Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63622
Automatic Translation
1,2,4, 3,4,5, 2,4,6, 2, 2,5, 4, 2,7, 2,7, 3,4,5,8
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Summary

В этой рукописи мы демонстрируем получение биогибридных гидрогелевых биочернил, содержащих графен, для использования в инженерии периферических тканей. С помощью этого 3D-биогибридного материала выполняется протокол нейронной дифференцировки стволовых клеток. Это может стать важным шагом в привлечении подобных биоматериалов в клинику.

Abstract

Периферические невропатии могут возникать в результате повреждения аксонов, а иногда и из-за демиелинизирующих заболеваний. Повреждение периферических нервов является глобальной проблемой, которая возникает у 1,5-5% пациентов неотложной помощи и может привести к значительным потерям работы. Сегодня подходы, основанные на тканевой инженерии, состоящие из каркасов, соответствующих клеточных линий и биосигналов, стали более применимыми с развитием технологий трехмерной (3D) биопечати. Комбинация различных гидрогелевых биоматериалов со стволовыми клетками, экзосомами или биосигнальными молекулами часто изучается для преодоления существующих проблем в регенерации периферических нервов. Соответственно, производство инъекционных систем, таких как гидрогели, или имплантируемых кондуитных структур, образованных различными методами биопечати, приобрело важное значение в периферической нейроинженерии. В нормальных условиях стволовые клетки являются регенеративными клетками организма, и их количество и функции не уменьшаются со временем, чтобы защитить их популяции; Они не являются специализированными клетками, но могут дифференцироваться при соответствующей стимуляции в ответ на травму. Система стволовых клеток находится под влиянием своего микроокружения, называемого нишей стволовых клеток. При повреждениях периферических нервов, особенно при невротмезисе, это микроокружение не может быть полностью спасено даже после хирургического связывания разорванных нервных окончаний вместе. Композитные биоматериалы и комбинированная клеточная терапия повышают функциональность и применимость материалов с точки зрения различных свойств, таких как биоразлагаемость, биосовместимость и технологичность. Соответственно, это исследование направлено на демонстрацию приготовления и использования биогибридного гидрогеля на основе графена и изучение эффективности дифференцировки стволовых клеток в нервные клетки, что может быть эффективным решением в регенерации нервов.

Introduction

Нервная система, которая является механизмом, соединяющим внутреннюю структуру организма и окружающей среды, делится на две части: центральную и периферическую нервные системы. Повреждение периферических нервов является глобальной проблемой, которая составляет 1,5-5% пациентов, поступающих в отделение неотложной помощи, и развивается из-за различных травм, что приводит к значительной потере работы 1,2,3.

Сегодня клеточные подходы к периферической нейроинженерии представляют большой интерес. Стволовые клетки занимают первое место среди клеток, используемых в этих подходах. В нормальных условиях стволовые клетки являются регенеративными клетками организма, и их количество и функции не уменьшаются со временем, чтобы защитить их популяции; Эти клетки являются специализированными, но могут дифференцироваться при соответствующей стимуляции в ответ на повреждение 4,5. Согласно гипотезе стволовых клеток, система стволовых клеток находится под влиянием своего микроокружения, называемого нишей стволовых клеток. Сохранение и дифференцировка стволовых клеток невозможны без присутствия их микроокружения6, которое может быть восстановлено с помощью тканевой инженерии с использованием клеток и скаффолдов7. Тканевая инженерия — это междисциплинарная область, которая включает в себя как инженерные, так и биологические принципы. Тканевая инженерия предоставляет инструменты для создания искусственных тканей, которые могут заменить живые ткани и могут быть использованы для регенерации этих тканей путем удаления поврежденных тканей и обеспечения функциональных тканей8. Тканевые каркасы, один из трех краеугольных камней тканевой инженерии, производятся с использованием различных методов из натуральных и синтетических материалов9. Трехмерная (3D) печать — это новая технология аддитивного производства, которая широко используется для замены или восстановления дефектных тканей с помощью простого, но универсального производства сложных форм с использованием различных методов. Биопечать — это метод аддитивного производства, который обеспечивает сосуществование клеток и биоматериалов, называемых биочернилами10. Рассматривая взаимодействие нервных клеток друг с другом, исследования перешли к проводящим биоматериалам-кандидатам, таким как графен. Графеновые нанопластины, обладающие такими свойствами, как гибкая электроника, суперконденсаторы, батареи, оптика, электрохимические датчики и накопители энергии, являются предпочтительным биоматериалом в области тканевой инженерии11. Графен использовался в исследованиях, где проводилась пролиферация и регенерация поврежденных тканей и органов12,13.

Тканевая инженерия состоит из трех основных строительных блоков: каркаса, клеток и молекул биосигнала. Существуют недостатки в исследованиях повреждения периферических нервов с точки зрения полного обеспечения этих трех структур. В биоматериалах, производимых и используемых в исследованиях, были обнаружены различные проблемы, такие как те, которые содержат только стволовые клетки или биосигнальные молекулы, отсутствие биологически активной молекулы, которая позволила бы дифференцировать стволовые клетки, отсутствие биосовместимости используемого биоматериала и низкое влияние на пролиферацию клеток в тканевой нише, и, таким образом, нервная проводимость не полностью реализована 2,13,14,15,16. Это требует оптимизации регенерации нервов, уменьшения мышечной атрофии 17,18 и создания необходимого самонаведения19 с факторами роста против таких проблем. На этом этапе очень важны характеристика и анализ нейроактивности прототипа хирургического биоматериала, который должен быть передан в клинику.

