Summary
I detta manuskript demonstrerar vi beredningen av ett biohybridhydrogelbiobläck innehållande grafen för användning inom perifer vävnadsteknik. Med hjälp av detta 3D-biohybridmaterial utförs stamcellernas neurala differentieringsprotokoll. Detta kan vara ett viktigt steg för att få liknande biomaterial till kliniken.
Abstract
Perifer neuropatier kan uppstå som ett resultat av axonal skada, och ibland på grund av demyeliniserande sjukdomar. Perifer nervskada är ett globalt problem som uppstår hos 1,5% -5% av akutpatienterna och kan leda till betydande förluster av arbetstillfällen. Idag har vävnadsteknikbaserade tillvägagångssätt, bestående av byggnadsställningar, lämpliga cellinjer och biosignaler, blivit mer tillämpliga med utvecklingen av tredimensionell (3D) bioprintningsteknik. Kombinationen av olika hydrogelbiomaterial med stamceller, exosomer eller biosignalmolekyler studeras ofta för att övervinna de befintliga problemen vid perifer nervregenerering. Följaktligen har produktionen av injicerbara system, såsom hydrogeler eller implanterbara ledningsstrukturer bildade av olika bioprintingmetoder fått betydelse i perifer neuroteknik. Under normala förhållanden är stamceller kroppens regenerativa celler, och deras antal och funktioner minskar inte med tiden för att skydda sina populationer. Dessa är inte specialiserade celler men kan differentieras vid lämplig stimulering som svar på skada. Stamcellssystemet påverkas av sin mikromiljö, kallad stamcellsnischen. Vid perifera nervskador, särskilt vid neurotmesis, kan denna mikromiljö inte räddas helt även efter att kirurgiskt ha bundit ihop avskurna nervändar. De sammansatta biomaterialen och kombinerade cellulära terapier ökar funktionaliteten och tillämpligheten av material när det gäller olika egenskaper såsom biologisk nedbrytbarhet, biokompatibilitet och bearbetbarhet. Följaktligen syftar denna studie till att demonstrera beredning och användning av grafenbaserad biohybridhydrogelmönstring och att undersöka differentieringseffektiviteten hos stamceller i nervceller, vilket kan vara en effektiv lösning vid nervregenerering.
Introduction
Nervsystemet, som är den mekanism som överbryggar organismens och miljöns inre struktur, är uppdelad i två delar: centrala och perifera nervsystemet. Perifer nervskada är ett globalt problem som utgör 1,5% -5% av patienterna som kommer till akutavdelningen och utvecklas på grund av olika traumor, vilket leder till betydande arbetsförlust 1,2,3.
Idag är cellulära tillvägagångssätt för perifer neuroteknik av stort intresse. Stamceller kommer först bland de celler som används i dessa metoder. Under normala förhållanden är stamceller kroppens regenerativa celler, och deras antal och funktioner minskar inte med tiden för att skydda sina populationer. Dessa celler är specialiserade men kan differentieras vid lämplig stimulering som svar på skada 4,5. Enligt stamcellshypotesen påverkas stamcellssystemet av sin mikromiljö, kallad stamcellsnischen. Bevarande och differentiering av stamceller är omöjligt utan närvaro av deras mikromiljö6, som kan rekonstitueras via vävnadsteknik med hjälp av celler och byggnadsställningar7. Vävnadsteknik är ett tvärvetenskapligt område som omfattar både tekniska och biologiska principer. Vävnadsteknik tillhandahåller verktyg för att skapa konstgjorda vävnader som kan ersätta levande vävnader och kan användas vid regenerering av dessa vävnader genom att avlägsna skadade vävnader och tillhandahålla funktionella vävnader8. Vävnadsställningar, en av vävnadsteknikens tre hörnstenar, tillverkas med olika metoder från naturliga och syntetiska material9. Tredimensionell (3D) utskrift är en framväxande additiv tillverkningsteknik som ofta används för att ersätta eller återställa defekta vävnader via sin enkla men mångsidiga produktion av komplexa former med olika metoder. Bioprinting är en additiv tillverkningsmetod som möjliggör samexistens av celler och biomaterial, så kallade biobläck10. Med tanke på nervcellernas interaktion med varandra har studier skiftat till ledande biomaterialkandidater som grafen. Grafennanoplattor, som har egenskaper som flexibel elektronik, superkondensatorer, batterier, optik, elektrokemiska sensorer och energilagring, är ett föredraget biomaterial inom vävnadsteknik11. Grafen har använts i studier där spridning och regenerering av skadade vävnader och organ utfördes12,13.
Vävnadsteknik består av tre grundläggande byggstenar: byggnadsställningar, celler och biosignalmolekyler. Det finns brister i studierna om perifera nervskador när det gäller att tillhandahålla dessa tre strukturer helt. Olika problem har uppstått i de biomaterial som produceras och används i studierna, såsom att de endast innehåller stamceller eller biosignalmolekyler, bristen på en bioaktiv molekyl som möjliggör stamcellsdifferentiering, bristen på biokompatibilitet hos det biomaterial som används och den låga effekten på spridningen av celler i vävnadsnischen, och därmed nervledning inte realiseras fullt ut 2,13,14,15,16. Detta kräver optimering av nervregenerering, minskning av muskelatrofi 17,18 och skapande av nödvändig homing19 med tillväxtfaktorer mot sådana problem. Vid denna tidpunkt är karakterisering och analys av neuroaktiviteten hos en kirurgisk biomaterialprototyp, som ska överföras till kliniken, mycket viktig.
