Summary
In dit manuscript demonstreren we de bereiding van een biohybride hydrogel bioink met grafeen voor gebruik in perifere tissue engineering. Met behulp van dit 3D-biohybride materiaal wordt het neurale differentiatieprotocol van stamcellen uitgevoerd. Dit kan een belangrijke stap zijn om vergelijkbare biomaterialen naar de kliniek te brengen.
Abstract
Perifere neuropathieën kunnen optreden als gevolg van axonale schade en soms als gevolg van demyeliniserende ziekten. Perifere zenuwbeschadiging is een wereldwijd probleem dat voorkomt bij 1,5% -5% van de spoedeisende hulppatiënten en kan leiden tot aanzienlijk banenverlies. Tegenwoordig zijn op tissue engineering gebaseerde benaderingen, bestaande uit steigers, geschikte cellijnen en biosignalen, meer toepasbaar geworden met de ontwikkeling van driedimensionale (3D) bioprinttechnologieën. De combinatie van verschillende hydrogel-biomaterialen met stamcellen, exosomen of bio-signalerende moleculen wordt vaak bestudeerd om de bestaande problemen bij perifere zenuwregeneratie te overwinnen. Dienovereenkomstig heeft de productie van injecteerbare systemen, zoals hydrogels, of implanteerbare buisstructuren gevormd door verschillende bioprintmethoden aan belang gewonnen in perifere neuro-engineering. Onder normale omstandigheden zijn stamcellen de regeneratieve cellen van het lichaam en hun aantal en functies nemen niet af met de tijd om hun populaties te beschermen; Dit zijn geen gespecialiseerde cellen, maar kunnen differentiëren bij passende stimulatie als reactie op letsel. Het stamcelsysteem staat onder invloed van zijn micro-omgeving, de stamcelniche genaamd. Bij perifere zenuwletsels, vooral bij neurotmese, kan deze micro-omgeving niet volledig worden gered, zelfs niet na het chirurgisch samenbinden van doorgesneden zenuwuiteinden. De benadering van samengestelde biomaterialen en gecombineerde cellulaire therapieën verhoogt de functionaliteit en toepasbaarheid van materialen in termen van verschillende eigenschappen zoals biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit en verwerkbaarheid. Dienovereenkomstig heeft deze studie tot doel de bereiding en het gebruik van op grafeen gebaseerde biohybride hydrogelpatronen aan te tonen en de differentiatie-efficiëntie van stamcellen in zenuwcellen te onderzoeken, wat een effectieve oplossing kan zijn bij zenuwregeneratie.
Introduction
Het zenuwstelsel, het mechanisme dat de interne structuur van het organisme en de omgeving overbrugt, is verdeeld in twee delen: het centrale en perifere zenuwstelsel. Perifere zenuwbeschadiging is een wereldwijd probleem dat 1,5% -5% van de patiënten vormt die zich op de afdeling spoedeisende hulp presenteren en zich ontwikkelt als gevolg van verschillende trauma's, wat leidt tot aanzienlijk baanverlies 1,2,3.
Tegenwoordig zijn cellulaire benaderingen van perifere neuro-engineering van groot belang. Stamcellen komen op de eerste plaats onder de cellen die in deze benaderingen worden gebruikt. Onder normale omstandigheden zijn stamcellen de regeneratieve cellen van het lichaam en hun aantal en functies nemen niet af met de tijd om hun populaties te beschermen; Deze cellen zijn gespecialiseerd, maar kunnen differentiëren bij passende stimulatie als reactie op letsel 4,5. Volgens de stamcelhypothese staat het stamcelsysteem onder invloed van zijn micro-omgeving, de stamcelniche genaamd. Het behoud en de differentiatie van stamcellen zijn onmogelijk zonder de aanwezigheid van hun micro-omgeving6, die kan worden gereconstitueerd via tissue engineering met behulp van cellen en steigers7. Tissue engineering is een multidisciplinair veld dat zowel technische als biologische principes omvat. Tissue engineering biedt hulpmiddelen voor het creëren van kunstmatige weefsels die levende weefsels kunnen vervangen en kan worden gebruikt bij de regeneratie van deze weefsels door de beschadigde weefsels te verwijderen en functionele weefsels te leveren8. Weefselsteigers, een van de drie hoekstenen van tissue engineering, worden geproduceerd met behulp van verschillende methoden van natuurlijke en synthetische materialen9. Driedimensionaal (3D) printen is een opkomende additieve productietechnologie die veel wordt gebruikt om defecte weefsels te vervangen of te herstellen via de eenvoudige maar veelzijdige productie van complexe vormen met behulp van verschillende methoden. Bioprinting is een additieve productiemethode die het naast elkaar bestaan van cellen en biomaterialen mogelijk maakt, genaamd bioinks10. Gezien de interactie van zenuwcellen met elkaar, zijn studies verschoven naar geleidende biomateriaalkandidaten zoals grafeen. Grafeen nanoplaten, die eigenschappen hebben zoals flexibele elektronica, supercondensatoren, batterijen, optica, elektrochemische sensoren en energieopslag, zijn een geprefereerd biomateriaal op het gebied van tissue engineering11. Grafeen is gebruikt in studies waar de proliferatie en regeneratie van beschadigde weefsels en organen werden uitgevoerd12,13.
Tissue engineering bestaat uit drie basisbouwstenen: steigers, cellen en biosignaalmoleculen. Er zijn tekortkomingen in de studies naar perifere zenuwbeschadiging in termen van het volledig verstrekken van deze drie structuren. Er zijn verschillende problemen ondervonden bij de biomaterialen die in de studies worden geproduceerd en gebruikt, zoals het feit dat ze alleen stamcellen of biosignaalmoleculen bevatten, het ontbreken van een bioactief molecuul dat stamceldifferentiatie mogelijk maakt, het gebrek aan biocompatibiliteit van het gebruikte biomateriaal en het lage effect op de proliferatie van cellen in de weefselniche, en dus wordt zenuwgeleiding niet volledig gerealiseerd 2,13,14,15,16. Dit vereist de optimalisatie van zenuwregeneratie, het verminderen van spieratrofie 17,18 en het creëren van noodzakelijke homing19 met groeifactoren tegen dergelijke problemen. Op dit punt zijn de karakterisering en analyse van de neuro-activiteit van een chirurgisch biomateriaalprototype, dat naar de kliniek moet worden overgebracht, erg belangrijk.
