Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تأثير حمض الهيالورونيك 35 كيلو دال أمبير على نموذج في المختبر للإصابات المعوية الصغيرة المبكرة والشفاء باستخدام الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/63758
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لإنشاء وإجراء فحص جرح خدش على طبقات أحادية ثنائية الأبعاد (2D) مشتقة من الأمعاء ثلاثية الأبعاد (3D) المعزولة من الدقاق الرئيسي غير البشري.

Abstract

تستخدم فحوصات الجرح في المختبر بشكل شائع للتحقيق في آليات وخصائص الشفاء الظهاري في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد طبقة أحادية ثنائية الأبعاد (2D) من المعوية الرئيسية ثلاثية الأبعاد (3D) غير البشرية المشتقة من الخبايا المعوية للدقاق الطرفي. ثم تم استخدام هذه الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء في فحص جرح خدش في المختبر لاختبار قدرة الهيالورونان 35 كيلو دال (HA35) ، وهو حليب بشري يحاكي HA ، لتعزيز هجرة الخلايا وانتشارها على طول حافة الجرح الظهارية. بعد زراعة الطبقات الأحادية إلى التقاء ، تم خدشها يدويا ومعالجتها باستخدام HA35 (50 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) أو التحكم (PBS). تم تصوير هجرة الخلايا وانتشارها إلى الفجوة باستخدام مجهر ضوئي منقول مجهز لتصوير الخلايا الحية. تم تحديد إغلاق الجروح كميا كنسبة مئوية من التئام الجروح باستخدام المكون الإضافي لحجم التئام الجروح في ImageJ. تم قياس منطقة الخدش ومعدل هجرة الخلايا والنسبة المئوية لإغلاق الجرح على مدار 24 ساعة. HA35 في المختبر يسرع التئام الجروح في الطبقات الأحادية المعوية المعوية الصغيرة ، على الأرجح من خلال مزيج من تكاثر الخلايا عند حافة الجرح والهجرة إلى منطقة الجرح. يمكن استخدام هذه الطرق كنموذج لاستكشاف تجديد الأمعاء في الأمعاء الدقيقة البشرية المبكرة.

Introduction

التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو واحد من أكثر حالات الطوارئ المعدية المعوية شيوعا عند الأطفال الخدج1. يتميز المرض بالتهاب معوي حاد يمكن أن يتدهور بسرعة إلى نخر معوي وتعفن الدم وربما الموت. على الرغم من أن المسببات غير واضحة ، إلا أن الأدلة تشير إلى أن NEC متعدد العوامل ونتيجة لتفاعل معقد للتغذية ، واستعمار بكتيري غير طبيعي ، وظهارة معوية غير ناضجة 2,3. زاد الأطفال الخدج من نفاذية الأمعاء ، والاستعمار البكتيري غير الطبيعي ، وانخفاض القدرة التجديدية للخلايا المعوية 4,5 ، مما يزيد من خطر إصابتهم بخلل في الحاجز المعوي ، ونقل البكتيريا ، وتطوير NEC. لذلك ، فإن تحديد الاستراتيجيات أو التدخلات لتسريع النضج الظهاري المعوي وتعزيز تجديد أو شفاء الظهارة المعوية أمر بالغ الأهمية في الوقاية من هذا المرض الفتاك.

أظهرت الدراسات أن الحليب البشري (HM) يحمي من NEC في الأطفال الخدج6،7،8،9،10،11. أظهرت كل من الدراسات البشرية والحيوانية أن الصيغة القائمة على الأبقار تزيد من نفاذية الأمعاء وهي سامة مباشرة للخلايا الظهارية المعوية 2,12. على الرغم من عدم توضيحها بالكامل ، تشير الأدلة إلى أن الآثار الوقائية ل HM يتم بوساطة المكونات النشطة بيولوجيا مثل اللاكتوفيرين والغلوبولين المناعي A (IgA) و HM oligosaccharides13. HM غني أيضا بالهيالورونان (HA) ، وهو جليكوزامينوغليكان غير كبريتات فريد من نوعه مع تكرار حمض D-glucuronic و N-acetyl-D-glucosamine disaccharides14,15. الأهم من ذلك ، لقد أظهرنا أن الفم 35 kDa HA (HA35) ، وهو تقليد HM HA ، يخفف من شدة الإصابة المعوية ، ويمنع نقل البكتيريا ، ويقلل من الوفيات في نموذج إصابة معوية تشبه الفئران NEC16,17.