Följaktligen undersöker denna metodstudie biobläckhydrogelmönstringen med grafennanoplattor bildade av en 3D-bioprinter och dess effektivitet på den neurogena differentieringen av stamcellerna den innehåller. Dessutom undersöks effekterna av grafen på neurosfärbildning och differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Odling av Whartons gelémesenkymala stamceller
- Ta Whartons gelémesenkymala stamceller (WJ-MSC, från ATCC) ur en frys på -80 °C. Kultur WJ-MSC i DMEM-F12-medium innehållande 10% fosterkalvserum (FBS), 1% Pen-Strep, och 1% L-glutamin i ett sterilt laminärt flöde vid rumstemperatur, som beskrivs i Yurie et al.20.
- Kryokonservera några av cellerna vid 1 x 106 celler / ml med frysmedel innehållande 35% FBS, 55% DMEMF-12 och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). För detta, räkna 1 x 106 celler på en Thoma-cellräkningsglas och tillsätt fryslösningen droppvis. Överför snabbt bilden till en behållare med flytande kväve.
- När odlade celler är 80% sammanflytande i kolven, häll ut mediet och tvätta med 5 ml PBS. Tillsätt 5 ml 0,25% trypsin och 2,21 mM EDTA-4Na. Inkubera i en inkubator vid 37 °C i 5 minuter.
- Tillsätt 10 ml DMEM-F12-medium med 10% FBS till cellerna som tagits bort från inkubatorn. Stäng av det väl, samla mediet och överför mediet till ett centrifugrör.
- Centrifugera med en rotationshastighet av 101 x g i 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och frö om cellerna i nya kolvar med färskt näringsmedium som innehåller 10% FBS.
OBS: Kommersiella WJ-MSC märkta med GFP-genen genom transduktionsmetoden kan användas för att bättre visualisera biomaterial-cellinteraktionerna som ska produceras21. De grupper som ska användas i den här metoden kan skapas på det sätt som visas i tabell 1.
| Skapade grupper | Anledningar att skapa | Antal reps | ||
| 2D WJ-MSC (2D-C) | 2D-kontroll | x 5 | ||
| 2D WJ-MSC & grafen (2D-G) | Bestämning av grafentoxisk dos i 2D | x 5 reps till var och en av olika koncentrationer | ||
| WJ-MSC ingår i biobläck (3D-B) | 3D-kontroll | x 3 | ||
| WJ-MSC & 0,1% grafen ingår i biobläck (3D-G) | 3D-grafen-biobläck biohybrid grupp | x 3 | ||
| WJ-MSC är i sfäroid form på biobläck (3D-BS) | 3D-kontroll av sfäroidform | x 3 | ||
| WJ-MSC & 0,1% grafen arein sfäroid form på biobläck (3D-GS grupp) | 3D-grafen-biobläck biohybridgrupp av sfäroidform | x3 | ||
| 3D Bioink droppe | Den produceras för SEM- och FTIR-karakteriseringsanalys. | x5 | ||
| 3D-grafen droppe | Den produceras för SEM- och FTIR-karakteriseringsanalys. | x5 | ||
| 3D Bioink med GFP märkt WJ-MSC & 0,1% | Observation av WJ-MSC:s rörelser i biobläcket innehållande lämplig dos grafen. | x3 | ||
Tabell 1. Grupper i metoden. Alla 2D- och 3D-grupper i metoden ingår.
2. Grafentoxicitet och 2D-avbildning
- Beredning av grafenkoncentrationer och applicering på celler
OBS: Råa grafennanopartiklar köptes kommersiellt (industriell grafennanoplåtstyp) och donerades också. Dimensionerna på partiklarna var 5-8 nm i tjocklek, 5 μm i diameter och 120-150 m2/g i yta.- Väg grafen för att skapa en 1% lösning (mg / ml). Gör en stamlösning genom att tillsätta 10 ml DMEMF-12-medium med 10% FBS till de vägda 100 μg grafennanopartiklarna och märk denna lösning som stamlösning. Sterilisera i en autoklav vid 121 °C under 1,5 atm tryck i 20 minuter.
OBS: Den sterila grafenblandningen förvaras i kylskåp vid 4 °C fram till användning. Det kanske inte är lämpligt för långvarig användning (högst 1 månad). I dessa fall måste blandningen rekonstitueras och steriliseras. - Bered en blandning av medium grafen i olika koncentrationer för att bestämma icke-toxiska doser. Ange de initiala utspädningarna till 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 % och 0,0001 % grafen/media.
- Börja med 1% stamlösning, ta 1 ml successivt från varje koncentration och överför den till ett nytt rör. Tillsätt 9 ml DMEMF-12-medium med 10% FBS till varje rör, gör fem gradvis utspädda prover och skaka och virvla lösningarna för att få lika fördelning. Använd endast 10 ml DMEMF-12-medium med 10% FBS som kontroll.
OBS: De tunga flingorna av grafen fälls ut och måste därför omfördelas. - Frö WJ-MSC: erna i 6-brunnsplattor med 2 ml färskt medium innehållande 10% FBS vid 5 x 105 celler per brunn. Inkubera i 1 dag vid 37 °C. Dela sedan plattorna i grupper av lika och upprepade brunnar. Gör fem repetitioner för varje koncentration.
- Kassera mediet och ersätt sedan mediet med grafenmedelkoncentrationer vid 2 ml per brunn. Använd endast mediet för kontrollgruppen. Inkubera plattorna vid 37 °C i 24 timmar.
