Summary
この原稿では、末梢組織工学で使用するためのグラフェンを含むバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製を示します。この3Dバイオハイブリッド材料を用いて、幹細胞の神経分化プロトコールを行う。これは、同様の生体材料を診療所に持ち込む上で重要なステップになる可能性があります。
Abstract
末梢神経障害は、軸索損傷の結果として、そして時には脱髄疾患のために起こり得る。末梢神経損傷は、救急患者の1.5%〜5%に発生する世界的な問題であり、重大な失業につながる可能性があります。今日、足場、適切な細胞株、およびバイオシグナルで構成される組織工学ベースのアプローチは、3次元(3D)バイオプリンティング技術の開発により適用可能になっています。末梢神経再生における既存の問題を克服するために、幹細胞、エクソソーム、またはバイオシグナル伝達分子と様々なヒドロゲル生体材料との組み合わせが頻繁に研究されています。したがって、ヒドロゲルなどの注射可能なシステム、または様々なバイオプリンティング法によって形成された埋め込み可能な導管構造の製造は、末梢神経工学において重要性を増している。通常の条件下では、幹細胞は体の再生細胞であり、それらの数と機能はそれらの集団を保護するために時間とともに減少しません。これらは特殊な細胞ではありませんが、損傷に応じて適切な刺激を受けると分化することができます。幹細胞システムは、幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境の影響下にあります。末梢神経損傷、特に神経緊張症では、切断された神経終末を外科的に結合した後でも、この微小環境を完全に救助することはできません。複合生体材料と複合細胞療法のアプローチは、生分解性、生体適合性、加工性などのさまざまな特性の観点から、材料の機能と適用性を向上させます。そこで、本研究では、グラフェンベースのバイオハイブリッドハイドロゲルパターニングの調製と使用を実証し、神経再生に有効なソリューションとなる幹細胞の神経細胞への分化効率を調べることを目的としています。
Introduction
生物の内部構造と環境を橋渡しするメカニズムである神経系は、中枢神経系と末梢神経系の2つの部分に分けられます。末梢神経損傷は、救急科に来院し、さまざまな外傷のために発症する患者の1.5%〜5%を構成する世界的な問題であり、重大な失業につながります1,2,3。
今日、末梢神経工学への細胞アプローチは非常に興味深いものです。幹細胞は、これらのアプローチで使用される細胞の中で最初に来ます。通常の条件下では、幹細胞は体の再生細胞であり、それらの数と機能はそれらの集団を保護するために時間とともに減少しません。これらの細胞は特殊化されていますが、損傷に応答して適切な刺激を受けると分化することができます4,5。幹細胞仮説によれば、幹細胞システムは幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境の影響下にあります。幹細胞の保存と分化は、細胞と足場7を使用した組織工学によって再構成できる微小環境6の存在なしには不可能です。組織工学は、工学と生物学の両方の原則を含む学際的な分野です。組織工学は、生体組織を置き換えることができ、損傷した組織を除去し、機能的な組織を提供することによってこれらの組織の再生に使用できる人工組織を作成するためのツールを提供する8。組織工学の3つの基礎の1つである組織足場は、天然および合成材料とは異なる方法を使用して製造されます9。3次元(3D)印刷は、さまざまな方法を使用して複雑な形状をシンプルかつ用途の広い製造することにより、欠陥のある組織を交換または修復するために広く使用されている新しい積層造形技術です。バイオプリンティングは、バイオインク10と呼ばれる細胞と生体材料の共存を可能にする積層造形方法です。神経細胞同士の相互作用を考慮すると、研究はグラフェンなどの導電性生体材料候補に移行しています。フレキシブルエレクトロニクス、スーパーキャパシタ、電池、光学、電気化学センサー、エネルギー貯蔵などの特性を有する単層カーボンナノプレートは、組織工学の分野で好ましい生体材料である11。グラフェンは、損傷した組織や臓器の増殖と再生が行われた研究で使用されています12,13。
組織工学は、足場、細胞、生体信号分子という3つの基本的な構成要素で構成されています。末梢神経損傷に関する研究には、これら3つの構造を完全に提供するという点で欠陥があります。幹細胞または生体シグナル分子のみを含む生体材料、幹細胞の分化を可能にする生理活性分子の欠如、使用される生体材料の生体適合性の欠如、および組織ニッチにおける細胞の増殖への影響の低さなど、研究で製造および使用される生体材料にはさまざまな問題がありました。 したがって、神経伝導は完全には実現されていません2,13,14,15,16。これには、神経再生の最適化、筋萎縮の減少17,18、およびそのような問題に対する成長因子を備えた必要なホーミング19の作成が必要です。この時点で、診療所に移される外科用生体材料プロトタイプの神経活動の特性評価と分析は非常に重要です。
したがって、この方法研究では、3Dバイオプリンターによって形成されたグラフェンナノプレートによるバイオインクヒドロゲルパターニングと、それに含まれる幹細胞の神経原性分化に対するその有効性を調査します。また、ニューロスフェアの形成と分化に対するグラフェンの影響も調査されています。
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Protocol
1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞の培養
- ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC、ATCC製)を-80°Cの冷凍庫から取り出します。Yurie et al.20に記載されているように、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペンストレプト、および1%L-グルタミンを含むDMEM-F12培地でWJ-MSCを室温の滅菌層流で培養します。
- 一部の細胞を、35%FBS、55%DMEMF-12、および10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む凍結培地で1 x 106 細胞/mLで凍結保存します。このために、トーマ細胞カウントスライド上の1 x 106 セルをカウントし、凍結溶液を滴下します。スライドを液体窒素容器にすばやく移します。
- 培養細胞がフラスコ内で80%コンフルエントになったら、培地を注ぎ出し、5 mLのPBSで洗浄します。5 mLの0.25%トリプシンと2.21 mM EDTA-4Naを加えます。37°Cのインキュベーターで5分間インキュベートします。
- インキュベーターから取り出した細胞に10%FBSを含むDMEM-F12培地10 mLを加えます。よく吊り下げ、培地を回収し、遠心チューブに移します。
- 室温で5分間、101 x g の回転速度で遠心分離します。上清を廃棄し、10%FBSを含む新鮮な栄養培地を新しいフラスコに細胞を再播種します。
注:形質導入法によってGFP遺伝子で標識された市販のWJ-MSCを使用して、産生される生体材料-細胞間相互作用をよりよく視覚化することができます21。この方法で使用するグループは、 表1に示すように作成できます。
| 作成されたグループ | 作成する理由 | 担当者数 | ||
| 2D WJ-MSC (2D-C) | 2Dコントロール | ×5 | ||
| 2D WJ-MSCs & Graphene (2D-G) | 2Dでのグラフェン毒性線量測定 | 異なる濃度のそれぞれに5回 | ||
| WJ-MSCはバイオインクに含まれています(3D-B) | 3Dコントロール | ×3 | ||
| WJ-MSCと0.1%グラフェンはバイオインクに含まれています(3D-G) | 3Dグラフェンバイオインクバイオハイブリッドグループ | ×3 | ||
| WJ-MSCはバイオインク上で回転楕円体型です(3D-BS) | 回転楕円体形態の3次元制御 | ×3 | ||
| WJ-MSCsおよびバイオインク上の0.1%グラフェンはスフェロイド型です(3D-GSグループ) | スフェロイド形態の3Dグラフェン-バイオインクバイオハイブリッドグループ | x3 | ||
| 3Dバイオインクドロップ | SEMおよびFTIRの特性評価分析用に製造されています。 | x5 | ||
| 3Dグラフェンドロップ | SEMおよびFTIRの特性評価分析用に製造されています。 | x5 | ||
| GFP標識WJ-MSCsおよび0.1%を用いた3Dバイオインク | 適切な用量のグラフェンを含むバイオインク中のWJ-MsCの動きの観察。 | x3 | ||
表 1. メソッド内のグループ。メソッド内のすべての 2D グループと 3D グループが含まれます。
2. グラフェン毒性と2Dイメージング
- グラフェン濃度の調製と細胞への応用
注:生のグラフェンナノ粒子は商業的に購入され(工業用グラフェンナノプレートタイプ)、寄付も行われました。粒子の寸法は、厚さ5〜8nm、直径5μm、表面積120〜150m2/gであった。- グラフェンを秤量して1%溶液(mg/mL)を作成します。秤量した100 μgのグラフェンナノ粒子に10%FBSを含む10 mLのDMEMF-12培地を加えてストック溶液を作り、この溶液をストック溶液としてラベル付けします。オートクレーブで121°C、気圧1.5で20分間滅菌します。
注:滅菌グラフェン混合物は、使用するまで4°Cの冷蔵庫に保存されます。長期使用(最大1ヶ月)には適さない場合があります。このような場合、混合物は再構成され滅菌されなければならない。 - 非毒性用量を決定するために、異なる濃度の培地グラフェンの混合物を調製する。初期希釈率を1%、0.1%、0.01%、0.001%、および0.0001%のグラフェン/培地に設定します。
- 1%ストック溶液から始めて、各濃度から1mLを連続して取り、新しいチューブに移します。10%FBSを含む9 mLのDMEMF-12培地を各チューブに加え、徐々に希釈した5つのサンプルを作成し、溶液を振とうしてボルテックスして均等に分配します。コントロールとして、10%FBSを含むDMEMF-12培地を10mLのみ使用してください。
注:グラフェンの重いフレークは沈殿するため、再分配する必要があります。 - WJ-MSCを6ウェルプレートに、10%FBSを含む2 mLの新しい培地を5 x 105 セル/ウェルに播種します。37°Cで1日間インキュベートします。 次に、プレートを等しい繰り返しウェルのグループに分けます。濃度ごとに5回繰り返します。
- 培地を廃棄し、培地をウェルあたり2 mLの培地濃度のグラフェンと交換します。コントロールグループの培地のみを使用してください。プレートを37°Cで24時間インキュベートします。
- グラフェンを秤量して1%溶液(mg/mL)を作成します。秤量した100 μgのグラフェンナノ粒子に10%FBSを含む10 mLのDMEMF-12培地を加えてストック溶液を作り、この溶液をストック溶液としてラベル付けします。オートクレーブで121°C、気圧1.5で20分間滅菌します。
