Summary
I dette manuskriptet demonstrerer vi fremstillingen av et biohybrid hydrogelbioblekk som inneholder grafen til bruk i perifer vevsteknikk. Ved hjelp av dette 3D biohybridmaterialet utføres den nevrale differensieringsprotokollen for stamceller. Dette kan være et viktig skritt i å bringe lignende biomaterialer til klinikken.
Abstract
Perifere nevropatier kan oppstå som følge av aksonal skade, og noen ganger på grunn av demyeliniserende sykdommer. Perifer nerveskade er et globalt problem som oppstår hos 1,5% -5% av akuttpasienter og kan føre til betydelig tap av jobb. I dag har vevsteknikkbaserte tilnærminger, bestående av stillas, passende cellelinjer og biosignaler, blitt mer anvendelige med utviklingen av tredimensjonale (3D) bioprintingsteknologier. Kombinasjonen av forskjellige hydrogelbiomaterialer med stamceller, eksosomer eller biosignalmolekyler studeres ofte for å overvinne de eksisterende problemene i perifer nerveregenerering. Følgelig har produksjonen av injiserbare systemer, for eksempel hydrogeler, eller implanterbare ledningsstrukturer dannet ved ulike bioprintingsmetoder, fått betydning i perifer nevroteknikk. Under normale forhold er stamceller kroppens regenerative celler, og deres antall og funksjoner reduseres ikke med tiden for å beskytte deres populasjoner; Disse er ikke spesialiserte celler, men kan differensiere ved passende stimulering som respons på skade. Stamcellesystemet er under påvirkning av sitt mikromiljø, kalt stamcellenisjen. I perifere nerveskader, spesielt i neurotmesis, kan dette mikromiljøet ikke reddes fullt ut selv etter kirurgisk binding av avskårne nerveender sammen. Den sammensatte biomaterial- og kombinerte cellulære terapitilnærmingen øker funksjonaliteten og anvendeligheten til materialer når det gjelder forskjellige egenskaper som biologisk nedbrytbarhet, biokompatibilitet og bearbeidbarhet. Følgelig har denne studien som mål å demonstrere fremstilling og bruk av grafenbasert biohybrid hydrogelmønster og å undersøke differensieringseffektiviteten av stamceller i nerveceller, noe som kan være en effektiv løsning i nerveregenerering.
Introduction
Nervesystemet, som er mekanismen som broer den indre strukturen til organismen og miljøet, er delt inn i to deler: det sentrale og perifere nervesystemet. Perifer nerveskade er et globalt problem som utgjør 1,5% -5% av pasientene som kommer til beredskapsavdelingen og utvikler seg på grunn av ulike traumer, noe som fører til betydelig jobbtap 1,2,3.
I dag er cellulære tilnærminger til perifer nevroteknikk av stor interesse. Stamceller kommer først blant cellene som brukes i disse tilnærmingene. Under normale forhold er stamceller kroppens regenerative celler, og deres antall og funksjoner reduseres ikke med tiden for å beskytte deres populasjoner; Disse cellene er spesialiserte, men kan differensiere ved passende stimulering som respons på skade 4,5. Ifølge stamcellehypotesen er stamcellesystemet under påvirkning av sitt mikromiljø, kalt stamcellenisjen. Bevaring og differensiering av stamceller er umulig uten tilstedeværelse av deres mikromiljø6, som kan rekonstitueres via vevsteknikk ved hjelp av celler og stillaser7. Tissue engineering er et tverrfaglig felt som inkluderer både engineering og biologi prinsipper. Tissue engineering gir verktøy for å lage kunstige vev som kan erstatte levende vev og kan brukes i regenerering av disse vevene ved å fjerne det skadede vevet og gi funksjonelle vev8. Vevsstillas, en av de tre hjørnesteinene i vevsteknikk, produseres ved hjelp av forskjellige metoder fra naturlige og syntetiske materialer9. Tredimensjonal (3D) utskrift er en fremvoksende additiv produksjonsteknologi som er mye brukt til å erstatte eller gjenopprette defekte vev via sin enkle, men allsidige produksjon av komplekse former ved hjelp av ulike metoder. Bioprinting er en additiv produksjonsmetode som muliggjør sameksistens av celler og biomaterialer, kalt bioblekk10. Tatt i betraktning samspillet mellom nerveceller med hverandre, har studier skiftet til ledende biomaterialkandidater som grafen. Grafen nanoplater, som har egenskaper som fleksibel elektronikk, superkondensatorer, batterier, optikk, elektrokjemiske sensorer og energilagring, er et foretrukket biomateriale innen vevsteknikk11. Grafen har blitt brukt i studier hvor spredning og regenerering av skadede vev og organer ble utført12,13.
Vevsteknikk består av tre grunnleggende byggesteiner: stillas, celler og biosignalmolekyler. Det er mangler i studiene på perifer nerveskade når det gjelder å gi disse tre strukturene helt. Ulike problemer har oppstått i biomaterialene som er produsert og brukt i studiene, for eksempel at de bare inneholder stamceller eller biosignalmolekyler, mangelen på et bioaktivt molekyl som vil muliggjøre stamcelledifferensiering, mangelen på biokompatibilitet av det biomaterialet som brukes, og den lave effekten på spredning av celler i vevnisjen, og dermed nerveledning ikke fullt ut realisert 2,13,14,15,16. Dette krever optimalisering av nerveregenerering, reduksjon av muskelatrofi 17,18, og skape nødvendig homing19 med vekstfaktorer mot slike problemer. På dette tidspunktet er karakterisering og analyse av nevroaktiviteten til en kirurgisk biomaterialprototype, som skal overføres til klinikken, svært viktig.
Følgelig undersøker denne metodestudien bioblekkhydrogelmønsteret med grafennanoplater dannet av en 3D-bioprinter og dens effektivitet på den neurogene differensieringen av stamcellene den inneholder. Også effekten av grafen på nevrosfæredannelse og differensiering undersøkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrking av Whartons gelé mesenkymale stamceller
- Ta Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSCs, fra ATCC) ut av en -80 ° C fryser. Kultur WJ-MSC i DMEM-F12 medium inneholdende 10% føtal kalv serum (FBS), 1% Pen-Strep, og 1% L-glutamin i en steril laminær strømning ved romtemperatur, som beskrevet i Yurie et al.20.
- Kryokonreservere noen av cellene ved 1 x 106 celler/ml med frysemedium inneholdende 35% FBS, 55% DMEMF-12 og 10% dimetylsulfoksid (DMSO). For dette, tell 1 x 106 celler på et Thoma-celletellingslysbilde og legg til fryseløsningen dråpevis. Overfør lysbildet raskt til en beholder med flytende nitrogen.
- Når dyrkede celler er 80% sammenflytende i kolben, hell ut mediet og vask med 5 ml PBS. Tilsett 5 ml 0,25% trypsin og 2,21 mM EDTA-4Na. Inkuber i en inkubator ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilsett 10 ml DMEM-F12 medium med 10% FBS til cellene fjernet fra inkubatoren. Heng det godt, samle mediet og overfør mediet til et sentrifugerør.
- Sentrifuge med en rotasjonshastighet på 101 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og frø cellene på nytt i nye kolber med friskt næringsmedium som inneholder 10% FBS.
MERK: Kommersielle WJ-MSCer merket med GFP-genet ved transduksjonsmetoden kan brukes til å bedre visualisere biomaterial-celle-interaksjonene som skal produseres21. Gruppene som skal brukes i denne metoden kan opprettes som vist i tabell 1.
| Opprettet grupper | Grunner til å opprette | Antall reps | ||
| 2D WJ-MSC (2D-C) | 2D-kontroll | x 5 | ||
| 2D WJ-MSC og grafén (2D-G) | Bestemmelse av toksisk dose i 2D | x 5 reps til hver av forskjellige konsentrasjoner | ||
| WJ-MSC er inkludert i bioblekk (3D-B ) | 3D-kontroll | x 3 | ||
| WJ-MSC og 0,1 % grafén er inkludert i bioblekk (3D-G) | 3D grafen-bioblekk biohybrid gruppe | x 3 | ||
| WJ-MSC er i sfæroid form på bioblekkene (3D-BS) | 3D-kontroll av sfæroid form | x 3 | ||
| WJ-MSC &; 0,1% grafen arein sfæroid form på bioblekk (3D-GS gruppe) | 3D grafen-bioblekk biohybrid gruppe av sfæroid form | x3 | ||
| 3D Bioink dråpe | Den er produsert for SEM og FTIR karakteriseringsanalyse. | x5 | ||
| 3D Graphene fall | Den er produsert for SEM og FTIR karakteriseringsanalyse. | x5 | ||
| 3D Bioink med GFP merket WJ-MSCs & 0.1% | Observasjon av bevegelsene til WJ-MsCs i bioblekket som inneholder riktig dose grafen. | x3 | ||
Tabell 1. Grupper i metoden. Alle 2D- og 3D-grupper i metoden er inkludert.
2. Grafen toksisitet og 2D-bildebehandling
- Fremstilling av grafenkonsentrasjoner og påføring på celler
MERK: Rå grafen nanopartikler ble kjøpt kommersielt (industriell grafen nanoplater type) og ble også donert. Dimensjonene til partiklene var 5-8 nm i tykkelse, 5 μm i diameter og 120-150 m2/g i overflateareal.- Vei grafen for å lage en 1% løsning (mg / ml). Lag en stamløsning ved å tilsette 10 ml DMEMF-12 medium med 10% FBS til veid 100 μg grafen nanopartikler og merk denne løsningen som stamløsning. Steriliser i en autoklav ved 121 °C under 1,5 atm trykk i 20 minutter.
MERK: Den sterile grafenblandingen oppbevares i kjøleskap ved 4 °C til bruk. Det kan ikke være egnet for langvarig bruk (maksimalt 1 måned). I disse tilfellene må blandingen rekonstitueres og steriliseres. - Forbered en blanding av medium grafen ved forskjellige konsentrasjoner for å bestemme giftfrie doser. Sett de første fortynningene som 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% og 0,0001% grafen / media.
- Begynn med 1 % stamløsning, ta 1 ml suksessivt fra hver konsentrasjon og overfør den til en ny tube. Tilsett 9 ml DMEMF-12 medium med 10% FBS til hvert rør, gjør fem gradvis fortynnede prøver, og rist og virvel løsningene for å få lik fordeling. Bruk bare 10 ml DMEMF-12 medium med 10% FBS som kontroll.
MERK: De tunge flakene av grafenutfelling og må derfor omfordeles. - Frø WJ-MSCene i 6-brønnsplater med 2 ml ferskt medium som inneholder 10% FBS ved 5 x 105 celler per brønn. Inkuber i 1 dag ved 37 °C. Del deretter platene i grupper med like og gjentatte brønner. Gjør fem repetisjoner for hver konsentrasjon.
- Kast mediet og erstatt deretter mediet med grafenmediumkonsentrasjoner ved 2 ml per brønn. Bruk bare mediet for kontrollgruppen. Inkuber platene ved 37 °C i 24 timer.
- Vei grafen for å lage en 1% løsning (mg / ml). Lag en stamløsning ved å tilsette 10 ml DMEMF-12 medium med 10% FBS til veid 100 μg grafen nanopartikler og merk denne løsningen som stamløsning. Steriliser i en autoklav ved 121 °C under 1,5 atm trykk i 20 minutter.
- Bestemmelse av ikke-toksiske konsentrasjoner av grafen med MTT
- Kast media med grafen etter 24 timer. Vask hver brønn med PBS. Tilsett fersk DMEMF-12 medium med 10% FBS ved 2mL per brønn.
MERK: Det er viktig å vaske med PBS etter påføring av grafenkonsentrasjoner på cellen fordi grafen nanopartikler, som ikke tas inn i cellen ved endocytose, fjernes fra miljøet. Dette gjør MTT-testen mer effektiv. - Bruk MTT-protokollen (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) til å bestemme IC50-verdien som indikerer 50 % cellelevedyktighet, som beskrevet i Kose et al.22 og i trinn 2.2.3.-2.2.6.
- Først veier du ut 5 mg / ml MTT-salt og oppløses i PBS. Steriliser med et 0,45 μm filter. Pakk MTT-oppløsningen, laget i et 15 ml sentrifugerør, med aluminiumsfolie og oppbevar ved 4 °C.
- Tilsett 10 μL MTT i alle brønnene og inkuber platen i 4 timer ved 37 °C. Vær oppmerksom på dannelsen av formazankrystaller ved 10x forstørrelse under mikroskopet etter inkubasjon.
- For å oppløse krystallene dannet i cellene, tilsett 100 μL DMSO til hver brønn og bland ved pipettering. Hold tallerkenen i mørket ved romtemperatur i 30 min. Sett platen inn i ELISA-plateleseren. Sett en bølgelengde på 570 nm fra programmet for absorbansmåling og få den til å lese platen22.
MERK: I tillegg, mens grafenpartikler alene leses ved 270 nm23, vil leseområdet på 570 nm24 her bare være for lesing av celle levedyktighet. - Utfør statistisk analyse på de oppnådde resultatene ved hjelp av enveis ANOVA med Tukeys test i et statistisk analyseprogram.
- Kast media med grafen etter 24 timer. Vask hver brønn med PBS. Tilsett fersk DMEMF-12 medium med 10% FBS ved 2mL per brønn.
- Søm avbildning
- For å undersøke samspillet mellom forskjellige grafenkonsentrasjoner med celler, utfør en time-lapse av cellene med metoden som kalles sømavbildning. Denne metoden skaper et time-lapse-bilde ved hjelp av bildeprøver tatt med jevne mellomrom under mikroskopet.
- For å gjøre dette, slå på datamaskinen først. Slå på time-lapse-inkubatoren og sett den på 37 °C. Plasser MTT-platen i time-lapse-inkubatorsporet.
- Åpne Stitch-programmet på datamaskinen. Spesifiser brønnene som skal leses i systemet. Ta leseren til den første brønnen og finn og fokuser området ved 10x forstørrelse i hvitt lys. Start programmet.
MERK: Det er et program for å lage høykvalitets 4 rader x 5 kolonner flere fotokollasjer. Programmet kombinerer bilder tatt etter hverandre i HD-kvalitet. Når du trykker på systemstartknappen, blir brønnene automatisk lest, og det tar og masker 4 rader x 5 kolonner flere bilder.
3. Grafen - Bioink biohybrid hydrogelproduksjon og WJ-MSCs differensiering
- Produksjon av bioblekk
MERK: De lyofiliserte kommersielt tilgjengelige alginat-gelatin (3:5) pulverene brukes som basis for bioblekk. Grafenbioblekkgruppen (3D-G; 3D-GS) og grafenfri kontrollbioblekkgruppe (3D-B; 3D-BS) fremstilles med samme metode (tabell 1).- Bruk 50 ml koniske rør til preparatet. Vei først 4,5 mg alginat og 1,5 mg gelatin og overfør til et sentrifugerør. Tilsett DMEMF-12 medium inneholdende 10% FBS til blandingen til et totalt volum på 50 ml. Dette er kontrollgruppen (C) uten grafen.
- Gjenta veiingen av 4,5 mg alginat og 1,5 mg gelatin og overfør til sentrifugerør. Ta deretter 50 μL av den tilberedte 0,1% grafen fra trinn 2.1.3. og legg det til røret. Legg DMEMF-12 med 10% FBS til et totalt volum på 50 ml.
- Bland bioblekket først ved pipettering og deretter virvel. Steriliser i en autoklav ved 121 °C under 1,5 atm trykk i 20 minutter. Alternativt kan du utføre sterilisering ved mikrobølgeovn til kokepunktet.
- Etter at blandingene er autoklaver, sentrifuge ved 280 x g i 2 minutter ved romtemperatur for å fjerne dannede bobler. Hold bioblekket på 37 °C til cellene er tilberedt.
- Tillegg av WJ-MSC og 3D bioprinting
- For telling, vask cellene når det er 80% sammenløp med ca. 5 ml PBS, og tilsett 5 ml 0,25% trypsin og 2,21 mM EDTA 4Na. La stå i 5 min ved 37 °C.
- Tilsett 10 ml DMEM-F12 medium med 10% FBS til cellene etter fjerning fra inkubatoren. Suspender godt, samle mediet og overfør det til et sentrifugerør. Sentrifuge ved 101 x g i 5 minutter ved romtemperatur og kast deretter supernatanten.
- La det være ca. 250 μL medium med pelleten. Løs opp pelleten på nytt i 1 ml friskt medium. Til 48 μL medium, tilsett 2 μL cellesuspensjon og 50 μL trypanblå (0,4 g trypanblå/100 ml) i et konisk rør (1,5 ml) for å telle4. Pipett det godt.
- Tilsett ca. 10 ml av den tilberedte fargede cellesuspensjonen til et Thoma-celletellekammer. Beregn gjennomsnittlig antall celler som faller inn i rutene på begge sider av lysmikroskopet.
Beregn vitalitetsprosent (%) = (telte levedyktige celler / totalt antall celler telles) x 100
MERK: Celle-bioblekk-interaksjonen studeres på to måter: (1) Den kan skrives ut ved å legge den inn i bioblekkene (3D-B; 3D-G); (2) Cellene blir sådd på bioblekkene etter å ha blitt presset, og cellene danner en sfæroid (3D-BS; 3D-GS). - For interaksjonen mellom celle og bioblekk må du først opprette bioblekkgruppene (tabell 1). Gruppe 1 inkluderer 3D-B og 3D-G trykt med bioblekk for bioprinting. Gruppe 2 inkluderer 3D-BS og 3D-GS bioblekk hvor sfæroider ble dannet etter bioprinting.
- Tell cellene for gruppe 1 slik at det er omtrent 1 x 107 celler i 0,5 ml medium. Tilsett 4,5 ml bioblekk for å bringe totalvolumet til 5 ml. Overfør dette til sylinderampullene i det sterile skapet ved hjelp av sprøyter. Installer sylinderampullene i den tilsvarende ekstruderdelen av bioprinteren.
- For den andre gruppen, ta 5 ml fra hver av bioblekkgruppene og overfør dem til sterile patroner ved hjelp av en injektor.
- Bruk bioprinteren med to koaksiale skrivehoder og den pneumatiskdrevne ekstruderingsteknologien. Sett X/Y/Z-oppløsningen per mikrotrinn til 1,25 μm, ekstruderingsbredden til 400 μm og ekstruderingshøyden til 200 μm. Et rutenett på 20 mm x 20 mm x 5 mm er en av de mest brukte 3D-modellene for 3D-bioprinting.
- Opprett 3D-modellene ved hjelp av webbaserte CAD-programmer med åpen kildekode. Før bioprinting, lag enkle 3D-modeller med en av open source-plattformene (f.eks. infill). Modellen kan være lineær (som modellen som brukes her), bikake eller rutenettformet. Eksporter og last ned i .stl-format etter å ha opprettet en 5 mm x 20 mm x 20 mm firkant.
- Bioprinter-programvaren bruker .stl-filer og konverterer dem til utskrivbart .gcode-format ved hjelp av slicermoduler. Hvis du vil ha en utskrivbar rutenettform, deaktiverer du det ytre skallet i slicermodulen. Tørk enheten med 70% etanol før bruk, og steriliser deretter ved UV-sterilisering.
- For bioprintingsprosessen, overfør bioblekkgruppene til kassettene ved hjelp av en injektor. Installer sylinderampullene i den tilsvarende ekstruderdelen av bioprinteren.
- Sett gjennomsnittstrykket på 3D-printeren til 7,5 psi og kassetten og sengetemperaturen til 37 °C. Sett hastigheten til 60% og utfør en standard 3D-utskriftsprosess.
MERK: Ved å planlegge de forberedte modellene med mellomrom (som en lineær modell) kan cellekultur gjøres i mellomrommene etter bioprinting. - Sett systemet i hjemmeposisjon i skrivefasen. Plasser aksene (X, Y, Z) automatisk, velg ekstruderen og sett. Start utskriftsprosessen. Etter bioprintingsprosessen, ta prøven og legg den under et laminært strømningskap.
- Spray bioblekket med 0,1 N CaCl2-oppløsning etter utskrift eller tilsett 1 ml av løsningen med en pipette ved romtemperatur. Vent i ca 10-20 s og vask de trykte mønstrene 2x med PBS som inneholder Ca 2+ og Mg2+.
- Tilsett 2 ml DMEMF-12 med 10% FBS-medium på toppen av hver av de celleholdige bioblekkgruppene. Inkuber platene ved 37 °C med 5 % CO2. Deretter tilsettes 2 ml suspensjonsmedium inneholdende 1 x 106 celler til hver gruppe for sfæroiddannelse.
- Inkuber platene ved 37 °C med 5 % CO2. Etter 24 timers inkubasjon, observer sfæroidformasjonen under et omvendt mikroskop.
- WJ-MSCs differensiering til nevronlignende celler
- Observer og fotografer alle partier med bioblekk etter 24 timers inkubasjon. Tilsett 2 ml nevrogent differensieringsmedium per brønn (unntatt kontrollgruppen) og oppdater hver 2. Følg i 7 dager for å observere nevral differensiering.
4. Grafen-Bioink biohybrid hydrogel karakterisering
MERK: Time-lapse imaging, Fourier transform infrarød spektroskopi (FT / IR), og skanning elektronmikroskopi (SEM) analyser utføres for karakterisering av grafen-bioblekk biohybrid hydrogel. Prøvene er laget fra 3D-B og 3D-G bioblekkgrupper ved dryppmetoden for FT / IR og SEM analyse.
- FT/IR-analyse
MERK: FT / IR er en kjemisk analytisk metode basert på den matematiske Fourier-transformasjonen, uunnværlig for materialkarakterisering. Bruk en FT/IR-enhet basert på Michelsons interferometerprinsipper på 28 °C, med halogenlampe, vannkjølt kvikksølvlyskilde, signalsideforhold på 4 cm−1, målt i 1 min, ved 2 200 cm−1.- Forbered FT / IR-mikroskopet og sørg for at instrumentets optikk er justert. Kalibrer enheten.
- Siden prøven er i en dråpe, ta et stykke 1-2 mm tykk hydrogel og legg det med tang på prøvedelen. Fokuser på prøven og hev den til nær kontakt er gjort. Samle prøvespekteret ved å starte prosessen fra systemet.
- Skanning elektronmikroskopi (SEM) analyse
MERK: Overflatemorfologi, indre struktur, cellefordeling og bioblekk-celle-interaksjoner kan undersøkes ved SEM-analyse i forskjellige dimensjoner.- Slipp hydrogelen i 6-brønnsplater inneholdende 1 ml CaCl 2-tverrbinder ved hjelp av pipettespissdråpemetoden (se figur 1).
- Vask platene 2x med ca. 1 ml PBS for å frigjøre oppløsningen av salter. Deretter legger du disse dråpene i et falkrør som inneholder 5 ml 5% paraformaldehyd ved hjelp av tang.
- Lag tynne seksjoner fra dråpebioblekkene ved hjelp av en skalpell. Fest prøvene på den klebrige siden på metallplaten. Sett inn i belegganordningen der gullpalladiumet, som passerer inn i plasmafasen ved å erstatte luften med argongass, dekker prøven.
- Sett den i elektronmikroskopet (SEM). Åpne mikroskopprogrammet som SEM er koblet til. Utfør skaleringen og ta bilder av forskjellige deler av prøven. For denne protokollen ble 5 μm, 10 μm og 200 μm skalaer brukt. Totalt 40 bilder ble tatt for 3D-B- og 3D-G-gruppene.
- Time-lapse-avbildning
MERK: Under time-lapse-avbildning ble ikke bare bioblekkprøver som inneholder GFP-gentransformerte celler brukt, men også bioblekk med sfæroider er avbildet i 16 timer. Time-lapse-avbildning utføres for å undersøke effekten av grafen på stamceller og for å overvåke celleinteraksjoner i bioblekket.- Legg til kommersielt tilgjengelige 1 x 107 GFP-merkede MSC-er i 5 ml bioblekk og biotrykk som i trinn 3.2.11. Tilsett 1 ml tverrbinder, hold i 20-30 s, og vask 2x med PBS.
- Slå på time-lapse-skjermen og åpne programmet på datamaskinen. Still inn ca. 16 timer i Time-Lapse-modus og sett temperaturen til 37 °C. Trykk på Start-knappen . Videoer i form av 40 s time-lapse videoprøver er tatt opp av systemet.
- Fokuser mikroskopet ved 10x forstørrelse hver 2. Visualiser også sfæroidene som er opprettet ved å følge de samme trinnene.
Figur 1: 3D-B og 3D-G bioblekkgrupper produsert som dråper for bruk i karakterisering. (A) Bioblekkprøver (pre-karakteriseringsbilde) på en plate med en tverrbinder. (B) 3D-B dråpebilde av bioblekk. (C) 3D-G bioblekkdråpebilde. Biomaterialet som skal karakteriseres og cellene det inneholder, kan lettere gå gjennom prosesser som gullbelegg, prøvetaking, etc. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Bestemmelse av nevrogen differensiering ved immunfargingsmetode
- Samle sfæroidene, uten å avbryte kuleformene, og frø til nye plater for å restain med en enklere metode, i stedet for å legge inn i parafin for vevsseksjonering.
- Dekk 48-brønnplatene med ca. 20 ml pre-autoklavert 0,1% gelatinoppløsning og hold i en inkubator i minst 1 time. Pipett ca. 500 μL tilberedt 0,1% gelatin i 48-brønnplater. La de gelatinøse platene ligge i inkubatoren i 10 minutter.
NOTAT: Dette vil tillate gelatinen å svelle litt, dekke overflaten og skape et bedre miljø for de oppsamlede sfæroidene å feste. - Samle sfæroidene ved pipettering, fordel de oppsamlede sfæroidene fra inkubatoren inn i brønnene på 48-brønnplaten, og tilsett friskt medium. Deretter inkuberer du i 12-24 timer.
MERK: Det er ganske vanskelig å distribuere sfæroidene ved å telle. Samle sfæroidene i et enkelt rør og fordel totalvolumet jevnt til brønnene. For denne studien inneholdt hver brønn ca. 4-6 sfæroider.
MERK: For 2D-prøver er forhåndsflekkvask tilstrekkelig, og ingen medieutskifting er nødvendig. - Fjern mediet og vask cellene sakte med PBS, da sfæroidene vil være øverst. Fest i 4% paraformaldehyd i 2 timer.
- Vask prøvene med PBS igjen og blokker med ca. 10 ml 2% BSA og 0,1% TritonX i 30 minutter. Vask deretter med PBS 3x.
- Fortynn utvalgte primerantistoffer (N-cadherin-kanin og β-III tubulin-mus) i forholdet 1:100 med antistoffdiluent reagensoppløsning. Tilsett 100 mikrol antistoffoppløsning til hver av prøvene og inkuber over natten ved 4 °C.
- Vask prøvene 3x med PBS. Inkuber med anti-mus IgG-FTIC-kanin for β-III tubulin og anti-mus IgG-SC2781-geit sekundært antistoff for N-Cad fortynnet til 1:200 ved romtemperatur i 30 minutter. Utfør alle operasjoner i mørket.
MERK: Uansett hvilken belastning som brukes som det primære antistoffet (f.eks. mus) ved dobbeltfarging, bør en annen stamme (f.eks. geit eller kanin) brukes til det sekundære antistoffet. - Vask det sekundære antistoffet med PBS 3x og drypp deretter DAPI-oppløsningen (1:1) i hver av prøvene. Vent i 15-20 min. Utfør immunfluorescensavbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafen toksisitet og 2D-bildebehandling
Statistisk analyse av de oppnådde MTT-resultatene ble utført med en enveis ANOVA med Tukeys test i statistisk analyseprogramvare, og grafen som er oppnådd er vist i figur 2. Grafenprosenten sammenlignet med kontrollen viste en signifikant reduksjon bare for 0,001% grafenkonsentrasjonen (**p < 0,01).. Det var ingen signifikante forskjeller mellom de andre gruppene og kontrollgruppen (p > 0,05). Derfor ble den optimale grafenkonsentrasjonen bestemt til å være 0,1% siden de høyeste levedyktighetsratene ble observert etter eksponering for denne konsentrasjonen i henhold til MTT-testresultatene og sømbildene.
Figur 2: Undersøkelse av effekten av grafenkonsentrasjon på celleproliferasjon. Grafénprosenten sammenlignet med kontrollen viste en signifikant reduksjon bare for 0,001 % grafenkonsentrasjon (**p < 0,01, n = 6). Det var ingen signifikante forskjeller mellom de andre gruppene og kontrollgruppen (p > 0,05; n = 6). Statistisk analyse av de oppnådde MTT-resultatene ble utført med en enveis ANOVA med Tukeys test i statistisk analyseprogramvare. Feilfeltene representerer standardavviket. Dette tallet er endret fra28. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne delen av den presenterte metoden demonstrerer at stamcelle-grafen-interaksjonen kan brukes i fremtidige studier. Det ble observert at grafen i hver testede konsentrasjon ble tolerert i 2D-systemet og ble tatt opp av cellene gjennom endocytose (figur 3). Det har blitt bestemt at grafenplatene beveger seg langs cytoplasma inne i cellen.
Figur 3: Celle-grafén-interaksjonene er vist i to dimensjoner i sydde bilder. (a) Kontroll; (B) 0,0001%; (C) 0,001%; (D) 0,01 %; (E) 0,1 %; og (F) 1% konsentrasjoner av grafen. Det oppnås ved å kombinere time-lapse-bildebehandling med HD-kvalitetsinnstillinger for å oppnå en 4 rader x 5 kolonner collage av flere bilder. Dette tallet er endret fra 28. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Videre ble det i denne studien observert at grafen-bioblekk-effekten ikke skapte noe giftig mikromiljø i 3D-systemet, og at cellene var i interaksjon.
Det har også blitt observert at bruken av grafen i 3D-systemer ikke skapte noe giftig mikromiljø. Bestemmelse av giftig dose for celler er avgjørende for bruk av grafen i langsiktige ledningsimplantater eller injiserbare hydrogelformer. I tillegg, siden grafen er et effektivt materiale i nevronkommunikasjon, har bruken i nervevevstekniske applikasjoner økt mye, som dokumentert i litteraturen25.
Produksjon av sammensatte biomaterialer og 3D bioprinting
Dannelsen av gelatin-alginatbasert bioblekk biohybrid mønster ble utført med en ikke-toksisk konsentrasjon av grafen (0,1%). Det har blitt observert at den valgte passende dosen grafen interagerer med cellene i bioblekket.
Time-lapse-avbildning
GFP-prøver ble satt til 37 °C i ca. 16 timer i time-lapse, og det ble tatt bilder og video (Video 1). GFP-signaler gikk tapt da celledød ble observert. Her ble det oppdaget at celler som overlevde i 3D-grafenmediet opprettholdt sine vitaliteter siden GFP-lysstyrken ble observert til slutten av inkubasjonen.
Video 1. Time-lapse-video av GFP-merkede WJ-MSC-er. Samspillet mellom merkede stamceller med hverandre observeres. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Graphene-Bioink biohybrid hydrogel karakterisering
SEM og FT / IR ble brukt til karakterisering av 3D-B- og 3D-G-gruppene opprettet ved dråpebioblekkmetoden. SEM-bildene av 3D-B og 3D-G bioblekkgruppene er gitt i figur 4. Av de 40 bildene som er tatt i trinn 4.2.5., vises 4 representative bilder her.
Figur 4: SEM-bilder av 3D-B og 3D-G bioblekkgrupper. (A) Bilde av en gullbelagt 3D-B bioblekkseksjon med elektronmikroskopi. Skala bar: 200 μm. (B) Bilde av MSC festet til 3D-B bioblekk indre overflate. Skala bar: 5 μm (C) Bilde av 3D-G bioblekk indre og ytre overflate. Skala bar: 200 μm. (D) Indre overflatecelle 3D-G bioblekkadhesjonsbilde. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Følgelig ble bioblekk-celle-interaksjoner demonstrert både på overflaten og internt. Det var en celle-biomateriell interaksjon i begge bioblekkene (3D-B; 3D-G). Cellene var morfologisk runde og festet til materialet. FT/IR-analysen av 3D-B og 3D-G bioblekkfall ble sammenlignet med grafen i figur 5.
Figur 5: FT/IR-analyse. (A) 3D-B bioblekk. (B) 3D-G bioblekk. Topper som 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 og 1033 cm−1 er funnet i alginat-gelatinbaserte hydrogelstudier i litteraturen26. Også 1335.46 cm-1-toppen ligner toppene sett i grafenbiomaterialstudier27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Siden kontrollbioblekket (3D-B) var basert på alginat/gelatin, var de mest fremtredende toppene rundt 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 og 1033 cm−1 sammenlignet med tilsvarende studier i litteraturen med topper sett på 1546 cm−126. En topp på 1399 cm-1 ble observert i grafengruppen (3D-G) og en lignende topp ble funnet på 1335,46 cm-1 i en studie utført med grafen27.
3D neuronal differensiering
Bildene av sfæroider på bioblekkene etter 7. dag etter differensiering er representert i figur 6.
Figur 6: 2D-bilde av kontroll-WJ-MSC og sfæroidgruppeprøver ved dag 7 etter differensiering . (A) Størrelsen på kulen fra 3D-BS-gruppen bioblekk med diametre på 160 μm og 200 μm. (B) 2D kontrollceller. Sfæroider fra (C) 3D-BS-gruppen og (D) 3D-GS-gruppen. De svarte materialene i (D) er grafenmolekyler integrert med sfæroider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det ble sett at celler opprettholdt sin vitalitet i både 2D- og 3D-kulturer. Det ble ansett at grensene til sfæroidcellene i begge gruppene (3D-B og 3D-G) var gjennomsiktige og livlige, og sfæroidene i grafengruppen var relativt større og fanget grafen inne i cellen. Differensieringen ble også testet ved immunfarging. Med dobbeltfargingen som ble brukt her, ble aktivitetene til celler i 2D-nevrontransformasjon sammenlignet med 3D-kultur (figur 7).
