Summary
이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.
Abstract
인간 호흡 상피의 강력한 시험관 내 모델의 부족은 호흡기의 생물학 및 병리학에 대한 이해를 방해합니다. 우리는 폐 조직의 성체 줄기 세포로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고 성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 정의된 프로토콜을 기술한다. 폐 오가노이드는 높은 안정성으로 1 년 이상 연속적으로 확장되는 반면, 분화 된기도 오가노이드는 형태 학적으로나 기능적으로 인간의 기도 상피를 거의 생리적 수준으로 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 따라서, 우리는 인간기도 상피의 강력한 오가노이드 모델을 확립합니다. 폐 오가노이드와 분화 된기도 오가노이드의 장기간 확장은 안정적이고 재생 가능한 공급원을 생성하여 과학자들이 배양 접시에서 인간기도 상피 세포를 재구성하고 확장 할 수있게합니다. 인간 폐 오가노이드 시스템은 바이러스-숙주 상호작용 연구, 약물 테스트 및 질병 모델링을 포함한 다양한 응용을 위한 독특하고 생리활성 시험관내 모델을 제공한다.
Introduction
오가노이드는 장기 발달의 시험관 내 모델링과 생물학 및 질병 연구를위한 강력하고 보편적 인 도구가되었습니다. 성장 인자 정의 배양 배지에서 배양하는 경우, 다양한 장기로부터의 성체 줄기 세포 (ASC)는 3차원 (3D)으로 확장될 수 있고 오가노이드라고 불리는 다중 세포 유형으로 구성된 장기 유사 세포 클러스터로 자기조립될 수 있다. 클레버즈의 실험실은 2009 년 1,2 년에 최초의 ASC 유래 오가노이드 인 인간 장내 오가노이드의 유도를보고했다. 그 후, ASC 유래 오가노이드는 전립선 3,4, 간 5,6, 위 7,8,9, 췌장 10, 유선 11 및 폐 12,13을 포함한 다양한 인간 장기 및 조직에 대해 확립되었다. . 이들 ASC 유래 오가노이드는 천연 장기의 중요한 세포, 구조적, 기능적 특성을 유지하고, 장기 확장 배양물에서 유전적 및 표현형 안정성을 유지하였다(14,15).
오가노이드는 또한 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 (16)를 포함하는 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래될 수 있다. PSC 유래 오가노이드는 그들의 설립을 위해 장기 발달의 메커니즘을 이용하는 반면, ASC는 생리적 인 조직 자체 재생 또는 조직 복구 중에 줄기 세포 틈새를 모방하는 조건을 재건함으로써 오가노이드를 형성하도록 강요 될 수 있습니다. PSC 유래 오가노이드는 ASC 유래 오가노이드의 비교 가능한 성숙 수준에 도달 할 수는 없지만 발달 및 유기 발생을 탐구하는 데 유리한 모델입니다. PSC 유래 오가노이드의 태아와 유사한 성숙 상태 및 이러한 오가노이드를 확립하기위한 복잡성은 성숙한 조직에서 생물학 및 병리학을 연구하기위한 광범위한 적용을 실질적으로 방해합니다.
코에서 말단 세기관지까지 인간의 호흡기는 기도 상피(pseudostratified ciliated epithelium)라고도 불리우며, 이는 네 가지 주요 세포 유형, 즉 섬모 세포, 잔 세포, 기저 세포 및 클럽 세포로 구성됩니다. 우리는 Clevers의 실험실12,13과 협력하여 인간 폐 조직에서 ASC 유래 인간 폐 오가노이드를 설립했습니다. 이들 폐 오가노이드는 일 년 이상 동안 확장 배지에서 연속적으로 확장되고; 정확한 지속 기간은 다른 기증자로부터 얻은 다른 오가노이드 라인에 따라 다릅니다. 그러나, 천연 기도 상피와 비교하여, 이러한 장기 팽창성 폐 오가노이드는 인간 기도의 주요 세포 집단인 섬모 세포가 이들 폐 오가노이드에서 과소 대표되기 때문에 충분히 성숙하지 않다. 따라서, 우리는 근위 분화 프로토콜을 개발하고기도 상피를 거의 생리적 수준으로 형태학적으로 그리고 기능적으로 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성했습니다.
여기서 우리는 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 비디오 프로토콜을 제공한다.
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Protocol
본원에 기술된 인간 조직을 이용한 모든 실험은 홍콩 대학/병원 당국 홍콩 서부 클러스터(UW13-364 및 UW21-695)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다. 조직 수집 전에 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다.