Dienovereenkomstig onderzoekt deze methodestudie de bioink hydrogel-patronen met grafeennanoplaten gevormd door een 3D-bioprinter en de effectiviteit ervan op de neurogene differentiatie van de stamcellen die het bevat. Ook worden de effecten van grafeen op neurosfeervorming en differentiatie onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kweken van Wharton's gelei mesenchymale stamcellen
- Neem de gelei mesenchymale stamcellen van de Wharton (WJ-MSCs, van ATCC) uit een vriezer van −80 °C. Kweek WJ-MSC's in DMEM-F12 medium met 10% foetaal kalfsserum (FBS), 1% Pen-Strep en 1% L-glutamine in een steriele laminaire stroom bij kamertemperatuur, zoals beschreven in Yurie et al.20.
- Cryopreserveer sommige cellen bij 1 x 106 cellen / ml met vriesmedium dat 35% FBS, 55% DMEMF-12 en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bevat. Tel hiervoor 1 x 106 cellen op een Thoma-celtelglaasje en voeg druppelsgewijs de vriesoplossing toe. Breng de dia snel over in een container met vloeibare stikstof.
- Wanneer gekweekte cellen voor 80% samenvloeien in de kolf, giet dan het medium uit en was met 5 ml PBS. Voeg 5 ml 0,25% trypsine en 2,21 mM EDTA-4Na toe. Incubeer in een incubator bij 37 °C gedurende 5 min.
- Voeg 10 ml DMEM-F12-medium met 10% FBS toe aan de cellen die uit de incubator zijn verwijderd. Suspenseer het goed, verzamel het medium en breng het medium over naar een centrifugebuis.
- Centrifugeer met een rotatiesnelheid van 101 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en zaai de cellen opnieuw in nieuwe kolven met een vers voedingsmedium dat 10% FBS bevat.
OPMERKING: Commerciële WJ-MSC's die door de transductiemethode met het GFP-gen zijn gelabeld, kunnen worden gebruikt om de te produceren biomateriaal-celinteracties beter te visualiseren21. De groepen die in deze methode moeten worden gebruikt, kunnen worden gemaakt zoals weergegeven in tabel 1.
| Groepen gemaakt | Redenen om te creëren | Aantal herhalingen | ||
| 2D WJ-MSC's (2D-C) | 2D-besturing | x 5 | ||
| 2D WJ-MSCs & Grafeen (2D-G) | Bepaling van de toxische dosis van grafeen in 2D | x 5 herhalingen voor elk van verschillende concentraties | ||
| WJ-MSC's zijn opgenomen in bioinks (3D-B) | 3D-besturing | x 3 | ||
| WJ-MSCs &; 0,1% grafeen zijn opgenomen in bioinks (3D-G) | 3D Grafeen-Bioink Biohybride Groep | x 3 | ||
| WJ-MSC's zijn in sferoïde vorm op de bioinks (3D-BS) | 3D-besturing van sferoïde vorm | x 3 | ||
| WJ-MSCs & 0,1% Grafeen zijn in sferoïde vorm op de bioinks (3D-GS groep) | 3D Grafeen-Bioink Biohybride Groep van Sferoïde Vorm | x3 | ||
| 3D Bioink druppel | Het wordt geproduceerd voor SEM- en FTIR-karakteriseringsanalyse. | x5 | ||
| 3D Grafeen druppel | Het wordt geproduceerd voor SEM- en FTIR-karakteriseringsanalyse. | x5 | ||
| 3D Bioink met GFP gelabeld WJ-MSCs & 0,1% | Observatie van de bewegingen van WJ-MsC's in de bioink die de juiste dosis grafeen bevat. | x3 | ||
Tabel 1. Groepen in de methode. Alle 2D- en 3D-groepen in de methode zijn opgenomen.
2. Grafeentoxiciteit en 2D-beeldvorming
- Bereiding van grafeenconcentraties en toepassing op cellen
OPMERKING: Ruwe grafeen nanodeeltjes werden commercieel gekocht (industriële grafeen nanoplaten type) en werden ook gedoneerd. De afmetingen van de deeltjes waren 5-8 nm dik, 5 μm in diameter en 120-150 m2/g in oppervlakte.- Weeg het grafeen af om een 1% oplossing (mg/ml) te creëren. Maak een stockoplossing door 10 ml DMEMF-12-medium met 10% FBS toe te voegen aan de gewogen 100 μg grafeennanodeeltjes en label deze oplossing als stockoplossing. Steriliseren in een autoclaaf bij 121 °C onder 1,5 atm druk gedurende 20 min.
OPMERKING: Het steriele grafeenmengsel wordt tot gebruik bij 4 °C in de koelkast bewaard. Het is mogelijk niet geschikt voor langdurig gebruik (maximaal 1 maand). In deze gevallen moet het mengsel worden gereconstitueerd en gesteriliseerd. - Bereid een mengsel van medium grafeen in verschillende concentraties om niet-toxische doses te bepalen. Stel de initiële verdunningen in op 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% en 0,0001% grafeen/media.
- Begin met de 1% stamoplossing, neem 1 ml achtereenvolgens van elke concentratie en breng deze over in een nieuwe buis. Voeg 9 ml DMEMF-12-medium met 10% FBS toe aan elke buis, maak vijf geleidelijk verdunde monsters en schud en vortex de oplossingen om een gelijke verdeling te krijgen. Gebruik slechts 10 ml DMEMF-12 medium met 10% FBS als controle.
OPMERKING: De zware vlokken grafeen slaan neer en moeten daarom worden herverdeeld. - Zaai de WJ-MSC's in 6-well platen met 2 ml vers medium met 10% FBS bij 5 x 105 cellen per put. Incubeer gedurende 1 dag bij 37 °C. Verdeel vervolgens de platen in groepen van gelijke en herhaalde putten. Doe vijf herhalingen voor elke concentratie.