هنا ، يتم التحقيق بشكل أكبر في آثار HA35 على الشفاء المعوي والتجديد في المختبر. حاليا ، الفحص الأكثر استخداما في المختبر لجرح الأمعاء وإصلاحها هو فحص جرح الخدش الذي يتم إجراؤه في الطبقات الأحادية لخلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC). إن الأهمية الفسيولوجية لمثل هذا النموذج لأمعاء الرضع الخدج محدودة ، حيث يعتمد إصلاح الجروح لخلايا CRC بشكل كبير على الطبيعة التكاثرية للغاية للخلايا السرطانية بدلا من عمليات الإصلاح التي تحركها الخلايا الجذعية18. للتغلب على هذا القيد ، يتم وصف إنشاء نموذج جرح خدش الأمعاء 2D ، بما في ذلك إجراء عزل والحفاظ على الأمعاء المعوية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية الأولية من الرئيسيات غير البشرية الخدج (NHP) ، هنا. بالنظر إلى أن NEC قبل الأوان غالبا ما يتم الإبلاغ عنه في الأمعاء الدقيقة البعيدة ، فإن استخدام الخلايا العضوية الظهارية الأولية في نموذج للتلف والإصلاح المعوي يوفر نموذجا أكثر قابلية للترجمة الفسيولوجية في المختبر مقارنة بالنماذج الحالية التي تستخدم الطبقات الأحادية التقليدية للقولون والمستقيم18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما. بعد الموافقة المؤسسية، تم الحصول على عينات راحة الأمعاء الدقيقة الجنينية من الرئيسيات غير البشرية قبل الأوان (NHP، 90٪ من الحمل، بابون الزيتون، بابيو أنوبيس) بعد القتل الرحيم لدراسة منفصلة (البروتوكول #101523-16-039-I)20.

