Summary
En este manuscrito, demostramos la preparación de una biotinta de hidrogel biohíbrida que contiene grafeno para su uso en ingeniería de tejidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, se realiza el protocolo de diferenciación neural de las células madre. Este puede ser un paso importante para traer biomateriales similares a la clínica.
Abstract
Las neuropatías periféricas pueden ocurrir como resultado del daño axonal, y ocasionalmente debido a enfermedades desmielinizantes. El daño a los nervios periféricos es un problema global que ocurre en el 1.5% -5% de los pacientes de emergencia y puede conducir a pérdidas significativas de empleos. Hoy en día, los enfoques basados en la ingeniería de tejidos, que consisten en andamios, líneas celulares apropiadas y bioseñales, se han vuelto más aplicables con el desarrollo de tecnologías de bioimpresión tridimensional (3D). La combinación de varios biomateriales de hidrogel con células madre, exosomas o moléculas de bioseñalización se estudia con frecuencia para superar los problemas existentes en la regeneración de nervios periféricos. En consecuencia, la producción de sistemas inyectables, como hidrogeles, o estructuras de conductos implantables formados por diversos métodos de bioimpresión ha ganado importancia en la neuroingeniería periférica. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas no son células especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a una lesión. El sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. En las lesiones de los nervios periféricos, especialmente en la neurotmesis, este microambiente no se puede rescatar por completo incluso después de unir quirúrgicamente las terminaciones nerviosas cortadas. El enfoque de biomateriales compuestos y terapias celulares combinadas aumenta la funcionalidad y aplicabilidad de los materiales en términos de diversas propiedades, como la biodegradabilidad, la biocompatibilidad y la procesabilidad. En consecuencia, este estudio tiene como objetivo demostrar la preparación y el uso de patrones de hidrogel biohíbridos basados en grafeno y examinar la eficiencia de diferenciación de las células madre en células nerviosas, que pueden ser una solución efectiva en la regeneración nerviosa.
Introduction
El sistema nervioso, que es el mecanismo que une la estructura interna del organismo y el medio ambiente, se divide en dos partes: el sistema nervioso central y periférico. El daño a los nervios periféricos es un problema global que constituye el 1,5%-5% de los pacientes que acuden al servicio de urgencias y se desarrolla debido a diversos traumatismos, lo que lleva a una pérdida significativa del empleo 1,2,3.
Hoy en día, los enfoques celulares de la neuroingeniería periférica son de gran interés. Las células madre ocupan el primer lugar entre las células utilizadas en estos enfoques. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas células son especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a la lesión 4,5. Según la hipótesis de las células madre, el sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. La preservación y diferenciación de las células madre es imposible sin la presencia de su microambiente6, que puede ser reconstituido a través de la ingeniería tisular utilizando células y andamios7. La ingeniería de tejidos es un campo multidisciplinario que incluye principios de ingeniería y biología. La ingeniería de tejidos proporciona herramientas para la creación de tejidos artificiales que pueden reemplazar los tejidos vivos y pueden ser utilizados en la regeneración de estos tejidos mediante la eliminación de los tejidos dañados y la provisión de tejidos funcionales8. Los andamios de tejidos, una de las tres piedras angulares de la ingeniería de tejidos, se producen utilizando métodos diferentes de materiales naturales y sintéticos9. La impresión tridimensional (3D) es una tecnología emergente de fabricación aditiva que se utiliza ampliamente para reemplazar o restaurar tejidos defectuosos a través de su producción simple pero versátil de formas complejas utilizando varios métodos. La bioimpresión es un método de fabricación aditiva que permite la coexistencia de células y biomateriales, llamados biotintas10. Teniendo en cuenta la interacción de las células nerviosas entre sí, los estudios se han desplazado a candidatos a biomateriales conductores como el grafeno. Las nanoplacas de grafeno, que tienen propiedades tales como electrónica flexible, supercondensadores, baterías, óptica, sensores electroquímicos y almacenamiento de energía, son un biomaterial preferido en el campo de la ingeniería de tejidos11. El grafeno ha sido utilizado en estudios donde se realizó la proliferación y regeneración de tejidos y órganos dañados12,13.
La ingeniería de tejidos consta de tres bloques de construcción básicos: andamio, células y moléculas de bioseñal. Existen deficiencias en los estudios sobre el daño a los nervios periféricos en términos de proporcionar estas tres estructuras por completo. Se han encontrado varios problemas en los biomateriales producidos y utilizados en los estudios, como que contienen solo células madre o moléculas de bioseñal, la falta de una molécula bioactiva que permita la diferenciación de células madre, la falta de biocompatibilidad del biomaterial utilizado y el bajo efecto sobre la proliferación de células en el nicho tisular. y, por lo tanto, la conducción nerviosa no se realiza completamente 2,13,14,15,16. Esto requiere la optimización de la regeneración nerviosa, reduciendo la atrofia muscular17,18, y creando el homing necesario 19 con factores de crecimiento contra tales problemas. En este punto, la caracterización y el análisis de la neuroactividad de un prototipo de biomaterial quirúrgico, para ser transferido a la clínica, son muy importantes.
En consecuencia, este estudio de métodos investiga el patrón de hidrogel de biotinta con nanoplacas de grafeno formadas por una bioimpresora 3D y su efectividad en la diferenciación neurogénica de las células madre que contiene. Además, se investigan los efectos del grafeno en la formación y diferenciación de la neuroesfera.
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Protocol
1. Cultivo de células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton
- Tome las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSC, de ATCC) de un congelador de -80 °C. Cultivo de WJ-MSCs en medio DMEM-F12 que contiene 10% de suero fetal de ternera (FBS), 1% de Pen-Strep y 1% de L-glutamina en un flujo laminar estéril a temperatura ambiente, como se describe en Yurie et al.20.
