Summary
Bu yazıda, periferik doku mühendisliğinde kullanılmak üzere grafen içeren biyohibrid hidrojel biyomürekkebin hazırlanması gösterilmektedir. Bu 3D biyohibrid materyal kullanılarak, kök hücrelerin nöral farklılaşma protokolü gerçekleştirilir. Bu, benzer biyomateryallerin kliniğe getirilmesinde önemli bir adım olabilir.
Abstract
Periferik nöropatiler aksonal hasarın bir sonucu olarak ve bazen de demiyelinizan hastalıklara bağlı olarak ortaya çıkabilir. Periferik sinir hasarı acil hastaların %1,5-5'inde görülen ve önemli iş kayıplarına yol açabilen küresel bir sorundur. Günümüzde iskeleler, uygun hücre hatları ve biyosinyallerden oluşan doku mühendisliği temelli yaklaşımlar, üç boyutlu (3D) biyobaskı teknolojilerinin gelişmesiyle daha uygulanabilir hale gelmiştir. Çeşitli hidrojel biyomateryallerinin kök hücreler, eksozomlar veya biyo-sinyal molekülleri ile kombinasyonu, periferik sinir rejenerasyonundaki mevcut sorunların üstesinden gelmek için sıklıkla çalışılmaktadır. Bu doğrultuda periferik nöro-mühendislikte hidrojeller gibi enjekte edilebilir sistemlerin veya çeşitli biyobaskı yöntemleriyle oluşturulan implante edilebilir kanal yapılarının üretimi önem kazanmıştır. Normal şartlar altında, kök hücreler vücudun rejeneratif hücreleridir ve popülasyonlarını korumak için sayıları ve işlevleri zamanla azalmaz; Bunlar uzmanlaşmış hücreler değildir, ancak yaralanmaya yanıt olarak uygun stimülasyon üzerine farklılaşabilirler. Kök hücre sistemi, kök hücre nişi olarak adlandırılan mikro çevresinin etkisi altındadır. Periferik sinir yaralanmalarında, özellikle nevrozezde, bu mikro çevre, kopmuş sinir uçlarını cerrahi olarak birbirine bağladıktan sonra bile tam olarak kurtarılamaz. Kompozit biyomalzemeler ve kombine hücresel tedaviler yaklaşımı, biyobozunurluk, biyouyumluluk ve işlenebilirlik gibi çeşitli özellikler açısından malzemelerin işlevselliğini ve uygulanabilirliğini arttırır. Bu doğrultuda bu çalışma, grafen bazlı biyohibrid hidrojel modellemesinin hazırlanması ve kullanımını göstermeyi ve kök hücrelerin sinir rejenerasyonunda etkili bir çözüm olabilecek sinir hücrelerine farklılaşma etkinliğini incelemeyi amaçlamaktadır.
Introduction
Organizmanın iç yapısını ve çevreyi birbirine bağlayan mekanizma olan sinir sistemi iki kısma ayrılır: merkezi ve periferik sinir sistemleri. Periferik sinir hasarı, acil servise başvuran hastaların %1,5-5'ini oluşturan ve çeşitli travmalara bağlı olarak gelişen, önemli iş kayıplarına yol açan küresel bir sorundur1,2,3.
Günümüzde periferik nöro-mühendisliğe hücresel yaklaşımlar büyük ilgi görmektedir. Bu yaklaşımlarda kullanılan hücreler arasında kök hücreler ilk sırada gelmektedir. Normal şartlar altında, kök hücreler vücudun rejeneratif hücreleridir ve popülasyonlarını korumak için sayıları ve işlevleri zamanla azalmaz; Bu hücreler uzmanlaşmıştır, ancak yaralanmaya yanıt olarak uygun stimülasyon ile farklılaşabilirler 4,5. Kök hücre hipotezine göre, kök hücre sistemi, kök hücre nişi olarak adlandırılan mikro çevresinin etkisi altındadır. Kök hücrelerin korunması ve farklılaşması, hücreler ve iskeleler kullanılarak doku mühendisliği yoluyla yeniden oluşturulabilen mikro çevrelerinin varlığı olmadan imkansızdır6 7. Doku mühendisliği hem mühendislik hem de biyoloji ilkelerini içeren multidisipliner bir alandır. Doku mühendisliği, canlı dokuların yerini alabilecek ve hasarlı dokuların çıkarılması ve fonksiyonel dokuların sağlanması yoluyla bu dokuların yenilenmesinde kullanılabilecek yapay dokuların oluşturulması için araçlar sağlar8. Doku mühendisliğinin üç temel taşından biri olan doku iskeleleri, doğal ve sentetik malzemelerden farklı yöntemler kullanılarak üretilmektedir9. Üç boyutlu (3D) baskı, çeşitli yöntemler kullanarak karmaşık şekillerin basit ama çok yönlü üretimi yoluyla kusurlu dokuları değiştirmek veya restore etmek için yaygın olarak kullanılan, gelişmekte olan bir katmanlı üretim teknolojisidir. Biyobaskı, biyomürekkepler10 olarak adlandırılan hücrelerin ve biyomalzemelerin bir arada bulunmasını sağlayan katkısal bir üretim yöntemidir. Sinir hücrelerinin birbirleriyle etkileşimi göz önüne alındığında, çalışmalar grafen gibi iletken biyomateryal adaylarına kaymıştır. Esnek elektronik, süper kapasitörler, piller, optikler, elektrokimyasal sensörler ve enerji depolama gibi özelliklere sahip olan grafen nanoplakalar, doku mühendisliği alanında tercih edilen bir biyomalzemedir11. Grafen, hasarlı doku ve organların çoğalması ve yenilenmesinin yapıldığı çalışmalarda kullanılmıştır12,13.
Doku mühendisliği üç temel yapı taşından oluşur: iskele, hücreler ve biyosinyal molekülleri. Periferik sinir hasarı ile ilgili çalışmalarda bu üç yapının tam olarak sağlanması açısından eksiklikler bulunmaktadır. Çalışmalarda üretilen ve kullanılan biyomateryallerde sadece kök hücre veya biyosinyal molekülleri içermeleri, kök hücre farklılaşmasını sağlayacak biyoaktif molekülün olmaması, kullanılan biyomateryalin biyouyumluluğunun olmaması, doku nişindeki hücrelerin çoğalması üzerindeki etkisinin düşük olması gibi çeşitli sorunlarla karşılaşıldığı, ve böylece sinir iletiminin tam olarak gerçekleşmemesi 2,13,14,15,16. Bu, sinir rejenerasyonunun optimizasyonunu, kas atrofisinin 17,18'in azaltılmasını ve bu tür sorunlara karşı büyüme faktörleri ile gerekli homing 19'un oluşturulmasını gerektirir. Bu noktada, kliniğe aktarılacak bir cerrahi biyomateryal prototipinin nöroaktivitesinin karakterizasyonu ve analizi çok önemlidir.
Buna göre, bu yöntem çalışması, bir 3D biyoyazıcı tarafından oluşturulan grafen nanoplakaları ile biyomürekkep hidrojel desenlemesini ve içerdiği kök hücrelerin nörojenik farklılaşması üzerindeki etkinliğini araştırmaktadır. Ayrıca, grafenin nörosfer oluşumu ve farklılaşması üzerindeki etkileri araştırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesi
- Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerini (WJ-MSC'ler, ATCC'den) -80 ° C'lik bir dondurucudan çıkarın. DMEM-F12 ortamındaki kültür WJ-MSC'leri, Yurie ve ark.20'de tanımlandığı gibi, oda sıcaklığında steril bir laminer akışta% 10 fetal buzağı serumu (FBS),% 1 Pen-Strep ve% 1 L-glutamin içerir.
- Bazı hücreleri 1 x 106 hücre / mL'de% 35 FBS,% 55 DMEMF-12 ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren dondurma ortamı ile kriyoproteksiyona uğratın. Bunun için, bir Thoma hücre sayma slaytında 1 x 106 hücre sayın ve dondurma solüsyonunu damla damla ekleyin. Slaytı hızlı bir şekilde sıvı azot kabına aktarın.
- Kültürlenmiş hücreler şişede% 80 oranında birleştiğinde, ortamı dökün ve 5 mL PBS ile yıkayın. 5 mL% 0.25 tripsin ve 2.21 mM EDTA-4Na ekleyin. Bir inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- İnkübatörden çıkarılan hücrelere% 10 FBS ile 10 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin. İyice askıya alın, ortamı toplayın ve ortamı bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 101 x g dönüş hızında santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri% 10 FBS içeren taze besin ortamı ile yeni şişelerde yeniden tohumlayın.
NOT: Transdüksiyon yöntemiyle GFP geni ile etiketlenmiş ticari WJ-MSC'ler, üretilecek biyomateryal-hücre etkileşimlerini daha iyi görselleştirmek için kullanılabilir21. Bu yöntemde kullanılacak gruplar Tablo 1'de gösterildiği gibi oluşturulabilir.
| Oluşturulan Gruplar | Oluşturma nedenleri | Tekrar sayısı | ||
| 2B WJ-MSC'ler (2D-C) | 2D Kontrol | x 5 | ||
| 2D WJ-MSC'ler ve Grafen (2D-G) | 2D'de grafen toksik doz tayini | Farklı konsantrasyonların her birine x 5 tekrar | ||
| WJ-MSC'ler biyomürekkeplere dahildir (3D-B) | 3D Kontrol | x 3 | ||
| WJ-MSC'ler ve% 0.1 Grafen, biyomürekkeplere (3D-G) dahil edilmiştir | 3D Grafen-Bioink Biyohibrid Grubu | x 3 | ||
| WJ-MSC'ler biyomürekkepler üzerinde küresel formdadır (3D-BS) | Küresel Formun 3D Kontrolü | x 3 | ||
| WJ-MSC'ler ve% 0.1 Grafen, biyomürekkepler üzerinde küresel formdadır (3D-GS grubu) | 3D Grafen-Bioink Biyohibrid Sferoid Form Grubu | 3 kat | ||
| 3D Bioink damlası | SEM ve FTIR karakterizasyon analizleri için üretilmiştir. | 5 kat | ||
| 3D Grafen damlası | SEM ve FTIR karakterizasyon analizleri için üretilmiştir. | 5 kat | ||
| GFP etiketli WJ-MSC'li 3D Bioink ve% 0.1 | WJ-MsC'lerin uygun grafen dozunu içeren biyomürekkep içindeki hareketlerinin gözlemlenmesi. | 3 kat | ||
Tablo 1. Yöntemdeki gruplar. Yöntemdeki tüm 2B ve 3B gruplar dahil edilir.
2. Grafen toksisitesi ve 2D görüntüleme
- Grafen konsantrasyonlarının hazırlanması ve hücrelere uygulanması
NOT: Ham grafen nanopartikülleri ticari olarak satın alındı (endüstriyel grafen nanoplakaları tipi) ve ayrıca bağışlandı. Parçacıkların boyutları 5-8 nm kalınlıkta, 5 μm çapında ve yüzey alanında 120-150 m2/g idi.- %1'lik bir çözelti (mg/mL) oluşturmak için grafeni tartın. Tartılmış 100 μg grafen nanopartiküllerine% 10 FBS ile 10 mL DMEMF-12 ortamı ekleyerek bir stok çözeltisi yapın ve bu çözeltiyi stok çözeltisi olarak etiketleyin. 121 °C'de 1,5 atm basınç altında 20 dakika boyunca otoklavda sterilize edin.
NOT: Steril grafen karışımı buzdolabında 4 °C'de kullanıma kadar saklanır. Uzun süreli kullanım için uygun olmayabilir (en fazla 1 ay). Bu durumlarda, karışım yeniden oluşturulmalı ve sterilize edilmelidir. - Toksik olmayan dozları belirlemek için farklı konsantrasyonlarda bir orta grafen karışımı hazırlayın. İlk seyreltmeleri %1, %0,1, %0,01, %0,001 ve %0,0001 grafen/ortam olarak ayarlayın.
- % 1 stok çözeltisinden başlayarak, her konsantrasyondan art arda 1 mL alın ve yeni bir tüpe aktarın. Her tüpe% 10 FBS ile 9 mL DMEMF-12 ortamı ekleyin, kademeli olarak seyreltilmiş beş numune yapın ve eşit dağılım elde etmek için çözeltileri sallayın ve vorteks edin. Kontrol olarak %10 FBS ile sadece 10 mL DMEMF-12 ortamı kullanın.
NOT: Grafenin ağır pulları çökelir ve bu nedenle yeniden dağıtılması gerekir. - WJ-MSC'leri, kuyu başına 5 x 105 hücrede% 10 FBS içeren 2 mL taze ortam içeren 6 delikli plakalara tohumlayın. 37 ° C'de 1 gün boyunca inkübe edin. Ardından, plakaları eşit ve tekrarlanan kuyucuk gruplarına bölün. Her konsantrasyon için beş tekrar yapın.
- Ortamı atın ve ardından ortamı, kuyucuk başına 2 mL'de grafen ortam konsantrasyonlarıyla değiştirin. Kontrol grubu için yalnızca ortamı kullanın. Plakaları 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- %1'lik bir çözelti (mg/mL) oluşturmak için grafeni tartın. Tartılmış 100 μg grafen nanopartiküllerine% 10 FBS ile 10 mL DMEMF-12 ortamı ekleyerek bir stok çözeltisi yapın ve bu çözeltiyi stok çözeltisi olarak etiketleyin. 121 °C'de 1,5 atm basınç altında 20 dakika boyunca otoklavda sterilize edin.
- MTT ile toksik olmayan grafen konsantrasyonlarının belirlenmesi
- 24 saat sonra grafen içeren ortamları atın. Her bir kuyucuğu PBS ile yıkayın. Kuyu başına 10 mL'de% 10 FBS ile taze DMEMF-12 ortamı ekleyin.
NOT: Grafen konsantrasyonlarının hücre üzerine uygulanmasından sonra PBS ile yıkanması önemlidir, çünkü endositoz tarafından hücreye alınmayan grafen nanopartikülleri ortamdan uzaklaştırılır. Bu, MTT testini daha verimli hale getirir. - Kose ve ark.22'de ve 2.2.3.-2.2.6 adımlarında açıklandığı gibi,% 50 hücre canlılığını gösteren IC50 değerini belirlemek için MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil-tetrazolyum bromür) protokolünü kullanın.
- İlk olarak, 5 mg / mL MTT tuzunu tartın ve PBS'de çözün. 0,45 μm filtre kullanarak sterilize edin. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde yapılan MTT çözeltisini alüminyum folyo ile sarın ve 4 ° C'de saklayın.
- Tüm kuyucuklara 10 μL MTT ekleyin ve plakayı 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra mikroskop altında 10x büyütmede formazan kristallerinin oluşumunu gözlemleyin.
- Hücrelerde oluşan kristalleri çözmek için, her bir oyuğa 100 μL DMSO ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika saklayın. Plakayı ELISA plaka okuyucuya takın. Absorbans ölçümü için programdan 570 nm'lik bir dalga boyu ayarlayın veplaka 22'yi okumasını sağlayın.
NOT: Ek olarak, grafen parçacıkları tek başına 270 nm23'te okunurken, buradaki 570 nm24 okuma aralığı yalnızca hücre canlılığını okumak için olacaktır. - İstatistiksel analiz programında Tukey'in testi ile tek yönlü ANOVA kullanarak elde edilen sonuçlar üzerinde istatistiksel analiz yapmak.
- 24 saat sonra grafen içeren ortamları atın. Her bir kuyucuğu PBS ile yıkayın. Kuyu başına 10 mL'de% 10 FBS ile taze DMEMF-12 ortamı ekleyin.
- Dikiş görüntüleme
- Farklı grafen konsantrasyonlarının hücrelerle etkileşimini incelemek için, dikiş görüntüleme adı verilen yöntemle hücrelerin hızlandırılmış bir çalışmasını gerçekleştirin. Bu yöntem, mikroskop altında düzenli aralıklarla alınan görüntü örneklerini kullanarak hızlandırılmış bir görüntü oluşturur.
- Bunu yapmak için önce bilgisayarı açın. Hızlandırılmış görüntüleme inkübatörünü açın ve 37 °C'ye ayarlayın. MTT plakasını hızlandırılmış inkübatör yuvasına yerleştirin.
- Bilgisayarda Stitch programını açın. Sistemde okunacak kuyucukları belirtin. Okuyucuyu ilk kuyucuğa getirin ve alanı beyaz ışıkta 10x büyütmede bulun ve odaklayın. Programı başlatın.
NOT: Yüksek kaliteli 4 satır x 5 sütun çoklu fotoğraf kolajları oluşturmak için bir programdır. Program, birbiri ardına çekilen fotoğrafları HD kalitesinde birleştirir. Sistem başlat düğmesine bastığınızda, kuyular otomatik olarak okunur ve 4 satır x 5 sütun birden fazla fotoğraf çeker ve diker.
3. Grafen - Bioink biyohibrid hidrojel üretimi ve WJ-MSC'lerin farklılaşması
- Biyomürekkep üretimi
NOT: Liyofilize ticari olarak temin edilebilen Aljinat-Jelatin (3:5) tozları, biyomürekkeplerin temeli olarak kullanılır. Grafen biyomürekkep grubu (3D-G; 3D-GS) ve grafen içermeyen kontrol biyomürekkep grubu (3D-B; 3D-BS) aynı yöntemle hazırlanır (Tablo 1).- Hazırlık için 50 mL konik tüpler kullanın. İlk olarak, 4.5 mg aljinat ve 1.5 mg jelatin tartın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Karışıma% 10 FBS içeren DMEMF-12 ortamını toplam 50 mL hacme ekleyin. Bu, grafen içermeyen kontrol (C) grubudur.
- 4.5 mg aljinat ve 1.5 mg jelatin tartımını tekrarlayın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, adım 2.1.3'ten hazırlanan% 0.1 grafenden 50 μL alın. ve tüpe ekleyin. DMEMF-12'yi %10 FBS ile toplam 50 mL hacme ekleyin.
- Biyomürekkepleri önce pipetleme ve ardından vorteks ile karıştırın. 121 °C'de 1,5 atm basınç altında 20 dakika boyunca otoklavda sterilize edin. Alternatif olarak, kaynama noktasına kadar mikrodalga fırınlayarak sterilizasyon gerçekleştirin.
- Karışımlar otoklavlandıktan sonra, oluşan kabarcıkları gidermek için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj. Hücreler hazırlanana kadar biyomürekkepleri 37 ° C'de tutun.
- WJ-MSC'lerin ve 3D biyobaskının eklenmesi
- Sayım için, yaklaşık 5 mL PBS ile% 80 birleşme olduğunda hücreleri yıkayın ve 5 mL% 0.25 tripsin ve 2.21 mM EDTA 4Na ekleyin. 37 °C'de 5 dakika bekletin.
- İnkübatörden çıkarıldıktan sonra hücrelere% 10 FBS ile 10 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin. İyice askıya alın, ortamı toplayın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklıklarında 5 dakika boyunca 101 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı atın.
- Pelet ile yaklaşık 250 μL orta bırakın. Peletleri 1 mL taze ortamda tekrar çözün. 48 μL ortama, 4 saymak için konik bir tüpe (1,5 mL) 2 μL hücre süspansiyonu ve 50 μL tripan mavisi (0,4 g tripan mavisi / 100 mL) ekleyin. İyi pipet yapın.
- Hazırlanan boyalı hücre süspansiyonunun yaklaşık 10 mL'sini bir Thoma hücre sayım odasına ekleyin. Işık mikroskobunun her iki tarafındaki karelere düşen ortalama hücre sayısını hesaplayın.
Canlılık yüzdesini hesaplayın (%) = (sayılan canlı hücreler/sayılan toplam hücre) x 100
NOT: Hücre-biyomürekkep etkileşimi iki şekilde incelenir: (1) Biyomürekkeplere eklenerek basılabilir (3D-B; 3D-G); (2) Hücreler preslendikten sonra biyomürekkepler üzerine ekilir ve hücreler bir küre oluşturur (3D-BS; 3D-GS). - Hücre-biyomürekkep etkileşimi için, önce biyomürekkep gruplarını oluşturun (Tablo 1). Grup 1, biyobaskı için biyomürekkeple basılmış 3D-B ve 3D-G'yi içerir. Grup 2, biyobaskıdan sonra sferoidlerin oluştuğu 3D-BS ve 3D-GS biyomürekkeplerini içerir.
- Grup 1 için hücreleri sayın, böylece 0,5 mL ortamda yaklaşık 1 x 107 hücre olur. Toplam hacmi 5 mL'ye çıkarmak için 4,5 mL biyomürekkep ekleyin. Bunu şırıngalar yardımıyla steril kabindeki kartuşlara aktarın. Kartuşları biyoyazıcının ilgili ekstrüder bölümüne takın.
- İkinci grup için, biyomürekkep gruplarının her birinden 5 mL alın ve bunları bir enjektör yardımıyla steril kartuşlara aktarın.
- İki koaksiyel yazıcı kafasına ve pnömatik tahrikli ekstrüzyon teknolojisine sahip biyoyazıcıyı kullanın. Mikro adım başına X/Y/Z çözünürlüğünü 1,25 μm, ekstrüzyon genişliğini 400 μm ve ekstrüzyon yüksekliğini 200 μm olarak ayarlayın. 20 mm x 20 mm x 5 mm ızgara, 3D biyobaskı çalışmaları için en çok kullanılan 3D modellerden biridir.
- Açık kaynaklı, web tabanlı CAD programlarını kullanarak 3B modeller oluşturun. Biyobaskıdan önce, açık kaynaklı platformlardan biriyle (örneğin, dolgu) basit 3B modeller oluşturun. Model doğrusal (burada kullanılan model gibi), petek veya ızgara şeklinde olabilir. 5 mm x 20 mm x 20 mm kare oluşturduktan sonra .stl formatında dışa aktarın ve indirin.
- Bioprinter yazılımı .stl dosyalarını kullanır ve dilimleyici modülleri kullanarak bunları yazdırılabilir .gcode biçimine dönüştürür. Yazdırılabilir bir ızgara şekli elde etmek için, dilimleyici modülündeki dış kabuğu devre dışı bırakın. İşlemden önce cihazı %70 etanol ile silin ve ardından UV sterilizasyonu ile sterilize edin.
- Biyobaskı işlemi için, biyomürekkep gruplarını bir enjektör yardımıyla kartuşlara aktarın. Kartuşları biyoyazıcının ilgili ekstrüder bölümüne takın.
- 3D yazıcının ortalama basıncını 7,5 psi'ye, kartuş ve yatak sıcaklığını ise 37 °C'ye ayarlayın. Hızı% 60'a ayarlayın ve standart bir 3D baskı işlemi gerçekleştirin.
NOT: Hazırlanan modellerin mekanlarla (lineer bir model gibi) planlanması, biyobaskı sonrası mekanlarda hücre kültürünün yapılmasına olanak sağlar. - Yazma aşamasında sistemi ev konumuna getirin. Eksenleri (X, Y, Z) otomatik olarak konumlandırın, ekstrüderi seçin ve ayarlayın. Yazdırma işlemini başlatın. Biyobaskı işleminden sonra, numuneyi alın ve laminer akış dolabının altına yerleştirin.
- Biyomürekkepleri baskıdan sonra 0,1 N CaCl2 çözeltisi ile püskürtün veya oda sıcaklığında bir pipetle 1 mL çözelti ekleyin. Yaklaşık 10-20 saniye bekleyin ve basılı desenleri Ca 2+ ve Mg2+ içeren PBS ile 2 kat yıkayın.
- Hücre içeren biyomürekkep gruplarının her birinin üzerine% 10 FBS ortamı ile 2 mL DMEMF-12 ekleyin. Plakaları 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin. Daha sonra, sferoid oluşum için her gruba 1 x 106 hücre içeren 2 mL süspansiyon ortamı ekleyin.
- Plakaları 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin. 24 saat inkübasyondan sonra, ters çevrilmiş bir mikroskop altında küresel oluşumu gözlemleyin.
- WJ-MSC'lerin nöron benzeri hücrelere farklılaşması
- 24 saatlik inkübasyondan sonra tüm biyomürekkep partilerini gözlemleyin ve fotoğraflayın. Kuyu başına 2 mL nörojenik farklılaşma ortamı ekleyin (kontrol grubu hariç) ve her 2 günde bir yenileyin. Nöral farklılaşmayı gözlemlemek için 7 gün boyunca takip edin.
4. Grafen-Bioink biyohibrid hidrojel karakterizasyonu
NOT: Grafen-biyomürekkep biyohibrid hidrojelin karakterizasyonu için hızlandırılmış görüntüleme, Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FT/IR) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizleri yapılmaktadır. Numuneler, FT/IR ve SEM analizi için damlama yöntemi ile 3D-B ve 3D-G biyomürekkep gruplarından oluşturulur.
- FT/IR analizi
NOT: FT/IR, malzeme karakterizasyonu için vazgeçilmez olan matematiksel Fourier dönüşümüne dayanan kimyasal bir analitik yöntemdir. Halojen lambalı, su soğutmalı cıva ışık kaynağı, 4 cm−1 sinyal en boy oranına sahip, 2.200 cm−1'de 1 dakika boyunca ölçülen, 28 °C Michelson interferometre prensiplerine dayanan bir FT/IR cihazı kullanın.- FT / IR mikroskobunu hazırlayın ve cihazın optiklerinin hizalandığından emin olun. Cihazı kalibre edin.
- Numune bir damla halinde olduğundan, 1-2 mm kalınlığında bir hidrojel parçası alın ve numune kısmına forseps ile yerleştirin. Numuneye odaklanın ve yakın temas kurulana kadar yükseltin. İşlemi sistemden başlatarak numune spektrumunu toplayın.
- Taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi
NOT: Yüzey morfolojisi, iç yapısı, hücre dağılımı ve biyomürekkep-hücre etkileşimleri farklı boyutlarda SEM analizi ile incelenebilir.- Pipet ucu damlacık yöntemini kullanarak hidrojeli 1 mL CaCl2 çapraz bağlayıcı içeren 6 delikli plakalara bırakın (bkz. Şekil 1).
- Tuz çözeltisini serbest bırakmak için plakaları yaklaşık 1 mL PBS ile 2 kat yıkayın. Daha sonra, bu damlaları forseps yardımıyla 5 mL% 5 paraformaldehit içeren bir şahin tüpüne koyun.
- Bir neşter yardımıyla damla biyomürekkeplerinden ince kesitler yapın. Numuneleri metal plakanın yapışkan tarafına yapıştırın. Havayı argon gazı ile değiştirerek plazma fazına geçen altın paladyumun numuneyi kapladığı kaplama cihazına yerleştirin.
- Elektron mikroskobuna (SEM) koyun. SEM'in bağlı olduğu mikroskop programını açın. Ölçeklendirmeyi gerçekleştirin ve örneğin farklı bölümlerinin görüntülerini çekin. Bu protokol için 5 μm, 10 μm ve 200 μm ölçekler kullanıldı. 3D-B ve 3D-G grupları için toplam 40 görüntü çekildi.
- Hızlandırılmış görüntüleme
NOT: Hızlandırılmış görüntüleme sırasında, sadece GFP gen dönüştürülmüş hücreleri içeren biyomürekkep örnekleri kullanılmadı, aynı zamanda sferoidli biyomürekkepler de 16 saat boyunca görüntülendi. Grafenin kök hücreler üzerindeki etkilerini incelemek ve biyomürekkep içindeki hücre etkileşimlerini izlemek için hızlandırılmış görüntüleme yapılır.- Piyasada satılan 1 x 107 GFP etiketli MSC'leri adım 3.2.11'deki gibi 5 mL biyomürekkep ve biyobaskıya ekleyin. 1 mL çapraz bağlayıcı ekleyin, 20-30 s bekleyin ve PBS ile 2 kat yıkayın.
- Hızlandırılmış monitörü açın ve programı bilgisayarda açın. Hızlandırılmış modda yaklaşık 16 saat ayarlayın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın. Başlat düğmesine basın. 40 s hızlandırılmış video örnekleri şeklindeki videolar sistem tarafından kaydedilir.
- Mikroskobu her 2 saatte bir 10x büyütmeye odaklayın. Ayrıca, aynı adımları izleyerek oluşturulan sferoidleri görselleştirin.
Resim 1: Karakterizasyonda kullanılmak üzere damla olarak üretilen 3D-B ve 3D-G biyomürekkep grupları. (A) Çapraz bağlayıcılı bir plaka üzerindeki biyomürekkep örnekleri (ön karakterizasyon görüntüsü). (B) Biyomürekkebin 3D-B damla görüntüsü. (C) 3D-G bioink damla görüntüsü. Karakterize edilecek biyomateryal ve içerdiği hücreler, altın kaplama, örnekleme vb. işlemlerden daha kolay geçebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
5. İmmün boyama yöntemi ile nörojenik farklılaşmanın belirlenmesi
- Küre formlarını kesintiye uğratmadan sferoidleri toplayın ve doku kesitleme için parafine gömmek yerine, daha kolay bir yöntemle restain etmek için yeni plakalara yeniden tohumlayın.
- 48 delikli plakaları yaklaşık 20 mL önceden otoklavlanmış% 0.1 jelatin çözeltisi ile örtün ve en az 1 saat boyunca bir inkübatörde tutun. Pipet, yaklaşık 500 μL hazırlanmış% 0.1 jelatini 48 delikli plakalara dönüştürür. Jelatinli plakaları inkübatörde 10 dakika bekletin.
NOT: Bu, jelatinin hafifçe şişmesine, yüzeyi kaplamasına ve toplanan sferoidlerin yapışması için daha iyi bir ortam yaratmasına izin verecektir. - Sferoidleri pipetleme yoluyla toplayın, toplanan sferoidleri inkübatörden 48 delikli plakanın kuyucuklarına dağıtın ve taze ortam ekleyin. Ardından, 12-24 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Sferoidleri sayarak dağıtmak oldukça zordur. Sferoidleri tek bir tüpte toplayın ve toplam hacmi kuyucuklara eşit olarak dağıtın. Bu çalışma için, her bir kuyu yaklaşık 4-6 sferoid içeriyordu.
NOT: 2D numuneler için ön leke yıkama yeterlidir ve ortam değişimi gerekmez. - Ortamı çıkarın ve sferoidler en üstte olacağından hücreleri PBS ile yavaşça yıkayın. 2 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
- Numuneleri PBS ile tekrar yıkayın ve 30 dakika boyunca yaklaşık 10 mL% 2 BSA ve% 0.1 TritonX ile bloke edin. Ardından, PBS 3x ile yıkayın.
- Seçilen primer antikorları (N-kadherin-tavşan ve β-III tübülin-fare) antikor seyreltici reaktif çözeltisi ile 1:100 oranında seyreltin. Numunelerin her birine 100 μL antikor çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Numuneleri PBS ile 3 kat yıkayın. β-III tübülin için anti-fare IgG-FTIC-tavşan ve N-Cad için anti-fare IgG-SC2781-keçi ikincil antikoru ile inkübe edin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1:200'e seyreltilir. Tüm işlemleri karanlıkta gerçekleştirin.
NOT: Çift boyamada birincil antikor (örneğin fare) olarak hangi suş kullanılırsa, ikincil antikor için farklı bir suş (örneğin keçi veya tavşan) kullanılmalıdır. - İkincil antikoru PBS 3x ile yıkayın ve ardından DAPI çözeltisini (1:1) numunelerin her birine damlatın. 15-20 dakika bekleyin. İmmünofloresan görüntüleme yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafen toksisitesi ve 2D görüntüleme
Elde edilen MTT sonuçlarının istatistiksel analizi, istatistiksel analiz yazılımında Tukey'in testi ile tek yönlü ANOVA ile yapılmış olup, elde edilen grafik Şekil 2'de gösterilmiştir. Kontrole kıyasla grafen yüzdesi sadece% 0.001 grafen konsantrasyonu için anlamlı bir düşüş gösterdi (**p < 0.01).. Diğer gruplar ile kontrol arasında anlamlı fark saptanmadı (p > 0.05). Bu nedenle, MTT test sonuçlarına ve dikiş görüntülerine göre bu konsantrasyona maruz kaldıktan sonra en yüksek canlılık oranları gözlendiğinden optimum grafen konsantrasyonu% 0.1 olarak belirlenmiştir.
Şekil 2: Grafen konsantrasyonunun hücre proliferasyonu üzerindeki etkisinin araştırılması. Kontrole kıyasla grafen yüzdesi sadece% 0.001 grafen konsantrasyonu için anlamlı bir düşüş göstermiştir (**p < 0.01, n = 6). Diğer gruplar ile kontrol arasında anlamlı fark saptanmadı (p > 0.05; n=6). Elde edilen MTT sonuçlarının istatistiksel analizi, istatistiksel analiz yazılımında Tukey'in testi ile tek yönlü ANOVA ile yapılmıştır. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu rakam28'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Sunulan yöntemin bu kısmı, kök hücre-grafen etkileşiminin gelecekteki çalışmalarda kullanılabileceğini göstermektedir. Test edilen her konsantrasyonda, grafenin 2D sistemde tolere edildiği ve endositoz yoluyla hücreler tarafından alındığı gözlendi (Şekil 3). Grafen plakalarının hücre içindeki sitoplazma boyunca hareket ettiği belirlenmiştir.
Şekil 3: Hücre-grafen etkileşimleri dikişli görüntülerde iki boyutlu olarak gösterilmiştir. (A) Kontrol; (B) %0,0001; (C) %0,001; (D) %0,01; (E) %0,1; ve (F) %1 grafen konsantrasyonları. Birden fazla fotoğraftan oluşan 4 satır x 5 sütunlu bir kolaj elde etmek için hızlandırılmış görüntülemeyi yüksek çözünürlüklü kalite ayarlarıyla birleştirerek elde edilir. Bu rakam 28'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ayrıca bu çalışmada grafen-biyomürekkep etkisinin 3D sistemde herhangi bir toksik mikro ortam yaratmadığı ve hücrelerin etkileşim halinde olduğu gözlenmiştir.
Grafenin 3D sistemlerde kullanılmasının herhangi bir toksik mikro ortam yaratmadığı da gözlemlenmiştir. Hücreler için toksik dozun belirlenmesi, grafenin uzun süreli kanal implantlarında veya enjekte edilebilir hidrojel formlarında kullanılması için çok önemlidir. Ayrıca grafen, nöronal iletişimde etkili bir materyal olduğundan, literatürde belgelendiği üzere sinir dokusu mühendisliği uygulamalarında kullanımı yaygın olarak artmıştır25.
Kompozit biyomalzemelerin üretimi ve 3D biyobaskı
Jelatin-aljinat bazlı biyomürekkep biyohibrid modellemesinin oluşumu, toksik olmayan bir grafen konsantrasyonu (% 0.1) ile gerçekleştirildi. Seçilen uygun grafen dozunun biyomürekkepteki hücrelerle etkileşime girdiği gözlenmiştir.
Hızlandırılmış görüntüleme
GFP örnekleri hızlandırılmış çekimde yaklaşık 16 saat boyunca 37 ° C'ye ayarlandı ve fotoğraflar ve videolar çekildi (Video 1). Hücre ölümü gözlendiğinde GFP sinyalleri kayboldu. Burada, 3D grafen ortamında hayatta kalan hücrelerin, inkübasyonun sonuna kadar GFP parlaklığı gözlendiği için canlılıklarını korudukları tespit edildi.
Video 1. GFP etiketli WJ-MSC'lerin hızlandırılmış videosu. Etiketli kök hücrelerin birbirleriyle etkileşimi gözlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Grafen-Bioink biyohibrid hidrojel karakterizasyonu
Damla biyomürekkep yöntemi ile oluşturulan 3D-B ve 3D-G gruplarının karakterizasyonunda SEM ve FT/IR kullanılmıştır. 3D-B ve 3D-G biyomürekkep gruplarının SEM görüntüleri Şekil 4'te verilmiştir. Adım 4.2.5.'te çekilen 40 görüntüden 4'ü temsili resim burada gösterilmektedir.
Şekil 4: 3D-B ve 3D-G biyomürekkep gruplarının SEM görüntüleri. (A) Elektron mikroskobu ile altın kaplı bir 3D-B biyomürekkep bölümünün görüntüsü. Ölçek çubuğu: 200 μm. (B) 3D-B bioink iç yüzeyine bağlı MSC'nin görüntüsü. Ölçek çubuğu: 5 μm (C) 3D-G bioink iç ve dış yüzeyinin görüntüsü. Ölçek çubuğu: 200 μm.(D) İç yüzey hücresi 3D-G biyomürekkep yapışma görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Buna göre, biyomürekkep-hücre etkileşimleri hem yüzeyde hem de dahili olarak gösterilmiştir. Her iki biyomürekkepte de hücre-biyomateryal etkileşimi vardı (3D-B; 3D-G). Hücreler morfolojik olarak yuvarlaktı ve malzemeye bağlıydı. 3D-B ve 3D-G biyomürekkep düşüşünün FT / IR analizi, Şekil 5'teki grafikle karşılaştırılmıştır.
Şekil 5: FT/IR analizi. (A) 3D-B biyomürekkep. (B) 3D-G biyomürekkep. Literatürdeki aljinat-jelatin bazlı hidrojel çalışmalarında 1633.41 cm−1, 1552.42 cm−1 ve 1033 cm−1 gibi pikler bulunmuştur26. Ayrıca, 1335.46 cm−1 pik grafen biyomateryal çalışmalarında görülen piklere benzer27. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Kontrol biyomürekkebi (3D-B) aljinat / jelatine dayandığından, en belirgin pikler 1633.41 cm−1, 1552.42 cm−1 ve 1033 cm−1 civarındayken, literatürde 1546 cm−126'da görülen piklerle karşılaştırılmıştır. Grafen grubunda (3D-G) 1399 cm−1'lik bir tepe gözlendi ve grafen27 ile yapılan bir çalışmada 1335.46 cm−1'de benzer bir tepe noktası bulundu.
3D nöronal farklılaşma
7. gün sonrası farklılaşmadan sonra biyomürekkepler üzerindeki sferoidlerin görüntüleri Şekil 6'da gösterilmiştir.
Şekil 6: Kontrol WJ-MSC'lerinin ve küresel grup örneklerinin farklılaşma sonrası 7. günde 2D görüntüsü . (A) 160 μm ve 200 μm çaplarında 3D-BS grubu biyomürekkepten kürenin boyutu. (B) 2B kontrol hücreleri. (C) 3D-BS grubundan ve (D) 3D-GS grubundan sferoidler. (D)'deki siyah malzemeler, sferoidlerle entegre grafen molekülleridir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Hücrelerin hem 2D hem de 3D kültürlerde canlılıklarını korudukları görülmüştür. Her iki gruptaki (3D-B ve 3D-G) küresel hücrelerin sınırlarının saydam ve canlı olduğu ve grafen grubundaki sferoidlerin nispeten daha büyük olduğu ve grafeni hücre içinde hapsettiği düşünülmüştür. Farklılaşma ayrıca immün boyama ile test edildi. Burada kullanılan çift boyama ile 2D nöronal transformasyondaki hücrelerin aktiviteleri 3D kültür ile karşılaştırılmıştır (Şekil 7).
Şekil 7: 2D ve 3D hücrelerin immün boyaması. (A,B) 3D-BS biyomürekkepleri üzerinde kültürlenmiş sferoidlerin immünoboyaması. (C,D) 3D-GS biyomürekkep sferoid immünoboyaları. (E) Farklılaştırılmış 2B pozitif kontrol WJ-MSC'ler. (F) Farklılaşmamış 2B negatif kontrol WJ-MSC'ler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7 gün boyunca kültürlenen hücrelerin immünofloresan görüntüleri Şekil 7'de gösterilmiştir. Örnekler N-kadherin (yeşil) ve β-III tübüline (kırmızı) özgü antikorlarla boyandı. Ek olarak, çekirdeğin (mavi veya mor) görselleştirilmesi için DAPI kullanıldı. Buna göre, 2D ve 3D örneklerde kullanılan N-kadherinler (yeşil), sinyal mekanizmalarında ve nöronların gelişiminde önemli bir rol oynadığı için 7 gün boyunca farklılık göstermiştir. Şekil 7A-E'deki yeşil görüntü nöron benzeri yapıları temsil eder (Şekil 7). Sınıf III β-tübülin, insan genomunda nöron belirteçleri olarak bilinen yedi izotipten biridir. N-kadherin ekspresyonu, 7 gün boyunca farklılaşan örneklerde β-III tübüline göre daha yüksek bulundu. Mevcut deneyin sonuçlarına göre, 3D sistemlerin hücrelerin hayatta kalması ve farklılaşması için daha uygun bir mikro ortam yarattığı tespit edilmiştir. 2D pozitif kontrol örneği (Şekil 7E), 3D örneklere kıyasla daha az nöron benzeri yapı belirteci ifade etmiştir (Şekil 7A-D). Bu da bize 3D yapı ile oluşturulan mikro ortamın kök hücrelerin farklılaşmasında daha etkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca tek başına hücre tedavileri yerine; Biyomateryal-hücre kombine tedavileri sinir hasarında daha etkili ve etkili görünmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mühendislik ürünü 3D iskelelerle uygulanan tedavilerin geleneksel 2D yöntemlere göre avantajları her geçen gün daha belirgin hale gelmektedir. Bu tedavilerde tek başına veya biyouyumluluğu düşük, biyolojik olarak parçalanabilirliği düşük çeşitli biyomalzemelerden üretilen iskelelerle birlikte kullanılan kök hücreler periferik sinir rejenerasyonunda genellikle yetersiz kalmaktadır. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücreleri (WJ-MSC'ler), özellikle edinim protokollerinin optimizasyonu, çoğalma yetenekleri ve farklılaşma kapasiteleri göz önüne alındığında uygun bir aday hücre hattı gibi görünmektedir29. Bu çalışmada, kök hücrelerin hem 2D hem de 3D kültürlerde grafen ile etkileşimini inceledik. Ayrıca, üretilen biyohibrid hidrojel gruplarındaki nörojenik farklılaşmayı 2D ortamı ile karşılaştırdık. Biyomürekkepler üzerindeki nörosfer oluşumunu immün boyama ile gösterdik. Daha ileri çalışmalarda, sinir kanalı olarak enjekte edilebilen veya implante edilebilen aday prototipimizi SEM ve FT/IR yöntemleri ile karakterize ettik. Bu çalışma, üretilen biyomateryalin özelliklerini, hücre-biyomateryal etkileşimini ve biyomateryal varlığında kök hücrelerin nöral farklılaşmasını karakterize etmektedir. Sonraki aşamalarda göç üzerindeki etkisi incelenecektir.
İki veya daha fazla biyouyumlu malzemenin bir araya getirilmesiyle oluşan biyohibrit malzemeler, homojen malzemelere göre yapısal özellikleri bakımından daha avantajlı hale gelmektedir30. Önceki bir çalışmada, poliglikolik asit bazlı bir nöro tüp kanalının fasiyal periferik sinire implantasyonu gerçekleştirildi. Etiketli koku alma kök hücreleri bu kanala yerleştirildi, bu da periferik cerrahinin başarılı bir şekilde yenilenmesi ve enjekte edilen kök hücre tedavisiile sonuçlandı 16. Başka bir çalışmada, insan normal dermal fibroblastları kullanılarak geliştirilen çoklu hücresel sferoidlerden elde edilen 3D yapı ile inert özelliği nedeniyle literatürde sıklıkla kullanılan silikon sinir kanalının siyatik sinir hasarının rejenerasyonundaki etkinliği karşılaştırılmıştır. Sferoid bazlı 3D yapının homojen malzemelere kıyasla siyatik hasarlı hayvan modellerinde doku rejenerasyonunu anlamlı ve hızlı bir şekilde arttırdığı gösterilmiştir20. Ancak literatürde sıklıkla kullanılan silikon esaslı biyomateryallerin yüksek enfeksiyon riski ve düşük biyouyumluluk gibi bazı önemli dezavantajları olduğu bilinmektedir15,30.
Bu çalışmada, sinir iletiminde etkili olduğu bilinen grafen nanoplateletler ile biyouyumlu, biyobozunur hidrojel biyohibrid kompozit doku üretimi 3D baskı tekniği ile gerçekleştirilmiştir. Grafenin sinir iletimi için biyomateryal olarak kullanıldığı çeşitli çalışmalar vardır25,30. Ayrıca, grafen mevcut en ince ve en hafif malzemelerden biridir ve bu da sağlık teknolojilerinde tercihini arttırır13. Biyomalzemelerin en çok arzu edilen özelliklerinden biri biyolojik olarak parçalanabilirliktir. Grafen ve türevlerinin biyolojik bozunmasını araştırmak için deneysel ve moleküler simülasyon teknolojileri uygulanmıştır13. Bu noktada, yüzey modifikasyonu-işlevselleştirme veya kompozit biyomalzemeler şeklinde üretim, büyük ölçüde katkı maddelerinin özelliklerine bağlı olarak biyolojik bozunmayı iyileştirebilir veya inhibe edebilir.
Grafen türevlerinin biyolojik olarak parçalanması için literatürde manganez peroksidaz (MnP), yaban turpu peroksidaz (HRP) ve miyeloperoksidaz (MPO) gibi çeşitli enzimler mevcuttur. Yabancı cisimlerin bulunduğu bölgeye gelen ve fagositoz yapan nötrofillerden salınan bir peroksidaz olan MPO enzimi, özellikle insan akciğerinde grafen biyodegradasyonu ile ilişkilidir13. Tek başına grafen nanotüpleri yerine grafen içeren kompozit biyomalzemelerin biyolojik olarak parçalanabilirlik seviyeleri birbirinden farklıdır. Kompozit malzemelerde istenilen bu özelliğin elde edilmesi daha kolaydır. Ek olarak, grafenin toksik dozunun belirlenmesi, klinik olarak uygulanabilir biyomalzemelerin kullanımına katkıda bulunur13.
Protokolün grafen aşamasının önemli bir kısmı, kullanılacağı zaman grafenin sterilize edilmesidir. Biyohibrid hücre etkileşimi aşamasında oluşabilecek kontaminasyon riski önlenir.
Elde edilen biyohibrid grafen-biyomürekkep hidrojel paternlemesinin sinir farklılaşması üzerine etkisi araştırıldı ve 3D sistemde farklılaşmanın daha yüksek olduğu literatürle uyumlu bulunmuştur. Periferik sinir hasarı gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklara karşı geliştirilebilen, doku mühendisliği yapılmış hücresel tabanlı tedavi yaklaşımları ile biyomateryal üretimine duyulan ihtiyaç, mevcut tedavilerin yetersizliği ile birlikte her geçen gün artmakta ve bu çalışmanın önemini vurgulamaktadır.
Önceki bir çalışmada, grafenin 2D hücre kültürü ortamındaki hücrelerle etkileşimi araştırılmıştır28. Buradan kazanılan tecrübe ile burada bilinen oranda aljinat-jelatin biyomürekkebine grafen eklenmiş ve 3D baskı yöntemi ile yeni ve özgün bir biyomalzeme prototipi üretilmiştir. Bu yeni materyal, hücre etkileşimini iki farklı şekilde incelemek için kullanıldı. Birincisi, hücre-kompozit biyomalzemenin bir 3D yazıcıda birlikte basılmasıdır. İkincisi, biyomateryalden hücresel bir sferoidin oluşumudur. Ek olarak, etiketlenmiş GFP genini içeren WJ-MSC'lerin materyalle etkileşimi de gözlenmiştir.
Bu çalışmada biyohibrid biyomürekkepler FTIR ve SEM yöntemleri seçilerek karakterize edilmiştir. Bunlar, damlama yöntemi ile oluşturulan numune toplarının karakterizasyon aşamasında incelenmesini sağlar. Özellikle SEM altın kaplama aşamasında sert ve kuru bir yapıyı inceleyebildiğimiz için SEM, bu yöntemle oluşturduğumuz bioink toplarından bir neşter ile daha iyi, ince kesitler elde etmek için fiziksel uygunluğu sağlamaktadır.
Bu yöntem çalışmasında, hücreler deneyler sırasında biyohibrid malzemeye iki farklı şekilde eklenmiştir: 3D biyobaskı için içeride veya küresel oluşum sırasında. Hücreleri biyomürekkeplerle kaplamak ve 3D biyoyazıcılar kullanmak, araştırmacıların sinir rejenerasyonu için istenen herhangi bir 3D şekli oluşturmalarını sağlar. Öte yandan, baskı basıncı ve dolayısıyla hücre canlılığının kaybı nedeniyle hücreler üzerinde daha fazla strese neden olur. Bununla birlikte, rejenerasyonu indüklemek için belirli bir bölgeye enjekte edildiğinde veya nakledildiğinde hücre homing'ini arttırmak daha arzu edilen bir yöntem olabilir.
Bioinkler üzerinde sferoidlerin oluşturulması, hücre etkileşimi açısından daha kullanışlı bir yapay doku formu oluşturur ve hücre farklılaşması için daha iyi bir niş sağlar. Doğal mikro çevreyi taklit etmek ve bu nedenle hücresel mekanizmaları araştırmak için de uygundur. Sferoidlerin biyomürekkeplere düşük yapışması, biyomürekkeplerden daha kolay ayrılmayı ve uygulamaların çok yönlülüğünü de sağlar.
Kullanılan N-kadherinler ( Şekil 7'de yeşil renkle gösterilmiştir) hücre sinyal mekanizmalarının bir parçasıdır ve nöronların gelişiminde önemli bir rol oynar32. Sınıf III β-tübülin, insan genomunda nöron belirteçleri olarak bilinen yedi izotipten biridir. Bu çalışmada kullanılan WJ-MSC'lerin nöron benzeri yapılar oluşturmaya başladığını göstermektedir. Bu bağlamda, 3D sistemler, hücrelerin canlılıklarını sürdürmeleri için daha uygun bir mikro ortam yaratacaktır.
Son olarak, söz konusu masraf ve hücre farklılaşma sistemlerinin klinik uygulanabilirliği nedeniyle, gelecekte iskelelerin, hücrelerin ve farklılaşma biyosinyallerinin33 kontrollü salınımına sahip sistemler geliştirmek ve bunları kombine tedaviler olarak kliniklere uyarlamak nöro-mühendislikte çok önemlidir. Bu nedenle, grafen ve diğer biyo-sinyallerin hidrojellere gömüldüğü ve kontrollü bir şekilde salındığı daha ileri çalışmalarda küresel ve biyobaskı yöntemleri de kullanılabilir. İn vitro çalışmalar, in vivo'ya giden yolda önemli bir adımdır. Burada prototip olarak temin edilen malzeme İyi Laboratuvar Uygulamaları standartlarına uygun olarak üretildiğinde kliniğe transfer için gerekli sterilizasyon standartlarına ulaşılabilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Proje, 3D biyobaskı teknolojisinin geliştiricisi HD Bioink ile işbirliği içinde gerçekleştirildi.
Acknowledgments
Bu çalışmada kullanılan grafen, Kırklareli Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü'nde geliştirilmiştir. Dr. Karabeyoğlu tarafından bağışlanmıştır. Grafen toksisite testi, TÜBİTAK 2209-B-Sanayi Odaklı Lisans Tez Destek Programı kapsamında tamamlanan "Grafen Katkılı Biyomürekkepli 3D Biyoyazıcılarda Mezenkimal Kök Hücrelerin Basımı ve Farklılaştırılması" (Uygulama No: 1139B411802273) başlıklı proje ile finanse edilmiştir. Çalışmanın diğer kısmı ise Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TSA-2021-4713) tarafından sağlanan araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Hızlandırılmış görüntüleme aşamasında kullanılan GFP'li mezenkimal kök hücreler Virostem Biyoteknoloji tarafından bağışlandı. Yazarlar, verimli tartışmalar için Darıcı LAB ve YTÜ Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği LAB ekibine teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
- Kaya, T. I.
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A.
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