- Väg grafen för att skapa en 1% lösning (mg / ml). Gör en stamlösning genom att tillsätta 10 ml DMEMF-12-medium med 10% FBS till de vägda 100 μg grafennanopartiklarna och märk denna lösning som stamlösning. Sterilisera i en autoklav vid 121 °C under 1,5 atm tryck i 20 minuter.
- Bestämning av giftfria koncentrationer av grafen med MTT
- Kassera media med grafen efter 24 timmar. Tvätta varje brunn med PBS. Tillsätt färskt DMEMF-12-medium med 10% FBS vid 2 ml per brunn.
OBS: Det är viktigt att tvätta med PBS efter applicering av grafenkoncentrationer på cellen eftersom grafennanopartiklar, som inte tas in i cellen genom endocytos, avlägsnas från miljön. Detta gör MTT-testet effektivare. - Använd MTT-protokollet (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) för att bestämma IC50-värdet som indikerar 50 % cellviabilitet, enligt beskrivningen i Kose et al.22 och i steg 2.2.3.-2.2.6.
- Väg först upp 5 mg/ml MTT-salt och lös upp i PBS. Sterilisera med ett 0,45 μm filter. Linda in MTT-lösningen, tillverkad i ett 15 ml centrifugrör, med aluminiumfolie och förvara vid 4 °C.
- Tillsätt 10 μl MTT till alla brunnar och inkubera plattan i 4 timmar vid 37 °C. Observera bildandet av formazankristaller vid 10x förstoring under mikroskopet efter inkubation.
- För att lösa upp kristallerna som bildas i cellerna, tillsätt 100 μL DMSO till varje brunn och blanda genom pipettering. Håll plattan i mörker vid rumstemperatur i 30 minuter. Sätt in plattan i ELISA-plattläsaren. Ställ in en våglängd på 570 nm från programmet för absorbansmätning och låt den läsa plattan22.
OBS: Dessutom, medan grafenpartiklar ensamma läses vid 270 nm23, kommer läsområdet 570 nm24 här endast att vara för läsning av cellviabilitet. - Utför statistisk analys av de erhållna resultaten med hjälp av envägs ANOVA med Tukeys test i ett statistiskt analysprogram.
- Kassera media med grafen efter 24 timmar. Tvätta varje brunn med PBS. Tillsätt färskt DMEMF-12-medium med 10% FBS vid 2 ml per brunn.
- Stygnavbildning
- För att undersöka interaktionen mellan olika grafenkoncentrationer med celler, utför en tidsfördröjning av cellerna med metoden som kallas stygnavbildning. Denna metod skapar en time-lapse-bild med hjälp av bildprover som tas med jämna mellanrum under mikroskopet.
- För att göra detta, slå på datorn först. Slå på timelapse-bildinkubatorn och ställ in den på 37 °C. Placera MTT-plattan i time-lapse-inkubatorspåret.
- Öppna Stitch-programmet på datorn. Ange de brunnar som ska läsas i systemet. Ta läsaren till den första brunnen och lokalisera och fokusera området med 10x förstoring i vitt ljus. Starta programmet.
OBS: Det är ett program för att skapa högkvalitativa 4 rader x 5 kolumner flera fotokollage. Programmet kombinerar bilder tagna efter varandra i HD-kvalitet. När du trycker på systemets startknapp läses brunnarna automatiskt och det tar och syr 4 rader x 5 kolumner flera foton.
3. Grafen - Bioink biohybrid hydrogelproduktion och WJ-MSC differentiering
- Produktion av biobläck
OBS: De frystorkade kommersiellt tillgängliga alginatgelatin (3: 5) pulver används som bas för biobläck. Grafenbiobläckgruppen (3D-G; 3D-GS) och den grafenfria kontrollbiobläckgruppen (3D-B; 3D-BS) framställs med samma metod (tabell 1).- Använd 50 ml koniska rör för beredningen. Väg först 4,5 mg alginat och 1,5 mg gelatin och överför till ett centrifugrör. Tillsätt DMEMF-12-medium innehållande 10% FBS till blandningen till en total volym av 50 ml. Detta är kontrollgruppen (C) utan grafen.
- Upprepa vägningen 4,5 mg alginat och 1,5 mg gelatin och överför till ett centrifugrör. Ta sedan 50 μL av det beredda 0,1% grafen från steg 2.1.3. och lägg till det i röret. Lägg till DMEMF-12 med 10% FBS till en total volym på 50 ml.
- Blanda biobläcken först genom pipettering och sedan virvel. Sterilisera i en autoklav vid 121 °C under 1,5 atm tryck i 20 minuter. Alternativt kan du utföra sterilisering genom mikrovågsugn tills kokpunkten.
- Efter att blandningarna autoklaverats, centrifugera vid 280 x g i 2 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna bildade bubblor. Håll biobläcket vid 37 °C tills cellerna är förberedda.
- Tillägg av WJ-MSC och 3D-bioprinting
- För att räkna, tvätta cellerna när det finns 80% sammanflöde med cirka 5 ml PBS och tillsätt 5 ml 0,25% trypsin och 2,21 mM EDTA 4Na. Låt verka i 5 min vid 37 °C.
- Tillsätt 10 ml DMEM-F12-medium med 10% FBS till cellerna efter avlägsnande från inkubatorn. Stäng av väl, samla mediet och överför det till ett centrifugrör. Centrifugera vid 101 x g i 5 min vid rumstemperatur och kassera sedan supernatanten.
- Lämna cirka 250 μl medium med pelleten. Lös upp pelleten i 1 ml färskt medium. Tillsätt 2 μl cellsuspension och 50 μl trypanblått (0,4 g trypanblått/100 ml) till 48 μl medium i ett koniskt rör (1,5 ml) för räkningav 4. Pipettera det bra.
- Tillsätt cirka 10 ml av den beredda färgade cellsuspensionen till en Thoma-cellräkningskammare. Beräkna det genomsnittliga antalet celler som faller i rutorna på båda sidor av ljusmikroskopet.
Beräkna vitalitetsprocenten (%) = (räknade viabla celler/totalt antal räknade celler) x 100
OBS: Cell-biobläckinteraktionen studeras på två sätt: (1) Den kan skrivas ut genom att lägga till den i biobläcken (3D-B; 3D-G); (2) Cellerna sås på biobläcken efter att ha pressats och cellerna bildar en sfäroid (3D-BS; 3D-GS). - För cell-biobläckinteraktionen skapar du först biobläckgrupperna (tabell 1). Grupp 1 omfattar 3D-B och 3D-G tryckta med biobläck för bioprinting. Grupp 2 inkluderar 3D-BS och 3D-GS biobläck på vilka sfäroider bildades efter bioprinting.
- Räkna cellerna för grupp 1 så att det finns ungefär 1 x 107 celler i 0,5 ml medium. Tillsätt 4,5 ml biobläck för att få den totala volymen till 5 ml. Överför detta till patronerna i sterilskåpet med hjälp av sprutor. Installera patronerna i motsvarande extrudersektion på bioprintern.
- För den andra gruppen, ta 5 ml från var och en av biobläckgrupperna och överför dem till sterila patroner med hjälp av en injektor.
- Använd bioprintern med två koaxiala skrivhuvuden och den pneumatiskt drivna extruderingstekniken. Ställ in X/Y/Z-upplösningen per mikrosteg på 1,25 μm, extruderingsbredden på 400 μm och extruderingshöjden på 200 μm. Ett rutnät på 20 mm x 20 mm x 5 mm är en av de mest använda 3D-modellerna för 3D-bioprintning.
- Skapa 3D-modellerna med webbaserade CAD-program med öppen källkod. Innan bioprinting, skapa enkla 3D-modeller med en av plattformarna med öppen källkod (t.ex. fyllning). Modellen kan vara linjär (som modellen som används här), bikaka eller rutnätformad. Exportera och ladda ner i .stl-format efter att ha skapat en 5 mm x 20 mm x 20 mm kvadrat.
- Bioprinter-programvaran använder .stl-filer och konverterar dem till utskrivbart .gcode-format med hjälp av utsnittsmoduler. Om du vill få en utskrivbar rutnätsform inaktiverar du det yttre skalet i utsnittsmodulen. Torka av enheten med 70% etanol före drift och sterilisera sedan genom UV-sterilisering.
- För bioprintningsprocessen, överför biobläckgrupperna till patronerna med hjälp av en injektor. Installera patronerna i motsvarande extrudersektion på bioprintern.
- Ställ in 3D-skrivarens medeltryck på 7,5 psi och patronens och sängtemperaturen på 37 °C. Ställ in hastigheten på 60% och utför en standard 3D-utskriftsprocess.
OBS: Planering av de förberedda modellerna med utrymmen (som en linjär modell) gör att cellodling kan göras i utrymmena efter bioprinting. - Sätt systemet i hemläge under skrivfasen. Placera axlarna (X, Y, Z) automatiskt, välj extrudern och ställ in. Starta utskriftsprocessen. Efter bioprintningsprocessen, ta provet och placera det under ett laminärt flödesskåp.
- Spraya biobläcken med 0,1 N CaCl2-lösning efter utskrift eller tillsätt 1 ml av lösningen med en pipett vid rumstemperatur. Vänta ca 10-20 s och tvätta de tryckta mönstren 2x med PBS innehållande Ca 2+ och Mg2+.
- Tillsätt 2 ml DMEMF-12 med 10% FBS-medium ovanpå var och en av de cellinnehållande biobläckgrupperna. Inkubera plattorna vid 37 °C med 5 %CO2. Tillsätt därefter 2 ml suspensionsmedium innehållande 1 x 106 celler till varje grupp för sfäroidbildning.
- Inkubera plattorna vid 37 °C med 5 %CO2. Efter 24 h inkubation, observera sfäroidbildningen under ett inverterat mikroskop.
- WJ-MSC differentiering till neuronliknande celler
- Observera och fotografera alla partier biobläck efter 24 timmars inkubation. Tillsätt 2 ml neurogent differentieringsmedium per brunn (förutom kontrollgruppen) och uppdatera varannan dag. Följ i 7 dagar för att observera neural differentiering.
4. Karakterisering av grafen-biobläck biohybrid hydrogel
OBS: Time-lapse imaging, Fourier transform infraröd spektroskopi (FT / IR) och svepelektronmikroskopi (SEM) analyser utförs för karakterisering av grafen-biobläck biohybrid hydrogel. Proverna skapas från 3D-B och 3D-G biobläckgrupper genom droppmetoden för FT/IR och SEM-analys.
- FT/IR-analys
OBS: FT / IR är en kemisk analysmetod baserad på den matematiska Fouriertransformen, oumbärlig för materialkarakterisering. Använd en FT/IR-enhet baserad på Michelson-interferometerprinciperna 28 °C, med halogenlampa, vattenkyld kvicksilverljuskälla, signalproportioner på 4 cm−1, mätt i 1 minut, vid 2 200 cm−1.- Förbered FT / IR-mikroskopet och se till att instrumentets optik är inriktad. Kalibrera enheten.
- Eftersom provet är i en droppe, ta en bit 1-2 mm tjock hydrogel och placera den med pincett på provdelen. Fokusera på provet och höj det tills nära kontakt görs. Samla provspektrumet genom att starta processen från systemet.
- Analys av svepelektronmikroskopi (SEM)
OBS: Ytmorfologin, den inre strukturen, cellfördelningen och biobläck-cellinteraktionerna kan undersökas genom SEM-analys i olika dimensioner.- Släpp hydrogelen i 6-brunnsplattor innehållande 1 ml CaCl 2-tvärbindare med pipettspetsdroppmetoden (se figur 1).
- Tvätta plattorna 2x med cirka 1 ml PBS för att frigöra lösningen av salter. Lägg sedan dessa droppar i ett falkrör innehållande 5 ml 5% paraformaldehyd med hjälp av pincett.
- Gör tunna sektioner från droppbiobläck med hjälp av en skalpell. Stick proverna på den klibbiga sidan på metallplattan. Sätt in i beläggningsanordningen där guldpalladiumet, som passerar in i plasmafasen genom att ersätta luften med argongas, täcker provet.
- Lägg den i elektronmikroskopet (SEM). Öppna mikroskopprogrammet som SEM är anslutet till. Utför skalningen och ta bilder av olika delar av provet. För detta protokoll användes 5 μm, 10 μm och 200 μm skalor. Totalt togs 40 bilder för grupperna 3D-B och 3D-G.
- Time-lapse-avbildning
OBS: Under time-lapse-avbildning användes inte bara biobläckprover innehållande GFP-gentransformerade celler utan även biobläck med sfäroider avbildas i 16 timmar. Time-lapse-avbildning utförs för att undersöka effekterna av grafen på stamceller och för att övervaka cellinteraktioner inom biobläcket.- Lägg till kommersiellt tillgängliga 1 x 107 GFP-märkta MSC i 5 ml biobläck och bioprint som i steg 3.2.11. Tillsätt 1 ml tvärbindare, håll i 20-30 s och tvätta 2x med PBS.
- Slå på time-lapse-monitorn och öppna programmet på datorn. Ställ in cirka 16 timmar i Time-Lapse-läge och ställ in temperaturen på 37 °C. Tryck på Start-knappen . Videor i form av 40 s time-lapse-videoprover spelas in av systemet.
- Fokusera mikroskopet med 10x förstoring var 2: e timme. Visualisera också sfäroiderna som skapats genom att följa samma steg.
Figur 1: 3D-B och 3D-G biobläckgrupper producerade som droppar för användning vid karakterisering. a) Biobläckprover (bild före karakterisering) på en platta med tvärbindare. (B) 3D-B droppbild av biobläck. (C) 3D-G biobläck droppbild. Det biomaterial som ska karakteriseras och cellerna det innehåller kan lättare gå igenom processer som guldplätering, provtagning etc. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Bestämning av neurogen differentiering genom immunfärgningsmetod
- Samla sfäroiderna, utan att avbryta sfärformer, och sätt tillbaka i nya plattor för att vila med en enklare metod, istället för att bädda in paraffin för vävnadssnittning.
- Täck plattorna med 48 brunnar med cirka 20 ml förautoklaverad 0,1% gelatinlösning och förvara i en inkubator i minst 1 timme. Pipettera cirka 500 μL beredd 0,1% gelatin i 48-brunnsplattor. Lämna de gelatinösa plattorna i inkubatorn i 10 minuter.
OBS: Detta gör att gelatinet sväller något, täcker ytan och skapar en bättre miljö för de uppsamlade sfäroiderna att fästa. - Samla sfäroiderna genom pipettering, fördela de uppsamlade sfäroiderna från inkubatorn i brunnarna på 48-brunnsplattan och tillsätt färskt medium. Inkubera sedan i 12-24 timmar.
OBS: Det är ganska svårt att fördela sfäroiderna genom att räkna. Samla sfäroiderna i ett enda rör och fördela den totala volymen jämnt till brunnarna. För denna studie innehöll varje brunn cirka 4-6 sfäroider.
OBS: För 2D-prover är tvätt före fläck tillräcklig, och inget byte av media krävs. - Ta bort mediet och tvätta långsamt cellerna med PBS eftersom sfäroiderna kommer att vara överst. Fix i 4% paraformaldehyd i 2 timmar.
- Tvätta proverna med PBS igen och blockera med ca 10 ml 2% BSA och 0,1% TritonX i 30 minuter. Tvätta sedan med PBS 3x.
- Späd utvalda primerantikroppar (N-cadherin-rabbit och β-III tubulin-mus) i förhållandet 1:100 med antikroppsspädningsreagenslösning. Tillsätt 100 μl antikroppslösning till vart och ett av proverna och inkubera över natten vid 4 °C.
- Tvätta proverna 3x med PBS. Inkubera med antimus IgG-FTIC-kanin för β-III tubulin och anti-mus IgG-SC2781-get sekundär antikropp för N-Cad utspädd till 1:200 vid rumstemperatur i 30 min. Utför alla operationer i mörkret.
OBS: Oavsett vilken stam som används som primär antikropp (t.ex. mus) vid dubbelfärgning, bör en annan stam (t.ex. get eller kanin) användas för den sekundära antikroppen. - Tvätta den sekundära antikroppen med PBS 3x och droppa sedan DAPI-lösningen (1:1) i vart och ett av proverna. Vänta i 15-20 min. Utför immunofluorescensavbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafentoxicitet och 2D-avbildning
Statistisk analys av de erhållna MTT-resultaten utfördes med en enkelriktad ANOVA med Tukeys test i statistisk analysprogramvara, och den erhållna grafen visas i figur 2. Grafenprocenten jämfört med kontroll visade en signifikant minskning endast för 0,001% grafenkoncentration (**p < 0,01). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan de andra grupperna och kontrollgruppen (p > 0,05). Därför bestämdes den optimala grafenkoncentrationen till 0,1 % eftersom de högsta viabilitetshastigheterna observerades efter exponering för denna koncentration enligt MTT-testresultaten och sömnadsbilderna.
Figur 2: Undersökning av effekten av grafenkoncentration på cellproliferation. Grafenprocenten jämfört med kontroll visade en signifikant minskning endast för 0,001% grafenkoncentration (**p < 0,01, n = 6). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan de andra grupperna och kontrollen (p > 0,05; n = 6). Statistisk analys av de erhållna MTT-resultaten utfördes med en enkelriktad ANOVA med Tukeys test i statistisk analysprogramvara. Felstaplarna representerar standardavvikelsen. Denna siffra har ändrats från28. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Denna del av den presenterade metoden visar att interaktionen mellan stamceller och grafen kan användas i framtida studier. Det observerades att grafen tolererades i 2D-systemet i varje testad koncentration och togs upp av cellerna genom endocytos (figur 3). Det har bestämts att grafenplattorna rör sig längs cytoplasman inuti cellen.
Figur 3: Cell-grafeninteraktionerna visas i två dimensioner i sammanfogade bilder . a) Kontroll. (B) 0,0001%; (C) 0,001%; (D) 0,01%; (E) 0,1%; och (F) 1% koncentrationer av grafen. Det erhålls genom att kombinera time-lapse-avbildning med högupplösta kvalitetsinställningar för att få ett 4 rader x 5 kolumner collage av flera foton. Denna siffra har ändrats från 28. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vidare observerades i denna studie att grafen-biobläckeffekten inte skapade någon toxisk mikromiljö i 3D-systemet och att cellerna var i interaktion.
Det har också observerats att användningen av grafen i 3D-system inte skapade någon giftig mikromiljö. Att bestämma den toxiska dosen för celler är avgörande för användningen av grafen i långsiktiga ledningsimplantat eller injicerbara hydrogelformer. Dessutom, eftersom grafen är ett effektivt material i neuronal kommunikation, har dess användning i nervvävnadstekniska tillämpningar ökat mycket, vilket dokumenterats i litteraturen25.
Produktion av kompositbiomaterial och 3D-bioprinting
Bildningen av gelatin-alginatbaserad biobläckbiohybridmönstring utfördes med en giftfri koncentration av grafen (0,1%). Det har observerats att den valda lämpliga dosen grafen interagerar med cellerna i biobläcket.
Time-lapse-avbildning
GFP-prover sattes till 37 °C i cirka 16 timmar i time-lapse, och foton och videor togs (Video 1). GFP-signaler förlorades när celldöd observerades. Här upptäcktes att celler som överlevde i 3D-grafenmediet behöll sina vitaliteter eftersom GFP-ljusstyrka observerades fram till slutet av inkubationen.
Videoklipp 1. Time-lapse-video av GFP-märkta WJ-MSC. Samspelet mellan märkta stamceller med varandra observeras. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Karakterisering av grafen-biobläck biohybrid hydrogel
SEM och FT/IR användes för karakterisering av 3D-B- och 3D-G-grupperna skapade med droppbiobläckmetoden. SEM-bilderna av biobläckgrupperna 3D-B och 3D-G visas i figur 4. Av de 40 bilder som togs i steg 4.2.5. visas 4 representativa bilder här.
Figur 4: SEM-bilder av biobläckgrupperna 3D-B och 3D-G. (A) Bild av en guldbelagd 3D-B biobläcksektion med elektronmikroskopi. Skalstapel: 200 μm. (B) Bild av MSC fäst på 3D-B biobläckets inre yta. Skalstång: 5 μm (C) Bild av 3D-G biobläck inre och yttre yta. Skalstång: 200 μm.(D) Vidhäftningsbild för inre ytceller 3D-G biobläck. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Följaktligen demonstrerades biobläck-cellinteraktioner både på ytan och internt. Det fanns en cell-biomaterialinteraktion i båda biobläcken (3D-B; 3D-G). Cellerna var morfologiskt runda och fästa vid materialet. FT/IR-analysen av 3D-B- och 3D-G-biobläckdroppen jämfördes med diagrammet i figur 5.
Figur 5: FT/IR-analys. (A) 3D-B biobläck. b) 3D-G biobläck. Toppar som 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 och 1033 cm−1 har hittats i alginat-gelatinbaserade hydrogelstudier i litteraturen26. Toppen på 1335,46 cm−1 liknar också topparna som ses i grafenbiomaterialstudier27. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Eftersom kontrollbiobläcket (3D-B) baserades på alginat/gelatin var de mest framträdande topparna cirka 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 och 1033 cm−1 jämfört med liknande studier i litteraturen med toppar som sågs vid 1546 cm−126. En topp på 1399 cm−1 observerades i grafengruppen (3D-G) och en liknande topp hittades vid 1335,46 cm−1 i en studie utförd med grafen27.
3D neuronal differentiering
Bilderna av sfäroider på biobläcken efter den 7: e dagen efter differentieringen representeras i figur 6.
Figur 6: 2D-bild av kontroll-WJ-MSC och sfäroidgruppprover dag 7 efter differentiering . (A) Sfärens storlek från 3D-BS-gruppens biobläck med diametrar på 160 μm och 200 μm. (B) 2D-kontrollceller. Sfäroider från (C) 3D-BS-gruppen och (D) 3D-GS-gruppen. De svarta materialen i (D) är grafenmolekyler integrerade med sfäroider. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Man såg att celler behöll sin vitalitet i både 2D- och 3D-kulturer. Det ansågs att gränserna för sfäroidcellerna i båda grupperna (3D-B och 3D-G) var transparenta och livliga, och sfäroiderna i grafengruppen var relativt större och fångade grafen inuti cellen. Differentieringen testades också genom immunfärgning. Med den dubbla färgning som används här jämfördes cellernas aktiviteter i 2D-neuronal transformation med 3D-kultur (figur 7).
Figur 7: Immunfärgning av 2D- och 3D-celler. (A,B) Immunfärgning av odlade sfäroider på 3D-BS-biobläck. (C,D) 3D-GS biobläcksfäroida immunfläckar. e) Differentierad 2D-positiv kontroll WJ-MSC. (F) Odifferentierad 2D negativ kontroll WJ-MSC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Immunofluorescensbilder av celler odlade i 7 dagar visas i figur 7. Proverna färgades med antikroppar specifika för N-cadherin (grön) och β-III tubulin (röd). Dessutom användes DAPI för visualisering av kärnan (blå eller lila). Följaktligen skilde sig N-kadherinerna (gröna) som användes i 2D- och 3D-proverna över 7 dagar eftersom det spelar en viktig roll i signalmekanismer och utveckling av neuroner. Den gröna bilden i figur 7A-E representerar neuronliknande strukturer (figur 7). Klass III β-tubulin är en av de sju isotyper som kallas neuronmarkörer i det mänskliga genomet. N-cadherinuttryck visade sig vara högre i proverna som differentierades i 7 dagar jämfört med β-III tubulin. Enligt resultaten av det aktuella experimentet fastställdes att 3D-systemen skapade en mer lämplig mikromiljö för cellerna att överleva och differentiera. Det 2D-positiva kontrollprovet (figur 7E) uttryckte färre neuronliknande strukturmarkörer jämfört med 3D-proverna (figur 7A-D). Detta visar oss att mikromiljön som skapas med 3D-strukturen är effektivare vid differentiering av stamceller. Dessutom, istället för enbart cellterapier; Biomaterial-cell kombinerade behandlingar verkar vara mer inflytelserika och effektiva vid nervskador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelarna med behandlingar som tillämpas med konstruerade 3D-ställningar jämfört med konventionella 2D-metoder blir mer och mer märkbara varje dag. Stamceller som används ensamma i dessa terapier eller tillsammans med byggnadsställningar framställda av olika biomaterial med låg biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet är vanligtvis otillräckliga vid perifer nervregenerering. Whartons jelly mesenkymala stamceller (WJ-MSC) verkar vara en lämplig kandidatcellinje, särskilt med tanke på optimeringen av protokollen för förvärv, deras spridningsförmåga och deras differentieringskapacitet29. I denna studie undersökte vi interaktionen mellan stamceller och grafen i både 2D- och 3D-kulturer. Vi jämförde också den neurogena differentieringen i de genererade biohybridhydrogelgrupperna med 2D-miljön. Vi demonstrerade neurosfärbildningen på biobläcken genom immunfärgning. I ytterligare studier karakteriserade vi vår kandidatprototyp, som kan injiceras eller implanteras som en neural kanal, med SEM- och FT/IR-metoder. Denna studie karakteriserar egenskaperna hos det producerade biomaterialet, cell-biomaterialinteraktionen och den neurala differentieringen av stamcellerna i närvaro av biomaterialet. I de följande stadierna utreds inverkan på migrationen.
De biohybridmaterial som bildas genom att kombinera två eller flera biokompatibla material blir mer fördelaktiga när det gäller deras strukturella egenskaper jämfört med homogena material30. I en tidigare studie utfördes implantation av en polyglykolsyrabaserad neurorörskanal i den perifera nerven i ansiktet. Märkta luktstamceller infördes i denna ledning, vilket resulterade i framgångsrik regenerering av perifer kirurgi och injicerad stamcellsterapi16. I en annan studie jämfördes effektiviteten av 3D-strukturen erhållen från flera cellulära sfäroider utvecklade med humana normala dermala fibroblaster och kiselnervkanalen, som ofta används i litteraturen på grund av dess inerta egenskaper, vid regenerering av ischiasnervskada. Det visades att den sfäroidbaserade 3D-strukturen ökade vävnadsregenereringen signifikant och snabbare i djurmodeller med ischiasskada jämfört med homogena material20. Det är dock känt att kiselbaserade biomaterial, som ofta används i litteraturen, har några viktiga nackdelar, såsom hög infektionsrisk och låg biokompatibilitet15,30.
I den aktuella studien utfördes produktionen av biokompatibel, biologiskt nedbrytbar hydrogel biohybrid kompositvävnad med grafen nanotrombocyter, som är kända för att vara effektiva vid nervledning, genom en 3D-utskriftsteknik. Det finns olika studier där grafen har använts som biomaterial för nervledning25,30. Dessutom är grafen ett av de tunnaste och lättaste materialen som finns, vilket ökar dess preferens inom medicinsk teknik13. En av de mest önskvärda egenskaperna hos biomaterial är biologisk nedbrytbarhet. Experimentella och molekylära simuleringstekniker har tillämpats för att undersöka biologisk nedbrytning av grafen och dess derivat13. Vid denna tidpunkt kan ytmodifieringsfunktionalisering eller produktion i form av sammansatta biomaterial förbättra eller hämma biologisk nedbrytning, till stor del beroende på tillsatsernas egenskaper.
Olika enzymer, såsom manganperoxidas (MnP), pepparrotsperoxidas (HRP) och myeloperoxidas (MPO), finns tillgängliga i litteraturen för biologisk nedbrytning av grafenderivat. MPO-enzymet, som är ett peroxidas som frigörs från neutrofiler som kommer till regionen av främmande kroppar och utför fagocytos, är associerad med biologisk nedbrytning av grafen, särskilt i den mänskliga lungan13. Den biologiska nedbrytbarheten hos sammansatta biomaterial som innehåller grafen i stället för enbart grafennanorör skiljer sig från varandra. Det är lättare att uppnå denna önskade egenskap i kompositmaterial. Dessutom bidrar bestämning av den toxiska dosen grafen till användningen av kliniskt tillämpliga biomaterial13.
En viktig del av grafensteget i protokollet är sterilisering av grafen när det ska användas. Risken för kontaminering som kan uppstå under interaktionsfasen mellan biohybridceller undviks.
Effekten av den erhållna biohybridgrafen-bioinkhydrogelmönstringen på nervdifferentiering undersöktes och det var förenligt med litteraturen att differentieringen var högre i 3D-systemet. Behovet av produktion av biomaterial med vävnadstekniska cellbaserade terapeutiska metoder som kan utvecklas mot olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom perifer nervskada, ökar med otillräckligheten av nuvarande behandlingar dag för dag, vilket betonar vikten av denna studie.
I en tidigare studie undersöktes interaktionen mellan grafen och celler i ett 2D-cellodlingsmedium28. Med erfarenheterna därifrån tillsattes grafen till alginat-gelatinbiobläcket med det kända förhållandet, och en ny och unik biomaterialprototyp producerades med en 3D-utskriftsmetod. Detta nya material användes för att studera cellinteraktion på två olika sätt. Den första är samutskrift av cellkompositbiomaterialet på en 3D-skrivare. Den andra är bildandet av en cellulär sfäroid från biomaterialet. Dessutom observerades interaktionen mellan WJ-MSC innehållande den märkta GFP-genen och materialet.
I denna studie karakteriserades biohybridbiobläck genom att välja FTIR- och SEM-metoder. Dessa gör det möjligt att undersöka provkulorna som bildas med droppmetoden under karakteriseringsfasen. Speciellt eftersom vi kan undersöka en hård och torr struktur under SEM-guldpläteringsstadiet, ger SEM den fysiska lämpligheten för att få bättre, tunna sektioner med en skalpell från biobläckbollarna vi skapade med denna metod.
I denna metodstudie tillsattes celler till biohybridmaterialet på två olika sätt under experimenten: inuti för 3D-bioprinting eller under sfäroidbildning. Att täcka celler med biobläck och använda 3D-bioprinters gör det möjligt för forskare att skapa önskad 3D-form för nervregenerering. Å andra sidan orsakar det mer stress på celler på grund av trycktrycket och därmed förlust av cellviabilitet. Det kan dock vara en mer önskvärd metod för att öka cellhoming när de injiceras eller transplanteras till ett specifikt område för att inducera regenerering.
Skapandet av sfäroider på biobläck skapar en mer användbar form av konstgjord vävnad när det gäller cellinteraktion och ger en bättre nisch för celldifferentiering. Det är också lämpligt för att efterlikna den naturliga mikromiljön och därför undersöka cellulära mekanismer. Spheroids låga vidhäftning till biobläcken möjliggör också enklare separation från biobläck och mångsidighet hos applikationerna.
De använda N-kadherinerna (visas i grönt i figur 7) är en del av cellsignaleringsmekanismer och spelar en viktig roll i utvecklingen av neuroner32. Klass III β-tubulin är en av de sju isotyper som kallas neuronmarkörer i det mänskliga genomet. Det visar att WJ-MSC som används i denna studie börjar bilda neuronliknande strukturer. I detta sammanhang kommer 3D-system att skapa en mer adekvat mikromiljö för celler för att bibehålla sin livskraft.
Slutligen, på grund av kostnaderna och den kliniska tillämpligheten av celldifferentieringssystem, är det mycket viktigt inom neuroteknik att utveckla system med kontrollerad frisättning av byggnadsställningar, celler och differentieringsbiosignaler33 i framtiden och anpassa dessa till klinikerna som kombinerade terapier. Därför kan sfäroid- och bioprintningsmetoder också användas i ytterligare studier där grafen och andra biosignaler bäddas in i hydrogeler och frigörs på ett kontrollerat sätt. In vitro-studier är ett viktigt steg på vägen mot in vivo. När materialet, som tillhandahålls här som en prototyp, produceras i enlighet med Good Laboratory Practice-standarder kan de steriliseringsstandarder som krävs för överföring till kliniken uppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt. Projektet genomfördes i samarbete med HD Bioink, utvecklare av 3D-bioprintningstekniken.
Acknowledgments
Grafen som används i denna studie har utvecklats vid Kirklareli University, Institutionen för maskinteknik. Det donerades av Dr. Karabeyoğlu. Grafentoxicitetstestet finansierades av projektet med titeln "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Application No: 1139B411802273) som slutfördes inom ramen för TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. Den andra delen av studien stöddes av forskningsfonden från Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Mesenkymala stamceller med GFP som används i time-lapse-avbildningsstadiet donerades av Virostem Biotechnology. Författarna tackar Darıcı LAB och YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB-teamet för produktiva diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
- Kaya, T. I.
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A.
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