Соответственно, в этом исследовании исследуется паттерн биочернил гидрогеля с графеновыми нанопластинами, сформированными 3D-биопринтером, и его эффективность в отношении нейрогенной дифференцировки стволовых клеток, которые он содержит. Также исследуется влияние графена на формирование и дифференцировку нейросферы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток желе Уортона

  1. Достаньте желеобразные мезенхимальные стволовые клетки Wharton (WJ-MSCs, от ATCC) из морозильной камеры с температурой -80 °C. Культивирование WJ-МСК в среде DMEM-F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% Pen-стрептококка и 1% L-глютамина в стерильном ламинарном потоке при комнатной температуре, как описано в Yurie et al.20.
  2. Криоконсервируйте некоторые клетки в дозе 1 x 106 клеток/мл с замораживающей средой, содержащей 35% FBS, 55% DMEMF-12 и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Для этого посчитайте 1 x 106 ячеек на предметном стекле для подсчета клеток Тома и добавьте раствор для замораживания по каплям. Быстро перенесите предметное стекло в емкость с жидким азотом.
  3. Когда культивируемые клетки на 80% сливаются в колбу, вылейте среду и промойте 5 мл PBS. Добавьте 5 мл 0,25% трипсина и 2,21 мМ ЭДТА-4Na. Инкубировать в инкубаторе при 37 °C в течение 5 мин.
  4. Добавьте 10 мл среды DMEM-F12 с 10% FBS в клетки, извлеченные из инкубатора. Хорошо суспендируйте его, соберите среду и перенесите среду в центрифужную пробирку.
  5. Центрифугу при скорости вращения 101 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно засейте клетки в новые колбы со свежей питательной средой, содержащей 10% FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие WJ-МСК, меченные геном GFP методом трансдукции, могут быть использованы для лучшей визуализации взаимодействий биоматериала и клеток, которые будут произведены21. Группы, которые будут использоваться в этом методе, могут быть созданы, как показано в таблице 1.

Созданные группы Причины для создания Количество повторений
2D WJ-MSC (2D-C) 2D-управление х 5
2D WJ-MSCs и графен (2D-G) Определение токсической дозы графена в 2D x 5 повторений для каждой из разных концентраций
WJ-MSC входят в состав биочернил (3D-B) 3D-управление х 3
WJ-MSC и 0,1% графена включены в биочернила (3D-G) Биогибридная группа 3D графен-биоинк х 3
WJ-MSC находятся в сфероидной форме на биочернилах (3D-BS) 3D-управление формой сфероида х 3
WJ-MSC и 0,1% графена находятся в форме сфероида на биочернилах (группа 3D-GS) 3D графен-биочернильная биогибридная группа сфероидной формы х3 шт.
Капля 3D Bioink Он предназначен для анализа характеристик SEM и FTIR. х5
3D графеновая капля Он предназначен для анализа характеристик SEM и FTIR. х5
3D Bioink с маркировкой GFP WJ-MSCs и 0,1% Наблюдение за движениями WJ-MsC в биочернилах, содержащих соответствующую дозу графена. х3 шт.

Таблица 1. Группы в методе. Все 2D и 3D группы в методе включены.

2. Токсичность графена и 2D-визуализация

  1. Получение концентраций графена и нанесение на клетки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные наночастицы графена были приобретены на коммерческой основе (тип промышленных графеновых нанопластин), а также были пожертвованы. Размеры частиц составляли 5-8 нм в толщину, 5 мкм в диаметре и 120-150 м2/г в площади поверхности.
    1. Взвесьте графен, чтобы получить 1% раствор (мг / мл). Сделайте исходный раствор, добавив 10 мл среды DMEMF-12 с 10% FBS к взвешенным 100 мкг наночастиц графена и пометьте этот раствор как исходный раствор. Стерилизовать в автоклаве при температуре 121 °C при давлении 1,5 атм в течение 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильную графеновую смесь хранят в холодильнике при температуре 4 °C до использования. Он может не подходить для длительного использования (максимум 1 месяц). В этих случаях смесь должна быть восстановлена и стерилизована.
    2. Приготовьте смесь среднего графена в разных концентрациях для определения нетоксичных доз. Установите начальные разведения как 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% и 0,0001% графена/среды.
    3. Начиная с 1% исходного раствора, возьмите последовательно 1 мл из каждой концентрации и переложите его в новую пробирку. Добавьте 9 мл среды DMEMF-12 с 10% FBS в каждую пробирку, получив пять постепенно разбавленных образцов, и встряхните и встряхните растворы, чтобы получить равномерное распределение. Используйте только 10 мл среды DMEMF-12 с 10% FBS в качестве контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тяжелые хлопья графена выпадают в осадок и, следовательно, должны быть перераспределены.
    4. Засейте WJ-MSC в 6-луночные планшеты с 2 мл свежей среды, содержащей 10% FBS, в количестве 5 x10,5 клеток на лунку. Инкубировать 1 день при температуре 37 °C. Затем разделите пластины на группы равных и повторяющихся лунок. Сделайте пять повторений для каждой концентрации.
    5. Откажитесь от среды, а затем замените среду концентрацией графеновой среды по 2 мл на лунку. Используйте только среду для контрольной группы. Выдерживают пластины при 37 °C в течение 24 часов.
  2. Определение нетоксичных концентраций графена с помощью МТТ
    1. Утилизируйте носители с графеном через 24 часа. Вымойте каждый из них хорошо с помощью PBS. Добавьте свежую среду DMEMF-12 с 10% FBS по 2 мл на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно промывать PBS после нанесения концентраций графена на клетку, потому что наночастицы графена, которые не попадают в клетку эндоцитозом, удаляются из окружающей среды. Это делает МТТ-тест более эффективным.
    2. Используйте протокол МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия бромид) для определения значения IC50, указывающего на 50% жизнеспособность клеток, как описано в Kose et al.22 и на этапах 2.2.3.-2.2.6.
    3. Во-первых, взвесьте 5 мг / мл соли МТТ и растворите в PBS. Стерилизовать с помощью фильтра 0,45 мкм. Раствор МТТ, изготовленный в центрифужной пробирке объемом 15 мл, оберните алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 °C.
    4. Добавьте 10 мкл МТТ во все лунки и инкубируйте пластину в течение 4 ч при 37 °C. Наблюдайте за образованием кристаллов формазана при 10-кратном увеличении под микроскопом после инкубации.
    5. Чтобы растворить кристаллы, образовавшиеся в клетках, добавьте по 100 мкл ДМСО в каждую лунку и перемешайте пипеткой. Держите тарелку в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Вставьте пластину в считыватель пластин ИФА. Установите длину волны 570 нм из программы для измерения поглощения и попросите ее прочитать на табличке22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, в то время как частицы графена считываются только при 270 нм23, диапазон считывания 570 нм24 здесь будет предназначен только для считывания жизнеспособности клеток.
    6. Проведите статистический анализ полученных результатов с помощью одностороннего ANOVA с тестом Тьюки в программе статистического анализа.
  3. Визуализация швов
    1. Чтобы изучить взаимодействие различных концентраций графена с клетками, выполните покадровую съемку клеток с помощью метода, называемого визуализацией стежка. Этот метод создает покадровое изображение с использованием образцов изображений, взятых через равные промежутки времени под микроскопом.
    2. Для этого сначала включите компьютер. Включите инкубатор для покадровой визуализации и установите его на 37 °C. Поместите планшет MTT в слот инкубатора с интервальной съемкой.
    3. Откройте программу Stitch на компьютере. Укажите скважины, которые будут считываться в системе. Поднесите считыватель к первому колодцу, найдите и сфокусируйте область с 10-кратным увеличением в белом свете. Запустите программу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это программа для создания высококачественных фотоколлажей размером 4 строки x 5 столбцов. Программа объединяет фотографии, сделанные одна за другой в HD качестве. Когда вы нажимаете кнопку запуска системы, скважины автоматически считываются, и она берет и сшивает 4 ряда х 5 столбцов несколько фотографий.