1. إنشاء الرئيسيات المعوية 3D الرئيسيات غير البشرية قبل الأوان

  1. الإعداد الإعلامي
    ملاحظة: يمكن إعداد الوسائط قبل 1 أسبوع من عزل السرداب باتباع تقنية التعقيم القياسية. يمكن استخدام البنسلين / الستربتومايسين (التركيز النهائي 1٪) بدلا من المضادات الحيوية واسعة الطيف للخلايا الأولية إذا رغبت في ذلك.
    1. تحضير وسائط النمو العضوي البشري + Y-27632 (HOGMY) عن طريق خلط 50 مل من وسط النمو العضوي وسط قاعدي بشري مع 50 مل من الملحق العضوي (جدول المواد). أضف 200 ميكرولتر من المضادات الحيوية واسعة الطيف (التركيز النهائي 100 ميكروغرام/مل) (جدول المواد) وY-27632 (إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر). دافئ على سطح الطاولة إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير وسائط النمو العضوي البشري (HOGM) عن طريق خلط 50 مل من وسط قاعدي عضوي متوسط النمو البشري مع 50 مل من الملحق العضوي. أضف 200 ميكرولتر من المضادات الحيوية واسعة الطيف (100 ميكروغرام / مل). دافئ على سطح الطاولة إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: سيتم استخدام HOGM عند تغيير الوسائط بعد أول 2-3 أيام بعد المرور.
    3. قم بتبريد 100 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون كالسيوم أو مغنيسيوم حتى يصبح الثلج باردا.
    4. قم بتحضير 50 مل من المخزن المؤقت للغسيل عن طريق الجمع بين 1x PBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم مع ألبومين مصل البقر بنسبة 0.1٪ (BSA). يبرد حتى يصبح الثلج باردا.
    5. قم بتحضير المخزن المؤقت لغسيل DMEM-F12 عن طريق إضافة 1 مل من المضادات الحيوية واسعة الطيف (100 ميكروغرام / مل) إلى 500 مل من DMEM / F12 (خليط Dulbecco المعدل من النسر المتوسط / المغذي F12 + 15 mM HEPES العازل). احفظه باردا.
  2. عزل السرداب والطلاء
    ملاحظة: يجب أن يبقى الهيدروجيل القائم على المصفوفة خارج الخلية (ECM) على الجليد أثناء الإجراء بأكمله. يفترض هذا الإجراء وجود أنسجة كافية لملء ست قباب هيدروجيل قائمة على ECM. إذا تم حصاد كثافة مختلفة من الخبايا ، فيجب تغيير رقم القبة وفقا لذلك.
    1. إذابة 150 ميكرولتر من عامل النمو المخفض (GFR) مستخلص الغشاء السفلي (BME) (خال من الفينول الأحمر) بين عشية وضحاها على الجليد عند 2-8 درجة مئوية.
    2. احتضن صفيحة بوليسترين معالجة بزراعة الأنسجة ذات 24 بئرا ومسطحة القاع في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
    3. بعد القتل الرحيم NHP وجمع الأنسجة ، اغسل الجزء الدقاقي من الحطام بطرف ماصة 1000 ميكرولتر باستخدام 1x PBS البارد في طبق بتري يمكن التخلص منه.
      ملاحظة: يجب حصاد الأنسجة الطازجة بسرعة والحفاظ على الجليد البارد لحصاد الأمعاء الصحية.
    4. قطع الدقاق طوليا على طول الأمعاء بأكملها ، واغسل مع PBS 3x الباردة الجليدية. قم بلف الأنسجة إلى شظايا صغيرة (طولها حوالي 2 مم) باستخدام مقص معقم فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 15 مل من PBS البارد ، بدءا من جزء الجزء اللفائفي الأقرب إلى الأنبوب.
    5. استخدم ماصة مصلية سعة 10 مل لتعطيل الخبايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5-10x. دع أجزاء الأنسجة تستقر في الجزء السفلي من الأنبوب ، ثم قم بإزالة supernatant واستبدله ب PBS طازج وبارد. كرر هذه العملية بحد أدنى 7x-10x حتى يصبح supernatant واضحا وخاليا من الحطام.
    6. بمجرد أن تصبح واضحة ، قم بإزالة supernatant وأعد تعليق الخبايا في 25 مل من كاشف تفكك الخلية. ضع الأنبوب على منصة هزازة عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. قم بإزالة الأنبوب من الروك ، واسمح للخلايا بالاستقرار لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة تقريبا ، وقم بإزالة السوبرناتانت. أضف 10 مل من المخزن المؤقت للغسيل البارد المثلج. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة p1000 لمزيد من الانفصال في سراديب واحدة.
    8. قم بتصفية الأنسجة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد بسعة 50 مل. اشطف الأنبوب المخروطي الأصلي سعة 50 مل مع 10 مل من المخزن المؤقت للغسيل البارد المثلج وقم بالتصفية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر لضمان إزالة جميع الخبايا من الأنبوب الأصلي. كرر هذا الغسيل للأنسجة لما مجموعه 4x شطف.
    9. الطرد المركزي للترشيح عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. أضف 600 ميكرولتر من HOGMY وقم بتعطيل الكريات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. ضع الأنبوب على الثلج حتى يصبح المحلول باردا.
      ملاحظة: إذا لم يكن المحلول باردا ، فلن تحافظ القبة على الهيكل المناسب عند طلائها. تجنب إدخال الفقاعات عند سحب قباب الهيدروجيل القائمة على ECM ، لأن الفقاعات ستمنع الالتصاق السليم بقاع اللوحة.
    10. أضف 600 ميكرولتر من الهيدروجيل القائم على ECM البارد المثلج لتعليق حبيبات الخلايا وتخلط جيدا مع ماصة 200 ميكرولتر.
    11. قم بإزالة اللوحة المكونة من 24 بئرا من الحاضنة وضعها على جهاز تدفئة صفيحة 37 درجة مئوية. ماصة 50 ميكرولتر من خليط هيدروجيل HOGMY / ECM البارد في وسط 24 بئرا من صفيحة استزراع 24 بئرا (50 ميكرولتر لكل قبة).
    12. بمجرد طلائها ، دع القباب تجلس على جهاز تدفئة صفيحة 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة للسماح بالالتزام بالجزء السفلي من اللوحة. قم بعكس اللوحة بعناية ، وتأكد من عدم تراكم أي تكثيف في الجزء السفلي من اللوحة ، ووضع اللوحة المقلوبة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    13. بعد 15 دقيقة ، اقلب اللوحة إلى الجانب الأيمن لأعلى وماصة 750 ميكرولتر من HOGMY في درجة حرارة الغرفة في كل بئر.
      ملاحظة: وسائط ماصة ببطء على الجدار الجانبي للآبار ، مع الحرص على عدم تعطيل قبة هيدروجيل 3D ECM التي تم تشكيلها حديثا.
    14. بمجرد ملء جميع الآبار بالوسائط ، ضع اللوحة في الحاضنة وقم بتغيير الوسائط كل 3 أيام باستخدام 750 ميكرولتر من HOGM. مرور المعوية كل 7-10 أيام.
  3. تمرير الأمعاء المعوية
    ملاحظة: البروتوكول التالي هو للوحة واحدة من 24 بئرا تحتوي على معوية NHP بمعدل انقسام 1: 2.
    1. قم بإزالة الوسائط المعوية من كل بئر ، مع الحرص على عدم تعطيل قبة ECM التي تحتوي على الأمعاء ، وإضافة 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا الباردة إلى كل بئر باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    2. قم بتعطيل ECM يدويا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 8-12x. نقل محتويات 12 بئرا إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل.
    3. بمجرد جمع كل المحلول من لوحة زراعة 24 بئرا ، أضف 250 ميكرولتر من كاشف اضطراب الخلايا إلى كل بئر لضمان إزالة جميع المعوية NHP من كل بئر ، مع إضافة هذا الشطف الأخير إلى الأنابيب المخروطية الحالية التي تبلغ سعتها 15 مل.
    4. يوضع على منصة هزازة بسرعة 40 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية). بدلا من ذلك ، هز الأنابيب يدويا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. بعد 15 دقيقة ، جهاز طرد مركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت من أنابيب 15 مل حتى تبقى الكريات فقط.
    6. أضف 8 مل من DMEM البارد المثلج + المضادات الحيوية واسعة الطيف إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل ، مع التأكد من تعطل الكريات بشكل كاف. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
    7. أضف 600 ميكرولتر من HOGMY وقم بتعطيل الكريات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. ضع الأنبوب على الثلج حتى يصبح المحلول باردا. بمجرد أن يصبح المحلول باردا ، أضف 600 ميكرولتر من ECM البارد المثلج لتعليق حبيبات الخلية وتخلط جيدا مع ماصة 1000 ميكرولتر. كرر الخطوات 1.3.2.-1.3.7. للآبار ال 12 المتبقية.
      1. للحصول على الخطوات المتبقية، راجع الخطوات 1.2.11.-1.2.16.

2. إنشاء طبقة أحادية الأمعاء وفحص جرح الخدش

  1. إعداد الوسائط والعلاج
    1. يبرد 5 مل من PBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم حتى يبرد الجليد.
    2. قم بتحضير المخزن المؤقت لغسيل DMEM-F12 عن طريق إضافة 1 مل من المضادات الحيوية واسعة الطيف (100 ميكروغرام / مل) إلى 500 مل من DMEM / F12 (خليط Dulbecco المعدل من النسر المتوسط / المغذي F12 + 15 mM HEPES العازل). حافظ على برودة الجليد.
    3. قم بإعداد 100 مل من HOGMY ، كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.1 ، وقم بتسخينه على سطح الطاولة إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. دافئ 25 مل من 0.25٪ من حمض التربسين-الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    5. تحضير 50 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، و 200 ميكروغرام / مل تركيزات من HA35 لمعالجة الخلايا ، وذلك باستخدام PBS معقمة بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم كمذيب. سيستخدم التخفيف النهائي ل HA35 HOMGY كمذيب.
      ملاحظة: قد يتطلب تحضير HA35 عدة تخفيفات ، حيث أن HA35 غالبا ما يخرج من المحلول بتركيز أكبر من 5 ملغ / مل.
  2. تشكيل أحادي الطبقة المعوية
    ملاحظة: يوفر الإجراء التالي كميات كافية لتوليد صفيحة واحدة من 24 بئرا من الطبقات الأحادية المعوية. اضبط وحدات التخزين للعدد المطلوب من الطبقات الأحادية.
    1. إذابة 96 ميكرولتر من هيدروجيل BME القائم على ECM (خال من الفينول الأحمر) بين عشية وضحاها على الجليد عند 2-8 درجة مئوية. تمييع الهيدروجيل القائم على ECM في PBS المثلج البارد بدون كالسيوم أو المغنيسيوم بنسبة 1:50. قم بتغطية كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا ب 200 ميكرولتر من الهيدروجيل المخفف القائم على ECM المخفف بالجليد البارد.
    2. احتضان اللوحة المطلية بالهيدروجيل القائم على ECM لمدة لا تقل عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استنشاق الوسائط من لوحة الثقافة 24-well التي تحتوي على المعوية 3D الموجهة إلى الطبقات الأحادية واستبدالها ب 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلية / البئر.
    3. تعطيل قباب الهيدروجيل القائمة على ECM يدويا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 8x-12x ونقل محتويات 12 بئرا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. اغسل الآبار الفارغة ال 12 ب 250 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا لضمان إزالة جميع المعوية ونقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل. كرر الخطوة 2.2.5. والخطوة 2.2.6. للآبار ال 12 المتبقية باستخدام أنبوب مخروطي ثان سعة 15 مل.
    5. الطرد المركزي للأنابيب المخروطية في 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية والتخلص من supernatant. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لغسل DMEM-F12 البارد إلى 15 مل من الأنابيب المخروطية الكريات المعوية عن طريق عكس الأنابيب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق كريات الخلايا في 12 مل من 37 درجة مئوية Trypsin-EDTA. ضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى تبدو الخلايا قابلة للذوبان. أضف 3 مل من المخزن المؤقت للغسيل DMEM-F12 إلى كل أنبوب لتخفيف التربسين-EDTA ، واخلطه عن طريق عكس الأنابيب ، وضعه على الجليد.
    7. قم بتصفية الأمعاء المنفصلة من خلال مصفاة خلية شبكية 37 ميكرومتر ، وجمع المحتويات في أنابيب مخروطية نظيفة سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    8. أثناء تكسير الخلايا في جهاز الطرد المركزي ، قم بإزالة اللوحة المطلية بالهيدروجيل القائم على ECM من الحاضنة وقم بشفط أي محلول هيدروجيل زائد قائم على ECM دون خدش السطح المطلي أو ترك اللوحة تجف تماما.
    9. قم بإزالة supernatant من الأنابيب المخروطية وأعد تعليق كريات الخلايا مع 6 مل من HOMGY. أضف 500 ميكرولتر من تعليق خلية HOMGY المدمج سعة 12 مل في كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا المطلية بهيدروجيل قائم على ECM بكثافة بذر تبلغ حوالي 3 × 105 خلايا / بئر. قم بتدوير اللوحة بغطاء لضمان توزيع متساو للخلايا داخل الآبار.
    10. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وتبادل وسائط HOMGY كل يومين حتى تصل الطبقات الأحادية إلى التقاء >90٪.
  3. العلاج أحادي الطبقة وفحص الجرح الخدش
    1. بمجرد أن تصل الطبقات الأحادية إلى التقاء >90٪ ، قم بشفط الوسائط لإزالة أي خلايا تفشل في الالتصاق. عالج الخلايا التي تحتوي على 500 ميكرولتر من HA35 (50 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) أو PBS ، الذائبة في HOMGY ، لمدة 24 ساعة.
    2. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسائط ، مع الحرص على عدم تعطيل سطح الطبقة الأحادية. باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر ، قم بعمل خدش خطي عبر قطر السطح الكامل للطبقة الأحادية في كل بئر ، مع الحرص على عدم ترك الطبقات الأحادية تجف.
    3. اغسل الطبقات الأحادية المخدوشة 1x ب 500 ميكرولتر من 1x PBS. أضف 500 ميكرولتر من HA35 (50 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) أو PBS المذاب في HOMGY ونقل اللوحة إلى أداة تحليل الخلايا الحية (جدول المواد) داخل حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 .
    4. ضمن أيقونة الجدول الزمني في برنامج تحليل الخلايا الحية (جدول المواد) ، انقر فوق أيقونة إطلاق إضافة معالج سفينة جديدة وقم بتعيين تردد المسح الضوئي للمسح الضوئي وفقا لجدول زمني. قم بإنشاء وعاء Whole Well جديد ضمن نوع المسح الضوئي ، وحدد إعدادات المسح الضوئي (أي المرحلة لقنوات الصور و 4x للهدف) ، وانقر فوق التالي.
    5. حدد الشركة المصنعة للوحة ورقم الكتالوج من القائمة المتوفرة. ضمن أيقونة جدولة ، اختر رمز الجمع حيث سيتم وضع اللوحة داخل أداة تحليل الخلايا الحية. حدد نمط المسح الضوئي المطلوب، ثم قم بإنشاء خريطة لوحة عن طريق تحديد "+" في صفحة تخطيط اللوحة. حدد تأجيل التحليل إلى وقت لاحق، ثم قم بتعيين جدول المسح الضوئي لكل 4 ساعات لمدة 24 ساعة وتحقق من إعدادات الاستحواذ ضمن صفحة ملخص معالج السفينة . وأخيرا، حدد إضافة إلى الجدول.
    6. بمجرد اكتمال الفحص 24 ، ضمن أيقونة عرض ، انقر نقرا مزدوجا فوق اسم السفينة ، وقم بتصدير الصور والأفلام. حدد الآبار وسلسلة من الصور لعرضها وتصديرها بتنسيق JPEG. قم بتحليل الصور للحصول على النسبة المئوية لالتئام الجروح باستخدام المكون الإضافي لحجم التئام الجروح ل ImageJ21 ، وفقا للخطوة 2.4. ادناه.
  4. تحليل الجرح الخدش
    1. افتح برنامج ImageJ. قم بتحميل صور فحص جرح الخدش (. TIFF أو .JPG).
    2. حدد صورة > اكتب > 8 بت لتغيير الصورة من RGB 24 بت إلى 8 بت. قم بتثبيت المكون الإضافي لحجم التئام الجروح عن طريق تحديد المكونات الإضافية > وحدات الماكرو > تثبيت المكون الإضافي > حجم التئام الجروح.
    3. قم بتدوير الصورة بحيث يكون الخدش رأسيا وقم بتهيئة المكون الإضافي أداة حجم التئام الجروح.
    4. حدد معلمات المكون الإضافي في مربع الحوار لتناسب جرح الخدش بشكل أفضل. قم بتعيين قيمة معلمات خيارات حجم التئام الجروح كما يلي: نصف قطر نافذة التباين عند 20، وقيمة العتبة عند 100، والنسبة المئوية للبيكسلات المشبعة عند 0.001، واختر نعم لتعيين مقياس عالمي. قم بإنهاء التحديد بالنقر فوق الزر موافق ( OK) . تحقق مما إذا كانت المنطقة المحددة هي منطقة الجرح. قد تتطلب المعلمات المذكورة أعلاه التوحيد القياسي من مختبر إلى آخر.
    5. كرر الخطوات 2.4.2.-2.4.4. للنقاط الزمنية المتبقية لكل خدش.
    6. احسب النسبة المئوية لالتئام جروح منطقة الخدش للخلايا المهاجرة أو المنتشرة على مدار 24 ساعة على النحو التالي:
      ٪ التئام الجروح = Equation 1
      حيث T 0 = ٪ المساحة في الوقت 0 ساعة و Tc = ٪ المساحة عند 0 ساعة أو 4 ساعات أو 12 ساعة أو 24 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

آثار HA على إصلاح الأنسجة والتئام الجروح في مختلف الأنسجة والأعضاء موثقة جيدا. ومع ذلك ، فإن الآثار المحددة ل HA مع وزن جزيئي يبلغ 35 kDa على الشفاء والتجديد المعوي الصغير للجنين أو حديثي الولادة غير معروفة حاليا. لاختبار قدرة HA35 على تعزيز التئام الجروح في نموذج للأمعاء الدقيقة الجنينية أو حديثي الولادة ، قمنا بإنشاء الأمعاء المعوية ثلاثية الأبعاد من الأنسجة اللفائفية NHP وقمنا بفصل هذا النسيج إلى خلايا مفردة لإنشاء طبقات أحادية مشتقة من الأمعاء ثنائية الأبعاد (الشكل 1A ، B). نمت الطبقات الأحادية إلى التقاء وخدشت يدويا باستخدام طرف ماصة P200 (الشكل 1B ، C). ثم عولجت الطبقات الأحادية باستخدام HA35 (50 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) أو التحكم (PBS). تم تصوير هجرة الخلايا وانتشارها في الفجوة كل 4 ساعات لما مجموعه 24 ساعة باستخدام مجهر ضوئي مرسل مجهز لتصوير الخلايا الحية22. تم تحديد معدل إغلاق الجرح ، وهو مقياس لسرعة هجرة الخلايا ، باستخدام ImageJ كنسبة مئوية من التئام الجروح باستخدام المكون الإضافي21 لحجم التئام الجروح (الشكل 2). تم قياس منطقة الخدش ومعدل هجرة الخلايا والنسبة المئوية لإغلاق الجرح على مدار 24 ساعة (الخطوة 2.4.6). وكما هو مبين في الشكل 3، أدى التعرض ل HA35 إلى تحفيز يعتمد على الجرعة والوقت لانتقال/انتشار الخلايا، مما أدى إلى تسريع إغلاق الجرح. HA35 عند 100 ميكروغرام / مل و 200 ميكروغرام / مل زاد بشكل كبير من الشفاء بمقدار ~ 1.5-2.5 أضعاف بالنسبة للتحكم في كل من 4 ساعات و 12 ساعة (* p < 0.05).

Figure 1
الشكل 1. توليد الأمعاء وإجراء فحص التئام الجروح أحادي الطبقة المشتق من الأمعاء. (أ) زراعة المعوية ثلاثية الأبعاد غير البشرية تستخدم للانفصال إلى (ب) طبقات أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد. (ج) نمت الطبقات الأحادية إلى التقاء >90٪ في صفيحة من 24 بئرا ثم عولجت بحمض الهيالورونيك 35 كيلو دال أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة 24 ساعة. ثم تم خدش الطبقات الأحادية بطرف ماصة P200. شريط المقياس = 800 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. صور وتحليل فحص التئام الجروح. صور تمثيلية لحمض الهيالورونيك 35 كيلو دال (100 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) وعلاجات التحكم في الطبقات الأحادية المعوية للرئيسيات غير البشرية. تم الحصول على الصور في 0 ساعة و 4 ساعات و 12 ساعة و 16 ساعة و 24 ساعة بعد إجراء خدش بطرف ماصة P200. تم التقاط الصور بتكبير 4x باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية وتحليلها في ImageJ باستخدام المكون الإضافي Wound Healing Size Plugin. تم حساب النسبة المئوية لالتئام الجروح من الخلايا المهاجرة / المنتشرة على مدار 24 ساعة. شريط المقياس = 800 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. تأثير حمض الهيالورونيك 35 كيلو دال (HA35) على التئام الجروح في الطبقات الأحادية المعوية. تغيير في التئام الجروح مع مرور الوقت في الطبقات الأحادية المعوية ، اعتمادا على تركيز العلاج HA35. زاد HA35 بشكل كبير من التئام الجروح بعد 4 ساعات و 12 ساعة عند 100 ميكروغرام / مل و 200 ميكروغرام / مل عند مقارنته بالتحكم ، ولكن تقاربت معدلات الشفاء بين العلاجات بمقدار 24 ساعة. تم تقييم الدلالة باستخدام اختبار t للطالب عند * p < 0.05 ، والذي تم تقديمه على أنه متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) (n = 6 آبار لكل علاج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتعرض الجهاز الهضمي للرضيع الخدج لضغط تجديدي مستمر من التعرض المتكرر للإهانات البيئية المرتبطة ب dysbiosis ، والمستقلبات البكتيرية الالتهابية والسموم ، ونقص الأكسجة المتقطع23,24. لسوء الحظ ، فإن الظهارة المعوية للرضيع المبتس غير قادرة على إثبات السلامة الوظيفية بسرعة23 ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي في الحاجز ، وزيادة نفاذية الأمعاء ، وفي الحالات الشديدة ، التهاب الأمعاء المتفشي وتطور NEC.

الغليكوزامينوغليكان (GAGs) هي فئة من السكريات المتعددة السائدة في حليب الإنسان ، وهي عوامل نشطة بيولوجيا محتملة تحمي من تطور NEC15,16. HA هو بوليمر خطي من تكرار ثنائي السكاريد من حمض الجلوكورونيك و N-acetylglucosamine25,26 التي تنتجها سينثاز الهيالورونان. يمكن أن يكون ل HA خصائص مؤيدة أو مضادة للالتهابات اعتمادا على الحجم وبيئة الأنسجة27,28. في الأمعاء والقولون ، يوجد HA الداخلي المنشأ في الفضاء خارج الخلية المجاور للخلايا الظهارية المشفرة ويدفع الانتشار الظهاري والنمو المعوي الطبيعي29،30،31. HA هو أيضا مكون طبيعي في HM ويتم إنتاجه بأعلى تركيزات خلال الأسابيع الأولى من الرضاعة30. والجدير بالذكر أن HA المنقى من HM أو HA المتاح تجاريا من الوزن الجزيئي ~ 35 kDa (HA 35) يحمي من التهاب القولون الناجم عن البكتيريا عن طريق زيادة التعبير عن مضادات الميكروبات β-defensin وبروتين TJ ZO-1 في ظهارة القولون في الجسم الحي والمختبر25,27. من المهم ملاحظة أنه من بين جميع HA ذات الحجم المحدد (4.7 kDa ، 16 kDa ، 28 kDa ، 74 kDa) ، HA35 هو أقوى محفز لبروتينات TJ وتعبير الببتيد المضاد للميكروبات في ظهارة القولون في المختبر. علاوة على ذلك ، فإن MW HA الكبير (~ 2000 kDa) لا يمارس أي تأثير على تعبير بروتين TJ ، مما يشير إلى أن هذه التأثيرات محددة الحجم32. أظهرنا أيضا أن تناول HA35 عن طريق الفم يسرع نضج الأمعاء الصغيرة ، ويعزز الانتشار الظهاري والتمايز ، ويحمي من تطور NEC16. هنا ، يتم اختبار قدرة HA35 على تعزيز التئام الجروح باستخدام فحص التئام الجروح في المختبر. باستخدام النماذج الموضحة أعلاه ، وجد أن HA35 يسرع إغلاق الجروح بطريقة تعتمد على التركيز عند 4 ساعات و 12 ساعة بعد الخدش مقارنة بالتحكم ، مما يوضح فجوة حرجة في المعرفة حول آثار HA ذات الحجم المحدد على التئام الجروح المعوية وإصلاح الأنسجة ، وبالتالي ، يؤكد دورا مفيدا ل HA35 في التئام الجروح المعوية حديثي الولادة. على الرغم من أن الآلية التي يمارس بها HA35 هذا التأثير غير معروفة ، إلا أن البيانات السابقة للمؤلفين في الجراء الفئران أظهرت أن الهدف الميكانيكي لمسار مجمع راباميسين (mTOR) 1 (mTORC1) قد تم تنظيمه في الأنسجة اللفائفية بعد علاج HA3516. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد مساهمة هذا المسار في هذه الآثار الملحوظة.

تم استخدام نماذج متعددة في المختبر للتحقيق في التدخلات التي تعزز تجديد الأمعاء والشفاء والإصلاح. الفحص الأكثر استخداما في المختبر للجرح المعوي والإصلاح اللاحق هو فحص جرح الخدش ، الذي يتم إجراؤه بشكل شائع في الطبقات الأحادية لخلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC)33,34. ومع ذلك ، فإن الأهمية الفسيولوجية لمثل هذا النموذج لأمعاء الرضع الخدج محدودة ، حيث يعتمد إصلاح الجروح لخلايا CRC بشكل كبير على الطبيعة التكاثرية للغاية للخلايا السرطانية بدلا من عمليات الإصلاح التي تحركها الخلايا الجذعية18. توفر القدرة الحديثة على عزل وصيانة الأمعاء المشتقة من سراديب الظهارة المعوية فرصة لاستكشاف استجابة معوية أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية للعديد من المحفزات المناعية أو الضارة ، بالإضافة إلى التدخلات العلاجية المحتملة35. تحتوي المعوية على جميع أنواع الخلايا الظهارية المتباينة الموجودة في الجزء المعوي الذي تستمد منه ، وبالتالي تعمل كنموذج فعال لدراسة تلف الحاجز المعوي وإصلاح 36،37،38.

الموصوفة هنا هي إنشاء وصيانة نموذج معوي في المختبر من الأضرار الظهارية المعوية وإصلاحها باستخدام الدقاق من NHP الخدج. يسمح هذا النموذج بالتحقيق في المسارات الميكانيكية والتدخلات العلاجية المشاركة في الشفاء الظهاري والتجديد. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في إنشاء فجوة محددة جيدا بعرض مماثل ، مما يقلل من التباين من الجيد إلى الجيد. بالإضافة إلى ذلك ، عند خدش الطبقات الأحادية ، يجب أن يحافظ طرف الماصة على اتصال مستمر مع قاع البئر لإزالة طبقة الخلية بشكل نظيف. يجب تجنب الضغط المفرط لمنع "رفع" حواف الجرح. وبالمثل ، يجب إجراء خطوة غسل PBS بعد الجرح بلطف ، باستخدام الجدار الجانبي للبئر ، لتجنب تلف الطبقة الأحادية المتبقية أو الاتساع الإضافي لفجوة الجرح. أخيرا ، يجب على المرء تجنب إبقاء اللوحة أقل من 37 درجة مئوية لفترات طويلة لضمان بقاء طلاء ECM على اللوحة مثل الهلام وعدم تعطل الطبقة الأحادية بسبب تغيرات لزوجة ECM.

على الرغم من أن هذا النموذج له مزايا متميزة على زراعة الخلايا التقليدية ، إلا أنه من الناحية الفنية أكثر تطلبا وتكلفة واستهلاكا للوقت مقارنة بفحص التئام الجروح التقليدي في الطبقات الأحادية CRC. علاوة على ذلك ، فإن الاتساق في الكواشف والوسائط المستخدمة أمر بالغ الأهمية في ضمان بقاء هذه الثقافات وصيانتها بشكل صحيح ، وكذلك الحفاظ على الخلايا والكواشف و ECM في درجات حرارة مناسبة. وأخيرا ، فإن الطبقات الأحادية المعوية الصغيرة الأولية قصيرة الأجل ، لذلك يجب إجراء فحص الجرح الموصوف هنا بعد فترة وجيزة من تحقيق التقاء الطبقة الأحادية.

تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أنه يمكن استخدام الطبقات الأحادية المعوية المعوية الصغيرة كنموذج جديد للتحقيق في التجديد الظهاري المعوي من خلال عمليات هجرة الخلايا وانتشارها بعد الإصابة. بالإضافة إلى ذلك ، توفر الأمعاء نسيجا أكثر قابلية للترجمة الفسيولوجية لدراسة التأثيرات على صلاحية الخلايا المعوية المتباينة. قد توفر هذه النماذج منصة لتشريح الآليات التي تنظم الإصلاح الظهاري والمساعدة في تحديد أهداف علاجية جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه ولا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم HC من خلال منحة P20GM134973 من المعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم KB من خلال منحة مؤسسة مستشفى الأطفال (CHF) ومؤسسة الصحة المشيخية (PHF). تم دعم خدمات تصوير الخلايا الحية التي يقدمها مركز علم الجينوم الوظيفي للسرطان جزئيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20GM103639 والمعهد الوطني للسرطان منحة P30CA225520 من المعاهد الوطنية للصحة ، الممنوحة لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما مركز ستيفنسون للسرطان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological Pipet Fisher Scientific 13-675-49
100x21mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 172931
15 mL Conical tube VWR 89039-666
24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate Corning 3524
37 µM Reversible Cell Strainer STEMCELL Technologies 27215
50 mL Conical tube VWR 89039-658
70 µm Sterile Cell Strainers Fisher Scientific FB22-363-548
Albumin, Bovine (BSA) VWR 0332-100G
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 100-0485
ImageJ NIH imagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument Sartorius 4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module Sartorius 9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010 This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free Corning 356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate ThermoFisher Scientific 136101
PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Primocin Invivogen ant-pm-1 This is broad-spectrum antibiotics
Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K Lifecore Biomedical HA20K-1
TC20 Automated Cell Counter Company: Bio-Rad 1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin Fisher Scientific MT25053CI
Y-27632 STEMCELL Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
  2. Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
  3. Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
  4. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  5. Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
  6. He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
  7. Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
  8. Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
  9. vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
  10. Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
  11. Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
  12. Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
  13. Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
  14. Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
  15. Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
  16. Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
  17. Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
  18. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  19. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
  20. Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
  21. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
  22. Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
  23. de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
  24. Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
  25. Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
  26. Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
  27. Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
  28. Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
  29. Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
  30. Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
  31. Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
  32. Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
  33. Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
  34. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  35. Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
  36. Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
  37. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  38. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).

Tags

الطب، العدد 185،
تأثير حمض الهيالورونيك 35 كيلو دال أمبير على نموذج <em>في المختبر</em> للإصابات المعوية الصغيرة المبكرة والشفاء باستخدام الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, A., Burge, K., Eckert, J.,… More

Wilson, A., Burge, K., Eckert, J., Chaaban, H. Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers. J. Vis. Exp. (185), e63758, doi:10.3791/63758 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter