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Chemistry

Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

Il presente protocollo descrive la precipitazione proteica a base solvente in condizioni controllate per il recupero e la purificazione robusti e rapidi dei campioni di proteoma prima della spettrometria di massa.

Abstract

Mentre i molteplici progressi negli strumenti di spettrometria di massa (MS) hanno migliorato l'analisi qualitativa e quantitativa del proteoma, approcci front-end più affidabili per isolare, arricchire e processare le proteine prima della SM sono fondamentali per una caratterizzazione del proteoma di successo. Il recupero proteico basso e incoerente e le impurità residue come i tensioattivi sono dannosi per l'analisi della SM. La precipitazione delle proteine è spesso considerata inaffidabile, dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente impegnativa da eseguire rispetto ad altre strategie di preparazione del campione. Queste preoccupazioni vengono superate utilizzando protocolli ottimali di precipitazione delle proteine. Per la precipitazione dell'acetone, la combinazione di sali specifici, controllo della temperatura, composizione del solvente e tempo di precipitazione è fondamentale, mentre l'efficienza della precipitazione del cloroformio / metanolo / acqua dipende dal corretto pipettaggio e manipolazione del flaconcino. In alternativa, questi protocolli di precipitazione sono semplificati e semi-automatizzati all'interno di una cartuccia di spin usa e getta. I risultati attesi della precipitazione proteica a base di solvente nel formato convenzionale e utilizzando una cartuccia di filtrazione ed estrazione monouso a due stadi sono illustrati in questo lavoro. Ciò include la caratterizzazione dettagliata delle miscele proteomiche mediante analisi LC-MS/MS bottom-up. Le prestazioni superiori dei flussi di lavoro basati su SDS sono dimostrate anche rispetto alle proteine non contaminate.

Introduction

L'analisi del proteoma mediante spettrometria di massa è diventata sempre più rigorosa, grazie alla maggiore sensibilità, risoluzione, velocità di scansione e versatilità dei moderni strumenti MS. I progressi della SM contribuiscono a una maggiore efficienza di identificazione delle proteine e a una quantificazione più precisa 1,2,3,4,5. Con una migliore strumentazione per la SM, i ricercatori richiedono una strategia di preparazione del campione front-end corrispondentemente coerente in grado di recuperare quantitativamente proteine ad alta purezza in un tempo minimo in tutte le fasi del flusso di lavoro 6,7,8,9,10,11 . Per riflettere accuratamente lo stato del proteoma di un sistema biologico, le proteine devono essere isolate dalla matrice del campione nativo in modo efficiente e imparziale. A tal fine, l'inclusione di un tensioattivo denaturante, come il sodio dodecil solfato (SDS), garantisce un'efficiente estrazione e solubilizzazione delle proteine12. Tuttavia, la SDS interferisce fortemente con la ionizzazione elettrospray, causando una grave soppressione del segnale MS se non adeguatamente eliminata13.

Varie strategie di deplezione della SDS sono disponibili per la successiva analisi del proteoma, come la ritenzione di proteine al di sopra di un filtro di taglio a peso molecolare contenuto all'interno di cartucce di spin monouso 14,15,16. Il metodo di preparazione del campione assistito da filtro (FASP) è favorito in quanto esaurisce efficacemente la SDS al di sotto di 10 ppm, facilitando la SM ottimale. Tuttavia, il recupero delle proteine con FASP è variabile, il che ha spinto l'esplorazione di altre tecniche. Gli approcci cromatografici che catturano selettivamente le proteine (o tensioattivi) si sono evoluti in varie cartucce convenienti o formati basati su perline 17,18,19,20,21. Date queste strategie semplici e (idealmente) coerenti per la purificazione delle proteine, l'approccio classico della precipitazione delle proteine con solventi organici è spesso trascurato come un approccio promettente all'isolamento proteico. Mentre la precipitazione del solvente ha dimostrato di esaurire con successo la SDS al di sotto dei livelli critici, il recupero delle proteine è stato una preoccupazione di lunga data di questo approccio. Più gruppi hanno osservato un bias di recupero delle proteine, con rese di precipitazione inaccettabilmente basse in funzione della concentrazione proteica, del peso molecolare e dell'idrofobicità22,23. A causa della diversità dei protocolli di precipitazione riportati in letteratura, sono state sviluppate condizioni di precipitazione standardizzate. Nel 2013, Crowell et al. hanno riportato per la prima volta la dipendenza della forza ionica dall'efficienza di precipitazione delle proteine nell'80% di acetone24. Per tutte le proteine esaminate, l'aggiunta di cloruro di sodio fino a 30 mM si è dimostrata essenziale per massimizzare le rese (fino al 100% di recupero). Più recentemente, Nickerson et al. hanno dimostrato che la combinazione di una forza ionica ancora più elevata (fino a 100 mM) con temperatura elevata (20 ° C) durante la precipitazione dell'acetone ha dato un recupero quasi quantitativo in 2-5 min25. È stato osservato un leggero calo nel recupero delle proteine a basso peso molecolare (LMW). Pertanto, un successivo rapporto di Baghalabadi et al. ha dimostrato il successo del recupero di proteine e peptidi LMW (≤5 kDa) combinando sali specifici, in particolare solfato di zinco, con un livello più elevato di solvente organico (acetone al 97%)26.

Mentre il perfezionamento del protocollo di precipitazione conferisce una strategia di purificazione delle proteine più affidabile per la proteomica basata sulla SM, il successo della precipitazione convenzionale dipende fortemente dalla tecnica dell'utente. Un obiettivo primario di questo lavoro è quello di presentare una robusta strategia di precipitazione che faciliti l'isolamento del pellet proteico dal surnatante contaminante. È stata sviluppata una cartuccia di filtrazione monouso per eliminare il pipettaggio isolando proteine aggregate sopra un filtro poroso a membrana in PTFE27. I componenti che interferiscono con LA SM nel surnatante vengono efficacemente rimossi in una breve fase di centrifugazione a bassa velocità. La cartuccia filtrante monouso offre anche una cartuccia SPE intercambiabile, che facilita la successiva pulizia del campione dopo la resolubilizzazione e la digestione proteica opzionale, prima della spettrometria di massa.

Una serie di flussi di lavoro raccomandati per la precipitazione del proteoma sono presentati qui, compresi i protocolli modificati di acetone e cloroformio / metanolo / acqua28 , in un formato convenzionale (basato su fiala) e semi-automatizzato in una cartuccia di filtrazione ed estrazione a due stati usa e getta. Vengono evidenziati i recuperi proteici risultanti e le efficienze di deplezione SDS, insieme alla copertura del proteoma LC-MS/MS bottom-up, per dimostrare il risultato atteso da ciascun protocollo. Vengono discussi i vantaggi pratici e gli svantaggi associati a ciascun approccio.

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Protocol

1. Considerazioni sui materiali e pre-preparazione del campione

  1. Utilizzare solo solventi ad alta purezza (acetone, cloroformio, metanolo) (>99,5%) e sostanze chimiche, privi di umidità in eccesso.
  2. Preparare soluzioni di cloruro di sodio e solfato di zinco (1 M) in acqua.
    NOTA: le soluzioni saline possono essere conservate indefinitamente a temperatura ambiente, purché siano prive di contaminanti o crescita microbica.
  3. Utilizzare il più piccolo flaconcino di microcentrifuga in polipropilene (PP) sufficiente a trattenere il volume richiesto di campione e solventi per indurre la precipitazione.
  4. Assicurarsi che la concentrazione di SDS nel campione da precipitare non sia superiore al 2% (p/v). Se la SDS è più alta, diluire il campione con acqua.
  5. Garantire una concentrazione proteica compresa tra 0,01 e 10 g/L per un'efficienza di precipitazione ottimale.
    NOTA: La massa ottimale per le precipitazioni varia tra 1-100 μg di proteine.
  6. Assicurarsi che tutti i solventi e le soluzioni siano privi di particolato prima dell'uso. Eseguire una fase di filtrazione (<0,5 μm) o centrifugazione (10.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente) per rimuovere il particolato non disciolto.
  7. Se sono necessarie la riduzione del legame disolfuro e l'alchilazione, eseguire questi passaggi prima della precipitazione delle proteine. I reagenti riducenti e alchilanti in eccesso verranno rimossi attraverso il processo di precipitazione.
  8. Precipitare le proteine selezionando ed eseguendo uno dei protocolli (passaggi 2, 3, 4 o 5).

2. Precipitazione rapida delle proteine (a base di flaconcino) con acetone

  1. Pipettare 90 μL di proteina (priva di particolato) o soluzione di proteoma in un tubo microcentrifuga in PP. Quindi, aggiungere 10 μL di 1 M nacl acquoso.
    NOTA: Se la forza ionica dell'estratto di proteoma supera già i 100 mM, non è necessario alcun sale aggiuntivo.
  2. Pipettare 400 μL di acetone nel campione. Tappare il flaconcino e picchiettare delicatamente il flaconcino per unire i solventi. Non è richiesta una miscelazione vigorosa.
    NOTA: Il volume di proteine, sale e acetone può essere aumentato purché venga mantenuto il rapporto relativo di ciascuno.
  3. Lasciare incubare il flaconcino a temperatura ambiente, indisturbato, per un minimo di 2 minuti.
    NOTA: incubazioni più lunghe, comprese quelle a temperatura ridotta (ad esempio, la precipitazione convenzionale dell'acetone impiega precipitazioni notturne nel congelatore), possono comportare la formazione di particelle proteiche aggregate più grandi (visibili) (Figura 1A), che generalmente non migliorano il recupero totale delle proteine.
  4. Dopo l'incubazione, posizionare i campioni in una centrifuga, notando l'orientamento del flaconcino. Ruotare per un minimo di 2 minuti, a 10.000 x g o superiore a temperatura ambiente.
  5. Scomporre il flaconcino e decantare delicatamente il surnatante invertendo lentamente il flaconcino in un contenitore per i rifiuti. Toccare il flaconcino invertito su un tovagliolo di carta per estrarre il solvente residuo dal flaconcino.
    ATTENZIONE: i solventi di scarto devono essere trattenuti e scartati secondo i protocolli appropriati.
  6. Per i campioni contenenti SDS, erogare 400 μL di acetone fresco, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
    NOTA: il passaggio 2.6 è facoltativo.
    1. Centrifugare immediatamente il campione (10.000 x g o superiore per 1 minuto a temperatura ambiente), posizionando il flaconcino nel rotore con lo stesso orientamento dello spin iniziale. Decantare il solvente di lavaggio come descritto al punto 2.5.
  7. Lasciare asciugare completamente il campione con il tappo aperto (~1 min). Ricapitolare il flaconcino e procedere con la solubilizzazione del pellet (fase 6).

3. Precipitazione di peptidi a basso peso molecolare (LMW) (ZnSO4 + acetone)

  1. Erogare 54 μL di estratto di proteoma in un flaconcino di PP da 2 mL, quindi aggiungere 6 μL di 1 M ZnSO4.
    NOTA: Il recupero ottimale dei peptidi LMW (≤5 kDa) si ottiene aggiungendo acetone ad un 97% finale in volume. Assumendo un flaconcino di PP da 2 mL, il volume massimo iniziale del campione è di 54 μL.
  2. Aggiungere 1940 μL di acetone a un 97% finale in volume. Ruotare delicatamente per mescolare e lasciare riposare indisturbato sul piano di lavoro per un minimo di 2 minuti.
  3. Centrifugare (10.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente) e rimuovere il surnatante invertendo il flaconcino, quindi toccando il flaconcino in un tovagliolo di carta.
  4. Per i campioni contenenti SDS, erogare 400 μL di acetone fresco, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
    NOTA: il passaggio 3.4 è facoltativo.
    1. Centrifugare immediatamente il campione come da passo 3.3, posizionando il flaconcino nel rotore nello stesso orientamento dello spin iniziale. Decantare il solvente di lavaggio come descritto al punto 3.3.
  5. Risolubilizzare il pellet secco risultante in un solvente acquoso con breve vortice o sonicazione (~5 min).

4. Precipitazione delle proteine mediante cloroformio/metanolo/acqua (CMW)

  1. Erogare 100 μL della proteina o della soluzione di proteoma in un flaconcino di PP. Aggiungere 400 μL di metanolo, seguiti da 100 μL di cloroformio. Chiudere brevemente il flaconcino e il vortice per mescolare.
    NOTA: per le precipitazioni CMW, sono preferiti flaconcini da 1,5 ml con fondo stretto (Figura 2A).
    ATTENZIONE: il solvente cloroformio deve essere maneggiato in un'adeguata cappa di ventilazione. Tutti i solventi che entrano in contatto con il cloroformio devono essere trattati come rifiuti alogenati quando vengono smaltiti.
  2. Erogare rapidamente 300 μL di acqua direttamente nel centro del flaconcino. Chiudere il flaconcino. Lasciare riposare il campione sul banco indisturbato per 1 minuto.
    NOTA: la soluzione apparirà immediatamente bianca torbida. Evitare di mescolare il flaconcino dopo l'aggiunta di acqua.
  3. Posizionare il flaconcino di PP in una centrifuga e ruotare per un minimo di 5 minuti (10.000 x g o superiore a temperatura ambiente).
    NOTA: Una volta centrifugati, si formeranno due strati di solvente visibili (strato superiore = metanolo/acqua; fondo = cloroformio). Un pellet proteico solido si forma all'interfaccia del solvente (Figura 2A).
  4. Utilizzando una grande punta a micropipetta (1 mL) e tenendo il flaconcino a ~45°, rimuovere ~700 μL del solvente dallo strato superiore ad una velocità uniforme.
  5. Utilizzare una punta di micropipetta più piccola (200 μL) per continuare a rimuovere lo strato superiore di solvente dal flaconcino inclinato di ~45°. Pipettare con un movimento continuo fino a quando lo strato superiore di solvente forma una perlina nel flaconcino.
  6. Aggiungere 400 μL di metanolo fresco al flaconcino campione, senza disturbare il pellet, erogando il solvente lungo il lato del flaconcino.
  7. Chiudere il flaconcino. Combinare gli strati di solvente dondolando delicatamente il flaconcino per far roteare i solventi insieme.
    NOTA: È essenziale evitare di interrompere il pellet. Non vortici il flaconcino.
  8. Notando l'orientamento del flaconcino nel rotore, centrifugare per un minimo di 10 minuti (10.000 x g a temperatura ambiente). Il pellet proteico aderisce al fondo del flaconcino (Figura 2B).
  9. Capovolgere il flaconcino a 45°, con il pellet rivolto verso il basso. Posizionare la punta della pipetta lungo il bordo superiore del flaconcino e rimuovere il surnatante con una punta di micropipetta da 1 mL a una velocità lenta ma continua. Trattenere ~20 μL di solvente nel flaconcino.
  10. Lavare il pellet proteico per i campioni contenenti SDS erogando lentamente 400 μL di metanolo fresco. Non vortici il flaconcino.
    1. Procedere direttamente con la centrifugazione (10.000 x g per 2 min a temperatura), posizionando il flaconcino nel rotore con lo stesso orientamento dello spin iniziale.
  11. Rimuovere il solvente, come da passaggio 4.9. Lasciare asciugare il campione all'aria in un fumi fino a quando il solvente residuo evapora.
  12. Consultare le procedure di risolubilizzazione raccomandate nel passaggio 6.

5. Precipitazione delle proteine utilizzando una cartuccia di filtrazione monouso

NOTA: Ogni protocollo di precipitazione a base solvente descritto nei passaggi da 2 a 5 può essere eseguito in una cartuccia di filtrazione ed estrazione a due stadi (vedere Tabella dei materiali).

  1. Con il tappo collegato alla cartuccia di filtrazione superiore (Figura 3A), erogare il volume desiderato del proteoma, del sale e del solvente estratti come indicato in una delle tre opzioni seguenti.
    1. (Opzione 1) Per la precipitazione proteica con acetone, combinare 90 μL di proteina o soluzione di proteoma, 10 μL di NaCl acquoso 1 M e 400 μL di acetone. Incubare per un minimo di 2 minuti sul piano di lavoro.
      NOTA: si svilupperà un precipitato visibile per campioni proteici concentrati (1 g/L) (Figura 3B).
    2. (Opzione 2) Per la precipitazione peptidica LMW, combinare 15 μL del campione, 1,5 μL di 1 M ZnSO4 e 485 μL di acetone. Incubare per un minimo di 2 minuti sul piano di lavoro.
      NOTA: una concentrazione salina di 90 mM nel campione acquoso non influirà sul recupero rispetto ai 100 mM raccomandati nel passaggio 3.
    3. (Opzione 3) Per la precipitazione cmW, aggiungere 50 μL di estratto di proteoma, 200 μL di metanolo e 50 μL di cloroformio. Chiudere il flaconcino e vorticare brevemente per combinare.
      1. Erogare rapidamente 150 μL di acqua direttamente nel centro del flaconcino. Incubare per 1 minuto sul banco.
  2. Centrifugare per 2 minuti a 2.500 x g a temperatura ambiente con la spina ancora attaccata alla cartuccia di filtrazione.
  3. Invertire la cartuccia, quindi svitare e rimuovere la spina dalla base della cartuccia.
  4. Posizionare la cartuccia filtrante in un flaconcino pulito e tornare alla centrifuga. Girare per 3 minuti a 500 x g a temperatura ambiente. Eliminare il solvente di flusso dal flaconcino inferiore.
    NOTA: se nella cartuccia di filtrazione superiore rimane del solvente, tornare alla centrifuga ed eseguire una rotazione aggiuntiva.
  5. Lavare il pellet proteico aggiungendo 400 μL di acetone alla cartuccia di filtrazione (per la precipitazione CMW, passaggio 5.1.3, aggiungere 400 μL di metanolo).
  6. Centrifugare per 3 minuti a 500 x g a temperatura ambiente o fino a quando non rimane alcun solvente nella cartuccia superiore.
  7. Risimolare il pellet di precipitazione come descritto nella fase 6.

6. Resolubilizzazione del pellet proteico

  1. Bagnare la membrana alla base della cartuccia di filtrazione erogando 2-5 μL di isopropanolo direttamente alla membrana immediatamente prima dei protocolli di risolubilizzazione descritti di seguito.
  2. Seguire uno dei seguenti metodi di resolubilizzazione.
    1. (Opzione 1) Aggiungere un minimo di 20 μL di tampone acquoso contenente ≥2% SDS alla cartuccia di filtrazione. Cappuccio e vortice vigorosamente (~ 1 min). In alternativa, sonicare (>10 min) per disperdere il pellet proteico.
      1. Riscaldare il campione a 95 °C per 5 min). Ripetere la fase di miscelazione dopo il riscaldamento.
        NOTA: Il tampone di carico del gel Laemmli può risisolare il pellet proteico. Tuttavia, i campioni contenenti SDS sono incompatibili con la digestione della tripsina e la LC e la SM in fase inversa.
    2. (Opzione 2) Preparare una soluzione di acido formico all'80% (v/v) in acqua. Prechill la soluzione acida (-20 °C), così come la cartuccia di filtrazione contenente proteine precipitate.
      1. Erogare 50 μL di acido formico freddo nella cartuccia; cappuccio e vortice per 30 s. Ritorno al congelatore (-20 °C) per 10 min.
      2. Vortice la cartuccia di nuovo per 30 s. Quindi, ripetere il ciclo di raffreddamento e miscelazione ancora una volta (10 min, -20 °C, vortice di 30 s).
      3. Aggiungere acqua a un finale di 500 μL, diluendo l'acido formico all'8%.
        NOTA: Il protocollo dell'acido formico freddo è incompatibile con la successiva digestione della tripsina, ma è compatibile con LC-MS.
    3. (Opzione 3) Aggiungere 50 μL di urea 8 M appena preparata in acqua alla cartuccia di filtrazione. Sonicate per 30 min.
      1. Lasciare incubare la cartuccia sul banco per 1 ora (fino a una notte).
      2. Diluire l'urea 8 M almeno 5 volte con acqua o tampone appropriato.
        NOTA: Una volta diluito, il protocollo di solubilizzazione dell'urea è compatibile con la successiva digestione della tripsina, così come con LC-MS.

7. Digestione delle proteine

  1. Per l'analisi bottom-up della SM, sottoporre le proteine risolubilizzate alla digestione enzimatica utilizzando uno dei due metodi menzionati di seguito.
    1. (Opzione 1) Per la risolubilizzazione dell'acido formico, ridurre il volume iniziale dell'acido formico all'80% nei passaggi da 6.2.2.1 a 25 μL. Nel passaggio 6.2.2.3, utilizzare 375 μL di acqua per diluire l'acido formico al 5% (v/v).
    2. Erogare pepsina nella cartuccia con un rapporto approssimativo proteina/enzima di 50:1. Con un tappo collegato alla cartuccia di filtrazione, incubare il campione durante la notte a temperatura ambiente.
  2. (Opzione 2) Per la risolubilizzazione nell'urea, garantire un pH compreso tra 8 e 8,3 con l'inclusione di 100 mM di Tris o bicarbonato di ammonio nel passaggio 6.2.3.2.
    1. Aggiungere tripsina ad un rapporto approssimativo tra proteine e massa enzimatica di 50:1. Con un tappo collegato alla cartuccia, incubare il campione durante la notte in un bagno d'acqua calda a 37 °C.
    2. Terminare la digestione acidificando la soluzione con il 10% di TFA fino all'1% finale.
  3. Recuperare la proteina digerita di pepsina o tripsina rimuovendo il tappo dalla base del filtro e centrifugando la cartuccia contenuta in un flaconcino pulito (2 min, 5000 x g, temperatura ambiente).

8. Pulizia SPE

NOTA: per la dissalazione aggiuntiva del campione dopo la digestione o lo scambio di solventi, il campione può essere soggetto a pulizia in fase inversa come descritto.

  1. Innescare una cartuccia SPE (vedi Tabella dei materiali) passando 300 μL di metanolo (2 min, 400 x g) seguiti da 300 μL di acetonitrile al 5% / 0,1% di TFA (2 min, 400 x g).
  2. Collegare la cartuccia SPE innescata alla base della cartuccia di filtrazione contenente proteine solubilizzate o digerite.
  3. Far girare la proteina attraverso la cartuccia SPE (5 min, 800 x g a temperatura ambiente). Se il solvente rimane nella cartuccia superiore, riportare la cartuccia alla centrifuga e ripetere lo spin.
    NOTA: il passaggio del campione attraverso la cartuccia SPE una seconda volta può migliorare il recupero.
  4. Aggiungere 300 μL di acetonitrile al 5% / 0,1% di TFA in acqua alla cartuccia. Per il lavaggio, scorrere attraverso la cartuccia SPE (2 min, 2000 x g). Scartare il flusso attraverso.
  5. Per le proteine LMW o i peptidi digeriti, eluire il campione facendo scorrere 300 μL di acetonitrile al 50%/0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
  6. Per le proteine intatte, seguire il passaggio 8.5 con un'ulteriore fase di eluizione utilizzando 300 μL di acetonitrile al 75% / TFA allo 0,1%. Combinare i due estratti risultanti.
    NOTA: il passaggio 8.6 è facoltativo.

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Representative Results

La Figura 4 riassume l'esaurimento SDS previsto a seguito della precipitazione di proteine basate su flaconcino o facilitata dalla cartuccia in una cartuccia filtrante monouso che utilizza acetone. L'incubazione notturna convenzionale (-20 °C) nell'acetone viene confrontata con il protocollo di precipitazione rapida dell'acetone a temperatura ambiente (fase 2), così come la precipitazione CMW (fase 4). La SDS residua è stata quantificata dal saggio dei principi attivi blu di metilene (MBAS)29. In breve, un campione di 100 μL è stato combinato con 100 μL di reagente MBAS (250 mg di blu di metilene, 50 g di solfato di sodio, 10 ml di acido solforico, diluito in acqua a 1,0 L), seguito dall'aggiunta di 400 μL di cloroformio e dalla misurazione dell'assorbanza dello strato organico a 651 nm su uno spettrofotometro UV/Vis. Tutti gli approcci riducono la SDS per consentire un'analisi ottimale della SM.

Il recupero quantitativo e riproducibile delle proteine si ottiene dopo una rapida precipitazione dell'acetone e della precipitazione CMW, come si vede nella Figura 5 attraverso l'analisi SDS PAGE di un lisato cellulare totale di lievito trasformato. La precipitazione in una cartuccia di filtrazione monouso elimina la necessità di pipettare con cura il surnatante contenente SDS mantenendo le proteine aggregate sopra un filtro a membrana. Il recupero costante si ottiene con tutti i protocolli di precipitazione, senza bande visibili rilevate nelle frazioni surnatante attraverso tre repliche indipendenti.

La figura 6 quantifica i rendimenti attesi, compresa la risolubilizzazione dei pellet proteici precipitati utilizzando acido formico freddo (fase 6). La precipitazione CMW consente un recupero quantitativo preservando attentamente il pellet in un approccio basato su fiala (fase 5), che equivale a quello ottenuto utilizzando la cartuccia (100 ± 4% contro 101 ± 3%, rispettivamente). Il recupero dei pellet proteici precipitati con acetone beneficia di una cartuccia di filtrazione, con un miglioramento del 15-20 % della resa osservato. Nelle fiale, l'isolamento del surnatante di acetone dalla proteina aggregata si basa essenzialmente sull'aderenza del pellet alla superficie del tubo in PP; la cartuccia di filtrazione elimina questa preoccupazione in quanto il filtro garantisce un elevato recupero delle proteine precipitate senza pipettaggio.

Per recuperare in modo efficiente proteine e peptidi LMW, il protocollo di precipitazione dell'acetone viene modificato sostituendo NaCl con ZnSO4 e aumentando la percentuale di solvente al 97%. La combinazione di questo sale specifico e livelli più elevati di solvente organico sono necessari per l'elevato recupero delle proteine LMW e dei peptidi26. Come si vede nella Figura 7, la precipitazione proteica basata su cartuccia dimostra un recupero superiore di un campione di plasma bovino digerito con pepsina rispetto alla precipitazione a base di fiala. La cartuccia di spin monouso può recuperare oltre il 90% dei peptidi LMW. Differenze più significative nella resa si notano nella cartuccia quando si utilizza NaCl, confermando l'importanza del tipo di sale per massimizzare la resa. L'inclusione di ZnSO4 rispetto a NaCl si traduce in un pellet proteico aggregato che è più facilmente intrappolato dal filtro a cartuccia di spin.

Per valutare l'efficacia delle proteine precipitatrici su un ampio intervallo dinamico, è stata elaborata una miscela di tre proteine standard: β-galattosidasi (β-gal) da E. coli, citocromo c (Cyt c) da bovino ed enolasi (Eno) da S. cerevisiae. Il rapporto di massa di β-gal:Cyt c:Eno era 10.000:10:1. I campioni inizialmente contenevano il 2% di SDS prima della precipitazione basata su cartuccia (fase 5) e sono stati solubilizzati e digeriti con tripsina (fasi 6 e 7). I campioni preparati in flaconcini fungevano da controllo, non avendo SDS e omettendo la precipitazione. Tutti i campioni sono stati sottoposti a pulizia SPE equivalente (fase 8). È stata condotta la SM bottom-up, con spettri MS/MS ricercati in un database combinato contenente tutte le proteine delle tre specie coinvolte (vedi Tabella dei materiali per piattaforme strumentali e software). È stato impiegato un tasso di falsa scoperta peptidica dell'1%. Tutte e tre le proteine sono state identificate dalla SM, con 666, 28 e 35 peptidi unici per β-gal, Cyt c ed Eno, rispettivamente. La Figura 8 quantifica il rapporto relativo (intensità di picco peptidico) da ciascun campione, con un rapporto superiore a 1 che riflette una maggiore abbondanza di peptidi per i campioni elaborati nelle cartucce filtranti monouso. I risultati dimostrano i vantaggi dell'incorporazione della SDS in un flusso di lavoro proteomico, riducendo al minimo la perdita di proteine (ad esempio, dal potenziale adsorbimento alla fiala campione) e massimizzando la resa peptidica.

Il fegato bovino è stato procurato in un negozio di alimentari locale. Le proteine sono state isolate estraendo il tessuto con una soluzione di SDS all'1%. Successivamente, il proteoma recuperato è stato precipitato, solubilizzato (urea) e digerito con tripsina, il tutto all'interno di una cartuccia monouso. È stato condotto LC-MS/MS bottom-up, con conseguente identificazione di una media di ~ 8.000 proteine (~ 30.000 peptidi). Sono stati impiegati tassi di falsa scoperta dello 0,5% e dell'1,0% per spettri peptidici e gruppi proteici, cercando nel database bovino. La riproducibilità tecnica di questo flusso di lavoro basato su cartucce viene valutata attraverso identificazioni proteiche sovrapposte. Le iniezioni replicate di MS di un campione digerito comune raggiungono in media 78 ± sovrapposizione dello 0,5% con le proteine identificate. In confronto, i campioni preparati in modo indipendente in cartucce discrete hanno raggiunto il 76 ± sovrapposizione dello 0,5%. Questi dati suggeriscono che il contributo della preparazione del campione verso la variabilità totale dell'analisi è minore, rispetto a quello già contribuito dall'approccio strumentale LC-MS. Le proteine bovine identificate da tre repliche tecniche (lavorate indipendentemente in tre cartucce monouso) sono state ulteriormente caratterizzate per quanto riguarda il loro peso molecolare, l'idrofobicità e il punto isoelettrico, mostrate nella Figura 9. Un ANOVA bidirezionale non è stato in grado di determinare differenze statistiche nei proteomi identificati tra le repliche tecniche. Infine, la Figura 10 confronta il numero di peptidi identificati per proteina tra i tre preparati campione replicati. I coefficienti di correlazione in questi grafici (0,94-0,95) dimostrano l'elevata coerenza dell'approccio di preparazione del campione per l'analisi bottom-up della SM.

Figure 1
Figura 1: Proteine precipitate con acetone. Campioni contenenti 100 e 1.000 μg di proteine combinati con 100 mM NaCl e precipitati con acetone (A) all'80% dopo 5 minuti di precipitazione e (B) dopo precipitazione e successiva centrifugazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Precipitazione delle proteine mediante cloroformio/metanolo/acqua. Un campione contenente 50 μg di proteine precipitate secondo la fase 4. (A) Immediatamente dopo il passaggio 4.4. (B) Immediatamente dopo il passaggio 4.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Foto di una cartuccia monouso a due stadi di filtrazione ed estrazione per la precipitazione delle proteine. Un campione contenente 100 μg di proteine è stato combinato con 100 mM di NaCl e l'80% di acetone in (A) la filtrazione assemblata e la cartuccia SPE e (B) precipitato per 5 minuti fino a quando gli aggregati proteici sono diventati visibili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Efficienza di esaurimento della SDS a seguito della precipitazione delle proteine. La percentuale di SDS rimossa è indicata dalla precipitazione dell'acetone con il protocollo convenzionale (durante la notte a -20 °C), il protocollo rapido (incubazione di 2 minuti a temperatura ambiente) o mediante precipitazione di cloroformio/metanolo/acqua (CMW) di un lisato di S. cerevisiae , sia in formato convenzionale (fiala) che a cartuccia. Questi campioni inizialmente contenevano lo 0,5% di SDS (5.000 ppm), deducendo >99,8% di rimozione SDS è necessaria per un'analisi ottimale della SM. La SDS residua è quantificata dal saggio dei principi attivi blu di metilene (MBAS). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalle repliche tecniche (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Recupero totale del proteoma attraverso le precipitazioni. SDS PAGE mostra il recupero del lisato proteico totale di S. cerevisiae , precipitato da (A) precipitazione convenzionale dell'acetone, (B) precipitazione del cloroformio / metanolo / acqua e (C) precipitazione rapida dell'acetone. Le bande proteiche sono osservate esclusivamente nella frazione del pellet, senza bande visibili nel surnatante (Super.). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Recupero proteico superiore all'interno di una cartuccia di filtrazione. Per la precipitazione del lisato proteico totale di S. cerevisiae , la cartuccia di spin monouso facilita il recupero quantitativo con acetone e precipitazione CMW. Un elevato recupero è possibile anche con la precipitazione basata su fiale, sebbene siano necessarie un'attenta manipolazione del campione e il pipettaggio. Il recupero proteico valutato LC-UV dopo la resolubilizzazione del pellet con acido formico freddo è mostrato qui. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalle repliche tecniche (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Elevate rese di precipitazione per peptidi a basso peso molecolare. Un protocollo di precipitazione dell'acetone modificato per peptidi e proteine ≤5 kDa prevede l'accoppiamento di 100 mM di ZnSO4 con il 97% di acetone per ottenere le rese più elevate. La precipitazione facilitata da una cartuccia di filtrazione monouso dimostra un recupero migliore rispetto alla precipitazione convenzionale basata su fiala in tutte e tre le condizioni di precipitazione. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalle repliche tecniche (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Maggiore recupero di proteine standard nel flusso di lavoro basato su SDS. Tukey Box-and-Whisker traccia30 dell'intensità relativa del segnale MS per peptidi recuperati da proteine contenenti SDS elaborate in una cartuccia di filtrazione monouso rispetto a un campione di controllo (nessuna SDS, nessuna precipitazione). Le proteine impiegate coprono un ampio intervallo dinamico di concentrazione β-galattosidasi:citocromo c:enolasi = 10.000:10:1. Ogni quartile all'interno delle caselle contiene il 25% della distribuzione, mentre le barre di errore comprendono il 95% della distribuzione. La media è indicata da "+" e la mediana da una linea orizzontale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Distribuzioni proteiche identificate da repliche tecniche. I grafici Tukey Box-and-Whisker caratterizzano (A) il peso molecolare, (B) l'idrofobicità e (C) il punto isoelettrico delle proteine identificate da LC-MS/MS bottom-up a seguito di preparazioni triplicate di un lisato epatico bovino in una cartuccia di filtrazione ed estrazione a due stadi. Non vi è stata alcuna differenza statistica in queste caratteristiche da ANOVA bidirezionale (p < 0,05). Ogni quartile all'interno delle caselle contiene il 25% della distribuzione, mentre le barre di errore comprendono il 95% della distribuzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Correlazione degli ID peptidici per proteina attraverso il flusso di lavoro di preparazione basato su SDS attraverso le repliche preparative. Analisi della riproducibilità del proteoma bottom-up tra (A) campioni 1 e 2, (B) campioni 2 e 3 e (C) campioni 1 e 3 in base al numero di identificazioni peptidiche MS per proteina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La caratterizzazione ottimale della SM si ottiene quando la SDS residua è esaurita al di sotto di 10 ppm. Mentre approcci alternativi, come FASP e digestione su perline, offrono un esaurimento quantitativo della SDS con recupero variabile 31,32,33, l'obiettivo primario delle precipitazioni è massimizzare la purezza e la resa contemporaneamente. Ciò dipende dall'isolamento efficace del surnatante (contenente la SDS) senza disturbare il pellet proteico. Con la precipitazione basata sulla fiala, una volta che la maggior parte del surnatante viene rimossa mediante pipettaggio, è sempre più probabile che alcuni dei pellet aggregati vengano accidentalmente persi. Per questo motivo, è essenziale lasciare una frazione più significativa del solvente residuo (~ 20 μL) e aggiungere una fase di lavaggio34. La fase di lavaggio diluisce e rimuove il solvente residuo dal flaconcino. In particolare con CMW, non è necessario vorticare la fiala del campione una volta che il pellet si è formato. Interrompere il pellet attraverso un'agitazione vigorosa ha l'effetto indesiderato di aumentare la probabilità di perdita da pipettaggio accidentale. Se il vortice è incluso (come raccomandato dai protocolli precedenti)35, esiste la possibilità che porzioni del pellet CMW aderiscano alla parte inferiore del tappo del flaconcino; una volta centrifugato, il pellet rimane fisso sul tappo del flaconcino e può causare una perdita di circa il 50%.

La precipitazione rapida può essere eseguita con un elevato recupero di campioni di proteoma diluito, idealmente tra 0,01-2 mg / mL, o una massa proteica corrispondente tra 1-200 μg. Tuttavia, i recuperi quantitativi e riproducibili a partire da meno di 0,01 mg / mL di proteina possono beneficiare di tempi di precipitazione più lunghi che vanno da 10 minuti a 1 ora, dimostrando i limiti di produttività del flusso di lavoro di precipitazione. Sorprendentemente, campioni più concentrati (10 mg/ml) mostrano una riduzione statistica della resa, presumibilmente da perdite accidentali di pipettaggio. Assumendo >10 μg di proteina, si deve osservare un pellet visibile sul lato del flaconcino (Figura 1B). Quantità minori, fino a 1 μg, sono difficili da vedere. Ciò mette a dura prova la capacità di pipettare il surnatante senza interrompere il pellet proteico. Il flaconcino può essere invertito (lentamente) con acetone per separare il solvente dal pellet. Per CMW, il pellet non aderisce sufficientemente al flaconcino, favorendo così il pipettaggio rispetto alla decantazione del surnatante. Per la precipitazione basata su flaconcino, si consiglia di lavorare con il tubo di microcentrifuga più piccolo possibile per facilitare i volumi di campione e solvente previsti. La precipitazione nella cartuccia di filtrazione monouso impiegata in questo lavoro fornisce una capacità massima di volume di 500 μL, consentendo la precipitazione delle proteine con l'80% di acetone su volumi di campione fino a 100 μL. I volumi di campione, sale e solvente possono essere regolati di conseguenza se vengono mantenute le concentrazioni raccomandate.

La purezza del pellet proteico recuperato dalla precipitazione organica a base di solvente è limitata dalla complessità della matrice del campione, dei componenti tampone e delle condizioni di precipitazione. Ad esempio, specifici componenti tampone come la glicina (utilizzata per le separazioni SDS PAGE) hanno dimostrato di co-precipitare con proteine utilizzando l'80% di acetone. Tuttavia, la glicina rimane solubile attraverso la precipitazione CMW. È stato segnalato che l'acetone precipita frammenti di DNA36,37, aggiungendo potenzialmente impurità di fondo indesiderate al pellet recuperato. La precipitazione di proteine e peptidi a basso peso molecolare richiede un livello elevato di solvente organico e un tipo di sale specifico per massimizzare la resa. Mentre sono stati esplorati diversi sali, ZnSO4 fornisce prodotti costantemente elevati. Questo sale precipiterà nel 97% di acetone in assenza di proteine. Pertanto, il pellet proteico risultante contiene un'alta concentrazione di sale. Si noti che l'impiego del 90% di acetone in volume raggiungerà anche elevate rese peptidiche, anche se si prevede un calo statisticamente significativo (~ 5%) nel recupero. Tuttavia, ciò consente di elaborare un volume di campione più significativo (fino a 180 μL, con 20 μL di 1 M ZnSO4) in ogni flaconcino da 2 mL. Al di là delle impurità della matrice che co-precipitano con il pellet proteico, va precisato che la precipitazione del solvente provoca intrinsecamente la denaturazione del campione38,39. Pertanto, questo protocollo non è applicabile per i preparati di proteine funzionali o flussi di lavoro nativi di SM. L'acetone è stato anche segnalato per causare modificazioni proteiche covalenti ai residui di glicina40 e indurre uno spostamento di massa di +98 u, ipotizzato per essere un sottoprodotto dell'acetone 41 di condensazionealdolica.

Quando si utilizza una cartuccia di filtrazione per la precipitazione delle proteine, l'isolamento del pellet proteico si basa sulla ritenzione di aggregati sopra un filtro a membrana in PTFE. La porosità di questa membrana supera quella di un filtro di taglio a peso molecolare (come si vede in FASP), consentendo l'isolamento proteico con tempi di spin ridotti. Il rapido trasferimento della soluzione a basse velocità di centrifuga si basa su una corretta bagnatura della membrana in PTFE; i solventi organici fluiscono facilmente attraverso, anche se un filtro PTFE secco impedisce i solventi acquosi. Se la cartuccia di filtrazione sembra essere intasata, la membrana deve essere nuovamente bagnata applicando direttamente un piccolo volume di solvente organico (ad esempio, isopropanolo) al filtro. A seconda delle dimensioni del pellet proteico e del volume di campione impiegato, può essere necessaria una centrifugazione aggiuntiva o spin a velocità più elevate (fino a 3.000 x g) per garantire che tutto il solvente sia passato attraverso la cartuccia di filtrazione.

Il recupero delle proteine dalla precipitazione con condizioni ottimali è in definitiva limitato dalla sfida della risisolizzazione del pellet, con poche opzioni di solvente compatibili con la lavorazione a valle e LC-MS. Inoltre, diverse condizioni di precipitazione come lunghe esposizioni a basse temperature e l'eccessiva essiccazione di un pellet ben confezionato contribuiscono alle sfide di ri-solubilizzazione40. Si noti che i pellet proteici CMW sono generalmente meno solubili dei pellet di acetone. L'efficienza di risisolamento massimizzata della proteina precipitata dall'acido formico freddo all'80% (fase 6.2.2) è stata precedentemente riportata42; la temperatura fredda impedisce la modificazione delle proteine, che altrimenti si verifica nell'acido formico concentrato43,44. La diluizione della concentrazione acida rallenta anche la reazione di modifica. L'acido formico è raccomandato per approcci top-down MS o prima della digestione enzimatica con pepsina. L'impiego di questo solvente richiede poco trattamento fisico; l'aggiunta di soli 5 μL (sufficiente a coprire il pellet proteico) può essere sufficiente se combinata con vortice, breve sonicazione o pipettaggio ripetuto. Allo stesso modo, per i campioni destinati ad essere analizzati da SDS PAGE, la ri-dissoluzione nel tampone Laemmli contenente SDS è altamente efficace, se combinata con una modesta miscelazione del campione prima del riscaldamento. Tuttavia, questi solventi sono entrambi incompatibili con la tripsina. La risolubilizzazione con urea 8 M è raccomandata prima della digestione della tripsina, assicurando che l'urea sia stata preparata al momento (lo stesso giorno). Un volume minimo di tampone da 50 μL è raccomandato per la risolubilizzazione delle proteine all'interno della cartuccia di filtrazione per massimizzare il contatto tra il solvente chaotropico e il pellet, nonché per facilitare la dissoluzione durante la sonicazione, il pipettaggio ripetuto e/o il vortice. Approcci alternativi sfruttano la tripsina per ri-solubilizzare la proteina, il che significa che la proteina non deve essere completamente ri-disciolta prima dell'aggiunta di enzimi. Tuttavia, questo approccio può influenzare la digestione, favorendo le specie più solubili mentre le proteine idrofobiche sperimentano tempi di digestione più brevi45. L'aggiunta di 8 M di urea, insieme a tamponi di base come Tris o bicarbonato di ammonio, richiede una fase di pulizia del campione post-digestione. Per tali additivi campione, la pulizia della colonna in fase inversa è l'ideale. La cartuccia di filtrazione monouso utilizzata in questo studio è integrata con una cartuccia SPE a fase inversa intercambiabile. Questa cartuccia è ideale anche per lo scambio di solventi, nel caso del protocollo di risolubilizzazione dell'acido formico. È importante notare che qualsiasi approccio di estrazione in fase solida è associato a una perdita intrinseca nel recupero del campione. Pertanto, l'utente dovrebbe valutare i benefici del recupero e la purificazione aggiuntiva per il loro esperimento.

Si prevede che questi protocolli consentiranno ai ricercatori di proteomica di semplificare i loro flussi di lavoro basati su detergenti, sfruttando la SDS per l'estrazione del proteoma. Le strategie preparative che facilitano il recupero coerente del proteoma completo sono fondamentali. Una cartuccia di rotazione a due stadi semplifica l'opportunità di un isolamento rapido, robusto e riproducibile del campione di proteoma. Tale approccio sarebbe suscettibile di applicazioni che richiedono un'analisi rigorosa senza sacrificare i rendimenti dei campioni, come le impostazioni cliniche o le iniziative di ricerca su larga scala46. Le applicazioni future di questi approcci possono includere la scoperta di biomarcatori, il rilevamento, la quantificazione accurata e la scoperta di farmaci e bersagli farmacologici.

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Disclosures

Il laboratorio Doucette ha ideato e brevettato il ProTrap XG impiegato in questo studio. AAD è anche socio fondatore di Proteoform Scientific, che ha commercializzato la cartuccia per la preparazione dei campioni.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Gli autori ringraziano Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) e SPARC BioCentre (Molecular Analysis) presso l'Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) per il loro contributo all'acquisizione dei dati sulla SM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

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Chimica Numero 180 Spettrometria di massa proteomica preparazione del campione sodio dodecil solfato precipitazione digestione delle proteine acetone cloroformio/metanolo/acqua
Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa
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Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

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