3. Производство биогибридного гидрогеля Graphene - Bioink и дифференциация WJ-MSCs

  1. Производство биочернил
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лиофилизированные коммерчески доступные порошки альгинат-желатина (3:5) используются в качестве основы биочернил. Группу графеновых биочернил (3D-G; 3D-GS) и группу безграфеновых контрольных биочернил (3D-B; 3D-BS) получают одним и тем же способом (таблица 1).
    1. Для приготовления используйте конические пробирки объемом 50 мл. Сначала взвесьте 4,5 мг альгината и 1,5 мг желатина и перенесите в центрифужную пробирку. Добавьте в смесь среду DMEMF-12, содержащую 10% FBS, до общего объема 50 мл. Это контрольная (С) группа без графена.
    2. Повторить взвешивание 4,5 мг альгината и 1,5 мг желатина и перенести в центрифужную пробирку. Затем возьмите 50 мкл приготовленного 0,1% графена из шага 2.1.3. и добавьте его в тюбик. Добавьте DMEMF-12 с 10% FBS к общему объему 50 мл.
    3. Смешайте биочернила сначала пипеткой, а затем вихревом. Стерилизовать в автоклаве при температуре 121 °C при давлении 1,5 атм в течение 20 мин. В качестве альтернативы выполните стерилизацию в микроволновой печи до точки кипения.
    4. После автоклавирования смесей центрифугу при 280 х г в течение 2 мин при комнатной температуре для удаления образовавшихся пузырьков. Храните биочернила при температуре 37 °C, пока клетки не будут подготовлены.
  2. Добавление WJ-MSC и 3D-биопечати
    1. Для подсчета промойте клетки, когда произойдет 80% слияние примерно с 5 мл PBS, и добавьте 5 мл 0,25% трипсина и 2,21 мМ EDTA 4Na. Оставьте на 5 минут при температуре 37 °C.
    2. Добавьте 10 мл среды DMEM-F12 с 10% FBS в клетки после извлечения из инкубатора. Хорошо суспендировать, собрать среду и перенести ее в центрифужную пробирку. Центрифугу при 101 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Оставьте примерно 250 мкл среды с гранулами. Повторно растворите гранулы в 1 мл свежей среды. К 48 мкл среды добавляют 2 мкл клеточной суспензии и 50 мкл трипанового синего (0,4 г трипанового синего/100 мл) в конической пробирке (1,5 мл) для подсчета4. Хорошо протрите его пипеткой.
    4. Добавьте приблизительно 10 мл подготовленной окрашенной клеточной суспензии в камеру для подсчета клеток Тома. Рассчитайте среднее количество клеток, попадающих в квадраты по обе стороны светового микроскопа.
      Рассчитайте процент жизнеспособности (%) = (подсчитано жизнеспособных клеток/подсчитано общее количество клеток) x 100
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взаимодействие клеток и биочернил изучается двумя способами: (1) его можно напечатать, добавив его в биочернила (3D-B; 3D-G); (2) Клетки высеваются на биочернила после прессования, и клетки образуют сфероид (3D-BS; 3D-GS).
    5. Для взаимодействия между клеткой и биочернилами сначала создайте группы биочернил (таблица 1). Группа 1 включает 3D-B и 3D-G, напечатанные биочернилами для биопечати. К группе 2 относятся биочернила 3D-BS и 3D-GS, на которых после биопечати образовались сфероиды.
    6. Подсчитайте клетки для группы 1 так, чтобы в 0,5 мл среды было примерно 1 x 107 клеток. Добавьте 4,5 мл биочернил, чтобы довести общий объем до 5 мл. Перенесите это в картриджи в стерильном шкафу с помощью шприцев. Установите картриджи в соответствующую секцию экструдера биопринтера.
    7. Для второй группы возьмите по 5 мл из каждой из групп биочернил и перенесите их в стерильные картриджи с помощью инжектора.
    8. Используйте биопринтер с двумя коаксиальными печатающими головками и технологией экструзии с пневматическим приводом. Установите разрешение X/Y/Z на микрошаг на 1,25 мкм, ширину экструзии на 400 мкм и высоту экструзии на 200 мкм. Сетка 20 мм x 20 мм x 5 мм является одной из наиболее часто используемых 3D-моделей для 3D-биопечати.
    9. Создавайте 3D-модели с помощью веб-программ САПР с открытым исходным кодом. Перед биопечатью создайте простые 3D-модели с помощью одной из платформ с открытым исходным кодом (например, infill). Модель может быть линейной (как модель, используемая здесь), сотовой или сетчатой. Экспортируйте и загружайте в формате .stl после создания квадрата размером 5 мм x 20 мм x 20 мм.
    10. Программное обеспечение биопринтера использует файлы .stl и преобразует их в формат .gcode для печати с помощью модулей слайсера. Чтобы получить печатную форму сетки, отключите внешнюю оболочку в модуле слайсера. Перед работой протрите устройство 70% этанолом, а затем стерилизуйте УФ-стерилизацией.
    11. Для процесса биопечати перенесите группы биочернил на картриджи с помощью инжектора. Установите картриджи в соответствующую секцию экструдера биопринтера.
    12. Установите среднее давление 3D-принтера на 7,5 фунтов на квадратный дюйм, а температуру картриджа и слоя — на 37 °C. Установите скорость на 60% и выполните стандартный процесс 3D-печати.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планирование подготовленных моделей с помощью пространств (как линейная модель) позволяет проводить культивирование клеток в пространствах после биопечати.
    13. Переведите систему в исходное положение на этапе записи. Автоматически расположите оси (X, Y, Z), выберите экструдер и установите. Запустите процесс печати. После процесса биопечати возьмите образец и поместите его под шкаф с ламинарным потоком.
    14. Распылите биочернила 0,1 N раствором CaCl2 после печати или добавьте 1 мл раствора пипеткой при комнатной температуре. Подождите около 10-20 секунд и простирайте напечатанные шаблоны 2x с помощью PBS, содержащего Ca 2+ и Mg2+.
    15. Добавьте 2 мл DMEMF-12 с 10% средой FBS поверх каждой из групп биочернил, содержащих клетки. Инкубируйте пластины при 37 °C с 5%CO2. После этого добавьте 2 мл суспензионной среды, содержащей 1 x 106 клеток, в каждую группу для образования сфероидов.
    16. Инкубируйте пластины при 37 °C с 5%CO2. После 24-часовой инкубации наблюдайте за образованием сфероида под перевернутым микроскопом.
  3. Дифференцировка WJ-МСК в нейроноподобные клетки
    1. Наблюдайте и фотографируйте все партии биочернил после 24 часов инкубации. Добавьте 2 мл среды для нейрогенной дифференцировки на лунку (кроме контрольной группы) и обновляйте каждые 2 дня. Наблюдайте в течение 7 дней, чтобы наблюдать нервную дифференцировку.