- Gooi het medium weg en vervang het medium vervolgens door grafeenmediumconcentraties van 2 ml per put. Gebruik alleen het medium voor de controlegroep. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Weeg het grafeen af om een 1% oplossing (mg/ml) te creëren. Maak een stockoplossing door 10 ml DMEMF-12-medium met 10% FBS toe te voegen aan de gewogen 100 μg grafeennanodeeltjes en label deze oplossing als stockoplossing. Steriliseren in een autoclaaf bij 121 °C onder 1,5 atm druk gedurende 20 min.
- Bepaling van niet-toxische concentraties van grafeen met MTT
- Gooi media met grafeen na 24 uur weg. Was elk goed met PBS. Voeg vers DMEMF-12 medium toe met 10% FBS bij 2 ml per put.
OPMERKING: Het is belangrijk om te wassen met PBS na het aanbrengen van grafeenconcentraties op de cel omdat grafeennanodeeltjes, die niet door endocytose in de cel worden opgenomen, uit de omgeving worden verwijderd. Dit maakt de MTT-test efficiënter. - Gebruik het MTT-protocol (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromide) om de IC50-waarde te bepalen die 50% levensvatbaarheid van cellen aangeeft, zoals beschreven in Kose et al.22 en in stappen 2.2.3.-2.2.6.
- Weeg eerst 5 mg / ml MTT-zout af en los op in PBS. Steriliseer met een filter van 0,45 μm. Wikkel de MTT-oplossing, gemaakt in een centrifugebuis van 15 ml, met aluminiumfolie en bewaar bij 4 °C.
- Voeg 10 μL MTT toe aan alle putjes en incubeer de plaat gedurende 4 uur bij 37 °C. Observeer de vorming van formazankristallen bij 10x vergroting onder de microscoop na incubatie.
- Om de kristallen die in de cellen zijn gevormd op te lossen, voegt u 100 μL DMSO toe aan elke put en mengt u door pipetteren. Houd de plaat in het donker op kamertemperatuur gedurende 30 min. Plaats de plaat in de ELISA-plaatlezer. Stel een golflengte van 570 nm in vanuit het programma voor absorptiemeting en laat deze de plaat22 lezen.
OPMERKING: Bovendien, terwijl grafeendeeltjes alleen worden gelezen bij 270 nm23, is het leesbereik van 570 nm24 hier alleen voor het lezen van de levensvatbaarheid van cellen. - Voer statistische analyse uit op de verkregen resultaten met behulp van eenrichtings-ANOVA met de test van Tukey in een statistisch analyseprogramma.
- Gooi media met grafeen na 24 uur weg. Was elk goed met PBS. Voeg vers DMEMF-12 medium toe met 10% FBS bij 2 ml per put.
- Beeldvorming van steekstoffen
- Om de interactie van verschillende grafeenconcentraties met cellen te onderzoeken, voert u een time-lapse van de cellen uit met de methode die steekbeeldvorming wordt genoemd. Deze methode creëert een time-lapse-beeld met behulp van beeldmonsters die met regelmatige tussenpozen onder de microscoop zijn genomen.
- Schakel hiervoor eerst de computer in. Schakel de time-lapse imaging incubator in en stel deze in op 37 °C. Plaats de MTT-plaat in de time-lapse-incubatorsleuf.
- Open het programma Stitch op de computer. Geef de putten op die in het systeem moeten worden gelezen. Breng de lezer naar de eerste put en lokaliseer en focus het gebied met een vergroting van 10x in wit licht. Start het programma.
OPMERKING: Het is een programma voor het maken van hoogwaardige 4 rijen x 5 kolommen meerdere fotocollages. Het programma combineert foto's die achter elkaar zijn gemaakt in HD-kwaliteit. Wanneer u op de startknop van het systeem drukt, worden de putjes automatisch gelezen en worden 4 rijen x 5 kolommen meerdere foto's gemaakt en samengevoegd.
3. Grafeen - Bioink biohybride hydrogel productie en WJ-MSCs differentiatie
- Productie van bioinks
OPMERKING: De gelyofiliseerde commercieel verkrijgbare alginaat-gelatine (3:5) poeders worden gebruikt als basis voor bioinks. De grafeenbioinkgroep (3D-G; 3D-GS) en de grafeenvrije controlebioinkgroep (3D-B; 3D-BS) worden met dezelfde methode bereid (tabel 1).- Gebruik 50 ml conische buizen voor de bereiding. Weeg eerst 4,5 mg alginaat en 1,5 mg gelatine af en breng het over in een centrifugebuis. Voeg DMEMF-12 medium met 10% FBS toe aan het mengsel tot een totaal volume van 50 ml. Dit is de controle (C) groep zonder grafeen.
- Herhaal een weging van 4,5 mg alginaat en 1,5 mg gelatine en breng over in een centrifugebuis. Neem vervolgens 50 μL van het bereide 0,1% grafeen uit stap 2.1.3. en voeg het toe aan de buis. Voeg DMEMF-12 met 10% FBS toe aan een totaal volume van 50 ml.
- Meng de bioinks eerst door pipetteren en daarna door vortex. Steriliseren in een autoclaaf bij 121 °C onder 1,5 atm druk gedurende 20 min. U kunt ook sterilisatie uitvoeren door in de magnetron te gaan tot het kookpunt.
- Nadat de mengsels zijn geautoclaveerd, centrifugeer u gedurende 2 minuten bij 280 x g bij kamertemperatuur om gevormde bellen te verwijderen. Houd de bioinks op 37 °C totdat de cellen zijn voorbereid.
- Toevoeging van WJ-MSCs en 3D bioprinting
- Voor het tellen, was de cellen wanneer er 80% samenvloeiing is met ongeveer 5 ml PBS en voeg 5 ml 0,25% trypsine en 2,21 mM EDTA 4Na toe. Laat 5 min staan bij 37 °C.
- Voeg 10 ml DMEM-F12-medium met 10% FBS toe aan de cellen na verwijdering uit de incubator. Suspenseer goed, verzamel het medium en breng het over naar een centrifugebuis. Centrifugeer op 101 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant vervolgens weg.
- Laat ongeveer 250 μL medium bij de pellet. Los de pellet opnieuw op in 1 ml vers medium. Voeg aan 48 μL medium 2 μL celsuspensie en 50 μL trypan blue (0,4 g trypanblauw/100 ml) toe in een conische buis (1,5 ml) voor het tellenvan 4. Pipetteer het goed.
- Voeg ongeveer 10 ml van de bereide gekleurde celsuspensie toe aan een Thoma-celtelkamer. Bereken het gemiddelde aantal cellen dat in de vierkanten aan beide zijden van de lichtmicroscoop valt.
Bereken het vitaliteitspercentage (%) = (getelde levensvatbare cellen/totaal aantal getelde cellen) x 100
OPMERKING: De cel-bioink interactie wordt op twee manieren bestudeerd: (1) Het kan worden geprint door het toe te voegen aan de bioinks (3D-B; 3D-G); (2) De cellen worden na het persen op de bioinks gezaaid en de cellen vormen een sferoïde (3D-BS; 3D-GS). - Maak voor de cel-bioink-interactie eerst de bioinkgroepen (tabel 1). Groep 1 omvat 3D-B en 3D-G geprint met bioink voor bioprinting. Groep 2 omvat 3D-BS en 3D-GS bioinks waarop na bioprinting sferoïden zijn gevormd.
- Tel de cellen voor groep 1 zodat er ongeveer 1 x 107 cellen in 0,5 ml medium zitten. Voeg 4,5 ml bioink toe om het totale volume op 5 ml te brengen. Breng dit met behulp van spuiten over naar de patronen in de steriele kast. Installeer de cartridges in het overeenkomstige extrudergedeelte van de bioprinter.
- Neem voor de tweede groep 5 ml van elk van de bioinkgroepen en breng ze over naar steriele patronen met behulp van een injector.
- Gebruik de bioprinter met twee coaxiale printkoppen en de pneumatisch aangedreven extrusietechnologie. Stel de X/Y/Z-resolutie per microstap in op 1,25 μm, de extrusiebreedte op 400 μm en de extrusiehoogte op 200 μm. Een raster van 20 mm x 20 mm x 5 mm is een van de meest gebruikte 3D-modellen voor 3D-bioprintwerk.
- Maak de 3D-modellen met behulp van open-source, webgebaseerde CAD-programma's. Maak vóór bioprinting eenvoudige 3D-modellen met een van de open-sourceplatforms (bijvoorbeeld infill). Het model kan lineair zijn (zoals het model dat hier wordt gebruikt), honingraat of rastervormig. Exporteer en download in .stl-formaat na het maken van een vierkant van 5 mm x 20 mm x 20 mm.
- De bioprintersoftware maakt gebruik van .stl-bestanden en converteert deze naar afdrukbare .gcode-indeling met behulp van slicermodules. Als u een afdrukbare rastervorm wilt krijgen, schakelt u de buitenste schil in de slicermodule uit. Veeg het apparaat voor gebruik af met 70% ethanol en steriliseer het vervolgens door UV-sterilisatie.
- Voor het bioprintproces brengt u de bioinkgroepen over naar de cartridges met behulp van een injector. Installeer de cartridges in het overeenkomstige extrudergedeelte van de bioprinter.
- Stel de gemiddelde druk van de 3D-printer in op 7,5 psi en de cartridge- en bedtemperatuur op 37 °C. Stel de snelheid in op 60% en voer een standaard 3D-printproces uit.
OPMERKING: Door de voorbereide modellen te plannen met spaties (zoals een lineair model) kan celkweek worden uitgevoerd in de ruimtes na bioprinting. - Zet het systeem in de thuispositie tijdens de schrijffase. Plaats de assen (X, Y, Z) automatisch, selecteer de extruder en stel in. Start het afdrukproces. Neem na het bioprintproces het monster en plaats het onder een laminaire stroomkast.
- Spuit de bioinks na het afdrukken met 0,1 N CaCl2-oplossing of voeg 1 ml van de oplossing toe met een pipet bij kamertemperatuur. Wacht ongeveer 10-20 s en was de bedrukte patronen 2x met PBS met Ca 2+ en Mg2+.
- Voeg 2 ml DMEMF-12 met 10% FBS-medium toe aan elk van de celbevattende bioinkgroepen. Incubeer de platen bij 37 °C met 5% CO2. Voeg daarna 2 ml suspensiemedium met 1 x 106 cellen toe aan elke groep voor sferoïdevorming.
- Incubeer de platen bij 37 °C met 5% CO2. Observeer na 24 uur incubatie de sferoïdevorming onder een omgekeerde microscoop.
- WJ-MSCs differentiatie naar neuron-achtige cellen
- Observeer en fotografeer alle partijen bioink na 24 uur incubatie. Voeg 2 ml neurogeen differentiatiemedium per put toe (behalve voor de controlegroep) en ververs elke 2 dagen. Volg gedurende 7 dagen om neurale differentiatie te observeren.
4. Grafeen-Bioink biohybride hydrogel karakterisering
OPMERKING: Time-lapse beeldvorming, Fouriertransformatie infraroodspectroscopie (FT/IR) en scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyses worden uitgevoerd voor de karakterisering van grafeen-bioink biohybride hydrogel. De monsters worden gemaakt van 3D-B- en 3D-G-bioinkgroepen met behulp van de druppelmethode voor FT / IR- en SEM-analyse.
- FT/IR analyse
OPMERKING: FT/IR is een chemische analysemethode gebaseerd op de wiskundige Fouriertransformatie, onmisbaar voor materiaalkarakterisering. Gebruik een FT/IR-apparaat op basis van 28 °C Michelson-interferometerprincipes, met een halogeenlamp, watergekoelde kwiklichtbron, signaalverhouding van 4 cm−1, gemeten gedurende 1 min, bij 2.200 cm−1.- Bereid de FT/IR-microscoop voor en zorg ervoor dat de optiek van het instrument is uitgelijnd. Kalibreer het apparaat.
- Omdat het monster zich in een druppel bevindt, neemt u een stuk hydrogel van 1-2 mm dik en plaatst u het met een tang op het monstergedeelte. Focus op het monster en til het op totdat er nauw contact is gemaakt. Verzamel het monsterspectrum door het proces vanuit het systeem te starten.
- Scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyse
OPMERKING: De oppervlaktemorfologie, interne structuur, celverdeling en bioink-celinteracties kunnen worden onderzocht door SEM-analyse in verschillende dimensies.- Laat de hydrogel in 6-putplaten met 1 ml CaCl 2-crosslinker vallen met behulp van de pipetpuntdruppelmethode (zie figuur 1).
- Was de borden 2x met ongeveer 1 ml PBS om de oplossing van zouten te bevrijden. Doe deze druppels vervolgens in een valkenbuis met 5 ml 5% paraformaldehyde met behulp van een tang.
- Maak dunne secties van de druppelbioinks met behulp van een scalpel. Plak de monsters aan de kleverige kant op de metalen plaat. Plaats in het coatingapparaat waar het gouden palladium, dat in de plasmafase overgaat door de lucht te vervangen door argongas, het monster bedekt.
- Leg het in de elektronenmicroscoop (SEM). Open het microscoopprogramma waarmee de SEM is verbonden. Voer de schaling uit en maak afbeeldingen van verschillende delen van het monster. Voor dit protocol werden schalen van 5 μm, 10 μm en 200 μm gebruikt. In totaal zijn er 40 opnames gemaakt voor de 3D-B en 3D-G groepen.
- Time-lapse beeldvorming
OPMERKING: Tijdens time-lapse beeldvorming werden niet alleen bioinkmonsters met GFP-gengetransformeerde cellen gebruikt, maar ook bioinks met sferoïden worden gedurende 16 uur afgebeeld. Time-lapse beeldvorming wordt uitgevoerd om de effecten van grafeen op stamcellen te onderzoeken en om celinteracties binnen de bioink te volgen.- Voeg in de handel verkrijgbare 1 x 107 GFP-gelabelde MSC's toe aan 5 ml bioink en bioprint zoals in stap 3.2.11. Voeg 1 ml crosslinker toe, houd 20-30 s vast en was 2x met PBS.
- Schakel de time-lapsemonitor in en open het programma op de computer. Stel ongeveer 16 uur in time-lapse-modus in en stel de temperatuur in op 37 °C. Druk op de knop Start . Video's in de vorm van 40 s time-lapse videosamples worden door het systeem opgenomen.
- Focus de microscoop op 10x vergroting om de 2 uur. Visualiseer ook de sferoïden die zijn gemaakt door dezelfde stappen te volgen.
Figuur 1: 3D-B en 3D-G bioink groepen geproduceerd als druppels voor gebruik bij karakterisering . (A) Bioink-monsters (pre-karakteriseringsbeeld) op een plaat met een crosslinker. (B) 3D-B drop afbeelding van bioink. (C) 3D-G bioink drop afbeelding. Het te karakteriseren biomateriaal en de cellen die het bevat, kunnen gemakkelijker processen doorlopen zoals vergulding, bemonstering, enz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Bepaling van neurogene differentiatie door immunostaining methode
- Verzamel de sferoïden, zonder de bolvormen te onderbreken, en zaai opnieuw in nieuwe platen om opnieuw te kleuren met een eenvoudigere methode, in plaats van in te bedden in paraffine voor weefselsectie.
- Bedek de 48-putplaten met ongeveer 20 ml voorgeautoclaveerde 0,1% gelatine-oplossing en bewaar ze minstens 1 uur in een incubator. Pipetteer ongeveer 500 μL bereide 0,1% gelatine in 48-putplaten. Laat de gelatineuze platen 10 minuten in de incubator staan.
OPMERKING: Hierdoor kan de gelatine enigszins opzwellen, het oppervlak bedekken en een betere omgeving creëren voor de verzamelde sferoïden om zich te hechten. - Verzamel de sferoïden door pipetteren, verdeel de verzamelde sferoïden uit de incubator in de putten van de 48-putplaat en voeg vers medium toe. Incubeer vervolgens gedurende 12-24 uur.
OPMERKING: Het is vrij moeilijk om de sferoïden te verdelen door te tellen. Verzamel de sferoïden in een enkele buis en verdeel het totale volume gelijkmatig over de putten. Voor deze studie bevatte elke put ongeveer 4-6 sferoïden.
OPMERKING: Voor 2D-monsters is het voldoende om vlekken voor te wassen en is er geen mediavervanging vereist. - Verwijder het medium en was de cellen langzaam met PBS omdat de sferoïden zich aan de bovenkant bevinden. Fixeer in 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur.
- Was de monsters opnieuw met PBS en blokkeer met ongeveer 10 ml 2% BSA en 0,1% TritonX gedurende 30 minuten. Daarna 3x wassen met PBS.
- Verdun geselecteerde primerantistoffen (N-cadherine-konijn en β-III tubuline-muis) in een verhouding van 1:100 met antilichaamverdunningsreagensoplossing. Voeg 100 μL antilichaamoplossing toe aan elk van de monsters en incubeer een nacht bij 4 °C.
- Was de monsters 3x met PBS. Incubeer met antimuis IgG-FTIC-konijn voor β-III tubuline en antimuis IgG-SC2781-geit secundair antilichaam voor N-Cad verdund tot 1:200 bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voer alle bewerkingen uit in het donker.
OPMERKING: Welke stam ook wordt gebruikt als het primaire antilichaam (bijv. Muis) bij dubbele kleuring, een andere stam (bijv. Geit of konijn) moet worden gebruikt voor het secundaire antilichaam. - Was het secundaire antilichaam met PBS 3x en druppel vervolgens de DAPI-oplossing (1:1) in elk van de monsters. Wacht 15-20 min. Voer immunofluorescentiebeeldvorming uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafeentoxiciteit en 2D-beeldvorming
Statistische analyse van de verkregen MTT-resultaten werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA met Tukey's test in statistische analysesoftware, en de verkregen grafiek is weergegeven in figuur 2. Het grafeenpercentage in vergelijking met de controle vertoonde alleen een significante daling voor de grafeenconcentratie van 0,001% (**p < 0,01).. Er waren geen significante verschillen tussen de andere groepen en de controle (p > 0,05). Daarom werd de optimale grafeenconcentratie bepaald op 0,1%, aangezien de hoogste levensvatbaarheidspercentages werden waargenomen na blootstelling aan deze concentratie volgens de MTT-testresultaten en de stikbeelden.