- Criopreservar algunas de las células a 1 x 106 células/ml con medio de congelación que contiene 35% FBS, 55% DMEMF-12 y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Para esto, cuente 1 x 106 celdas en un portaobjetos de conteo de células Thoma y agregue la solución de congelación gota a gota. Transfiera rápidamente el portaobjetos a un recipiente de nitrógeno líquido.
- Cuando las células cultivadas estén 80% confluentes en el matraz, vierta el medio y lave con 5 ml de PBS. Añadir 5 mL de tripsina al 0,25% y 2,21 mM de EDTA-4Na. Incubar en una incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Agregue 10 ml de medio DMEM-F12 con 10% de FBS a las células eliminadas de la incubadora. Suspenda bien, recoja el medio y transfiera el medio a un tubo de centrífuga.
- Centrífuga a una velocidad de rotación de 101 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a sembrar las células en matraces nuevos con un medio nutriente fresco que contenga un 10% de FBS.
NOTA: Las WJ-MSC comerciales marcadas con el gen GFP por el método de transducción se pueden utilizar para visualizar mejor las interacciones biomaterial-célula que se producirán21. Los grupos que se utilizarán en este método se pueden crear como se muestra en la Tabla 1.
| Grupos creados | Razones para crear | Número de representantes | ||
| WJ-MSC 2D (2D-C) | Control 2D | x 5 | ||
| WJ-MSCs 2D y Grafeno (2D-G) | Determinación de dosis tóxicas de grafeno en 2D | x 5 repeticiones a cada una de las diferentes concentraciones | ||
| Los WJ-MSC se incluyen en biotintas (3D-B) | Control 3D | x 3 | ||
| WJ-MSCs y 0.1% de grafeno se incluyen en biotintas (3D-G) | Grupo Biohíbrido 3D Grafeno-Biotinta | x 3 | ||
| Las WJ-MSC están en forma esferoide en las biotintas (3D-BS) | Control 3D de la forma esferoide | x 3 | ||
| WJ-MSCs & 0.1% de grafeno son en forma de esferoide en las biotintas (grupo 3D-GS) | Grupo biohíbrido de grafeno-biotinta 3D de forma esferoide | x3 | ||
| Gota de Biotinta 3D | Se produce para el análisis de caracterización SEM y FTIR. | x5 | ||
| Gota de grafeno 3D | Se produce para el análisis de caracterización SEM y FTIR. | x5 | ||
| Biotinta 3D con etiquetas GFP WJ-MSCs y 0.1% | Observación de los movimientos de WJ-MsCs en la biotinta que contiene la dosis adecuada de grafeno. | x3 | ||
Tabla 1. Grupos en el método. Se incluyen todos los grupos 2D y 3D del método.
2. Toxicidad del grafeno e imágenes 2D
- Preparación de concentraciones de grafeno y aplicación a células
NOTA: Las nanopartículas de grafeno en bruto se compraron comercialmente (tipo nanoplacas de grafeno industrial) y también se donaron. Las dimensiones de las partículas eran 5-8 nm de espesor, 5 μm de diámetro y 120-150 m2/g de superficie.- Pesar el grafeno para crear una solución al 1% (mg/ml). Haga una solución madre agregando 10 ml de medio DMEMF-12 con 10% de FBS a los 100 μg pesados de nanopartículas de grafeno y etiquete esta solución como solución madre. Esterilizar en autoclave a 121 °C bajo una presión de 1,5 atm durante 20 min.
NOTA: La mezcla estéril de grafeno se almacena en el refrigerador a 4 °C hasta su uso. Puede no ser adecuado para uso a largo plazo (máximo 1 mes). En estos casos, la mezcla debe ser reconstituida y esterilizada. - Prepare una mezcla de grafeno medio a diferentes concentraciones para determinar dosis no tóxicas. Establezca las diluciones iniciales como 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% y 0.0001% de grafeno/medio.
- Comenzando con la solución madre al 1%, tome 1 ml sucesivamente de cada concentración y transfiérala a un tubo nuevo. Agregue 9 ml de medio DMEMF-12 con 10% de FBS a cada tubo, haciendo cinco muestras diluidas gradualmente, y agite y vortice las soluciones para obtener una distribución equitativa. Use solo 10 ml de medio DMEMF-12 con 10% de FBS como control.
NOTA: Las pesadas escamas de grafeno precipitan y, por lo tanto, deben redistribuirse. - Sembrar los WJ-MSC en placas de 6 pocillos con 2 ml de medio fresco que contenga 10% de FBS a 5 x 105 células por pocillo. Incubar durante 1 día a 37 °C. Luego, divida las placas en grupos de pozos iguales y repetidos. Haz cinco repeticiones para cada concentración.
- Deseche el medio y luego reemplace el medio con concentraciones de medio de grafeno a 2 ml por pocillo. Utilice sólo el medio para el grupo de control. Incubar las placas a 37 °C durante 24 h.
- Pesar el grafeno para crear una solución al 1% (mg/ml). Haga una solución madre agregando 10 ml de medio DMEMF-12 con 10% de FBS a los 100 μg pesados de nanopartículas de grafeno y etiquete esta solución como solución madre. Esterilizar en autoclave a 121 °C bajo una presión de 1,5 atm durante 20 min.
- Determinación de concentraciones no tóxicas de grafeno con MTT
- Desechar los medios con grafeno después de 24 h. Lave cada pozo con PBS. Agregue medio DMEMF-12 fresco con 10% de FBS a 2 ml por pocillo.
NOTA: Es importante lavar con PBS después de la aplicación de concentraciones de grafeno en la célula porque las nanopartículas de grafeno, que no se introducen en la célula por endocitosis, se eliminan del medio ambiente. Esto hace que la prueba MTT sea más eficiente. - Utilice el protocolo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio) para determinar el valor de IC50 que indica una viabilidad celular del 50%, como se describe en Kose et al.22 y en los pasos 2.2.3.-2.2.6.
- En primer lugar, pesar 5 mg / ml de sal MTT y disolver en PBS. Esterilizar con un filtro de 0,45 μm. Envuelva la solución MTT, hecha en un tubo centrífugo de 15 ml, con papel de aluminio y guárdela a 4 °C.
- Añadir 10 μL de MTT a todos los pocillos e incubar la placa durante 4 h a 37 °C. Observe la formación de cristales de formazan con un aumento de 10x bajo el microscopio después de la incubación.
- Para disolver los cristales formados en las células, añadir 100 μL de DMSO a cada pocillo y mezclar por pipeteo. Mantenga el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Inserte la placa en el lector de placas ELISA. Establezca una longitud de onda de 570 nm desde el programa para la medición de absorbancia y haga que lea la placa22.
NOTA: Además, mientras que las partículas de grafeno solas se leen a 270 nm23, el rango de lectura de 570 nm24 aquí será solo para leer la viabilidad celular. - Realizar análisis estadísticos sobre los resultados obtenidos utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey en un programa de análisis estadístico.
- Desechar los medios con grafeno después de 24 h. Lave cada pozo con PBS. Agregue medio DMEMF-12 fresco con 10% de FBS a 2 ml por pocillo.
- Imágenes de puntada
- Para examinar la interacción de diferentes concentraciones de grafeno con las células, realice un lapso de tiempo de las células con el método llamado imágenes de puntada. Este método crea una imagen de lapso de tiempo utilizando muestras de imágenes tomadas a intervalos regulares bajo el microscopio.
- Para hacer esto, encienda primero la computadora. Encienda la incubadora de imágenes time-lapse y configúrela a 37 °C. Coloque la placa MTT en la ranura de la incubadora de lapso de tiempo.
- Abra el programa Stitch en el equipo. Especifique los pozos que se leerán en el sistema. Lleve al lector al primer pozo y localice y enfoque el área con un aumento de 10x con luz blanca. Inicie el programa.
NOTA: Es un programa para crear collages de fotos múltiples de alta calidad de 4 filas x 5 columnas. El programa combina fotos tomadas una tras otra en calidad HD. Cuando presiona el botón de inicio del sistema, los pozos se leen automáticamente, y toma y cose 4 filas x 5 columnas varias fotos.
3. Grafeno - Bioink biohíbrido de producción de hidrogel y diferenciación WJ-MSCs
- Producción de biotintas
NOTA: Los polvos de alginato y gelatina liofilizados disponibles comercialmente (3:5) se utilizan como base de biotintas. El grupo de biotinta de grafeno (3D-G; 3D-GS) y el grupo de biotinta de control sin grafeno (3D-B; 3D-BS) se preparan con el mismo método (Tabla 1).- Use tubos cónicos de 50 ml para la preparación. Primero, pesar 4,5 mg de alginato y 1,5 mg de gelatina y transferir a un tubo de centrífuga. Agregue DMEMF-12 medio que contenga 10% de FBS a la mezcla hasta un volumen total de 50 ml. Este es el grupo de control (C) sin grafeno.
- Repetir pesando 4,5 mg de alginato y 1,5 mg de gelatina y transferir a un tubo de centrífuga. Luego, tome 50 μL del grafeno preparado al 0,1% del paso 2.1.3. y añádelo al tubo. Agregue DMEMF-12 con 10% de FBS a un volumen total de 50 ml.
- Mezclar las biotintas primero pipeteando y luego vórtice. Esterilizar en autoclave a 121 °C bajo una presión de 1,5 atm durante 20 min. Alternativamente, realice la esterilización en el microondas hasta el punto de ebullición.
- Después de esterilizar las mezclas en autoclave, centrifugar a 280 x g durante 2 min a temperatura ambiente para eliminar las burbujas formadas. Mantener las biotintas a 37 °C hasta que las células estén preparadas.
- Adición de WJ-MSCs y bioimpresión 3D
- Para contar, lave las células cuando haya 80% de confluencia con aproximadamente 5 ml de PBS, y agregue 5 ml de tripsina al 0,25% y 2,21 mM EDTA 4Na. Dejar actuar durante 5 min a 37 °C.
- Agregue 10 ml de medio DMEM-F12 con 10% de FBS a las células después de retirarlas de la incubadora. Suspenda bien, recoja el medio y transfiéralo a un tubo de centrífuga. Centrifugar a 101 x g durante 5 min a temperatura ambiente y luego desechar el sobrenadante.
- Dejar aproximadamente 250 μL de medio con el pellet. Vuelva a disolver el pellet en 1 ml de medio fresco. A 48 μL de medio, añadir 2 μL de suspensión celular y 50 μL de azul de tripano (0,4 g de azul de tripano/100 ml) en un tubo cónico (1,5 mL) para contar4. Pipetear bien.
- Agregue aproximadamente 10 ml de la suspensión de células teñidas preparada a una cámara de conteo de células Thoma. Calcule el número promedio de células que caen en los cuadrados a ambos lados del microscopio óptico.
Calcular el porcentaje de vitalidad (%) = (células viables contadas/total de células contadas) x 100
NOTA: La interacción célula-biotinta se estudia de dos maneras: (1) Se puede imprimir añadiéndola a las biotintas (3D-B; 3D-G); (2) Las células se siembran en las biotintas después de ser presionadas, y las células forman un esferoide (3D-BS; 3D-GS). - Para la interacción célula-biotinta, primero cree los grupos de biotinta (Tabla 1). El grupo 1 incluye 3D-B y 3D-G impresos con biotinta para bioimpresión. El grupo 2 incluye biotintas 3D-BS y 3D-GS en las que se formaron esferoides después de la bioimpresión.
- Cuente las células para el grupo 1 de modo que haya aproximadamente 1 x 107 células en 0,5 ml de medio. Agregue 4.5 ml de biotinta para llevar el volumen total a 5 ml. Transfiera esto a los cartuchos en el gabinete estéril con la ayuda de jeringas. Instale los cartuchos en la sección del extrusor correspondiente de la bioimpresora.
- Para el segundo grupo, tome 5 ml de cada uno de los grupos de biotinta y transfiéralos a cartuchos estériles con la ayuda de un inyector.
- Utilice la bioimpresora con dos cabezales de impresión coaxiales y la tecnología de extrusión neumática. Establezca la resolución X/Y/Z por micropaso en 1,25 μm, el ancho de extrusión en 400 μm y la altura de extrusión en 200 μm. Una cuadrícula de 20 mm x 20 mm x 5 mm es uno de los modelos 3D más utilizados para el trabajo de bioimpresión 3D.
- Cree los modelos 3D utilizando programas CAD de código abierto basados en la web. Antes de la bioimpresión, cree modelos 3D simples con una de las plataformas de código abierto (por ejemplo, relleno). El modelo puede ser lineal (como el modelo utilizado aquí), en forma de panal o en forma de cuadrícula. Exporte y descargue en formato .stl después de crear un cuadrado de 5 mm x 20 mm x 20 mm.
- El software bioprinter utiliza archivos .stl y los convierte al formato .gcode imprimible utilizando módulos de corte. Para obtener una forma de cuadrícula imprimible, deshabilite la carcasa exterior en el módulo de segmentación de datos. Limpie el dispositivo con etanol al 70% antes de la operación y luego esterilice mediante esterilización UV.
- Para el proceso de bioimpresión, transfiera los grupos de biotinta a los cartuchos con la ayuda de un inyector. Instale los cartuchos en la sección del extrusor correspondiente de la bioimpresora.
- Ajuste la presión media de la impresora 3D a 7,5 psi y la temperatura del cartucho y la cama a 37 °C. Ajuste la velocidad al 60% y lleve a cabo un proceso de impresión 3D estándar.
NOTA: La planificación de los modelos preparados con espacios (como un modelo lineal) permite realizar el cultivo celular en los espacios después de la bioimpresión. - Coloque el sistema en la posición inicial durante la fase de escritura. Coloque los ejes (X, Y, Z) automáticamente, seleccione el extrusor y configúrelo. Inicie el proceso de impresión. Después del proceso de bioimpresión, tome la muestra y colóquela debajo de un gabinete de flujo laminar.
- Rocíe las biotintas con una solución de CaCl2 0,1 N después de imprimir o agregue 1 ml de la solución con una pipeta a temperatura ambiente. Espere unos 10-20 s y lave los patrones impresos 2x con PBS que contenga Ca 2+ y Mg2+.
- Agregue 2 ml de DMEMF-12 con un 10% de medio FBS encima de cada uno de los grupos de biotinta que contienen células. Incubar las placas a 37 °C con un 5% deCO2. Después, agregue 2 ml de medio de suspensión que contenga 1 x 106 células a cada grupo para la formación de esferoides.
- Incubar las placas a 37 °C con un 5% deCO2. Después de 24 h de incubación, observe la formación de esferoides bajo un microscopio invertido.
- Diferenciación WJ-MSCs a células similares a neuronas
- Observar y fotografiar todos los lotes de biotinta después de 24 h de incubación. Agregue 2 ml de medio de diferenciación neurogénica por pocillo (excepto para el grupo control) y actualice cada 2 días. Siga durante 7 días para observar la diferenciación neuronal.
4. Caracterización del hidrogel biohíbrido Graphene-Bioink
NOTA: Se realizan análisis de imágenes de lapso de tiempo, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT / IR) y microscopía electrónica de barrido (SEM) para la caracterización del hidrogel biohíbrido de grafeno-biotinta. Las muestras se crean a partir de grupos de biotinta 3D-B y 3D-G mediante el método de goteo para el análisis FT/IR y SEM.
- Análisis FT/IR
Nota: FT/IR es un método analítico químico basado en la transformada matemática de Fourier, indispensable para la caracterización de materiales. Utilice un dispositivo FT/IR basado en los principios del interferómetro Michelson a 28 °C, con lámpara halógena, fuente de luz de mercurio refrigerada por agua, relación de aspecto de señal de 4 cm−1, medida durante 1 min, a 2.200 cm−1.- Prepare el microscopio FT/IR y asegúrese de que la óptica del instrumento esté alineada. Calibre el dispositivo.
- Dado que la muestra está en una gota, tome un trozo de hidrogel de 1-2 mm de espesor y colóquelo con pinzas en la parte de la muestra. Concéntrese en la muestra y levántela hasta que se haga contacto cercano. Recopile el espectro de muestra iniciando el proceso desde el sistema.
- Análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM)
NOTA: La morfología de la superficie, la estructura interna, la distribución celular y las interacciones biotinta-célula se pueden examinar mediante análisis SEM en diferentes dimensiones.- Coloque el hidrogel en placas de 6 pocillos que contengan 1 ml de reticulante de CaCl2 utilizando el método de gota de punta de pipeta (véase la figura 1).
- Lave las placas 2 veces con aproximadamente 1 ml de PBS para liberar la solución de sales. Luego, coloque estas gotas en un tubo de halcón que contenga 5 ml de paraformaldehído al 5% con la ayuda de fórceps.
- Haga secciones delgadas de las biotintas de gota con la ayuda de un bisturí. Pegue las muestras en el lado adhesivo de la placa de metal. Inserte en el dispositivo de recubrimiento donde el paladio de oro, que pasa a la fase plasmática reemplazando el aire con gas argón, cubre la muestra.
- Póngalo en el microscopio electrónico (SEM). Abra el programa de microscopio al que está conectado el SEM. Realice el escalado y tome imágenes de diferentes partes de la muestra. Para este protocolo, se utilizaron escalas de 5 μm, 10 μm y 200 μm. Se tomaron un total de 40 imágenes para los grupos 3D-B y 3D-G.
- Imágenes de lapso de tiempo
NOTA: Durante las imágenes de lapso de tiempo, no solo se utilizaron muestras de biotinta que contenían células transformadas en el gen GFP, sino que también se obtuvieron imágenes de biotintas con esferoides durante 16 h. Las imágenes de lapso de tiempo se realizan para examinar los efectos del grafeno en las células madre y para monitorear las interacciones celulares dentro de la biotinta.- Agregue 1 x 107 MSC etiquetadas con GFP disponibles comercialmente en 5 ml de biotinta y bioimpresión como en el paso 3.2.11. Agregue 1 ml de reticulante, mantenga durante 20-30 s y lave 2 veces con PBS.
- Encienda el monitor de lapso de tiempo y abra el programa en la computadora. Ajuste aproximadamente 16 h en modo Time-Lapse y ajuste la temperatura a 37 °C. Presione el botón Inicio . El sistema graba videos en forma de muestras de video de lapso de tiempo de 40 s.
- Enfoque el microscopio con un aumento de 10x cada 2 h. Además, visualice los esferoides creados siguiendo los mismos pasos.
Figura 1: Grupos de biotinta 3D-B y 3D-G producidos como gotas para su uso en la caracterización. (A) Muestras de biotinta (imagen de precaracterización) en una placa con un reticulante. (B) Imagen de gota 3D-B de biotinta. (C) Imagen de gota de biotinta 3D-G. El biomaterial a caracterizar y las células que contiene pueden pasar más fácilmente por procesos como el baño de oro, el muestreo, etc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Determinación de la diferenciación neurogénica por el método de inmunotinción
- Recoja los esferoides, sin interrumpir las formas de la esfera, y vuelva a sembrar en nuevas placas para resein con un método más fácil, en lugar de incrustar en parafina para la sección de tejido.
- Cubra las placas de 48 pocillos con aproximadamente 20 ml de solución de gelatina al 0,1% esterilizada en autoclave y manténgala en una incubadora durante al menos 1 h. Pipetear aproximadamente 500 μL de gelatina preparada al 0,1% en placas de 48 pocillos. Deje las placas gelatinosas en la incubadora durante 10 minutos.
NOTA: Esto permitirá que la gelatina se hinche ligeramente, cubriendo la superficie y creando un mejor ambiente para que los esferoides recolectados se adhieran. - Recoja los esferoides mediante pipeteo, distribuya los esferoides recolectados de la incubadora en los pocillos de la placa de 48 pocillos y agregue un medio fresco. Luego, incubar durante 12-24 h.
NOTA: Es bastante difícil distribuir los esferoides contando. Recoja los esferoides en un solo tubo y distribuya uniformemente el volumen total a los pozos. Para este estudio, cada pozo contenía aproximadamente 4-6 esferoides.
NOTA: Para muestras 2D, el lavado previo a la mancha es suficiente y no se requiere reemplazo de medios. - Retire el medio y lave lentamente las células con PBS ya que los esferoides estarán en la parte superior. Fijar en paraformaldehído al 4% durante 2 h.
- Lave las muestras con PBS nuevamente y bloquee con aproximadamente 10 ml de BSA al 2% y TritonX al 0,1% durante 30 min. Luego, lavar con PBS 3x.
- Diluir anticuerpos de cebador seleccionados (N-cadherina-conejo y β-III tubulina-ratón) en una proporción de 1:100 con solución reactiva diluyente de anticuerpos. Añadir 100 μL de solución de anticuerpos a cada una de las muestras e incubar durante la noche a 4 °C.
- Lave las muestras 3 veces con PBS. Incubar con conejo IgG-FTIC anti-ratón para tubulina β-III y anticuerpo secundario anti-ratón IgG-SC2781-cabra para N-Cad diluido a 1:200 a temperatura ambiente durante 30 min. Realice todas las operaciones en la oscuridad.
NOTA: Cualquiera que sea la cepa que se use como anticuerpo primario (por ejemplo, ratón) en la tinción doble, se debe usar una cepa diferente (por ejemplo, cabra o conejo) para el anticuerpo secundario. - Lave el anticuerpo secundario con PBS 3x y luego gotee la solución DAPI (1:1) en cada una de las muestras. Espere 15-20 min. Realizar imágenes de inmunofluorescencia.
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Representative Results
Toxicidad del grafeno e imágenes 2D
El análisis estadístico de los resultados MTT obtenidos se realizó con un ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey en software de análisis estadístico, y el gráfico obtenido se muestra en la Figura 2. El porcentaje de grafeno en comparación con el control mostró una disminución significativa solo para la concentración de grafeno al 0,001% (**p < 0,01). No hubo diferencias significativas entre los otros grupos y el control (p > 0,05). Por lo tanto, se determinó que la concentración óptima de grafeno era del 0,1%, ya que las tasas de viabilidad más altas se observaron después de la exposición a esta concentración de acuerdo con los resultados de la prueba MTT y las imágenes de costura.
Figura 2: Investigación del efecto de la concentración de grafeno en la proliferación celular. El porcentaje de grafeno en comparación con el control mostró una disminución significativa solo para la concentración de grafeno del 0,001% (**p < 0,01, n = 6). No hubo diferencias significativas entre los otros grupos y el control (p > 0,05; n = 6). El análisis estadístico de los resultados MTT obtenidos se realizó con un ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey en software de análisis estadístico. Las barras de error representan la desviación estándar. Esta cifra se ha modificado de28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Esta parte del método presentado demuestra que la interacción madre-grafeno se puede utilizar en futuros estudios. Se observó que, en cada concentración probada, el grafeno fue tolerado en el sistema 2D y fue absorbido por las células a través de endocitosis (Figura 3). Se ha determinado que las placas de grafeno se mueven a lo largo del citoplasma dentro de la célula.
Figura 3: Las interacciones célula-grafeno se muestran en dos dimensiones en imágenes cosidas. a) Control; (B) 0,0001%; (C) 0,001%; (D) 0,01%; (E) 0,1%; y (F) concentraciones de grafeno al 1%. Se obtiene combinando imágenes de lapso de tiempo con configuraciones de calidad de alta definición para obtener un collage de 4 filas x 5 columnas de múltiples fotos. Esta cifra se ha modificado de 28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, en este estudio, se observó que el efecto grafeno-biotinta no creaba ningún microambiente tóxico en el sistema 3D y que las células estaban en interacción.
También se ha observado que el uso de grafeno en sistemas 3D no creó ningún microambiente tóxico. Determinar la dosis tóxica para las células es crucial para el uso de grafeno en implantes de conductos a largo plazo o formas de hidrogel inyectables. Además, dado que el grafeno es un material eficaz en la comunicación neuronal, su uso en aplicaciones de ingeniería de tejidos nerviosos ha aumentado ampliamente, como se documenta en la literatura25.
Producción de biomateriales compuestos y bioimpresión 3D
La formación de patrones biohíbridos de biotinta a base de gelatinato de alginato se realizó con una concentración no tóxica de grafeno (0,1%). Se ha observado que la dosis apropiada seleccionada de grafeno interactúa con las células de la biotinta.
Imágenes de lapso de tiempo
Las muestras de GFP se ajustaron a 37 °C durante aproximadamente 16 h en lapso de tiempo, y se tomaron fotos y videos (Video 1). Las señales de GFP se perdieron cuando se observó la muerte celular. Aquí, se detectó que las células que sobrevivieron en el medio de grafeno 3D mantuvieron sus vitalidades desde que se observó el brillo de GFP hasta el final de la incubación.
Vídeo 1. Vídeo time-lapse de WJ-MSCs etiquetados con GFP. Se observa la interacción de las células madre marcadas entre sí. Haga clic aquí para descargar este video.
Caracterización del hidrogel biohíbrido Graphene-Bioink
Se utilizaron SEM y FT/IR para la caracterización de los grupos 3D-B y 3D-G creados por el método drop bioink. Las imágenes SEM de los grupos de biotinta 3D-B y 3D-G se dan en la Figura 4. De las 40 imágenes tomadas en el paso 4.2.5., aquí se muestran 4 imágenes representativas.
Figura 4: Imágenes SEM de los grupos de biotinta 3D-B y 3D-G. (A) Imagen de una sección de biotinta 3D-B recubierta de oro con microscopía electrónica. Barra de escala: 200 μm. (B) Imagen de MSC unida a la superficie interna de biotinta 3D-B. Barra de escala: 5 μm (C) Imagen de la superficie interna y externa de biotinta 3D-G. Barra de escala: 200 μm.(D) Imagen de adhesión de biotinta 3D-G de celda de superficie interna. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En consecuencia, las interacciones biotinta-célula se demostraron tanto en la superficie como internamente. Hubo una interacción célula-biomaterial en ambas biotintas (3D-B; 3D-G). Las células eran morfológicamente redondas y unidas al material. El análisis FT/IR de la gota de biotinta 3D-B y 3D-G se comparó con el gráfico de la Figura 5.
Figura 5: Análisis FT/IR. (A) Biotinta 3D-B. (B) Biotinta 3D-G. Picos como 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 y 1033 cm−1 han sido encontrados en estudios de hidrogel a base de alginato-gelatina en la literatura26. Además, el pico de 1335,46 cm−1 es similar a los picos observados en los estudios de biomateriales de grafeno27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Dado que la biotinta control (3D-B) se basó en alginato/gelatina, los picos más prominentes fueron alrededor de 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 y 1033 cm−1 en comparación con estudios similares en la literatura con picos observados a 1546 cm−126. Se observó un pico de 1399 cm−1 en el grupo de grafeno (3D-G) y un pico similar en 1335.46 cm−1 en un estudio realizado con grafeno27.
Diferenciación neuronal 3D
Las imágenes de esferoides en las biotintas después del 7º día después de la diferenciación se representan en la Figura 6.
Figura 6: Imagen 2D de WJ-MSCs de control y muestras de grupos esferoides en el día 7 después de la diferenciación . (A) Tamaño de la esfera a partir de la biotinta del grupo 3D-BS con diámetros de 160 μm y 200 μm. (B) Celdas de control 2D. Esferoides de (C) el grupo 3D-BS y (D) el grupo 3D-GS. Los materiales negros en (D) son moléculas de grafeno integradas con esferoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se observó que las células mantenían su vitalidad tanto en cultivos 2D como 3D. Se consideró que los bordes de las células esferoides en ambos grupos (3D-B y 3D-G) eran transparentes y vivos, y los esferoides en el grupo de grafeno eran relativamente más grandes y atrapaban el grafeno dentro de la célula. La diferenciación también se probó mediante inmunotinción. Con la doble tinción utilizada aquí, las actividades de las células en la transformación neuronal 2D se compararon con el cultivo 3D (Figura 7).
Figura 7: Inmunotinción de células 2D y 3D. (A,B) Inmunotinción de esferoides cultivados en biotintas 3D-BS. (C,D) Inmunotinciones esferoides de biotinta 3D-GS. (E) WJ-MSC de control positivo 2D diferenciado. (F) WJ-MSC de control negativo 2D indiferenciado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las imágenes de inmunofluorescencia de células cultivadas durante 7 días se muestran en la Figura 7. Las muestras se tiñeron con anticuerpos específicos para N-cadherina (verde) y β-III tubulina (rojo). Además, DAPI se utilizó para la visualización del núcleo (azul o púrpura). En consecuencia, las N-cadherinas (verde) utilizadas en las muestras 2D y 3D difirieron durante 7 días, ya que desempeña un papel importante en los mecanismos de señalización y el desarrollo de las neuronas. La imagen verde en la Figura 7A-E representa estructuras similares a neuronas (Figura 7). La β-tubulina de clase III es uno de los siete isotipos conocidos como marcadores neuronales en el genoma humano. Se encontró que la expresión de N-cadherina fue mayor en las muestras que se diferenciaron durante 7 días en comparación con la tubulina β-III. De acuerdo con los resultados del presente experimento, se estableció que los sistemas 3D crearon un microambiente más adecuado para que las células sobrevivieran y se diferenciaran. La muestra de control positivo 2D (Figura 7E) expresó menos marcadores de estructura similar a neuronas en comparación con las muestras 3D (Figura 7A-D). Esto nos muestra que el microambiente creado con la estructura 3D es más efectivo en la diferenciación de las células madre. Además, en lugar de terapias celulares solas; Los tratamientos combinados entre biomaterial y células parecen ser más influyentes y efectivos en el daño nervioso.
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Discussion
Las ventajas de los tratamientos aplicados con andamios 3D diseñados sobre los métodos 2D convencionales son cada vez más notables cada día. Las células madre utilizadas solas en estas terapias o junto con andamios producidos a partir de diversos biomateriales con baja biocompatibilidad y biodegradabilidad suelen ser inadecuadas en la regeneración de los nervios periféricos. Las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSCs) parecen ser una línea celular candidata adecuada, especialmente considerando la optimización de los protocolos de adquisición, su capacidad de proliferación y su capacidad de diferenciación29. En este estudio, examinamos la interacción de las células madre con el grafeno en cultivos 2D y 3D. También comparamos la diferenciación neurogénica en los grupos de hidrogel biohíbridos generados con el entorno 2D. Demostramos la formación de la neuroesfera en las biotintas mediante inmunotinción. En estudios posteriores, caracterizamos nuestro prototipo candidato, que puede ser inyectado o implantado como un canal neuronal, por métodos SEM y FT / IR. Este estudio caracteriza las propiedades del biomaterial producido, la interacción célula-biomaterial y la diferenciación neural de las células madre en presencia del biomaterial. En las siguientes etapas, se examinará el efecto sobre la migración.
Los materiales biohíbridos formados por la combinación de dos o más materiales biocompatibles son cada vez más ventajosos en términos de sus propiedades estructurales en comparación con los materiales homogéneos30. En un estudio anterior, se realizó la implantación de un canal de neurotubo a base de ácido poliglicólico en el nervio periférico facial. Las células madre olfativas marcadas se insertaron en este conducto, lo que resultó en la regeneración exitosa de la cirugía periférica y la terapia con células madre inyectadas16. En otro estudio, la efectividad de la estructura 3D obtenida de múltiples esferoides celulares desarrollados utilizando fibroblastos dérmicos normales humanos y el canal nervioso de silicio, que se usa con frecuencia en la literatura debido a su característica inerte, se comparó en la regeneración del daño del nervio ciático. Se demostró que la estructura 3D basada en esferoides aumentó la regeneración tisular significativamente y más rápidamente en modelos animales con daño ciático en comparación con materiales homogéneos20. Sin embargo, se sabe que los biomateriales a base de silicio, que se utilizan con frecuencia en la literatura, tienen algunas desventajas importantes, como el alto riesgo de infección y la baja biocompatibilidad15,30.
En el presente estudio, la producción de tejido compuesto biohíbrido de hidrogel biodegradable biocompatible con nanoplaquetas de grafeno, que se sabe que son efectivas en la conducción nerviosa, se llevó a cabo mediante una técnica de impresión 3D. Existen diversos estudios en los que el grafeno ha sido utilizado como biomaterial para la conducción nerviosa25,30. Además, el grafeno es uno de los materiales más delgados y ligeros disponibles, lo que aumenta su preferencia en tecnologías de salud13. Una de las propiedades más deseables de los biomateriales es la biodegradabilidad. Se han aplicado tecnologías experimentales y de simulación molecular para investigar la biodegradación del grafeno y sus derivados13. En este punto, la modificación-funcionalización de la superficie o la producción en forma de biomateriales compuestos puede mejorar o inhibir la biodegradación, dependiendo en gran medida de las propiedades de los aditivos.
Varias enzimas, como la peroxidasa de manganeso (MnP), la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la mieloperoxidasa (MPO), están disponibles en la literatura para la biodegradación de derivados de grafeno. La enzima MPO, que es una peroxidasa liberada por los neutrófilos que llegan a la región de cuerpos extraños y realizan fagocitosis, está asociada con la biodegradación del grafeno, especialmente en el pulmón humano13. Los niveles de biodegradabilidad de los biomateriales compuestos que contienen grafeno en lugar de nanotubos de grafeno solos son diferentes entre sí. Es más fácil lograr esta propiedad deseada en materiales compuestos. Además, la determinación de la dosis tóxica de grafeno contribuye para el uso de biomateriales clínicamente aplicables13.
Una parte importante de la etapa de grafeno del protocolo es esterilizar el grafeno cuando se va a utilizar. Se evita el riesgo de contaminación que puede ocurrir durante la fase de interacción biohíbrido-célula.
Se investigó el efecto del patrón de hidrogel biohíbrido de grafeno-biotinta obtenido sobre la diferenciación nerviosa y fue compatible con la literatura que la diferenciación era mayor en el sistema 3D. La necesidad de la producción de biomateriales con enfoques terapéuticos basados en células de ingeniería tisular que puedan desarrollarse contra diversas enfermedades neurodegenerativas, como el daño a los nervios periféricos, está aumentando con la insuficiencia de los tratamientos actuales día a día, enfatizando la importancia de este estudio.
En un estudio previo, se investigó la interacción del grafeno con células en un medio de cultivo celular2D 28. Con la experiencia adquirida a partir de ahí, aquí, se agregó grafeno a la biotinta de alginato-gelatina con la proporción conocida, y se produjo un prototipo de biomaterial nuevo y único mediante un método de impresión 3D. Este nuevo material se utilizó para estudiar la interacción celular de dos maneras diferentes. El primero es la coimpresión del biomaterial compuesto celular en una impresora 3D. El segundo es la formación de un esferoide celular a partir del biomaterial. Además, también se observó la interacción de WJ-MSCs que contienen el gen GFP marcado con el material.
En este estudio, las biotintas biohíbridas se caracterizaron seleccionando métodos FTIR y SEM. Esto permite examinar las bolas de muestra formadas por el método de goteo durante la fase de caracterización. Especialmente porque podemos examinar una estructura dura y seca durante la etapa de baño de oro SEM, SEM proporciona la idoneidad física para obtener secciones mejores y delgadas con un bisturí de las bolas de biotinta que creamos con este método.
En este estudio de método, las células se agregaron al material biohíbrido de dos maneras diferentes durante los experimentos: en el interior para la bioimpresión 3D o durante la formación de esferoides. Cubrir las células con biotintas y usar bioimpresoras 3D permite a los investigadores crear cualquier forma 3D deseada para la regeneración nerviosa. Por otro lado, causa más estrés en las células debido a la presión de impresión y, por lo tanto, la pérdida de viabilidad celular. Sin embargo, podría ser un método más deseable para aumentar el localing celular cuando se inyectan o trasplantan a un área específica para inducir la regeneración.
La creación de esferoides en biotintas crea una forma más utilizable de tejido artificial en términos de interacción celular y proporciona un mejor nicho para la diferenciación celular. También es adecuado para imitar el microambiente natural y, por lo tanto, investigar los mecanismos celulares. La baja adhesión de los esferoides a las biotintas también permite una separación más fácil de las biotintas y la versatilidad de las aplicaciones.
Las N-cadherinas utilizadas (mostradas en verde en la Figura 7) forman parte de los mecanismos de señalización celular y juegan un papel importante en el desarrollo de las neuronas32. La β-tubulina de clase III es uno de los siete isotipos conocidos como marcadores neuronales en el genoma humano. Muestra que las WJ-MSC utilizadas en este estudio comienzan a formar estructuras similares a las neuronas. En este contexto, los sistemas 3D crearán un microambiente más adecuado para que las células mantengan su viabilidad.
Finalmente, debido al gasto involucrado y la aplicabilidad clínica de los sistemas de diferenciación celular, es muy importante en neuroingeniería desarrollar sistemas con liberación controlada de andamios, células y bioseñales de diferenciación33 en el futuro y adaptarlos a las clínicas como terapias combinadas. Por lo tanto, los métodos de esferoide y bioimpresión también se pueden utilizar en estudios adicionales donde el grafeno y otras bioseñales se incrustan en hidrogeles y se liberan de manera controlada. Los estudios in vitro son un paso importante en el camino hacia in vivo. Cuando el material, proporcionado aquí como prototipo, se produce de acuerdo con las normas de Buenas Prácticas de Laboratorio, se pueden alcanzar los estándares de esterilización requeridos para la transferencia a la clínica.
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Disclosures
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses. El proyecto se realizó en colaboración con HD Bioink, desarrollador de la tecnología de bioimpresión 3D.
Acknowledgments
El grafeno utilizado en este estudio fue desarrollado en la Universidad de Kirklareli, Departamento de Ingeniería Mecánica. Fue donado por el Dr. Karabeyoğlu. La prueba de toxicidad del grafeno fue financiada por el proyecto titulado "Impresión y diferenciación de células madre mesenquimales en bioimpresoras 3D con biotintas dopadas con grafeno" (Nº de solicitud: 1139B411802273) completado dentro del alcance del Programa de Apoyo a la Tesis de Pregrado TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis. La otra parte del estudio fue apoyada por el fondo de investigación proporcionado por los Proyectos de Investigación Científica de la Universidad Técnica de Yildiz (TSA-2021-4713). Las células madre mesenquimales con GFP utilizadas en la etapa de imagen de lapso de tiempo fueron donadas por Virostem Biotechnology. Los autores agradecen a Darıcı LAB y al equipo de YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB por sus discusiones productivas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
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