4. Характеристика биогибридного гидрогеля графен-биоинк

ПРИМЕЧАНИЕ: Покадровая съемка, инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT/IR) и сканирующая электронная микроскопия (SEM) выполняются для определения характеристик биогибридного гидрогеля графена и биочернил. Образцы создаются из групп биочернил 3D-B и 3D-G капельным методом для FT/IR и SEM-анализа.

  1. FT/IR анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: FT/IR - это химический аналитический метод, основанный на математическом преобразовании Фурье, незаменимом для определения характеристик материалов. Используйте ИК/ИК-устройство, основанное на принципах интерферометра Майкельсона 28 °C, с галогенной лампой, ртутным источником света с водяным охлаждением, соотношением сторон сигнала 4 см-1, измеренным в течение 1 мин, при 2,200 см-1.
    1. Подготовьте ИК/ИК-микроскоп и убедитесь, что оптика прибора выровнена. Откалибруйте устройство.
    2. Поскольку образец находится в капле, возьмите кусочек гидрогеля толщиной 1-2 мм и поместите его щипцами на часть образца. Сосредоточьтесь на образце и поднимите его до тесного контакта. Соберите спектр образца, запустив процесс из системы.
  2. Анализ сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология поверхности, внутренняя структура, распределение клеток и взаимодействия биочернил с клетками могут быть изучены с помощью анализа SEM в различных измерениях.
    1. Капните гидрогель в 6-луночные планшеты, содержащие 1 мл сшивающего агента CaCl2 , используя метод капель наконечника пипетки (см. рис. 1).
    2. Вымойте пластины 2 раза примерно 1 мл PBS, чтобы освободить раствор солей. Затем поместите эти капли в соколиную пробирку, содержащую 5 мл 5% параформальдегида, с помощью щипцов.
    3. Сделайте тонкие срезы из капель биочернил с помощью скальпеля. Наклейте образцы липкой стороной на металлическую пластину. Вставьте в устройство покрытия там, где золотой палладий, который переходит в плазменную фазу, заменяя воздух газообразным аргоном, покрывает образец.
    4. Поместите его в электронный микроскоп (СЭМ). Откройте программу микроскопа, к которой подключен СЭМ. Выполните масштабирование и сделайте снимки разных частей образца. Для этого протокола использовались шкалы 5 мкм, 10 мкм и 200 мкм. Всего было сделано 40 снимков для групп 3D-B и 3D-G.
  3. Покадровая визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время покадровой визуализации использовались не только образцы биочернил, содержащие клетки, трансформированные геном GFP, но и биочернила со сфероидами визуализировались в течение 16 часов. Покадровая визуализация выполняется для изучения влияния графена на стволовые клетки и для мониторинга клеточных взаимодействий в биочернилах.
    1. Добавьте коммерчески доступные 1 x 107 GFP-меченных МСК в 5 мл биочернил и биопечати, как показано на шаге 3.2.11. Добавьте 1 мл сшивающего агента, подержите 20-30 с и промойте 2 раза PBS.
    2. Включите покадровый монитор и откройте программу на компьютере. Установите примерно 16 ч в режиме Time-Lapse и установите температуру 37 °C. Нажмите кнопку «Пуск ». Видео в виде 40-секундных покадровых видеосэмплов записываются системой.
    3. Фокусируйте микроскоп с 10-кратным увеличением каждые 2 часа. Кроме того, визуализируйте сфероиды, созданные путем выполнения тех же шагов.