Figuur 2: Onderzoek naar het effect van grafeenconcentratie op celproliferatie. Het grafeenpercentage ten opzichte van de controle vertoonde alleen een significante daling voor de grafeenconcentratie van 0,001% (**p < 0,01, n = 6). Er waren geen significante verschillen tussen de andere groepen en de controle (p > 0,05; n = 6). Statistische analyse van de verkregen MTT-resultaten werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA met Tukey's test in statistische analysesoftware. De foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Dit cijfer is gewijzigd van28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit deel van de gepresenteerde methode toont aan dat de stamcel-grafeen interactie kan worden gebruikt in toekomstige studies. Er werd waargenomen dat grafeen in elke geteste concentratie werd getolereerd in het 2D-systeem en door de cellen werd opgenomen door middel van endocytose (figuur 3). Er is vastgesteld dat de grafeenplaten langs het cytoplasma in de cel bewegen.
Figuur 3: De cel-grafeen interacties worden in twee dimensies weergegeven in gestikte afbeeldingen. a) controle; b) 0,0001 %; c) 0,001 %; d) 0,01 %; e) 0,1 %; en (F) 1% concentraties grafeen. Het wordt verkregen door time-lapse-beeldvorming te combineren met high-definition kwaliteitsinstellingen om een collage van 4 rijen x 5 kolommen van meerdere foto's te verkrijgen. Dit cijfer is gewijzigd van 28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bovendien werd in deze studie waargenomen dat het grafeen-bioink-effect geen toxische micro-omgeving in het 3D-systeem creëerde en dat de cellen in interactie waren.
Er is ook waargenomen dat het gebruik van grafeen in 3D-systemen geen giftige micro-omgeving heeft gecreëerd. Het bepalen van de toxische dosis voor cellen is cruciaal voor het gebruik van grafeen in langdurige buisimplantaten of injecteerbare hydrogelvormen. Bovendien, aangezien grafeen een effectief materiaal is in neuronale communicatie, is het gebruik ervan in zenuwweefselmanipulatietoepassingen sterk toegenomen, zoals gedocumenteerd in de literatuur25.
Productie van composiet biomaterialen en 3D bioprinting
De vorming van biohybride patronen op basis van gelatine-alginaat werd uitgevoerd met een niet-toxische concentratie grafeen (0,1%). Er is waargenomen dat de geselecteerde geschikte dosis grafeen interageert met de cellen in de bioink.
Time-lapse beeldvorming
GFP-monsters werden ingesteld op 37 °C gedurende ongeveer 16 uur in time-lapse en foto's en video's werden gemaakt (Video 1). GFP-signalen gingen verloren wanneer celdood werd waargenomen. Hier werd gedetecteerd dat cellen die overleefden in het 3D-grafeenmedium hun vitaliteit behielden sinds de GFP-helderheid werd waargenomen tot het einde van de incubatie.
Video 1. Time-lapse video van GFP-gelabelde WJ-MSCs. De interactie van gelabelde stamcellen met elkaar wordt waargenomen. Klik hier om deze video te downloaden.
Grafeen-Bioink biohybride hydrogel karakterisering
SEM en FT/IR werden gebruikt voor de karakterisering van de 3D-B- en 3D-G-groepen gemaakt door de druppelbioinkmethode. De SEM-beelden van de 3D-B- en 3D-G-bioinkgroepen zijn weergegeven in figuur 4. Van de 40 foto's die bij stap 4.2.5 zijn gemaakt, worden hier 4 representatieve afbeeldingen getoond.
Figuur 4: SEM-beelden van de 3D-B- en 3D-G-bioinkgroepen. (A) Afbeelding van een vergulde 3D-B bioink sectie met elektronenmicroscopie. Schaalbalk: 200 μm. (B) Afbeelding van MSC bevestigd aan het 3D-B bioink binnenoppervlak. Schaalbalk: 5 μm (C) Afbeelding van 3D-G bioink binnen- en buitenoppervlak. Schaalbalk: 200 μm.(D) Binnenoppervlakcel 3D-G bioink adhesiebeeld. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dienovereenkomstig werden bioink-cel interacties zowel aan de oppervlakte als intern aangetoond. Er was een cel-biomateriaal interactie in beide bioinks (3D-B; 3D-G). De cellen waren morfologisch rond en bevestigd aan het materiaal. De FT/IR analyse van de 3D-B en 3D-G bioink daling werd vergeleken met de grafiek in figuur 5.
Figuur 5: FT/IR-analyse. (A) 3D-B bioink. (B) 3D-G bioink. Pieken zoals 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 en 1033 cm−1 zijn gevonden in hydrogelstudies op basis van alginaat-gelatine in de literatuur26. Ook is de piek van 1335,46 cm−1 vergelijkbaar met de pieken die werden gezien in grafeenbiomateriaalstudies27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aangezien de controlebioink (3D-B) gebaseerd was op alginaat/gelatine, waren de meest prominente pieken rond 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 en 1033 cm−1 vergeleken met vergelijkbare studies in de literatuur met pieken gezien bij 1546 cm−126. Een piek van 1399 cm−1 werd waargenomen in de grafeengroep (3D-G) en een vergelijkbare piek werd gevonden bij 1335,46 cm−1 in een studie uitgevoerd met grafeen27.
3D neuronale differentiatie
De beelden van sferoïden op de bioinks na de 7e dag na differentiatie zijn weergegeven in figuur 6.
Figuur 6: 2D-beeld van controle-WJ-MSC's en sferoïdegroepmonsters op dag 7 na differentiatie . (A) Grootte van de bol van de 3D-BS-groep bioink met diameters van 160 μm en 200 μm. (B) 2D-controlecellen. Sferoïden van (C) de 3D-BS groep en (D) de 3D-GS groep. De zwarte materialen in (D) zijn grafeenmoleculen geïntegreerd met sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er werd gezien dat cellen hun vitaliteit behielden in zowel 2D- als 3D-culturen. Er werd aangenomen dat de grenzen van de sferoïde cellen in beide groepen (3D-B en 3D-G) transparant en levendig waren, en de sferoïden in de grafeengroep waren relatief groter en hielden het grafeen in de cel gevangen. De differentiatie werd ook getest door immunostaining. Met de hier gebruikte dubbele kleuring werden de activiteiten van cellen in 2D neuronale transformatie vergeleken met 3D-cultuur (figuur 7).