1. 인간 폐 오가노이드의 유도
- 실험자료의 제조
- 고급 DMEM/F12 배지에 2mM 글루타민, 10mM HEPES, 100U/mL의 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신을 보충하여 기본 배지를 준비합니다.
- 기본 배지에 10% R-스폰딘 1 컨디셔닝 배지, 10% 노긴 컨디셔닝 배지, 1x B27 보충물, 1.25 mM N-아세틸시스테인, 10 mM 니코틴아미드, 5 μM의 Y-27632, 500 nM의 A-83-01, 1 μM의 SB202190, 5 ng/mL의 섬유성 성장 인자(FGF)-7, 20 ng/mL의 FGF-10 및 100 μg/mL의 프리모신을 보충함으로써 인간 폐 오가노이드 확장 배지를 제조하였다( 물질 표 참조).
참고: R-스폰딘 1 및 노긴 컨디셔닝 배지는 상업적 재조합 R-스폰딘 1(500 ng/mL) 및 노긴(100 ng/mL)으로 대체될 수 있다. - 24-웰 현탁 배양 플레이트를 세포 배양 배양기에서 예열한다. 표준 세포 배양 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 5%CO2 및 가습 분위기로 한다. 지하 매트릭스를 4°C 냉장고에서 해동시킨다. 실험 중에 지하 매트릭스와 배양 배지를 얼음 위에 보관하십시오.
- 3D 오가노이드 배양을 위한 인간 폐 조직으로부터의 세포 분리
- 다양한 질병으로 인해 외과 적 절제술을받는 환자로부터 약 0.5cm 크기의 갓 절제된 인간 폐 조직을 조달하십시오. 폐 조직을 실온에서 30mL의 기초 배지로 운반하고 가능한 한 빨리 생물안전 후드 내부로 처리하십시오.
- 폐 조직을 10cm 세포 배양 접시에 멸균 메스로 작은 조각 (0.5-1 mm)으로 다듬습니다. 조직 조각을 15 mL 원심분리 튜브에서 차가운 기저 배지 10 mL로 세척하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다.
- 상층액을 버리고 펠렛을 콜라게나제가 보충된 8mL의 기본 배지에 2mg/mL의 최종 농도로 재현탁시킨다. 튜브를 37°C에서 30-40분 동안 120 rpm으로 흔들어 조직 조각을 소화시켰다.
- 20x 상하로 피펫팅하여 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 소화된 조직 조각을 전단한다. 100 μm 스트레이너를 50 mL 원심분리 튜브에 적층하고 현탁액을 여과한다.
- 기저 배지로 스트레이너 상의 조직 조각을 회수하여 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 두 번째 전단 및 여과를 실시한다. 추가적인 전단-필터링은 1x-2x를 수행하여 더 많은 세포를 분리할 수 있으며, 특히 조직의 작은 조각(예를 들어, <0.5cm)이 조달될 때 더욱 그러하다.
- FBS를 2%의 최종 농도로 유동관에 첨가하여 소화를 종료하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다.
- 세포 펠릿을 10 mL의 기초 배지에 재현탁시키고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다. 상층액을 버리십시오.
- (선택 사항) 펠릿 내에 많은 적혈구가 보이면 (펠렛의 색상으로 추정), 세포 펠릿을 적혈구 용해 완충액 2 mL에 재현탁시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 10 mL의 기초 배지를 튜브에 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다. 상층액을 버리십시오.
- 펠릿을 차가운 지하실 매트릭스에 재현탁하고 얼음 위에 보관하십시오. 약 0.5 cm 크기의 폐 조직으로부터 회수된 세포를 위한 80-160 μL의 기저 매트릭스를 추가; 양은 2-4 방울을 종설하기에 충분합니다.
- 40 μL의 현탁액을 미리 가온된 24-웰 현탁액 배양 플레이트의 각 웰에 분주한다. 배양 플레이트를 37°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 응고되어 물방울을 형성하게하십시오.
- 5 nM의 헤레굴린 베타-1이 보충된 500 μL의 인간 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
- 3일마다 매체를 새로 고칩니다. 물방울을 그대로 유지하면서 오래된 매체를 제거하고 조심스럽게 신선한 매체를 추가하십시오. 10-14 일 동안 배양 한 후 오가노이드를 통과시킵니다. 헤레굴린 베타-1은 첫 번째 계대 전에 초기 배양물에서만 사용한다.