Figure 1
Рисунок 1: Группы биочернил 3D-B и 3D-G, полученные в виде капель для использования в характеризации. (A) Образцы биочернил (изображение перед характеристикой) на пластине со сшивающим агентом. (B) 3D-B каплевидное изображение биочернил. (C) 3D-G изображение с биочернилами. Биоматериал, подлежащий описанию, и содержащиеся в нем клетки могут легче проходить такие процессы, как золочение, отбор проб и т. Д. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Определение нейрогенной дифференцировки методом иммуноокрашивания

  1. Соберите сфероиды, не прерывая формы сфер, и пересейте в новые пластины, чтобы окрасить более простым методом, вместо того, чтобы встраивать парафин для разделения тканей.
  2. Накройте 48-луночные планшеты примерно 20 мл предварительно автоклавированного 0,1% раствора желатина и выдержите в инкубаторе не менее 1 часа. Пипеткой налейте примерно 500 мкл подготовленного 0,1% желатина в 48-луночные планшеты. Студенистые пластины оставить в инкубаторе на 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит желатину немного набухнуть, покрывая поверхность и создавая лучшую среду для прикрепления собранных сфероидов.
  3. Соберите сфероиды пипеткой, распределите собранные сфероиды из инкубатора в лунки 48-луночной пластины и добавьте свежую среду. Затем инкубируйте в течение 12-24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Довольно сложно распределить сфероиды путем подсчета. Соберите сфероиды в одну трубку и равномерно распределите общий объем по лункам. Для этого исследования каждая лунка содержала примерно 4-6 сфероидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 2D-образцов достаточно предварительной промывки пятен и замены носителя не требуется.
  4. Удалите среду и медленно промойте ячейки PBS, так как сфероиды будут наверху. Зафиксируйте в 4% параформальдегиде в течение 2 ч.
  5. Снова промойте образцы PBS и заблокируйте примерно 10 мл 2% BSA и 0,1% TritonX в течение 30 мин. Затем постирайте с помощью PBS 3x.
  6. Разбавьте выбранные антитела-праймер (N-кадгерин-кролик и β-III тубулин-мышь) в соотношении 1:100 раствором реагента-разбавителя антител. Добавьте 100 мкл раствора антитела к каждому из образцов и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
  7. Промойте образцы 3 раза с помощью PBS. Инкубируйте с антимышиным IgG-FTIC-кроликом для β-III тубулина и мышиным вторичным антителом IgG-SC2781-козья для N-Cad, разбавленными до 1:200 при комнатной температуре в течение 30 мин. Выполняйте все операции в темное время суток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от того, какой штамм используется в качестве первичного антитела (например, мыши) при двойном окрашивании, для вторичного антитела следует использовать другой штамм (например, козу или кролика).
  8. Промойте вторичное антитело PBS 3x, а затем капните раствор DAPI (1:1) в каждый из образцов. Подождите 15-20 минут. Проведите иммунофлюоресцентную визуализацию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Токсичность графена и 2D-визуализация
Статистический анализ полученных результатов МТТ проводился с помощью одностороннего ANOVA с тестом Тьюки в программном обеспечении статистического анализа, а полученный график показан на рисунке 2. Процентное содержание графена по сравнению с контролем показало достоверное снижение только при концентрации графена 0,001% (**p < 0,01). Достоверных различий между другими группами и контролем не выявлено (p > 0,05). Таким образом, оптимальная концентрация графена была определена равной 0,1%, поскольку самые высокие показатели жизнеспособности наблюдались после воздействия этой концентрации в соответствии с результатами теста МТТ и изображениями сшивания.

Figure 2
Рисунок 2: Исследование влияния концентрации графена на пролиферацию клеток. Процентное содержание графена по сравнению с контролем показало достоверное снижение только при концентрации графена 0,001% (**p < 0,01, n = 6). Достоверных различий между другими группами и контролем не выявлено (p > 0,05; n = 6). Статистический анализ полученных результатов МТТ проводился с помощью одностороннего ANOVA с тестом Тьюки в программном обеспечении статистического анализа. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Эта цифра была изменена с28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эта часть представленного метода демонстрирует, что взаимодействие стволовых клеток с графеном может быть использовано в будущих исследованиях. Было замечено, что в каждой тестируемой концентрации графен переносился в 2D-системе и поглощался клетками посредством эндоцитоза (рис. 3). Установлено, что графеновые пластины движутся по цитоплазме внутри клетки.

Figure 3
Рисунок 3: Взаимодействия между клетками и графеном показаны в двух измерениях на сшитых изображениях. а) контроль; (В) 0,0001%; (С) 0,001%; d) 0,01%; е) 0,1%; и (F) 1-процентная концентрация графена. Он получен путем объединения покадровой съемки с настройками качества высокой четкости для получения коллажа из нескольких фотографий размером 4 строки x 5 столбцов. Эта цифра была изменена с 28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Кроме того, в этом исследовании было замечено, что эффект графена и биочернил не создает никакой токсичной микросреды в 3D-системе и что клетки взаимодействуют.