- MTTによるグラフェンの非毒性濃度の測定
- 24時間後にグラフェンを含む培地を廃棄します。各ウェルをPBSで洗浄します。1ウェルあたり2mLで10%FBSを含む新鮮なDMEMF-12培地を追加します。
注:エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれないグラフェンナノ粒子は環境から除去されるため、細胞にグラフェン濃度を適用した後はPBSで洗浄することが重要です。これにより、MTTテストがより効率的になります。 - MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド)プロトコルを使用して、Koseら22 およびステップ2.2.3.-2.2.6に記載されているように、50%の細胞生存率を示すIC50値を決定します。
- まず、5 mg/mLのMTT塩を計量し、PBSに溶解します。0.45 μmフィルターを使用して滅菌します。15 mL遠沈管にしたMTT溶液をアルミホイルで包み、4°Cで保存します。
- 10 μLのMTTをすべてのウェルに加え、プレートを37°Cで4時間インキュベートします。 インキュベーション後の顕微鏡下でホルマザン結晶の形成を10倍の倍率で観察する。
- 細胞内に形成された結晶を溶解するには、各ウェルに100 μLのDMSOを加え、ピペッティングで混合します。プレートを室温で30分間暗所に保ちます。プレートをELISAプレートリーダーに挿入します。吸光度測定用のプログラムから波長570nmを設定し、プレート22を読み取らせる。
注:さらに、グラフェン粒子のみが270 nm23で読み取られますが、ここでの570 nm24 の読み取り範囲は、細胞生存率の読み取りのみを目的とします。 - 統計分析プログラムでテューキーの検定で一元配置分散分析を使用して、得られた結果の統計分析を実行します。
- 24時間後にグラフェンを含む培地を廃棄します。各ウェルをPBSで洗浄します。1ウェルあたり2mLで10%FBSを含む新鮮なDMEMF-12培地を追加します。
- ステッチイメージング
- 異なるグラフェン濃度と細胞との相互作用を調べるには、ステッチイメージングと呼ばれる方法で細胞のタイムラプスを実行します。この方法は、顕微鏡下で一定間隔で撮影された画像サンプルを使用してタイムラプス画像を作成します。
- これを行うには、最初にコンピューターの電源を入れます。タイムラプスイメージングインキュベーターの電源を入れ、37°Cに設定します。 MTTプレートをタイムラプスインキュベータースロットに入れます。
- コンピューターでStitchプログラムを開きます。システムで読み取るウェルを指定します。リーダーを最初のウェルに持ってきて、白色光の中で10倍の倍率で領域を見つけて焦点を合わせます。プログラムを起動します。
注:これは、高品質の4行x5列の複数の写真コラージュを作成するためのプログラムです。このプログラムは、次々に撮影した写真をHD品質で組み合わせます。システムスタートボタンを押すと、ウェルが自動的に読み込まれ、4行×5列の複数の写真を撮影してステッチします。
3. グラフェン - バイオインクバイオハイブリッドヒドロゲル生産とWJ-MSCの分化
- バイオインクの製造
注:凍結乾燥された市販のアルギン酸ゼラチン(3:5)粉末は、バイオインクの基礎として使用されます。グラフェンバイオインク群(3D−G;3D−GS)およびグラフェンフリーコントロールバイオインク群(3D−B;3D−BS)を同じ方法で調製する(表1)。- 調製には50mLのコニカルチューブを使用してください。まず、アルギン酸塩4.5 mgとゼラチン1.5 mgを量り、遠沈管に移します。10%FBSを含むDMEMF-12培地を混合物に全容量50mLまで加えます。これはグラフェンを含まない対照(C)群である。
- 4.5 mgのアルギン酸塩と1.5 mgのゼラチンの計量を繰り返し、遠沈管に移します。次に、ステップ2.1.3から調製した0.1%グラフェンを50μL採取します。そしてそれをチューブに加えます。10%FBSを含むDMEMF-12を総容量50 mLに加えます。
- バイオインクを最初にピペッティングで混合し、次にボルテックスで混合します。オートクレーブで121°C、気圧1.5で20分間滅菌します。あるいは、沸点まで電子レンジで殺菌を行う。
- 混合物をオートクレーブした後、280 x g で室温で2分間遠心分離し、形成された気泡を除去します。細胞が調製されるまで、バイオインクを37°Cに保ちます。
- WJ-MSCと3Dバイオプリンティングの追加
- カウントするには、約5 mLのPBSで80%のコンフルエントがあるときに細胞を洗浄し、5 mLの0.25%トリプシンと2.21 mM EDTA 4Naを追加します。37°Cで5分間放置する。
- インキュベーターから取り出した後、10%FBSを含む10 mLのDMEM-F12培地を細胞に加えます。よく懸濁し、培地を集めて遠沈管に移します。室温で101 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- ペレットと一緒に約250μLの培地を残します。ペレットを1 mLの新しい培地に再溶解します。48 μLの培地に、2 μLの細胞懸濁液と50 μLのトリパンブルー(0.4 gトリパンブルー/ 100 mL)を円錐形のチューブ(1.5 mL)に入れてカウントします 4.よくピペットで入れてください。
- 調製した染色細胞懸濁液約10 mLをトーマ細胞計数チャンバーに加えます。光学顕微鏡の両側の正方形に落ちる細胞の平均数を計算します。
活力率(%)=(カウントされた生細胞/カウントされた総細胞数)x 100を計算します
注:細胞とバイオインクの相互作用は2つの方法で研究されます:(1)バイオインク(3D-B; 3D-G)に追加することで印刷できます。(2)細胞をプレス後にバイオインク上に播種し、細胞をスフェロイド(3D-BS;3D-GS)を形成する。 - 細胞とバイオインクの相互作用のために、まずバイオインクグループを作成します(表1)。グループ1は、バイオプリンティング用のバイオインクで印刷された3D−Bおよび3D−Gを含む。グループ2には、バイオプリンティング後にスフェロイドが形成された3D-BSおよび3D-GSバイオインクが含まれます。
- グループ1の細胞を数えて、0.5 mLの培地中に約1 x 107 個の細胞が存在するようにします。4.5 mLのバイオインクを加えて、総容量を5 mLにします。注射器の助けを借りて、これを滅菌キャビネット内のカートリッジに移します。バイオプリンターの対応する押出機セクションにカートリッジを取り付けます。
- 2番目のグループについては、各バイオインクグループから5 mLを採取し、インジェクターを使用して滅菌カートリッジに移します。
- 2つの同軸プリントヘッドと空気圧駆動の押出技術を備えたバイオプリンターを使用してください。マイクロステップあたりのX/Y/Z分解能を1.25μm、押し出し幅を400μm、押し出し高さを200μmに設定します。20 mm x 20 mm x 5 mmのグリッドは、3Dバイオプリンティング作業に最もよく使用される3Dモデルの1つです。
- オープンソースのWebベースのCADプログラムを使用して3Dモデルを作成します。バイオプリンティングの前に、オープンソースプラットフォームの1つ(インフィルなど)を使用して簡単な3Dモデルを作成します。モデルは、線形(ここで使用するモデルのように)、ハニカム、またはグリッド形状にすることができます。5 mm x 20 mm x 20 mmの正方形を作成した後、.stl形式でエクスポートおよびダウンロードします。
- バイオプリンターソフトウェアは.stlファイルを使用し、スライサーモジュールを使用して印刷可能な.gcode形式に変換します。印刷可能なグリッド形状を取得するには、スライサー モジュールで外殻を無効にします。操作前に70%エタノールでデバイスを拭き、UV滅菌で滅菌してください。
- バイオプリンティングプロセスでは、インジェクターを使用してバイオインクグループをカートリッジに移します。バイオプリンターの対応する押出機セクションにカートリッジを取り付けます。
- 3Dプリンターの平均圧力を7.5psiに設定し、カートリッジとベッドの温度を37°Cに設定します。 速度を60%に設定し、標準の3D印刷プロセスを実行します。
注:準備されたモデルをスペース(線形モデルなど)で計画すると、バイオプリンティング後にスペースで細胞培養を行うことができます。 - 書き込みフェーズ中にシステムをホーム位置にします。軸(X、Y、Z)を自動的に配置し、押出機を選択して設定します。印刷プロセスを開始します。バイオプリンティングプロセスの後、サンプルを採取し、層流キャビネットの下に置きます。
- 印刷後にバイオインクに0.1 N CaCl2溶液をスプレーするか、室温でピペットで1 mLの溶液を追加します。約10〜20秒待ってから、印刷されたパターンをCa2+とMg2+を含むPBSで2倍洗浄します。
- 各細胞含有バイオインクグループの上に、10%FBS培地を含むDMEMF-12を2 mL加えます。プレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。その後、スフェロイド形成のために、1 x 106 細胞を含む懸濁液2 mLを各グループに追加します。
- プレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。24時間のインキュベーション後、倒立顕微鏡でスフェロイド形成を観察します。
- WJ-MSCの神経細胞様細胞への分化
- インキュベーションの24時間後にバイオインクのすべてのバッチを観察して写真を撮ります。ウェルあたり2 mLの神経原性分化培地を追加し(対照群を除く)、2日ごとにリフレッシュします。神経分化を観察するために7日間追跡します。
4. グラフェン-バイオインクバイオハイブリッドヒドロゲルの特性評価
注:グラフェン-バイオインクバイオハイブリッドヒドロゲルの特性評価のために、タイムラプスイメージング、フーリエ変換赤外分光法(FT / IR)、および走査型電子顕微鏡(SEM)分析が実行されます。サンプルは、FT / IRおよびSEM分析用のドリップ法によって3D-Bおよび3D-Gバイオインクグループから作成されます。
- FT/IR分析
注:FT/IRは、数学的フーリエ変換に基づく化学分析法であり、材料のキャラクタリゼーションに不可欠です。28°Cのマイケルソン干渉計の原理に基づくFT/IRデバイスを使用し、ハロゲンランプ、水冷水銀光源、信号アスペクト比4 cm-1、2,200 cm-1で1分間測定します。- FT / IR顕微鏡を準備し、機器の光学系が揃っていることを確認します。デバイスを調整します。
- サンプルは一滴になっているので、厚さ1〜2 mmのヒドロゲル片を取り、サンプル部分に鉗子を付けて置きます。サンプルに焦点を合わせ、密着するまで上げます。システムからプロセスを開始して、サンプルスペクトルを収集します。
- 走査型電子顕微鏡(SEM)分析
注:表面形態、内部構造、細胞分布、およびバイオインクと細胞の相互作用は、さまざまな次元のSEM分析によって調べることができます。- ピペットチップドロップレット法を使用して、1 mLのCaCl2 架橋剤を含む6ウェルプレートにヒドロゲルを滴下します( 図1を参照)。
- プレートを約1 mLのPBSで2回洗浄して、塩の溶液を遊離させます。次に、これらの滴を鉗子の助けを借りて5mLの5%パラホルムアルデヒドを含むファルコンチューブに入れます。
- メスの助けを借りてドロップバイオインクから薄い切片を作ります。金属板の粘着面にサンプルを貼り付けます。空気をアルゴンガスで置き換えることによってプラズマ相に入る金パラジウムがサンプルを覆うコーティング装置に挿入します。
- 電子顕微鏡(SEM)に入れます。SEMが接続されている顕微鏡プログラムを開きます。スケーリングを実行し、サンプルのさまざまな部分の画像を撮ります。このプロトコルでは、5 μm、10 μm、および200 μmのスケールを使用しました。3D-B群と3D-G群で合計40枚の画像を撮影した。
- タイムラプスイメージング
注:タイムラプスイメージングでは、GFP遺伝子形質転換細胞を含むバイオインクサンプルだけでなく、スフェロイドを含むバイオインクも16時間イメージングされます。タイムラプスイメージングは、幹細胞に対するグラフェンの影響を調べ、バイオインク内の細胞相互作用を監視するために実行されます。- 市販の1 x 107 GFP標識MSCを、ステップ3.2.11のように5 mLのバイオインクとバイオプリントに加えます。1 mLの架橋剤を加え、20〜30秒間保持し、PBSで2回洗浄します。
- タイムラプスモニターの電源を入れ、コンピューターでプログラムを開きます。タイムラプスモードで約16時間設定し、温度を37°Cに設定します。 スタート ボタンを押します。40秒のタイムラプスビデオサンプルの形式のビデオがシステムによって記録されます。
- 2時間ごとに10倍の倍率で顕微鏡の焦点を合わせます。また、同じ手順に従って作成された回転楕円体を視覚化します。
図1:特性評価に使用するためのドロップとして製造された3D-Bおよび3D-Gバイオインクグループ。 (A)架橋剤を含むプレート上のバイオインクサンプル(事前特性評価画像)。(B)バイオインクの3D-Bドロップ画像。(C)3D-Gバイオインクドロップ画像。特性評価される生体材料とそれに含まれる細胞は、金メッキ、サンプリングなどのプロセスをより簡単に通過できます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. 免疫染色法による神経原性分化の判定
- 球体の形成を中断することなくスフェロイドを収集し、組織切片作成のためにパラフィンに埋め込む代わりに、新しいプレートに再播種してより簡単な方法で再染色します。
- 48ウェルプレートを約20 mLのオートクレーブ滅菌済み0.1%ゼラチン溶液で覆い、インキュベーターに少なくとも1時間保持します。調製した0.1%ゼラチン約500 μLを48ウェルプレートにピペットで入れます。ゼラチン状プレートをインキュベーターに10分間放置します。
注:これにより、ゼラチンがわずかに膨潤し、表面を覆い、収集されたスフェロイドが付着するためのより良い環境が作成されます。 - ピペッティングでスフェロイドを収集し、収集したスフェロイドをインキュベーターから48ウェルプレートのウェルに分配し、新鮮な培地を追加します。その後、12〜24時間インキュベートします。
注:回転楕円体をカウントして分布させることは非常に困難です。スフェロイドを単一のチューブに集め、全量をウェルに均等に分配します。この研究では、各ウェルには約4〜6個のスフェロイドが含まれていました。
注意: 2Dサンプルの場合、事前に染色洗浄するだけで十分であり、メディアの交換は必要ありません。 - 培地を取り出し、スフェロイドが一番上になるようにPBSで細胞をゆっくりと洗浄します。4%パラホルムアルデヒドで2時間固定します。
- サンプルを再度PBSで洗浄し、約10 mLの2%BSAと0.1%TritonXで30分間ブロックします。その後、PBSで3回洗浄します。
- 選択したプライマー抗体(N-カドヘリン-ウサギおよびβ-IIIチューブリン-マウス)を抗体希釈試薬溶液で1:100の比率で希釈します。各サンプルに100 μLの抗体溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
- サンプルをPBSで3回洗浄します。β-IIIチューブリン用の抗マウスIgG-FTIC-ウサギと、室温で30分間1:200に希釈したN-CAD用の抗マウスIgG-SC2781ヤギ二次抗体と一緒にインキュベートします。暗闇の中ですべての操作を実行してください。
注:二重染色で一次抗体として使用する株(マウスなど)に関係なく、二次抗体には別の株(ヤギやウサギなど)を使用する必要があります。 - 二次抗体をPBS 3xで洗浄し、DAPI溶液(1:1)を各サンプルに滴下します。15〜20分待ちます。免疫蛍光イメージングを実行します。
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Representative Results
グラフェン毒性と2Dイメージング
得られたMTT結果の統計解析を統計解析ソフトでテューキー検定による一元配置分散分析で行い、得られたグラフを 図2に示す。対照と比較したグラフェン百分率は、0.001%グラフェン濃度(**p < 0.01)についてのみ有意な減少を示した。他の群と対照との間に有意差はなかった(p > 0.05)。したがって、MTT試験結果およびステッチング画像に従って、この濃度への曝露後に最も高い生存率が観察されたため、最適なグラフェン濃度は0.1%であると決定された。
図2:細胞増殖に対するグラフェン濃度の影響の調査。 対照と比較したグラフェン百分率は、0.001%のグラフェン濃度についてのみ有意な減少を示した(**p < 0.01、n = 6)。他の群と対照との間に有意差はなかった(p > 0.05;n = 6)。得られたMTT結果の統計解析は、統計解析ソフトウェアにおけるテューキーの検定を用いた一元配置分散分析を用いて行った。エラーバーは標準偏差を表します。この数値は28から変更されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
提示された方法のこの部分は、幹細胞-グラフェン相互作用が将来の研究に使用できることを示しています。試験した各濃度において、グラフェンは2D系で許容され、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれることが観察されました(図3)。グラフェンプレートは細胞内の細胞質に沿って移動することが決定されています。
図3:細胞-グラフェン相互作用は、ステッチ画像で2次元で示されています。 (a)コントロール;(B) 0.0001%;(C) 0.001%;(D) 0.01%;(E) 0.1%;(F)1%濃度のグラフェン。タイムラプスイメージングと高精細品質設定を組み合わせて、複数の写真の4行x5列のコラージュを取得することによって得られます。この数値は 28から変更されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
さらに、この研究では、グラフェン-バイオインク効果が3Dシステムに有毒な微小環境を作成せず、細胞が相互作用していることが観察されました。
また、3Dシステムでのグラフェンの使用は、有毒な微小環境を作成しないことも観察されています。細胞の毒性量を決定することは、長期導管インプラントまたは注射可能なヒドロゲル形態でのグラフェンの使用にとって非常に重要です。さらに、グラフェンはニューロンコミュニケーションに有効な材料であるため、文献25に記載されているように、神経組織工学の用途でのその使用が広く増加しています。
複合バイオマテリアルと3Dバイオプリンティングの製造
ゼラチン-アルギン酸塩ベースのバイオインクバイオハイブリッドパターニングの形成は、非毒性濃度のグラフェン(0.1%)で行われました。選択された適切な用量のグラフェンがバイオインク中の細胞と相互作用することが観察されている。
タイムラプスイメージング
GFPサンプルを37°Cで約16時間タイムラプスでセットし、写真とビデオを撮影しました(ビデオ1)。GFPシグナルは、細胞死が観察されたときに失われました。ここでは、3Dグラフェン培地で生き残った細胞は、インキュベーション終了までGFPの明るさが観察されたため、活力を維持していることが検出されました。
ビデオ 1. GFP標識WJ-MSCのタイムラプスビデオ。標識幹細胞同士の相互作用が観察される。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
グラフェン-バイオインクバイオハイブリッドヒドロゲルの特性評価
SEMおよびFT/IRは、ドロップバイオインク法によって作成された3D-Bおよび3D-Gグループのキャラクタリゼーションに使用されました。3D-Bおよび3D-GバイオインクグループのSEM画像を 図4に示します。手順4.2.5で撮影した40枚の画像のうち、代表的な4枚をここに示します。
図4:3D-Bおよび3D-GバイオインクグループのSEM画像。 (A)電子顕微鏡による金コーティングされた3D-Bバイオインク切片の画像。スケールバー:200μm。 (B)3D-Bバイオインク内面に付着したMSCの画像。スケールバー:5 μm (C) 3D-Gバイオインクの内面と外面の画像。スケールバー:200μm(D) 内面細胞3D-Gバイオインク接着画像。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
したがって、バイオインクと細胞の相互作用は、表面と内部の両方で実証されました。両方のバイオインク(3D-B;3D-G)で細胞-生体材料相互作用があった。細胞は形態学的に丸く、材料に付着していた。3D-Bおよび3D-GバイオインクドロップのFT/IR分析を 図5のグラフと比較した。
図5:FT/IR分析。 (A)3D-Bバイオインク。(B)3D-Gバイオインク。1633.41 cm−1、1552.42 cm−1、および1033 cm−1などのピークは、文献26のアルギン酸ゼラチンベースのヒドロゲル研究で見出されている。また、1335.46 cm−1のピークは、グラフェン生体材料研究27で見られるピークと類似している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
対照バイオインク(3D-B)はアルギン酸塩/ゼラチンに基づいていたため、最も顕著なピークは、1546 cm-1にピークが見られる文献の同様の研究と比較して、約1633.41 cm-1、1552.42 cm-1、および1033 cm-1でした26。グラフェングループ(3D-G)で1399 cm-1のピークが観察され、グラフェン27で実施された研究では1335.46 cm-1に同様のピークが見つかりました。
3D神経分化
分化後7日目以降のバイオインク上のスフェロイドの画像を 図6に示します。
図6:分化後7日目の対照WJ-MSCおよびスフェロイド群サンプルの2D画像 。 (A)直径160μmおよび200μmの3D-BSグループバイオインクからの球のサイズ。 (B)2Dコントロール細胞。(C)3D-BS群および(D)3D-GS群からの回転楕円体。(D)の黒色物質は、スフェロイドと一体化したグラフェン分子である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
細胞は2D培養と3D培養の両方で活力を維持していることがわかりました。両群(3D-Bと3D-G)のスフェロイド細胞の境界は透明で生き生きとしており、グラフェン群のスフェロイドは比較的大きく、グラフェンを細胞内に閉じ込めていると考えられた。鑑別も免疫染色により試験した。ここで使用した二重染色を用いて、2Dニューロン形質転換における細胞の活性を3D培養と比較した(図7)。
図7:2Dおよび3D細胞の免疫染色。 (A,B)3D-BSバイオインク上の培養スフェロイドの免疫染色。(C,D)3D-GSバイオインクスフェロイド免疫染色剤。(E)分化した2DポジティブコントロールWJ-MSC。 (F)未分化な2DネガティブコントロールWJ-MSC。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
7日間培養した細胞の免疫蛍光画像を図7に示す。サンプルをN-カドヘリン(緑)およびβ-IIIチューブリン(赤)に特異的な抗体で染色した。さらに、DAPIは核(青または紫)の視覚化に使用されました。したがって、2Dおよび3Dサンプルで使用されたN-カドヘリン(緑色)は、シグナル伝達メカニズムとニューロンの発達に重要な役割を果たすため、7日間にわたって異なっていました。図7A-Eの緑色の画像は、ニューロン様構造を表す(図7)。クラスIII βチューブリンは、ヒトゲノムのニューロンマーカーとして知られる7つのアイソタイプの1つです。N-カドヘリン発現は、β-IIIチューブリンと比較して7日間分化したサンプルでより高いことがわかった。本実験の結果によると、3Dシステムは、細胞が生存し分化するためのより適切な微小環境を作り出すことが確立された。2D陽性対照サンプル(図7E)は、3Dサンプル(図7A-D)と比較してニューロン様構造マーカーの発現が少なかった。これは、3D構造で作成された微小環境が幹細胞の分化に効果的であることを示しています。さらに、細胞療法単独の代わりに;生体材料と細胞を組み合わせた治療は、神経損傷においてより影響力があり効果的であるように思われます。
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Discussion
従来の2D手法に対するエンジニアリングされた3D足場で適用される処理の利点は、日々ますます顕著になっています。これらの治療法で単独で、または生体適合性と生分解性の低いさまざまな生体材料から製造された足場と一緒に使用される幹細胞は、通常、末梢神経の再生には不十分です。ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)は、特に取得のためのプロトコルの最適化、それらの増殖能力、およびそれらの分化能力を考慮すると、適切な候補細胞株であるように思われます29。この研究では、2Dおよび3D培養の両方で幹細胞とグラフェンの相互作用を調べました。また、生成されたバイオハイブリッドヒドロゲル群の神経原性分化を2D環境と比較しました。バイオインク上でのニューロスフェア形成を免疫染色により実証した。さらなる研究では、神経チャネルとして注入または移植できる候補プロトタイプをSEMおよびFT / IR法によって特徴付けました。この研究は、生産された生体材料の特性、細胞と生体材料の相互作用、および生体材料の存在下での幹細胞の神経分化を特徴付けます。次の段階では、移行への影響が検討されます。
2つ以上の生体適合性材料を組み合わせて形成されるバイオハイブリッド材料は、均質材料30と比較して、その構造特性の点でより有利になりつつある。以前の研究では、顔面末梢神経へのポリグリコール酸ベースの神経管チャネルの移植が行われました。標識された嗅幹細胞をこの導管に挿入し、末梢手術および注入幹細胞療法の再生に成功した16。別の研究では、ヒト正常皮膚線維芽細胞とその不活性特性のために文献で頻繁に使用されているシリコン神経管を使用して開発された複数の細胞スフェロイドから得られた3D構造の有効性を、坐骨神経損傷の再生において比較しました。スフェロイドベースの3D構造は、均質な材料と比較して、坐骨損傷のある動物モデルで組織再生を有意かつ迅速に増加させることが示されました20。しかし、文献で頻繁に使用されているシリコンベースの生体材料には、感染リスクが高く、生体適合性が低いなど、いくつかの重要な欠点があることが知られています15,30。
本研究では、神経伝導に有効であることが知られているグラフェンナノプレートレットを用いた生体適合性の生分解性ヒドロゲルバイオハイブリッド複合組織の製造を、3D印刷技術によって行った。グラフェンが神経伝導の生体材料として使用されているさまざまな研究があります25,30。さらに、グラフェンは入手可能な最も薄くて軽い材料の1つであり、健康技術における嗜好が高まっています13。生体材料の最も望ましい特性の1つは生分解性です。グラフェンとその誘導体の生分解を調べるために、実験的および分子シミュレーション技術が適用されています13。この時点で、表面修飾 - 官能化または複合生体材料の形態での生産は、添加剤の特性に大きく依存して、生分解を改善または阻害することができる。
マンガンペルオキシダーゼ(MnP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)などのさまざまな酵素が、グラフェン誘導体の生分解に関する文献で入手可能です。MPO酵素は、異物の領域に来て食作用を行う好中球から放出されるペルオキシダーゼであり、特にヒト肺におけるグラフェン生分解に関連しています13。単層カーボンナノチューブ単独の代わりにグラフェンを含む複合生体材料の生分解性レベルは互いに異なる。複合材料でこの所望の特性を達成することはより容易である。さらに、グラフェンの毒性用量を決定することは、臨床的に適用可能な生体材料の使用に寄与する13。
プロトコルのグラフェン段階の重要な部分は、グラフェンを使用するときに滅菌することです。バイオハイブリッド細胞相互作用段階で発生する可能性のある汚染のリスクが回避されます。
得られたバイオハイブリッドグラフェン-バイオインクヒドロゲルパターニングが神経分化に及ぼす影響を調べたところ、3D系の方が分化が高いという文献と合致した。末梢神経損傷などの様々な神経変性疾患に対して開発可能な組織工学的細胞ベースの治療アプローチによる生体材料の製造の必要性は、現在の治療法の不十分さとともに日々高まっており、この研究の重要性を強調しています。
以前の研究では、2D細胞培養培地中のグラフェンと細胞との相互作用が調査されました28。そこから得られた経験をもとに、ここでは、既知の比率でアルギン酸-ゼラチンバイオインクにグラフェンを添加し、3D印刷法によって新しいユニークな生体材料のプロトタイプを作成しました。この新しい材料は、2つの異なる方法で細胞相互作用を研究するために使用されました。1つ目は、3Dプリンターでの細胞複合生体材料のコプリンティングです。第二は、生体材料からの細胞スフェロイドの形成である。さらに、タグ付きGFP遺伝子を含むWJ-MSCと物質との相互作用も観察されました。
この研究では、バイオハイブリッドバイオインクは、FTIRおよびSEM法を選択することによって特徴付けられました。これらにより、ドリップ法で形成されたサンプルボールを特性評価段階で検査することができます。特にSEMの金めっき段階で硬く乾燥した構造を調べることができるため、SEMは、この方法で作成したバイオインクボールからメスでより良い薄い切片を得るための物理的適合性を提供します。
この方法研究では、実験中に細胞を2つの異なる方法でバイオハイブリッド材料に添加した:3Dバイオプリンティングのための内部またはスフェロイド形成中。細胞をバイオインクで覆い、3Dバイオプリンターを使用することで、研究者は神経再生に必要な3D形状を作成できます。一方、印刷圧力により細胞により多くのストレスが発生し、したがって細胞の生存率が低下します。ただし、再生を誘導するために特定の領域に細胞を注入または移植するときに、細胞ホーミングを増加させることがより望ましい方法である可能性があります。
バイオインク上にスフェロイドを作成することは、細胞相互作用の観点からより使用可能な形態の人工組織を作成し、細胞分化のためのより良いニッチを提供する。また、自然の微小環境を模倣し、したがって細胞メカニズムを調査するのにも適しています。バイオインクへのスフェロイドの接着性が低いため、バイオインクからの分離が容易になり、用途が多様になります。
使用されるN-カドヘリン( 図7の緑色で表示)は、細胞シグナル伝達メカニズムの一部であり、ニューロン32の発生に重要な役割を果たします。クラスIII βチューブリンは、ヒトゲノムのニューロンマーカーとして知られる7つのアイソタイプの1つです。本研究で用いたWJ-MSCがニューロン様構造を形成し始めることを示している。これに関連して、3Dシステムは、細胞が生存能力を維持するためのより適切な微小環境を作成します。
最後に、細胞分化システムの費用と臨床適用性のために、将来的には足場、細胞、および分化生体シグナル33の制御放出を備えたシステムを開発し、これらを併用療法として臨床に適応させることが神経工学において非常に重要です。したがって、スフェロイドおよびバイオプリンティング法は、グラフェンおよび他の生体シグナルがヒドロゲルに埋め込まれ、制御された方法で放出されるさらなる研究においても使用することができる。インビトロ研究は、インビボへの道の重要なステップです。ここでプロトタイプとして提供される材料が、適正実験室基準に従って製造されると、診療所への移送に必要な滅菌基準を達成することができます。
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Disclosures
著者は、利益相反はないと宣言しています。このプロジェクトは、3Dバイオプリンティング技術の開発者であるHD Bioinkと共同で実施されました。
Acknowledgments
この研究で使用されたグラフェンは、カークラレリ大学の機械工学科で開発されました。カラベヨオール博士から寄贈されました。グラフェン毒性試験は、TÜBİTAK 2209-B産業指向学部論文支援プログラムの範囲内で完了した「グラフェンドープバイオインクを使用した3Dバイオプリンター上での間葉系幹細胞の印刷と分化」(出願番号:1139B411802273)というタイトルのプロジェクトによって資金提供されました。研究の他の部分は、ユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)によって提供された研究資金によってサポートされました。タイムラプスイメージング段階で使用したGFPを有する間葉系幹細胞は、バイロステムバイオテクノロジーから寄贈されました。著者らは、生産的な議論をしてくれたDarıcıLABとYTU細胞培養および組織工学LABチームに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
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