- 현미경으로 오가노이드를 관찰하여 오가노이드가 매우 높은 세포 밀도로 매립되지 않도록하십시오. 액적이 지나치게 높은 세포 밀도로 인해 분해되면, 더 높은 부피의 지하실 매트릭스를 가진 오가노이드와 세포를 회수하고 다시 임포하여 더 낮고 바람직한 세포 밀도로 더 많은 물방울을 만듭니다.
2. 인간 폐 오가노이드의 확장
- 파스퇴르 피펫의 끝을 분젠 버너와 같은 화염에 태워 파스퇴르 피펫을 준비하여 개구부를 직경 1.5mm에서 약 1.0mm로 좁힙니다. 피펫을 식히고 오토클레이빙하여 살균하십시오. 피펫을 기본 배지로 적셔 기계적 전단 중 세포 부착 및 손실을 피하십시오.
- 기계적 전단이 있는 폐 오가노이드 통과
- 1 mL 팁과 피펫을 위아래로 사용하여 위에서 얻은 물방울을 부수십시오. 이어서, 배지와 함께 오가노이드를 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고 차가운 기저 배지로 부피를 10 mL로 조정한다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리 후 상층액을 버리십시오.
- 오가노이드를 차가운 기저 배지 10mL로 다시 한 번 씻으십시오. 오가노이드를 차가운 기저 배지 2mL에 재현탁하십시오. 오가노이드를 파스퇴르 피펫으로 작은 조각으로 전단하기 위해 위아래로 피펫하십시오.
- 총 부피가 10 mL인 기초 배지로 보충하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하였다. 오가노이드 단편을 1:3 내지 1:5 확장을 가능하게 하기에 충분한 차가운 지하실 매트릭스로 재현탁시킨다. 얼음 위에 보관하십시오.
- 40 μL의 오가노이드 현탁액을 미리 가온된 24-웰 플레이트의 각 웰에 놓는다. 배양 플레이트를 37°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 굳어지게하십시오.
- 500 μL의 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 3일마다 매체를 새로 고칩니다. 1 : 3에서 1 : 5의 비율로 2 주마다 오가노이드를 통과하십시오.
- 트립신화를 통한 폐 오가노이드 통과
참고 : 트립신화는 파스퇴르 피펫을 사용하여 폐 오가노이드를 작은 조각으로 전단하기가 어렵거나 오가노이드의 크기가 매우 가변적이거나 후속 실험에서보다 균일 한 크기의 오가노이드가 필요할 때 선호됩니다.- 단계 2.2.1에 나타낸 바와 같이 폐 오가노이드를 수확한다. 오르가노이드를 해리 효소 1 mL에 재현탁시키고, 3-5분 동안 37°C 수조에서 인큐베이션한다.
- 튜브에 기본 배지 1 mL를 첨가하십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 오가노이드를 위아래로 작은 조각으로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 전단하십시오. 4x 배율로 현미경으로 오가노이드 조각의 크기를 확인하십시오. 그런 다음 40 μL의 FBS를 첨가하여 소화를 종료하십시오.
참고 : 실험 배열에 따라 현미경으로 오가노이드 단편의 크기를 결정하십시오. 실험에 더 균일 한 크기의 오가노이드 또는 오가노이드가 필요한 경우 오가노이드를 더 작은 조각 또는 단일 세포로 전단하십시오. 그런 다음 오가노이드가 실험 준비가되기 전에 더 오랜 시간, 아마도 3 주가 걸립니다. - 최종 부피가 10 mL인 기저 배지로 충전하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하였다. 1:5-1:10의 비율로 통과하기에 충분한 부피로 차가운 지하실 매트릭스에 오르가노이드 조각을 재현탁하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.
- 40 μL의 오가노이드 현탁액을 미리 가온된 24-웰 플레이트의 각 웰에 놓는다. 배양 플레이트를 37°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 굳어지게하십시오.
- 웰 당 500 μL의 폐 오가노이드 확장 배지를 보충하고 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다. 3일마다 확장 매체를 새로 고칩니다. 2-3 주 후에 오가노이드를 통과하십시오.
참고: 약 100개의 오가노이드가 지하 매트릭스의 40μL 물방울 내에 장착됩니다. 폐 오가노이드는 일반적으로 상대적으로 높은 세포 밀도로 더 잘 자랍니다. 방울이 분해되거나 지나치게 높은 세포 밀도로 인해 성장하는 오가노이드가 함께 부착되면 더 낮은 세포 밀도로 오가노이드를 다시 내장하십시오.
3. 성숙한 기도 오가노이드를 생성하는 근위 분화
- 공기 액체 계면 기본 배지에 1x 공기 액체 계면 보충물, 1x 공기 액체 계면 유지 보조 보충제, 4 μg/mL의 헤파린, 1 μM의 하이드로코르티손, 10 μM의 Y-27632 및 10 μM의 DAPT를 보충하여 근위 분화 배지 (PD 배지)를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
- 3D 기도 오가노이드
- 폐 오가노이드를 기계적 전단을 통해 통과 후 7-10 일 동안 팽창 배지에서 배양하십시오. 확장 매체를 PD 매체로 교체하십시오. 오가노이드를 세포 배양 인큐베이터에서 14일 동안 PD 배지에서 인큐베이션한다.
- PD 배지를 각 웰에 버리십시오. 세포 용해물 완충액을 추가하여 RNA 추출 및 RT-qPCR 분석법에 의한 세포 유전자 발현의 검출을 위해 분화된 기도 오가노이드를 수확한다.
- 대안적으로, 오가노이드를 단일 세포로 분리하기 위해 10 mM EDTA를 첨가한 후 37°C에서 60분 동안 오가노이드를 인큐베이션하고, 이어서 세포 집단을 조사하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 오가노이드는 다양한 실험 조작을 할 준비가되어 있습니다.
- 2D 기도 오가노이드
- 2D 분화 배양을 위해 충분한 3D 폐 오가노이드를 준비하십시오. 총 1.3 x 10 5 및 4.5 x 105 셀이 각각 24-웰 투과성 지지 인서트 및 12-웰 투과성 지지 인서트에 요구된다.
- 3D 폐 오가노이드가 2주 동안 팽창 배지에서 성장한 후, 오가노이드를 단일 세포로 소화하고 24-웰 및 12-웰 인서트에 시드하여 2D 기도 오가노이드를 생성한다.
- 예비-삽입물을 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 기본 배지와 함께 인큐베이션한다. 250 μL 및 500 μL의 기초 배지를 각각 24-웰 플레이트의 상부 및 하부 챔버에 첨가한다. 12-웰 플레이트의 경우, 상부 및 하부 챔버에 각각 500 μL 및 1,000 μL의 기초 배지를 첨가한다.
- 단계 2.2.1에 기재된 바와 같이 3D 폐 오가노이드를 수확한다. 오가노이드를 해리 효소 1 mL로 재현탁시키고, 3-5분 동안 37°C 수조에서 인큐베이션한다.
- 튜브에 기본 배지 1 mL를 첨가하십시오. 오가노이드를 파스퇴르 피펫으로 단일 세포로 전단하고 현미경으로 세포를 확인하기 위해 위아래로 피펫을 만듭니다. 그런 다음 40 μL의 FBS를 첨가하여 소화를 종료하십시오.
- 세포를 40 μm 스트레이너를 통해 50 mL 원심분리 튜브에 여과한다. 여과된 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮긴다. 총 부피가 10 mL인 기저 배지로 충전하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하였다.
- 24 액적(40 μL)으로부터 수집된 펠렛을 액적 내의 세포 밀도에 따라 1-2.5 mL의 폐 오가노이드 확장 배지에 재현탁시킨다. 현미경으로 셀 카운터가 있는 세포 수를 계산합니다. 세포 농도를 1.3 x 106/mL(24웰 인서트의 경우) 또는 9 x 105/mL(12웰 인서트의 경우)로 조정합니다.
- 상단 및 하단 챔버에서 기본 배지를 제거하십시오. 500 μL 및 1,000 μL의 팽창 배지를 각각 24-웰 인서트 및 12-웰 인서트의 바닥 챔버에 첨가한다. 단계 3.3.7에서 제조된 세포 현탁액 100 μL 및 500 μL의 시드를 각각 24-웰 인서트 및 12-웰 인서트의 정점 챔버 상에 상으로 한다.
- 세포 배양 배양기에서 2일 동안 배양한다. 팽창 배지를 플레이트의 정점 및 바닥 챔버 모두에서 PD 배지로 교체하십시오. 오가노이드를 세포 배양 인큐베이터에서 14일 동안 인큐베이션하고 3일마다 PD 배지를 리프레시한다.
참고: 이동성 섬모는 PD 배지에서 배양한 후 7일째부터 현미경으로 3D 및 2D 오가노이드에서 식별할 수 있습니다. PD 배지에서 분화 배양 14일 후, 기도 오가노이드는 다양한 실험 조작을 위해 성숙된다. - 17에 기술된 표준 프로토콜에 따라 전기 저항 측정 시스템을 사용하여 격일로 상피 전기 저항(TEER)을 측정한다.
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Representative Results
이 프로토콜은 높은 성공률을 가진 인간 폐 오가노이드의 유도를 가능하게 한다. 신선한 인간 폐 조직은 작은 조각으로 다진 다음 콜라게나제로 분해됩니다. 생성된 단일 세포는 기저 매트릭스에 포매되고 상피 줄기 세포의 증식을 위한 틈새 인자의 칵테일로 보충된 폐 오가노이드 확장 배지에서 배양된다(단계 1.1.2). 도 1 은 환원 성장인자 기저막 매트릭스 타입 2에 포매된 갓 분리된 폐 세포의 현미경 사진을 도시한다(BME; 그림 1A, 왼쪽). 낭포성 오가노이드는 시간이 지남에 따라 나타나고 확대됩니다 (그림 1A, 오른쪽). 한편, 관련되지 않은 세포는 점차적으로 세포 사멸을 겪는다. 섬유아세포는 첫 번째 또는 두 번째 계대 동안 배양물에 존재한다. 그 후, 배양물은 상피 오가노이드를 독점적으로 함유하는데, 이는 원발성 폐 조직에 존재하는 상피 줄기 세포로부터 유래된 폐 오가노이드이다. 이러한 폐 오가노이드는 1:3 내지 1:5의 비율로 기계적 전단에 의해 또는 1:5 내지 1:10의 비율로 트립신화에 의해 2-3주마다 계대된다(단계 2.2-2.3). 네 번째 계대 후 폐 오가노이드의 대표적인 현미경 사진을 도 1B에 나타내었다. 기계적 전단 후, BME에 포매된 오가노이드 단편은 몇 시간 내에 낭성 도메인을 형성한다(도 1B, 왼쪽). 5일째에 같은 필드의 현미경 사진(그림 1B, 오른쪽)은 오가노이드가 시간이 지남에 따라 성장하는 것을 보여줍니다. 이러한 팽창하는 인간 폐 오가노이드는 ACCTUB+ 또는 FOXJ1+ 섬모 세포, P63+ 기저 세포, CC10+ 클럽 세포 및 MUC5AC+ 잔 세포18 (도 1C)을 포함하는 4개의 주요 기도 상피 세포 유형을 모두 조기 상태로 보유한다. 특히, 이러한 인간 폐 오가노이드는 1년 이상 연속적이고 안정적으로 계대될 수 있다. 기저 매트릭스 내에서 유지될 때, 폐 오가노이드는 정점-인 극성을 보일 가능성이 가장 높으며, 폐 오가노이드의 2%-3% 미만은 정점 아웃 극성을 나타낸다(13). 결과적으로, 세포 정점은 3D 오가노이드가 전단되어 열리지 않는 한 쉽게 접근 할 수 없습니다.
그러나, 천연 인간 기도 상피와 비교하여, 이러한 장기 팽창성 폐 오가노이드는 천연 인간 기도 상피에서 우세한 세포 집단, 섬모 세포가 폐 오가노이드에서 과소 대표되기 때문에 충분히 성숙하지 않다. 이어서, 인간 폐 오가노이드의 성숙 상태를 개선하기 위해 근위 분화 (PD) 배지를 정의하였다. 확장 배지 및 PD 배지에서 배양된 오가노이드는 시간이 지남에 따라 뚜렷한 형태학을 발전시켰다(도 2A). 모타일 섬모는 확장 배지 내의 것들보다 PD 배지에서 오가노이드에 더 풍부하였다. PD 배지에서 분화 배양 2주 후, 모타일 섬모는 모든 단일 오가노이드에서 식별가능하다(도 2B 및 보충 비디오 1). 흥미롭게도, 박동하는 섬모는 세포 파편을 구동하고 오가노이드 루멘 내부의 뮤신을 일방향으로 소용돌이 치게하며, 이는 점액 에스컬레이터를 적절하게 재순환시켜 흡입 된 입자를 제거합니다 (보충 비디오 1), 인간 기도의 중요한 자기 제거 메커니즘. 우리는 섬모 세포가 원래의 폐 오가노이드와 비교하여 분화 된 오가노이드에서 약 50 %로 극적으로 증가했음을 입증합니다. 상피 세포의 네 가지 유형의 백분율을 평가하기 위해, 2D 기도 오가노이드를 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 간략하게, 오가노이드를 37°C에서 60분 동안 10 mM EDTA로 해리시키고, 4% PFA로 고정하고, 0.1% 계면활성제로 투과시켰다. 이어서, 세포를 4°C에서 1시간 동안 일차 항체( 물질의 표 참조)와 함께 인큐베이션한 다음, 이차 항체로 염색하였다. FACS 시스템을 사용하여 샘플을 분석하였다. 유세포 분석 결과, 분화된 오가노이드가 네 가지 기도 상피 세포 유형을 수용함을 입증하였다(도 2C). 따라서, 우리는 인간 기도 상피를 거의 생리학적 수준으로 충실하게 시뮬레이션할 수 있는 기도 오가노이드를 생성하기 위한 근위 분화 프로토콜을 개발하였다.
오가노이드 정점 표면이 쉽게 접근 할 수있게하고 호흡기 병원균에 대한 인간기도 상피 노출을보다 잘 모델링하기 위해 우리는 기도 오가노이드의 2D 단층을 생성했습니다. 분화 배양 2주 후, 2D 기도 오가노이드는 손상되지 않은 상피 장벽을 개발하였다(도 3A, B). 우리는 또한 2D 기도 오가노이드에서 형성된 상피 장벽의 완전성을 평가하기 위해 덱스트란 막힘 분석을 수행했습니다. 트랜스웰 인서트에서 배양한 후 10일째에, 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란(MW 10,000)을 상부 챔버의 배지에 첨가하고, 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 상부 및 하부 챔버 내의 배지를 형광 분석을 위해 수확하였다. 덱스트란 막힘 지수는 상부 챔버 내의 배지 대 하부 챔버에서의 매질의 형광 강도를 지칭한다(도 3B). 이러한 2D 기도 오가노이드는 또한 풍부한 섬모 세포를 함유한다(도 3C). 섬모 세포를 항-β-투불린 IV 항체 (ACCTUB) 및 염소 항-마우스 488 이차 항체로 표지하였다. 공초점 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 획득하였다. 다중 채널 이미지는 DAPI의 경우 405nm, ACCTUB의 경우 488nm, Phalloidin의 경우 633/640nm의 레이저를 사용하여 획득되었습니다. 이미징 파라미터는 공초점 현미경의 사용자 매뉴얼에 따라 조정되었다. 간략하게, 핀홀 크기는 1 AU로 설정되었고, 마스터 이득은 1.0의 디지털 이득으로 650 V 내지 750 V로 설정되었고, 레이저 파워는 0.2% 내지 5%의 범위 내에서 각 채널에 대해 조정되었다. 이미지 처리는 제공된 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
인간의 호흡기는 두 가지 유형의 상피, 즉 기도 상피와 폐포 상피로 줄 지어 있습니다. 전자는 비강에서 말단 세기관지로기도를 정렬하고 상피 세포의 네 가지 주요 유형, 즉 섬모 세포, 잔 세포, 클럽 세포 및 기저 세포로 구성됩니다. 또한, 근위 및 원위 기도를 라이닝하는 기도 상피는 근위-원위 축을 따라 가변적인 세포 조성을 나타낸다. 근위 기도 상피는 풍부한 섬모 세포와 점액 분비 잔 세포로 구성된 의사 층화되고; 원위 기도 상피는 입방체 섬모 및 클럽 세포의 단일 층인 반면, 기저 및 잔 세포가 적은세포(19)이다. 폐 오가노이드를 유도하는 데 사용되는 인간 폐 조직은 다양한 질병으로 인해 외과 적 절제술을받은 환자로부터 조달되었습니다. 우리는 오가노이드 배양을 위해 병든 조직에 인접한 정상적인 폐 조직을 사용합니다. 이러한 폐 조직은 일반적으로 폐포낭으로 둘러싸인 가변 크기의 세기관지를 함유한다. 초기 배양 동안, 폐 조직 내의 기도 상피 줄기 세포 또는 기도 전구 세포는 팽창 배지 내의 틈새 인자로 인해 생존하고 증식한다. 확장 배지는 오가노이드를 미성숙 상태로 향하게 함으로써 폐 오가노이드의 초기 유도 및 장기 확장을 가능하게 하는 반면, 기도 분화 프로토콜은 천연 기도 상피를 형태학적으로 그리고 기능적으로 표현복사하는 기도 오가노이드를 생성한다. 폐 오가노이드의 유도, 확장 및 분화를 포함하는 모델 시스템은 도 4에 요약되어 있다. 근위 및 원위 기도 상피에서의 세포 조성이 또한 도 4에 예시되어 있다.