Также было замечено, что использование графена в 3D-системах не создало никакой токсичной микросреды. Определение токсической дозы для клеток имеет решающее значение для использования графена в долгосрочных имплантатах кондуита или инъекционных гидрогелевых формах. Кроме того, поскольку графен является эффективным материалом для нейронной коммуникации, его использование в приложениях для инженерии нервной ткани значительно возросло, как задокументировано в литературе25.

Производство композитных биоматериалов и 3D-биопечать
Формирование биогибридного рисунка биочернил на основе желатина-альгината проводили с нетоксичной концентрацией графена (0,1%). Было замечено, что выбранная подходящая доза графена взаимодействует с клетками в биочернилах.

Покадровая визуализация
Образцы GFP устанавливали при температуре 37 °C в течение примерно 16 часов в интервальной съемке, а также делали фотографии и видео (видео 1). Сигналы GFP терялись при наблюдении за гибелью клеток. Здесь было обнаружено, что клетки, выжившие в среде 3D-графена, сохраняли свою жизнеспособность, поскольку яркость GFP наблюдалась до конца инкубации.

Видео 1. Покадровое видео WJ-MSC с маркировкой GFP. Наблюдается взаимодействие меченых стволовых клеток друг с другом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Характеристика биогибридного гидрогеля Graphene-Bioink
SEM и FT/IR использовались для характеристики групп 3D-B и 3D-G, созданных методом капельных биочернил. СЭМ-изображения групп биочернил 3D-B и 3D-G приведены на рисунке 4. Из 40 изображений, сделанных на шаге 4.2.5., здесь показаны 4 репрезентативных изображения.

Figure 4
Рисунок 4: СЭМ-изображения групп биочернил 3D-B и 3D-G. (A) Изображение покрытого золотом участка биочернил 3D-B с электронной микроскопией. Масштабная линейка: 200 мкм. (B) Изображение MSC, прикрепленное к внутренней поверхности биочернил 3D-B. Масштабная линейка: 5 мкм (C) Изображение внутренней и внешней поверхности биочернил 3D-G. Масштабная линейка: 200 мкм.(D) Изображение адгезии биочернил 3D-G ячейки внутренней поверхности. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Соответственно, взаимодействия биочернил и клеток были продемонстрированы как на поверхности, так и внутри. В обеих биочернилах (3D-B; 3D-G) наблюдалось взаимодействие между клеткой и биоматериалом. Клетки были морфологически круглыми и прикреплялись к материалу. Анализ FT/IR капли биочернил 3D-B и 3D-G сравнивался с графиком на рисунке 5.

Figure 5
Рисунок 5: FT/IR анализ. (A) Биочернила 3D-B. (B) Биочернила 3D-G. Пики, такие как 1633,41 см-1, 1552,42 см-1 и 1033 см-1, были обнаружены в исследованиях гидрогеля на основе альгината и желатина в литературе26. Кроме того, пик 1335,46 см-1 аналогичен пикам, наблюдаемым в исследованиях графенового биоматериала27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Поскольку контрольные биочернила (3D-B) были основаны на альгинате/желатине, наиболее заметные пики составляли около 1633,41 см-1, 1552,42 см-1 и 1033 см-1 по сравнению с аналогичными исследованиями в литературе с пиками, наблюдаемыми при 1546 см-1 26. Пик 1399 см-1 наблюдался в группе графена (3D-G), а аналогичный пик был обнаружен в 1335,46 см-1 в исследовании, проведенном с графеном27. 

3D-дифференцировка нейронов
Изображения сфероидов на биочернилах после 7-го дня после дифференциации представлены на рисунке 6.

Figure 6
Рисунок 6: 2D-изображение контрольных образцов WJ-MSC и сфероидной группы на 7-й день после дифференциации . (A) Размер сферы из биочернил группы 3D-BS диаметром 160 мкм и 200 мкм. (B) 2D контрольные ячейки. Сфероиды из (C) группы 3D-BS и (D) группы 3D-GS. Черные материалы в (D) представляют собой молекулы графена, интегрированные со сфероидами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Было замечено, что клетки сохраняют свою жизнеспособность как в 2D, так и в 3D культурах. Считалось, что границы сфероидных клеток в обеих группах (3D-B и 3D-G) были прозрачными и живыми, а сфероиды в графеновой группе были относительно больше и улавливали графен внутри клетки. Дифференциацию также проверяли с помощью иммуноокрашивания. С помощью двойного окрашивания, используемого здесь, активность клеток в 2D-трансформации нейронов сравнивалась с 3D-культурой (рис. 7).