Figur 7: Immunfarging av 2D- og 3D-celler. (A,B) Immunfarging av dyrkede sfæroider på 3D-BS bioblekk. (C,D) 3D-GS bioblekk sfæroide immunoflekker. (E) Differensiert 2D positiv kontroll WJ-MSCs. (F) Udifferensierte 2D negativ kontroll WJ-MSCs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Immunfluorescensbilder av celler dyrket i 7 dager er vist i figur 7. Prøvene ble farget med antistoffer spesifikke for N-cadherin (grønn) og β-III tubulin (rød). I tillegg ble DAPI brukt til visualisering av kjernen (blå eller lilla). Følgelig varierte N-cadherinene (grønn) som ble brukt i 2D- og 3D-prøvene over 7 dager, da det spiller en viktig rolle i signalmekanismer og utvikling av nevroner. Det grønne bildet i figur 7A-E representerer nevronlignende strukturer (figur 7). Klasse III β-tubulin er en av de syv isotypene kjent som nevronmarkører i det menneskelige genomet. N-cadherin-ekspresjon ble funnet å være høyere i prøvene som ble differensiert i 7 dager sammenlignet med β-III tubulin. Ifølge resultatene fra dette eksperimentet ble det fastslått at 3D-systemene skapte et mer egnet mikromiljø for cellene å overleve og differensiere. Den 2D-positive kontrollprøven (figur 7E) uttrykte færre nevronlignende strukturmarkører sammenlignet med 3D-prøvene (figur 7A-D). Dette viser oss at mikromiljøet opprettet med 3D-strukturen er mer effektivt i differensiering av stamceller. I tillegg, i stedet for celleterapier alene; Biomaterial-celle kombinerte behandlinger ser ut til å være mer innflytelsesrike og effektive i nerveskader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelene med behandlinger påført med konstruerte 3D-stillaser i forhold til konvensjonelle 2D-metoder blir mer og mer merkbare hver dag. Stamceller som brukes alene i disse terapiene eller sammen med stillaser produsert fra forskjellige biomaterialer med lav biokompatibilitet og biologisk nedbrytbarhet, er vanligvis utilstrekkelige i perifer nerveregenerering. Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSCs) ser ut til å være en egnet kandidatcellelinje, spesielt med tanke på optimalisering av protokollene for oppkjøp, deres spredningsevne og deres differensieringskapasitet29. I denne studien undersøkte vi samspillet mellom stamceller og grafen i både 2D- og 3D-kulturer. Vi sammenlignet også den nevrogene differensieringen i de genererte biohybridhydrogelgruppene med 2D-miljøet. Vi demonstrerte nevrosfæredannelsen på bioblekkene ved immunfarging. I videre studier karakteriserte vi vår kandidatprototype, som kan injiseres eller implanteres som en nevral kanal, ved SEM og FT / IR-metoder. Denne studien karakteriserer egenskapene til det produserte biomaterialet, celle-biomaterial-interaksjonen og den nevrale differensieringen av stamcellene i nærvær av biomaterialet. I de neste fasene vil effekten på migrasjon bli undersøkt.
Biohybridmaterialene dannet ved å kombinere to eller flere biokompatible materialer blir mer fordelaktige når det gjelder deres strukturelle egenskaper sammenlignet med homogene materialer30. I en tidligere studie ble implantasjon av en polyglykolsyrebasert nevrorørkanal i ansikts perifer nerve utført. Merkede olfaktoriske stamceller ble satt inn i denne kanalen, noe som resulterte i vellykket regenerering av perifer kirurgi og injisert stamcellebehandling16. I en annen studie ble effektiviteten av 3D-strukturen oppnådd fra flere cellulære sfæroider utviklet ved bruk av humane normale dermale fibroblaster og silisiumnervekanalen, som ofte brukes i litteraturen på grunn av sin inerte funksjon, sammenlignet i regenerering av isjiasnerveskader. Det ble vist at den sfæroidbaserte 3D-strukturen økte vevregenerering betydelig og raskere i dyremodeller med isjiasskader sammenlignet med homogene materialer20. Det er imidlertid kjent at silisiumbaserte biomaterialer, som er hyppig brukt i litteraturen, har noen viktige ulemper, som høy infeksjonsrisiko og lav biokompatibilitet15,30.
I denne studien ble produksjonen av biokompatibelt, biologisk nedbrytbart hydrogel biohybrid komposittvev med grafen nanoplateletter, som er kjent for å være effektive i nerveledning, utført ved en 3D-utskriftsteknikk. Det finnes ulike studier der grafen har blitt brukt som biomateriale for nerveledning25,30. Videre er grafen et av de tynneste og letteste materialene som er tilgjengelige, noe som øker preferansen innen helseteknologi13. En av de mest ønskelige egenskapene til biomaterialer er biologisk nedbrytbarhet. Eksperimentelle og molekylære simuleringsteknologier har blitt brukt til å undersøke biologisk nedbrytning av grafen og dets derivater13. På dette tidspunktet kan overflatemodifisering-funksjonalisering eller produksjon i form av sammensatte biomaterialer forbedre eller hemme biologisk nedbrytning, hovedsakelig avhengig av egenskapene til tilsetningsstoffene.
Ulike enzymer, som manganperoksidase (MnP), pepperrotperoksidase (HRP) og myeloperoksidase (MPO), er tilgjengelige i litteraturen for biologisk nedbrytning av grafenderivater. MPO-enzymet, som er en peroksidase frigjort fra nøytrofiler som kommer til regionen av fremmedlegemer og utfører fagocytose, er assosiert med grafenbiodegradering, spesielt i den menneskelige lungen13. De biologiske nedbrytbarhetsnivåene av sammensatte biomaterialer som inneholder grafen i stedet for grafennanorør alene, er forskjellige fra hverandre. Det er lettere å oppnå denne ønskede egenskapen i komposittmaterialer. I tillegg bidrar bestemmelse av giftig dose grafen til bruk av klinisk anvendelige biomaterialer13.
En viktig del av graféntrinnet i protokollen er sterilisering av grafén når den skal brukes. Risikoen for forurensning som kan oppstå under biohybrid-celle-interaksjonsfasen unngås.
Effekten av det oppnådde biohybrid grafen-bioblekkhydrogelmønsteret på nervedifferensiering ble undersøkt, og det var kompatibelt med litteraturen at differensieringen var høyere i 3D-systemet. Behovet for produksjon av biomaterialer med vevskonstruerte cellulære terapeutiske tilnærminger som kan utvikles mot ulike neurodegenerative sykdommer, som perifer nerveskade, øker med utilstrekkeligheten av dagens behandlinger dag for dag, og understreker viktigheten av denne studien.
I en tidligere studie ble samspillet mellom grafen og celler i et 2D-cellekulturmedium undersøkt28. Med erfaringene derfra, her, ble grafen lagt til alginat-gelatinbioblekket med det kjente forholdet, og en ny og unik biomaterialprototype ble produsert ved en 3D-utskriftsmetode. Dette nye materialet ble brukt til å studere celleinteraksjon på to forskjellige måter. Den første er samtrykking av det cellesammensatte biomaterialet på en 3D-skriver. Den andre er dannelsen av en cellulær sfæroid fra biomaterialet. I tillegg ble interaksjonen mellom WJ-MSC som inneholder det merkede GFP-genet og materialet også observert.
I denne studien ble biohybridbioblekk karakterisert ved å velge FTIR- og SEM-metoder. Disse gjør det mulig å undersøke prøvekulene dannet ved dryppmetoden i karakteriseringsfasen. Spesielt siden vi kan undersøke en hard og tørr struktur under SEM gullbeleggstadiet, gir SEM den fysiske egnetheten for å få bedre, tynne seksjoner med en skalpell fra bioblekkkulene vi opprettet med denne metoden.
I denne metodestudien ble celler lagt til biohybridmaterialet på to forskjellige måter under forsøkene: inne for 3D-bioprinting eller under sfæroiddannelse. Dekker celler med bioblekk og bruker 3D-bioprintere tillater forskere å lage hvilken som helst ønsket 3D-form for nerveregenerering. På den annen side forårsaker det mer stress på celler på grunn av utskriftstrykket og dermed tap av celle levedyktighet. Det kan imidlertid være en mer ønskelig metode for å øke cellehuset når de injiseres eller transplanteres til et bestemt område for å indusere regenerering.
Opprettelsen av sfæroider på bioblekk skaper en mer brukbar form for kunstig vev når det gjelder celleinteraksjon og gir en bedre nisje for celledifferensiering. Det er også egnet for å etterligne det naturlige mikromiljøet og derfor undersøke cellulære mekanismer. Den lave vedheft av sfæroider til bioblekk tillater også enklere separasjon fra bioblekk og allsidighet av programmene.
N-cadherinene som brukes (vist i grønt i figur 7) er en del av cellesignalmekanismer og spiller en viktig rolle i utviklingen av nevroner32. Klasse III β-tubulin er en av de syv isotypene kjent som nevronmarkører i det menneskelige genomet. Det viser at WJ-MSCene som ble brukt i denne studien begynner å danne nevronlignende strukturer. I denne sammenheng vil 3D-systemer skape et mer tilstrekkelig mikromiljø for celler for å opprettholde levedyktigheten.
Til slutt, på grunn av kostnadene som er involvert og den kliniske anvendeligheten av celledifferensieringssystemer, er det svært viktig i nevroteknikk å utvikle systemer med kontrollert frigjøring av stillas, celler og differensiering biosignaler33 i fremtiden og tilpasse disse til klinikkene som kombinerte terapier. Derfor kan sfæroide og bioprintingsmetoder også brukes i videre studier der grafen og andre biosignaler er innebygd i hydrogeler og frigjort på en kontrollert måte. In vitro studier er et viktig skritt på veien mot in vivo. Når materialet, her gitt som en prototype, er produsert i samsvar med standarder for god laboratoriepraksis, kan steriliseringsstandardene som kreves for overføring til klinikken oppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke foreligger noen interessekonflikt. Prosjektet ble utført i samarbeid med HD Bioink, utvikler av 3D bioprinting-teknologien.
Acknowledgments
Grafénet som ble brukt i denne studien ble utviklet ved Kirklareli University, Institutt for maskinteknikk. Det ble donert av Dr. Karabeyoğlu. Grafentoksisitetstesten ble finansiert av prosjektet med tittelen "Utskrift og differensiering av mesenkymale stamceller på 3D-bioprintere med grafendopede bioblekk" (applikasjonsnr: 1139B411802273) fullført innenfor rammen av TÜBİTAK 2209-B-industriorientert bacheloroppgavestøtteprogram. Den andre delen av studien ble støttet av forskningsfondet fra Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Mesenkymale stamceller med GFP brukt i time-lapse-bildestadiet ble donert av Virostem Biotechnology. Forfatterne takker Darıcı LAB og YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB-teamet for produktive diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
- Kaya, T. I.
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A.
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