Figuur 7: Immunostaining van 2D- en 3D-cellen. (A,B) Immunostaining van gekweekte sferoïden op 3D-BS-bioinks. (C,D) 3D-GS bioink sferoïde immunostains. (E) Gedifferentieerde 2D-positieve controle WJ-MSC's. (F) Ongedifferentieerde 2D-negatieve controle WJ-MSCs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Immunofluorescentiebeelden van cellen die gedurende 7 dagen zijn gekweekt, zijn weergegeven in figuur 7. Monsters werden gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor N-cadherine (groen) en β-III tubuline (rood). Daarnaast werd DAPI gebruikt voor visualisatie van de kern (blauw of paars). Dienovereenkomstig verschilden de N-cadherinen (groen) die in de 2D- en 3D-monsters werden gebruikt gedurende 7 dagen, omdat het een belangrijke rol speelt bij signaleringsmechanismen en de ontwikkeling van neuronen. De groene afbeelding in figuur 7A-E geeft neuronachtige structuren weer (figuur 7). Klasse III β-tubuline is een van de zeven isotypen die bekend staan als neuronmarkers in het menselijk genoom. N-cadherine-expressie bleek hoger te zijn in de monsters die gedurende 7 dagen werden gedifferentieerd in vergelijking met β-III-tubuline. Volgens de resultaten van het huidige experiment werd vastgesteld dat de 3D-systemen een meer geschikte micro-omgeving creëerden voor de cellen om te overleven en te differentiëren. Het 2D-positieve controlemonster (figuur 7E) vertoonde minder neuronachtige structuurmarkers in vergelijking met de 3D-monsters (figuur 7A-D). Dit laat ons zien dat de micro-omgeving gecreëerd met de 3D-structuur effectiever is in de differentiatie van stamcellen. Bovendien, in plaats van celtherapieën alleen; Biomateriaal-cel gecombineerde behandelingen lijken invloedrijker en effectiever te zijn bij zenuwbeschadiging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voordelen van behandelingen toegepast met technische 3D-steigers ten opzichte van conventionele 2D-methoden worden elke dag meer en meer merkbaar. Stamcellen die alleen in deze therapieën worden gebruikt of samen met steigers geproduceerd uit verschillende biomaterialen met een lage biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid zijn meestal ontoereikend bij perifere zenuwregeneratie. Wharton's jelly mesenchymale stamcellen (WJ-MSCs) lijken een geschikte kandidaat-cellijn te zijn, vooral gezien de optimalisatie van de protocollen voor acquisitie, hun proliferatievermogen en hun differentiatiecapaciteit29. In deze studie onderzochten we de interactie van stamcellen met grafeen in zowel 2D- als 3D-culturen. We vergeleken ook de neurogene differentiatie in de gegenereerde biohybride hydrogelgroepen met de 2D-omgeving. We toonden de neurosfeervorming op de bioinks aan door immunostaining. In verdere studies hebben we ons kandidaat-prototype, dat kan worden geïnjecteerd of geïmplanteerd als een neuraal kanaal, gekarakteriseerd door SEM- en FT / IR-methoden. Deze studie karakteriseert de eigenschappen van het geproduceerde biomateriaal, de cel-biomateriaal interactie en de neurale differentiatie van de stamcellen in aanwezigheid van het biomateriaal. In de volgende fasen zal het effect op migratie worden onderzocht.
De biohybride materialen die worden gevormd door het combineren van twee of meer biocompatibele materialen worden steeds voordeliger in termen van hun structurele eigenschappen in vergelijking met homogene materialen30. In een eerdere studie werd implantatie van een op polyglycolzuur gebaseerd neurobuiskanaal in de perifere gezichtszenuw uitgevoerd. Gelabelde olfactorische stamcellen werden in deze buis ingebracht, wat resulteerde in de succesvolle regeneratie van perifere chirurgie en geïnjecteerde stamceltherapie16. In een andere studie werd de effectiviteit van de 3D-structuur verkregen uit meerdere cellulaire sferoïden ontwikkeld met behulp van menselijke normale dermale fibroblasten en het silicium zenuwkanaal, dat vaak wordt gebruikt in de literatuur vanwege zijn inerte kenmerk, vergeleken bij de regeneratie van heupzenuwbeschadiging. Er werd aangetoond dat de op sferoïden gebaseerde 3D-structuur de weefselregeneratie aanzienlijk en sneller verhoogde in diermodellen met ischiasschade in vergelijking met homogene materialen20. Het is echter bekend dat biomaterialen op basis van silicium, die vaak in de literatuur worden gebruikt, enkele belangrijke nadelen hebben, zoals een hoog infectierisico en een lage biocompatibiliteit15,30.
In de huidige studie werd de productie van biocompatibele, biologisch afbreekbare hydrogel biohybride composietweefsel met grafeen nanoplaatjes, waarvan bekend is dat ze effectief zijn in zenuwgeleiding, uitgevoerd door een 3D-printtechniek. Er zijn verschillende studies waarin grafeen is gebruikt als biomateriaal voor zenuwgeleiding25,30. Bovendien is grafeen een van de dunste en lichtste materialen die beschikbaar zijn, waardoor de voorkeur in gezondheidstechnologieën toeneemt13. Een van de meest wenselijke eigenschappen van biomaterialen is biologische afbreekbaarheid. Experimentele en moleculaire simulatietechnologieën zijn toegepast om de biologische afbraak van grafeen en zijn derivaten te onderzoeken13. Op dit punt kan oppervlaktemodificatie-functionalisatie of productie in de vorm van samengestelde biomaterialen de biologische afbraak verbeteren of remmen, grotendeels afhankelijk van de eigenschappen van de additieven.
Verschillende enzymen, zoals mangaanperoxidase (MnP), mierikswortelperoxidase (HRP) en myeloperoxidase (MPO), zijn beschikbaar in de literatuur voor de biologische afbraak van grafeenderivaten. Het MPO-enzym, een peroxidase dat vrijkomt uit neutrofielen die naar het gebied van vreemde lichamen komen en fagocytose uitvoeren, wordt geassocieerd met de biologische afbraak van grafeen, vooral in de menselijke long13. De biologische afbreekbaarheidsniveaus van samengestelde biomaterialen die grafeen bevatten in plaats van alleen grafeennanobuisjes verschillen van elkaar. Het is gemakkelijker om deze gewenste eigenschap in composietmaterialen te bereiken. Bovendien draagt het bepalen van de toxische dosis grafeen bij aan het gebruik van klinisch toepasbare biomaterialen13.
Een belangrijk onderdeel van de grafeenfase van het protocol is het steriliseren van het grafeen wanneer het moet worden gebruikt. Het risico op besmetting dat kan optreden tijdens de biohybride-cel interactiefase wordt vermeden.
Het effect van de verkregen biohybride grafeen-bioink hydrogelpatronen op zenuwdifferentiatie werd onderzocht en het was compatibel met de literatuur dat de differentiatie hoger was in het 3D-systeem. De behoefte aan de productie van biomaterialen met weefsel-engineered cellulaire therapeutische benaderingen die kunnen worden ontwikkeld tegen verschillende neurodegeneratieve ziekten, zoals perifere zenuwbeschadiging, neemt toe met de ontoereikendheid van de huidige behandelingen van dag tot dag, wat het belang van deze studie benadrukt.
In een eerdere studie werd de interactie van grafeen met cellen in een 2D-celkweekmedium onderzocht28. Met de ervaring die daar is opgedaan, werd hier grafeen toegevoegd aan de alginaat-gelatine bioink met de bekende verhouding, en een nieuw en uniek biomateriaal prototype werd geproduceerd door een 3D-printmethode. Dit nieuwe materiaal werd gebruikt om celinteractie op twee verschillende manieren te bestuderen. De eerste is het co-printen van het cel-composiet biomateriaal op een 3D-printer. De tweede is de vorming van een cellulaire sferoïde uit het biomateriaal. Daarnaast werd ook de interactie van WJ-MSC's met het gelabelde GFP-gen met het materiaal waargenomen.
In deze studie werden biohybride bioinks gekenmerkt door het selecteren van FTIR- en SEM-methoden. Hiermee kunnen de door de druppelmethode gevormde monsterballen tijdens de karakteriseringsfase worden onderzocht. Vooral omdat we een harde en droge structuur kunnen onderzoeken tijdens de SEM-verguldingsfase, biedt SEM de fysieke geschiktheid om betere, dunne secties te krijgen met een scalpel van de bioink-ballen die we met deze methode hebben gemaakt.
In deze methodestudie werden tijdens de experimenten op twee verschillende manieren cellen aan het biohybride materiaal toegevoegd: binnen voor 3D-bioprinting of tijdens sferoïdevorming. Door cellen te bedekken met bioinks en 3D-bioprinters te gebruiken, kunnen onderzoekers elke gewenste 3D-vorm creëren voor zenuwregeneratie. Aan de andere kant veroorzaakt het meer stress op cellen als gevolg van de drukdruk en dus verlies van de levensvatbaarheid van cellen. Het kan echter een meer wenselijke methode zijn om de celhoming te verhogen wanneer ze worden geïnjecteerd of getransplanteerd naar een specifiek gebied om regeneratie te induceren.
De creatie van sferoïden op bioinks creëert een meer bruikbare vorm van kunstmatig weefsel in termen van celinteractie en biedt een betere niche voor celdifferentiatie. Het is ook geschikt voor het nabootsen van de natuurlijke micro-omgeving en daarom het onderzoeken van cellulaire mechanismen. De lage hechting van de sferoïden aan de bioinks maakt ook een gemakkelijkere scheiding van de bioinks en veelzijdigheid van de toepassingen mogelijk.
De gebruikte N-cadherinen (in het groen weergegeven in figuur 7) maken deel uit van celsignaleringsmechanismen en spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van neuronen32. Klasse III β-tubuline is een van de zeven isotypen die bekend staan als neuronmarkers in het menselijk genoom. Het toont aan dat de WJ-MSC's die in deze studie worden gebruikt, neuronachtige structuren beginnen te vormen. In deze context zullen 3D-systemen een adequatere micro-omgeving creëren voor cellen om hun levensvatbaarheid te behouden.
Ten slotte is het, vanwege de kosten die ermee gemoeid zijn en de klinische toepasbaarheid van celdifferentiatiesystemen, erg belangrijk in neuro-engineering om in de toekomst systemen te ontwikkelen met gecontroleerde afgifte van steigers, cellen en differentiatiebiosignalen33 en deze aan te passen aan de klinieken als gecombineerde therapieën. Daarom kunnen sferoïde en bioprintmethoden ook worden gebruikt in verdere studies waarbij grafeen en andere biosignalen worden ingebed in hydrogels en op een gecontroleerde manier worden vrijgegeven. In vitro studies zijn een belangrijke stap op weg naar in vivo. Wanneer het materiaal, dat hier als prototype wordt geleverd, wordt geproduceerd in overeenstemming met de normen voor goede laboratoriumpraktijken, kunnen de sterilisatienormen worden bereikt die nodig zijn voor overdracht naar de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling. Het project werd uitgevoerd in samenwerking met HD Bioink, ontwikkelaar van de 3D-bioprinttechnologie.
Acknowledgments
Het grafeen dat in deze studie werd gebruikt, werd ontwikkeld aan de Kirklareli University, Department of Mechanical Engineering. Het werd geschonken door Dr. Karabeyoğlu. De grafeentoxiciteitstest werd gefinancierd door het project getiteld "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Application No: 1139B411802273) voltooid in het kader van TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. Het andere deel van de studie werd ondersteund door het onderzoeksfonds van Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Mesenchymale stamcellen met GFP gebruikt in de time-lapse beeldvormingsfase werden gedoneerd door Virostem Biotechnology. De auteurs bedanken Darıcı LAB en YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB-team voor productieve discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
- Kaya, T. I.
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A.
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
