性。包括ZnSO4 而不是NaCl会导致聚合的蛋白质沉淀更容易被旋转筒过滤器捕获。
为了评估在宽动态范围内沉淀蛋白质的功效，处理了三种标准蛋白质的混合物：来自 大肠杆菌 的β-半乳糖苷酶（β-gal），来自牛的细胞色素c（Cyt c）和来自 酿酒酵母的烯醇化酶（Eno）。β加仑：Cyt c：Eno的质量比为10，000：10：1。样品在基于柱体的沉淀（步骤5）之前最初含有2%的SDS，并用胰蛋白酶重新溶解和消化（步骤6和7）。在小瓶中制备的样品充当对照，没有SDS并且省略沉淀。所有样品均经过等效的SPE清理（步骤8）。进行了自下而上的MS，对照包含涉及的三种物种的所有蛋白质的组合数据库搜索MS / MS光谱（参见仪器和软件平台 的材料表 ）。采用1%的肽假发现率。所有三种蛋白质均由MS鉴定，分别具有666，28和35种独特的肽，用于β-gal，Cyt c和Eno。 图8 量化了每个样品的相对比率（肽峰强度），高于1的比率反映了在一次性滤芯中处理的样品的肽丰度较高。结果证明了将SDS纳入蛋白质组学工作流程，最大限度地减少蛋白质损失（例如，从潜在的吸附到样品瓶）和最大化肽产量的好处。
牛肝是在当地的一家杂货店购买的。通过用1%SDS的溶液提取组织来分离蛋白质。随后，回收的蛋白质组沉淀，重新溶解（尿素），并用胰蛋白酶消化，所有这些都在一次性墨盒中。自下而上地进行LC-MS / MS，结果平均鉴定出约8，000种蛋白质（约30，000种肽）。在牛数据库中搜索，对肽谱和蛋白质组采用0.5%和1.0%的错误发现率。这种基于墨盒的工作流程的技术可重复性是通过重叠的蛋白质鉴定来评估的。普通消化样品的重复MS进样平均与鉴定的蛋白质实现78±0.5%的重叠。相比之下，在离散盒中独立制备的样品实现了76±0.5%的重叠。这些数据表明，与LC-MS仪器方法已经贡献的贡献相比，样品制备对分析总变异性的贡献很小。从三个技术重复（在三个一次性墨盒中独立处理）中鉴定出的牛蛋白进一步表征了它们的分子量，疏水性和等电点， 如图9所示。双向方差分析无法确定技术重复中已鉴定的蛋白质组的统计学差异。最后， 图10 比较了三个重复样品制备中每种蛋白质的鉴定肽数量。这些图中的相关系数（0.94-0.95）证明了自下而上MS分析的样品制备方法的高度一致性。
图1：丙酮沉淀蛋白。 含有100和1，000μg蛋白质与100mM NaCl结合并用80%丙酮沉淀的样品（A）在沉淀5分钟后和（B）沉淀后沉淀并随后离心。 请点击此处查看此图的大图。
图2：氯仿/甲醇/水的蛋白质沉淀。 将含有50μg蛋白质的样品按照步骤4沉淀。（A） 紧接在步骤4.4之后。（B） 紧接在步骤4.8之后。 请点击此处查看此图的大图。
图3：用于蛋白质沉淀的一次性两级过滤和提取盒的照片。 将含有100μg蛋白质的样品与100mM的NaCl和80%丙酮结合在（A）组装的过滤和SPE滤筒中，（B）沉淀5分钟，直到蛋白质聚集体变得可见。 请点击此处查看此图的大图。
图4：蛋白质沉淀后的SDS消耗效率。 使用常规方案（在-20°C下过夜），快速方案（在室温下孵育2分钟）或通过酿酒 酵母 裂解物的氯仿/甲醇/水（CMW）沉淀，以常规（小瓶）和墨盒形式显示从丙酮沉淀中去除的SDS的百分比。这些样品最初含有0.5%的SDS（5，000 ppm），推断出>99.8%的SDS去除率是最佳的MS分析所必需的。残留的SDS通过亚甲基蓝活性物质（MBAS）测定进行定量。误差线表示与技术重复的标准偏差 （n = 3）。 请点击此处查看此图的大图。
图5：通过沉淀实现蛋白质组总回收率。 SDS PAGE显示了酿酒 酵母 总蛋白裂解物的回收率，该裂解物由（A）常规丙酮沉淀，（B）氯仿/甲醇/水沉淀和（C）快速丙酮沉淀。仅在沉淀级分中观察到蛋白质条带，上清液（Super.）中没有可见的条带。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：过滤滤芯中的卓越蛋白质回收率。 对于 酿酒酵母 总蛋白裂解物的沉淀，一次性纺丝盒有助于丙酮和CMW沉淀的定量回收。基于小瓶的沉淀也可以实现高回收率，但需要仔细的样品操作和移液。此处显示了用冷甲酸重溶沉淀后的LC-UV评估蛋白质回收率。误差线表示与技术重复的标准偏差 （n = 3）。 请点击此处查看此图的大图。
图7：低分子量肽的高沉淀率。 用于肽和蛋白质≤5 kDa的改良丙酮沉淀方案涉及将100 mM的ZnSO4 与97%的丙酮偶联以实现最高产量。与基于传统小瓶的沉淀相比，一次性过滤滤芯促进的沉淀在所有三种沉淀条件下均具有更高的回收率。误差线表示与技术重复的标准偏差 （n = 3）。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：在基于 SDS 的工作流程中，标准蛋白的回收率更高。 Tukey盒和晶须绘制了相对于对照样品（无SDS，无沉淀）的从一次性过滤盒中处理的含SDS蛋白质中回收的肽的30 个相对MS信号强度。所采用的蛋白质跨越宽浓度动态范围 - β - 半乳糖苷酶：细胞色素c：烯醇化酶= 10，000：10：1。框内的每个四分位数包含 25% 的分布，而误差线包含 95% 的分布。平均值由“+”表示，中位数由水平线表示。 请点击此处查看此图的大图。
图9：从技术重复中鉴定出的蛋白质分布。 Tukey盒和晶须图表征了（A）在两级过滤和提取柱中一式三份制备牛肝裂解物后由自下而上的LC-MS / MS鉴定的蛋白质的分子量，（B）疏水性和（C）等电点。双向方差分析对这些特征没有统计学差异（p < 0.05）。框内的每个四分位数包含 25% 的分布，而误差线包含 95% 的分布。 请点击此处查看此图的大图。
图 10：通过基于 SDS 的制备工作流程，跨制备重复，每个蛋白质的肽 ID 的相关性。 根据每个蛋白质的肽MS鉴定数量，分析（A）样品1和2，（B）样品2和3以及（C）样品1和3的自下而上的蛋白质组再现性。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
当残余SDS耗尽到10 ppm以下时，可实现最佳的MS表征。虽然FASP和磁珠消化等替代方法提供定量SDS耗尽，回收率为31，32，33，但沉淀的主要目标是同时最大化纯度和产量。这取决于在不干扰蛋白质沉淀的情况下有效分离上清液（含有SDS）。使用基于小瓶的沉淀，一旦通过移液去除了大部分上清液，一些聚集的沉淀物就越来越有可能意外丢失。因此，必须留下更重要的残留溶剂（〜20μL）并添加洗涤步骤34。洗涤步骤稀释并除去小瓶中的残留溶剂。特别是对于CMW，一旦沉淀形成，就不需要涡旋样品瓶。通过剧烈搅拌破坏沉淀具有增加意外移液损失可能性的不良影响。如果包括涡旋（如先前方案所建议的那样）35，则CMW沉淀的一部分有可能粘附在小瓶盖的下侧;一旦离心，沉淀仍然固定在小瓶盖上，可导致约50%的损失。
快速沉淀可以通过稀释蛋白质组样品的高回收率进行，理想情况下在0.01-2 mg / mL之间，或相应的蛋白质质量在1-200μg之间。然而，从低于0.01 mg / mL蛋白开始的定量和可重复的回收率可能受益于从10分钟到1小时不等的更长的沉淀时间，这表明沉淀工作流程的通量限制。令人惊讶的是，更浓缩的样品（10 mg / mL）显示出产量的统计降低，可能是由于意外的移液损失。假设>10μg蛋白质，则应在小瓶的侧面观察到可见的沉淀（图1B）。较小的量，低至1μg，很难看到。这挑战了在不破坏蛋白质沉淀的情况下移液上清液的能力。小瓶可以用丙酮倒置（缓慢）以将溶剂从沉淀中分离出来。对于CMW，沉淀不能可靠地充分粘附在小瓶上，因此有利于移液而不是倾析上清液。对于基于小瓶的沉淀，建议使用尽可能小的微量离心管，以促进预期的样品和溶剂体积。这项工作中使用的一次性过滤滤芯中的沉淀提供了500μL的最大体积容量，可以在高达100μL的样品体积上用80%丙酮沉淀蛋白质。
从有机溶剂基沉淀中回收的蛋白质沉淀的纯度受到样品基质，缓冲液组分和沉淀条件的复杂性的限制。例如，特定的缓冲液组分，如甘氨酸（用于SDS PAGE分离）已被证明使用80%丙酮与蛋白质共沉淀。然而，甘氨酸通过CMW沉淀仍然是可溶的。据报道，丙酮会沉淀DNA片段36，37，可能向回收的沉淀中添加不需要的背景杂质。低分子量蛋白质和肽的沉淀需要高水平的有机溶剂和特定的盐类型才能最大限度地提高产量。虽然已经探索了几种盐，但ZnSO4 提供了一致的高产物。在没有蛋白质的情况下，这种盐会在97%丙酮中沉淀。因此，所得蛋白质沉淀含有高浓度的盐。值得注意的是，按体积使用90%的丙酮也将实现高肽产量，尽管预计回收率将显着下降（约5%）。然而，这允许在每个2 mL小瓶中处理更重要的样品体积（高达180μL，20μL1 M ZnSO4）。除了基质杂质与蛋白质沉淀共同沉淀外，必须指出溶剂沉淀固有地导致样品38，39变性。因此，该方案不适用于功能性蛋白质或天然MS工作流程的制备。据报道，丙酮在甘氨酸残基40处引起共价蛋白修饰，并诱导+98u质量偏移，推测是醛缩合丙酮41的副产物。
当使用过滤盒进行蛋白质沉淀时，蛋白质沉淀的分离依赖于PTFE膜过滤器上方聚集体的保留。该膜的孔隙率超过分子量截止过滤器的孔隙率（如FASP所示），允许以更短的旋转时间分离蛋白质。低旋转速度下的快速溶液转移依赖于PTFE膜的适当润湿;有机溶剂很容易流过，尽管干燥的PTFE过滤器会阻碍水溶剂。如果过滤滤芯似乎被堵塞，则应通过直接向过滤器施加少量有机溶剂（例如异丙醇）来重新润湿膜。根据蛋白质沉淀的尺寸和所采用的样品体积，可能需要以更高的速度（高达3，000 x g）进行额外的离心或旋转，以确保所有溶剂都通过过滤盒。
在最佳条件下从沉淀中回收蛋白质最终受到颗粒再溶解挑战的限制，很少有溶剂选择与下游加工和LC-MS兼容。此外，一些沉淀条件，如长时间暴露在低温下和过度干燥紧密包装的颗粒，都会导致重新溶解的挑战40。值得注意的是，CMW蛋白颗粒通常不如丙酮颗粒溶解。42. 以前已报道过80%冷甲酸（步骤6.2.2）使沉淀蛋白的再溶解效率最大化42;低温阻止了蛋白质修饰，否则蛋白质修饰会发生在浓缩的甲酸43，44中。稀释酸浓度也会减慢改性反应。甲酸推荐用于自上而下的MS方法或胃蛋白酶消化之前。使用这种溶剂几乎不需要物理处理;当与涡旋，短暂超声处理或重复移液相结合时，仅添加5μL（足以覆盖蛋白质沉淀）可能就足够了。同样，对于打算通过SDS PAGE分析的样品，当在加热前与样品的适度混合结合使用时，重新溶解在含有SDS的Laemmli缓冲液中是非常有效的。然而，这些溶剂都与胰蛋白酶不相容。建议在胰蛋白酶消化之前用8M尿素重新溶解，确保尿素已经新鲜制备（同一天）。建议在过滤柱内使用最小体积为50μL的缓冲液进行蛋白质再溶解，以最大限度地提高离液溶剂与沉淀之间的接触，并有助于超声处理，重复移液和/或涡旋期间的溶解。替代方法利用胰蛋白酶重新溶解蛋白质，这意味着蛋白质在添加酶之前不需要完全重新溶解。然而，这种方法可能会偏向消化，有利于更可溶的物种，而疏水性蛋白质的消化时间较短45。添加8 M尿素以及Tris或碳酸氢铵等基本缓冲液需要消化后样品的纯化步骤。对于此类样品添加剂，反相色谱柱清理是理想的选择。本研究中使用的一次性过滤滤芯补充了可互换的反相SPE滤芯。该滤芯也非常适合在甲酸再溶解方案的情况下进行溶剂交换。重要的是要注意，任何固相提取方法都与样品回收中的固有损失有关。因此，用户应权衡回收的益处和实验的额外纯化。
预计这些方案将使蛋白质组学研究人员能够简化其基于洗涤剂的工作流程，利用SDS进行蛋白质组提取。促进整个蛋白质组一致恢复的制备策略至关重要。两级旋转盒简化了快速、可靠和可重复的蛋白质组样品分离的机会。这种方法适用于需要严格分析而不牺牲样品通量的应用，例如临床环境或大规模研究计划46.这些方法的未来应用可能包括生物标志物发现，检测，准确定量以及药物和药物靶点发现。
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Disclosures
杜塞特实验室构思了本研究中使用的ProTrap XG并获得了专利。AAD也是蛋白型科学的创始合作伙伴，蛋白子科学将样品制备盒商业化。
Acknowledgments
这项工作由加拿大自然科学和工程研究委员会资助。作者感谢生物信息学解决方案公司（加拿大滑铁卢）和病童医院（加拿大多伦多）的SPARC BioCentre（分子分析）对获取MS数据的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
References
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