그림 1: 인간 폐 오가노이드의 유도, 확장 및 특성화. (A) 대표적인 현미경 사진은 0일째에 폐 조직으로부터 분리한 후 기저 매트릭스에 포매된 단일 세포를 보여준다(왼쪽). 5 일째에 낭포 성 오가노이드가 자라고 있습니다 (오른쪽). 스케일 바는 0.5 mm이다. (B) 네 번째 계대 당일 및 통과 후 5일째에 폐 오가노이드의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바는 0.5mm입니다. P1과 P4는 첫 번째와 네 번째 구절을 나타낸다. 이미지는 10x 배율로 촬영되었습니다. (c) 인간 폐 오가노이드에서 네 가지 기도 상피 세포 유형의 공초점 이미지. 기도 상피 세포의 4 계통은 ACCUB+ 및 FOXJ1+ 섬모 세포, P63+ 기저 세포, CC10+ 클럽 세포 및 MUC5AC+ 잔 세포를 포함하는 폐 오가노이드에 존재한다. 핵 및 세포 액틴 필라멘트는 각각 DAPI (파란색) 및 Phalloidin-647 (보라색)로 역염색됩니다. 스케일 바는 10 μm이다. 이 수치는13에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 인간 폐 오가노이드의 근위 분화. (A) 인간 폐 오가노이드는 PD 배지 또는 팽창 (Exp) 배지에서 16일 동안 병렬로 배양되었다. 지시 된 날의 오가노이드의 밝은 필드 현미경 사진이 표시됩니다. 스케일 바는 0.4 mm. (B) 분화된 기도에서 섬모 오가노이드가 도시되어 있다(검정 화살표). 스케일 바는 20 μm이다. (C) FACS 분석에 의해 검출된 바와 같이 PD 배지 (상부) 및 확장 배지 (하단)에서 인큐베이션된 오가노이드에서의 개별 세포 유형의 백분율이다. 하나의 오가노이드 라인의 대표적인 히스토그램이 도시되어 있다. 실험은 세 개의 상이한 오가노이드 라인에서 수행되었다. 이 수치는13에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 2D 차별화된 기도 오가노이드의 생성. (a) 경상피 전자 저항(TEER)은 PD 배지에서 인큐베이션 후 지시된 날에 측정되었다. 데이터는 10개의 인서트± 있는 2D 단층의 평균 및 표준 편차(SD)를 보여줍니다. (b) 투과성 지지체 플레이트에서 배양한 후 10일째에, 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란을 첨가하고, 상부 및 하부 챔버에서 배지를 4시간 후에 형광 분석을 위해 수확하였다. 덱스트란 막힘 지수는 상부 챔버 내의 배지의 형광 강도와 하부 챔버에서의 형광 강도를 지칭한다. 실험에 사용된 투과성 지지 인서트의 직경은 0.4 μm입니다. 세포를 시딩하지 않고도 덱스트란은 일반 2D 인서트에 자유롭게 침투 할 수 있습니다. 따라서, 정상 2D(Blank로 라벨링된 막대)의 덱스트란 막힘 지수는 1이어야 한다. 데이터는 2D 기도 오가노이드(2D 오가노이드)로 시딩된 10개의 인서트와 2개의 빈 인서트(blank)에 있는 인서트의 평균 ± SD를 나타냅니다. (C) 2D 기도 오가노이드에서 풍부한 ACCTUB+ 섬모 세포(녹색)의 공초점 이미지. 세포 액틴 필라멘트는 Phalloidin-647 (보라색)로 역염색됩니다. 스케일 바는 20 μm이다. 이 수치는13에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 폐 오가노이드의 유도, 확장 및 분화의 개략적인 그림. 인간 폐 조직으로부터 분리된 단일 세포는 기저 매트릭스에 직접 포매되고 폐 오가노이드 확장 배지에서 인큐베이션된다. 유래된 인간 폐 오가노이드는 높은 안정성으로 장기간 확장될 수 있고 동결보존된 스톡으로부터 쉽게 회수될 수 있다. 분화시, 생성된 기도 오가노이드는 인간 기도 상피를 충실하게 시뮬레이션할 수 있다. 2D 및 3D 기도 오가노이드는 다양한 실험 조작을 위해 개발되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1. 동시적으로 박동하는 섬모는 분화된 기도 오가노이드(13)에서 일방향으로 소용돌이치도록 세포 파편을 구동한다. 이 비디오는13에서 채택되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 기도는 의사 층화 된 섬모 상피라고도 알려진 기도 상피와 줄 지어 있습니다. 상부 기도 상피의 주요 세포 유형은 기도에서 점액과 흡입된 입자를 배출하기 위해 정수리 섬모의 조율된 이동을 가능하게 하는 섬모 세포, 점액을 생산하고 분비하는 잔 세포, 기저막을 늘어서서 재생에 연루된 기저 세포이다. 세기관지와 같은 작은 기도에서, 입방체 기도 상피는 분비 클럽 세포를 포함하고 상부 기도 영역에서보다 더 적은 섬모 세포를 함유한다. 우리는 인간 폐 조직의 상피 줄기 세포로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하는 강력한 프로토콜을 기술합니다. 이들 인간 폐 오가노이드는 팽창 배지에서 유지되고 높은 안정성으로 1년 이상 연속적으로 계대된다. 확장 배지에서 주요 성장 인자는 R-스폰딘, Wnt 작용제20; 및 BMP 신호전달21의 억제제인 노긴, 뿐만 아니라 FGF7 및 FGF10. 선행 연구는 호흡기 상피22,23,24의 항상성에서 Wnt, FGF 및 BMP 신호전달의 중요한 역할을 밝혀냈다. 확장 매질은 오가노이드를 미성숙 상태로 향하게 함으로써 폐 오가노이드의 초기 유도 및 장기 확장을 가능하게 한다. 우리는 또한 네 가지 주요 기도 세포 유형을 수용하고 인간기도 상피를 거의 생리적 수준으로 시뮬레이션하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 근위 분화 방법을 개발합니다. 초기 유도, 장기 확장 및 근위 분화를 포함한 전체 절차 동안 지루한 세포 정제나 피더 및 기질 세포가 필요하지 않습니다. 따라서, 우리는 인간기도 상피의 오가노이드 모델을 확립합니다. 문화의 두 단계, 확장 배양과 분화 배양은 상호 배타적입니다. 폐 오가노이드는 장기 확장을 위한 안정한 공급원을 제공하는 반면, 분화된 기도 오가노이드는 인간 기도 상피를 충실하게 표현한다. 이러한 오가노이드는 영상화, RNA 시퀀싱, 유세포 분석, 유전자 편집 등을 포함한 다양한 실험 조작에 적용 가능합니다.13,14,25,26,27.
폐 오가노이드를 유도하기 위한 높은 효율을 보장하기 위해, 확장 매질은 정확하고 세심하게 재구성되어야 하며, 이는 프로토콜에 의해 활성화된 높은 확립 속도에 필수적이다. 이러한 오가노이드 모델의 주요 한계는 순수한 상피 조성물, 기질 세포의 부족, 및 인간 호흡 점막에 존재하는 면역 세포이며, 이는 기도 오가노이드가 천연 기도 상피로부터 어느 정도 이탈하게 할 수 있다. 따라서 우리는 면역 세포 및 기타 생물학적으로 관련된 구성 요소를 현재의 오가노이드 모델에 통합하여 차세대 호흡기 오가노이드를 생성하기 위해 노력합니다.
우리가 확립 한 기도 오가노이드는 토착 인간 호흡 상피의 다세포 구성 및 기능을 거의 생리적 수준으로 충실하게 시뮬레이션하며, 이는 어떤 균질 한 세포주에서도 불가능합니다. 우리의 오가노이드 모델을 통해 과학자들은 배양 접시에서 토착 인간기도 상피를 재구성하고 안정적으로 확장 할 수 있습니다. 이 기도 오가노이드는 인간기도의 생물학과 병리학을 연구하는 보편적 인 도구입니다. 연구실에서 사용되는 일차기도 상피 세포는 제한된 복제 능력으로 인해 확장 할 수 없으며 재현 가능하고 쉽게 접근 할 수있는 연구 도구로 거의 사용되지 않습니다.
인간 호흡 오가노이드를 포함한 오가노이드는 SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34를 포함한 인간 병원균을 연구하기위한 독창성과 강점을 드러냈다. 보편적이고 생리 활성 인 도구로서 인간 폐 오가노이드는 인간 호흡기의 생물학 및 병리학을 탐구하는 데 널리 활용 될 수 있습니다.
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Disclosures
J. Z., C.L., 및 M.C.C.는 기도 오가노이드의 특허에 발명가로서 열거되어 있다(공개번호: US-2021-0207081-A1). 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 공초점 이미징 및 유세포 측정에 도움을 주신 PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Hong Kong에 감사드립니다. 이 작업은 식품 보건국의 건강 및 의료 연구 기금 (HMRF, 17161272 및 19180392)의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 연구 보조금위원회의 일반 연구 기금 (GRF, 17105420); Health@InnoHK, 혁신 기술위원회, 홍콩 특별 행정 구역 정부.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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