Figure 7
Рисунок 7: Иммуноокрашивание 2D и 3D клеток. (А,Б) Иммуноокрашивание культивируемых сфероидов на биочернилах 3D-BS. (C,D) 3D-GS биочернильные сфероидные иммунокрасители. (E) Дифференцированные 2D положительные контрольные WJ-MSC. (F) Недифференцированные 2D отрицательные контрольные WJ-MSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Иммунофлуоресцентные изображения клеток, культивируемых в течение 7 дней, показаны на рисунке 7. Образцы окрашивали антителами, специфичными к N-кадгерину (зеленый) и β-III тубулину (красный). Кроме того, DAPI использовался для визуализации ядра (синего или фиолетового). Соответственно, N-кадгерины (зеленые), используемые в 2D и 3D образцах, различались в течение 7 дней, поскольку они играют важную роль в сигнальных механизмах и развитии нейронов. Зеленое изображение на рисунке 7A-E представляет собой нейроноподобные структуры (рис. 7). β-тубулин класса III является одним из семи изотипов, известных как нейронные маркеры в геноме человека. Было обнаружено, что экспрессия N-кадгерина была выше в образцах, которые были дифференцированы в течение 7 дней, по сравнению с β-III тубулином. По результатам настоящего эксперимента было установлено, что 3D-системы создали более подходящее микроокружение для выживания и дифференцировки клеток. 2D-положительный контрольный образец (рис. 7E) экспрессировал меньше маркеров нейроноподобной структуры по сравнению с 3D-образцами (рис. 7A-D). Это показывает нам, что микросреда, созданная с помощью 3D-структуры, более эффективна в дифференцировке стволовых клеток. Кроме того, вместо одной клеточной терапии; Комбинированное лечение биоматериалом и клетками, по-видимому, более влиятельно и эффективно при повреждении нервов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Преимущества лечения, применяемого с помощью инженерных 3D-каркасов, по сравнению с традиционными 2D-методами становятся все более заметными с каждым днем. Стволовые клетки, используемые отдельно в этих методах лечения или вместе со скаффолдами, полученными из различных биоматериалов с низкой биосовместимостью и биоразлагаемостью, обычно недостаточны для регенерации периферических нервов. Желейные мезенхимальные стволовые клетки Уортона (WJ-MSCs), по-видимому, являются подходящей клеточной линией-кандидатом, особенно с учетом оптимизации протоколов приобретения, их способности к пролиферации и способности к дифференцировке29. В этом исследовании мы изучили взаимодействие стволовых клеток с графеном как в 2D, так и в 3D культурах. Мы также сравнили нейрогенную дифференцировку в сгенерированных биогибридных гидрогелевых группах с 2D-средой. Мы продемонстрировали формирование нейросферы на биочернилах методом иммуноокрашивания. В дальнейших исследованиях мы охарактеризовали наш прототип-кандидат, который может быть введен или имплантирован в виде нейронного канала методами SEM и FT/IR. Данное исследование характеризует свойства продуцируемого биоматериала, взаимодействие клетки с биоматериалом и нейронную дифференцировку стволовых клеток в присутствии биоматериала. На следующих этапах будет изучено влияние на миграцию.

Биогибридные материалы, образованные путем объединения двух или более биосовместимых материалов, становятся более выгодными с точки зрения их структурных свойств по сравнению с гомогенными материалами30. В предыдущем исследовании была выполнена имплантация канала нейротрубки на основе полигликолевой кислоты в лицевой периферический нерв. Меченые обонятельные стволовые клетки были вставлены в этот канал, что привело к успешной регенерации периферической хирургии и инъекционной терапии стволовыми клетками16. В другом исследовании эффективность 3D-структуры, полученной из нескольких клеточных сфероидов, разработанных с использованием нормальных дермальных фибробластов человека и кремниевого нервного канала, который часто используется в литературе из-за его инертной особенности, сравнивалась при регенерации повреждения седалищного нерва. Было показано, что 3D-структура на основе сфероидов значительно и быстрее увеличивает регенерацию тканей на животных моделях с повреждением седалищного нерва по сравнению с гомогенными материалами20. Однако известно, что биоматериалы на основе кремния, которые часто используются в литературе, имеют некоторые важные недостатки, такие как высокий риск заражения и низкая биосовместимость15,30.

В настоящем исследовании получение биосовместимой, биоразлагаемой гидрогелевой биогибридной композитной ткани с графеновыми нанопластинками, которые, как известно, эффективны в нервной проводимости, осуществлялось методом 3D-печати. Существуют различные исследования, в которых графен использовался в качестве биоматериала для нервной проводимости25,30. Кроме того, графен является одним из самых тонких и легких материалов, что повышает его предпочтение в технологиях здравоохранения13. Одним из наиболее желательных свойств биоматериалов является биоразлагаемость. Экспериментальные технологии и технологии молекулярного моделирования были применены для исследования биодеградации графена и его производных13. На этом этапе модификация-функционализация поверхности или производство в виде композитных биоматериалов может улучшить или ингибировать биодеградацию, в значительной степени в зависимости от свойств добавок.

Различные ферменты, такие как марганцевая пероксидаза (MnP), пероксидаза хрена (HRP) и миелопероксидаза (MPO), доступны в литературе для биодеградации производных графена. Фермент MPO, представляющий собой пероксидазу, высвобождаемую из нейтрофилов, которые попадают в область инородных тел и выполняют фагоцитоз, связан с биодеградацией графена, особенно в легкихчеловека 13. Уровни биоразлагаемости композитных биоматериалов, содержащих графен, а не только графеновые нанотрубки, отличаются друг от друга. Этого нужного свойства легче добиться в композитных материалах. Кроме того, определению токсической дозы графена способствует использование клинически применимых биоматериалов13.

Важной частью графенового этапа протокола является стерилизация графена, когда он будет использоваться. Риск заражения, который может возникнуть во время фазы взаимодействия биогибрида с клетками, избегается.

Исследовано влияние полученного биогибридного графен-биочернильного гидрогелевого паттерна на дифференцировку нервов, и было совместимо с литературой, что дифференцировка была выше в 3D-системе. Потребность в производстве биоматериалов с тканеинженерными клеточными терапевтическими подходами, которые могут быть разработаны против различных нейродегенеративных заболеваний, таких как повреждение периферических нервов, растет с неадекватностью современных методов лечения день ото дня, что подчеркивает важность этого исследования.

В предыдущем исследовании было исследовано взаимодействие графена с клетками в 2D-среде для культивирования клеток28. Благодаря опыту, полученному оттуда, здесь графен был добавлен к альгинатно-желатиновым биочернилам с известным соотношением, и методом 3D-печати был изготовлен новый уникальный прототип биоматериала. Этот новый материал был использован для изучения клеточного взаимодействия двумя различными способами. Во-первых, это совместная печать клеточно-композитного биоматериала на 3D-принтере. Второй – образование клеточного сфероида из биоматериала. Кроме того, также наблюдалось взаимодействие WJ-МСК, содержащих меченый ген GFP, с материалом.

В этом исследовании биогибридные биочернила были охарактеризованы выбором методов FTIR и SEM. Это позволяет исследовать образцы шариков, сформированных капельным методом, на этапе определения характеристик. Тем более, что мы можем исследовать твердую и сухую структуру на этапе золочения SEM, SEM обеспечивает физическую пригодность для получения лучших тонких срезов с помощью скальпеля из шариков биочернил, которые мы создали с помощью этого метода.

В этом исследовании клетки были добавлены к биогибридному материалу двумя различными способами во время экспериментов: внутри для 3D-биопечати или во время формирования сфероида. Покрытие клеток биочернилами и использование 3D-биопринтеров позволяют исследователям создавать любую желаемую 3D-форму для регенерации нервов. С другой стороны, это вызывает большую нагрузку на клетки из-за давления печати и, следовательно, потери жизнеспособности клеток. Тем не менее, это может быть более желательным методом увеличения самонаведения клеток, когда они вводятся или пересаживаются в определенную область, чтобы вызвать регенерацию.

Создание сфероидов на биочернилах создает более пригодную для использования форму искусственной ткани с точки зрения взаимодействия клеток и обеспечивает лучшую нишу для дифференцировки клеток. Он также подходит для имитации естественного микроокружения и, следовательно, для исследования клеточных механизмов. Низкая адгезия сфероидов к биочернилам также обеспечивает более легкое отделение от биочернил и универсальность применения.

Используемые N-кадгерины (показаны зеленым цветом на рисунке 7) являются частью клеточных сигнальных механизмов и играют важную роль в развитии нейронов32. β-тубулин класса III является одним из семи изотипов, известных как нейронные маркеры в геноме человека. Это показывает, что WJ-MSCs, используемые в этом исследовании, начинают формировать нейроноподобные структуры. В этом контексте 3D-системы создадут более адекватное микроокружение для клеток, чтобы поддерживать их жизнеспособность.

Наконец, из-за связанных с этим затрат и клинической применимости систем дифференцировки клеток, в нейроинженерии очень важно в будущем разработать системы с контролируемым высвобождением каркасов, клеток и биосигналов дифференцировки33 и адаптировать их к клиникам в качестве комбинированных методов лечения. Таким образом, методы сфероидной и биопечати также могут быть использованы в дальнейших исследованиях, где графен и другие биосигналы встраиваются в гидрогели и высвобождаются контролируемым образом. Исследования in vitro являются важным шагом на пути к in vivo. Когда материал, представленный здесь в качестве прототипа, производится в соответствии со стандартами надлежащей лабораторной практики, могут быть достигнуты стандарты стерилизации, необходимые для передачи в клинику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Проект выполнен в сотрудничестве с HD Bioink, разработчиком технологии 3D-биопечати.

Acknowledgments

Графен, используемый в этом исследовании, был разработан в Университете Киркларели, на факультете машиностроения. Он был подарен доктором Карабейоглу. Испытание на токсичность графена финансировалось в рамках проекта под названием «Печать и дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток на 3D-биопринтерах с помощью биочернил, легированных графеном» (No заявки: 1139B411802273), завершенного в рамках программы поддержки дипломных работ TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented для студентов. Другая часть исследования была поддержана исследовательским фондом, предоставленным научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713). Мезенхимальные стволовые клетки с GFP, используемые на этапе покадровой визуализации, были безвозмездно предоставлены компанией Virostem Biotechnology. Авторы благодарят Darıcı LAB и команду YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB за продуктивные обсуждения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Centrifugal		 Hitachi Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2 HD Bioink Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter Aιsιmo Used for sterilization
0.45 µm syringe filter Aιsιmo Used for sterilization
1.5mL conic tube Eppendorfa Used for bioink drop
15mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used for cell culture
3D Bioprinting Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) Bioprinting Step
50 mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) Merck Millipore Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit Santa Cruz Biotechnology J1514 Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat Santa Cruz Biotechnology C3109 Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600 Leica for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave NUVE-OT 90L Used for the sterilization process.
Autoclave NUVE-OT 90L Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine Hera Safe KS Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 Sigma RNBJ7249 Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM Quanta FEG 450 for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS Capricorn FBS-16A It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C Panasonic MDF-U5386S-PE We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder HD Bioink Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs Virostem Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) Grafen Chemical Industries Co. Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) Cell Signalling and Santa Cruz Used for dye
JASCO 6600 Tetra for FTIR
MTT Assay Sigma Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution Capricorn PB-S It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide Isolab Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System Zeiss Axio.Observer.Z1 Imaging
Tripsin-EDTA Multicell The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks Biobase For produced bioink step
WJ-MSCs ATCC Used for the cell culture process

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
  3. Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
  4. Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
  5. Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
  6. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
  7. Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
  8. Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
  9. Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
  10. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
  11. Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
  12. Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
  13. Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
  14. Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
  15. Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
  16. Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
  17. Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
  18. Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
  19. Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
  20. Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
  21. Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
  22. Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
  23. Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
  24. Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
  25. Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
  26. Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
  27. Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
  28. Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
  29. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
  30. Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
  31. Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
  32. Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
  33. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).

Tags

Опровержение выпуск 183
Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zorba Yildiz, A. P., Darici, H.,… More

Zorba Yildiz, A. P., Darici, H., Yavuz, B., Abamor, E. S., Ozdemir, C., Yasin, M. E., Bagirova, M., Allahverdiyev, A., Karaoz, E. Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering. J. Vis. Exp. (183), e63622, doi:10.3791/63622 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter