Summary
이 프로토콜은 인간이 아닌 영장류 회장으로부터 분리된 3차원(3D) 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단층에 대한 스크래치 상처 분석을 확립하고 수행하는 방법을 설명한다.
Abstract
시험관 내 스크래치 상처 분석은 일반적으로 다양한 조직 유형에서 상피 치유의 메커니즘과 특성을 조사하는 데 사용됩니다. 여기에서는 회장의 장 음와에서 유래한 3차원(3D) 비인간 영장류 엔테로이드로부터 2차원(2D) 단층을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 이러한 장내 유래 단분자층을 시험 관 내 스크래치 상처 분석에 활용하여 모유 HA 모방체인 히알루로난 35kDa(HA35)가 상피 상처 가장자리를 따라 세포 이동 및 증식을 촉진하는 능력을 테스트했습니다. 단층이 컨플루언스로 성장한 후 수동으로 긁어 HA35(50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) 또는 대조군(PBS)으로 처리했습니다. 간극으로의 세포 이동 및 증식은 살아있는 세포 이미징을 위해 장착된 투과광 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. 상처 봉합은 ImageJ의 상처 치유 크기 플러그인을 사용하여 상처 치유 백분율로 정량화되었습니다. 스크래치 영역과 세포 이동 속도 및 상처 봉합 비율을 24시간에 걸쳐 측정했습니다. 시험 관 내 HA35는 상처 가장자리에서의 세포 증식과 상처 영역으로의 이동의 조합을 통해 소장 장내 단층에서 상처 치유를 가속화합니다. 이러한 방법은 잠재적으로 조산 인간 소장에서 장 재생을 탐구하는 모델로 사용될 수 있습니다.
Introduction
괴사성 장염(NEC)은 미숙아에서 가장 흔한 위장 응급 상황 중하나입니다1. 이 질병은 장 괴사, 패혈증 및 잠재적으로 사망으로 빠르게 악화 될 수있는 심각한 장 염증을 특징으로합니다. 병인은 불분명하지만 증거에 따르면 NEC는 다인성이며 섭식, 비정상적인 박테리아 집락화 및 미성숙 장 상피 2,3의 복잡한 상호 작용의 결과입니다. 미숙아는 장 투과성, 비정상적인 박테리아 집락화 및 낮은 장 세포 재생 능력4,5를 증가시켜 장 장벽 기능 장애, 박테리아 전좌 및 NEC 발달의 위험을 증가시킵니다. 따라서 장 상피 성숙을 가속화하고 장 상피의 재생 또는 치유를 촉진하는 전략이나 중재를 식별하는 것이 이 치명적인 질병을 예방하는 데 중요합니다.
연구에 따르면 모유(HM)는 조산아 6,7,8,9,10,11에서 NEC를 예방합니다. 인간과 동물 연구 모두 소 기반 분유가 장 투과성을 증가시키고 장 상피 세포에 직접 독성이 있음을 보여주었습니다 2,12. 완전히 밝혀지지는 않았지만, 증거는 HM의 보호 효과가 락토페린, 면역 글로불린 A (IgA) 및 HM 올리고당13과 같은 생리 활성 성분을 통해 매개된다는 것을 시사한다. HM은 또한 D- 글루 쿠 론산과 N- 아세틸 -D- 글루코사민 이당류14,15를 반복하는 독특한 비 황산화 글리코 사 미노 글리 칸 인 히알루 론산 (HA)이 풍부합니다. 중요하게도, 우리는 HM HA 모방체인 경구 35kDa HA(HA35)가 장 손상의 중증도를 약화시키고 박테리아 전좌를 방지하며 쥐 NEC 유사 장 손상 모델16,17에서 사망률을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다.
여기에서, HA35가 장 치유 및 체외 재생에 미치는 영향을 추가로 조사한다. 현재, 장 상처 및 복구를 위해 가장 널리 사용되는 시험관 내 분석은 대장 암 (CRC) 세포 단층에서 수행되는 스크래치 상처 분석입니다. CRC 세포의 상처 복구가 줄기 세포 구동 복구 과정18보다는 암세포의 고도로 증식 된 특성에 크게 의존하기 때문에 조산아 장에 대한 이러한 모델의 생리 학적 관련성은 제한적입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 조산아 비인간 영장류(NHP)로부터 1차 줄기세포 유래 소장 장내로이드를 분리 및 유지하는 절차를 포함하는 2D 장내 스크래치 상처 모델의 확립이 여기에 설명되어 있다. 조기 NEC가 원위 소장에서 가장 흔하게 보고된다는 점을 감안할 때, 장 손상 및 복구 모델에서 일차 상피 세포 오가노이드의 사용은 전통적인 결장직장 단일층을 활용하는 기존 모델과 비교하여 보다 생리학적으로 번역가능한 시험관 내 모델을 제공합니다18,19.
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Protocol
이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 기관 승인 후, 별도의 연구를 위해 안락사 후 조산한 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 개코원숭이, Papio anubis)의 태아 소장 편의 샘플을 얻었습니다(프로토콜 #101523-16-039-I)20.
1. 조산 비인간 영장류 3D 장내 장내 확립
- 미디어 준비
알림: 배지는 표준 무균 기술에 따라 지하실 격리 최대 1주일 전에 준비할 수 있습니다. 원하는 경우 일차 세포에 대한 광범위한 항생제 대신 페니실린/스트렙토마이신(최종 농도 1%)을 사용할 수 있습니다.- 오가노이드 성장 배지 인간 기초 배지 50mL와 오가노이드 보충제 50mL를 혼합하여 인간 오가노이드 성장 배지 + Y-27632(HOGMY)를 준비합니다(재료 표). 200 μL의 광범위한 항생제 (최종 농도 100 μg / mL) (재료 표) 및 Y-27632 (최종 농도 10 μM까지)를 추가하십시오. 벤치 탑에서 실온으로 따뜻하게하십시오.
- 오가노이드 성장 배지 인간 기초 배지 50mL와 오가노이드 보충제 50mL를 혼합하여 인간 오가노이드 성장 배지(HOGM)를 준비합니다. 200 μL의 광범위한 항생제 (100 μg / mL)를 첨가하십시오. 벤치 탑에서 실온으로 따뜻하게하십시오.
알림: HOGM은 통과 후 처음 2-3일 이후에 미디어를 변경할 때 사용됩니다. - 칼슘이나 마그네슘 없이 1x 인산완충 식염수(PBS) 100mL를 얼음처럼 차가워질 때까지 식힙니다.
- 칼슘 또는 마그네슘이 없는 1x PBS와 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 결합하여 세척 완충액 50mL를 준비합니다. 얼음처럼 차가워질 때까지 식히십시오.
- 1mL의 DMEM/F100(Dulbecco의 변형 이글스 배지/영양소 햄의 혼합물 F12 + 15mM hepes 버퍼)에 1mL의 광범위 항생제(100μg/mL)를 추가하여 DMEM-F12 세척 완충액을 준비합니다. 얼음처럼 차갑게 유지하십시오.
- 지하실 격리 및 도금
알림: 세포외 기질(ECM) 기반 하이드로겔은 전체 절차 동안 얼음 위에 남아 있어야 합니다. 이 절차는 6 개의 ECM 기반 하이드로 겔 돔을 채우기에 충분한 조직을 가정합니다. 다른 밀도의 지하실을 수확하는 경우 그에 따라 돔 번호를 변경해야합니다.- 150 μL의 성장 인자 감소 (GFR) 기저막 추출물 (BME) (페놀 레드 프리)을 2-8 °C의 얼음 위에서 밤새 해동시켰다.
- 사용하기 전에 최소 30분 동안 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 24웰, 평평한 바닥, 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플레이트를 배양합니다.
- NHP 안락사 및 조직 수집 후, 일회용 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 1x PBS를 사용하여 1,000μL 피펫 팁으로 회장 파편 부분을 씻어냅니다.
알림: 건강한 엔터로이드를 수확하려면 신선한 조직을 빨리 수확하고 얼음처럼 차갑게 유지해야 합니다. - 회장을 전체 장을 따라 세로로 자르고 얼음처럼 차가운 PBS 3x로 씻으십시오. 튜브에 가장 가까운 회장 세그먼트 부분부터 시작하여 15mL 얼음처럼 차가운 PBS가 들어있는 50mL 원추형 튜브 위에 멸균 가위로 조직을 작은 조각 (길이 약 2mm)으로 만듭니다.
- 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 5-10배 위아래로 피펫팅하여 음와를 파괴합니다. 조직 세그먼트가 튜브 바닥에 가라앉도록 한 다음 상청액을 제거하고 얼음처럼 차가운 신선한 PBS로 교체합니다. 상청액이 깨끗하고 파편이 없어질 때까지 이 과정을 최소 7x-10x 반복합니다.
- 깨끗해지면 상청액을 제거하고 25mL의 세포 해리 시약에 음와를 재현탁합니다. 튜브를 실온에서 20분 동안 15rpm의 흔들 플랫폼에 놓습니다.
- 로커에서 튜브를 제거하고 세포가 약 30초에서 1분 동안 안정되도록 하고 상청액을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 세척 완충액 10mL를 추가합니다. p1000 피펫으로 위아래로 피펫을 사용하여 단일 크립트로 더 분리합니다.
- 70μm 세포 여과기를 통해 조직을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다. 원래 50mL 원뿔형 튜브를 10mL의 얼음처럼 차가운 세척 완충액으로 헹구고 70μm 스트레이너를 통해 필터링하여 모든 지하실이 원래 튜브에서 제거되었는지 확인합니다. 총 4회 헹굼을 위해 이 티슈 세척을 반복합니다.
- 여과액을 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 600μL의 HOGMY를 추가하고 200μL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 파쇄합니다. 용액이 얼음처럼 차가워 질 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
알림: 용액이 얼음처럼 차갑지 않으면 돔이 도금 될 때 적절한 구조를 유지하지 못합니다. ECM 기반 하이드로겔 돔을 피펫팅할 때 기포가 플레이트 바닥에 적절하게 부착되는 것을 방해하므로 기포를 도입하지 마십시오. - 600μL의 얼음처럼 차가운 ECM 기반 하이드로겔을 추가하여 세포 펠릿을 현탁시키고 200μL 피펫으로 잘 혼합합니다.
- 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 제거하고 37°C 플레이트 워머에 놓습니다. 얼음처럼 차가운 HOGMY/ECM 기반 하이드로겔 혼합물 50μL를 24웰 배양 플레이트의 24웰 중앙에 피펫팅합니다(돔당 50μL).
- 도금이 완료되면 돔을 37°C 플레이트 워머에 1분 동안 두어 플레이트 바닥에 부착되도록 합니다. 플레이트를 조심스럽게 뒤집고 플레이트 바닥에 응결이 쌓이지 않았는지 확인하고 거꾸로 된 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO2의 인큐베이터에 놓습니다.
- 15분 후, 플레이트를 우회전이 위로 향하게 하고 실온 HOGMY 750μL를 각 웰에 피펫팅합니다.
참고: 새로 형성된 3D ECM 기반 하이드로겔 돔을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫 매체를 웰의 측벽에 천천히 놓습니다. - 모든 웰에 배지가 채워지면 플레이트를 인큐베이터에 넣고 3 일마다 750 μL의 HOGM으로 배지를 교체하십시오. 통로 엔테로이드는 7-10 일마다.
- 장 장내 통과
참고: 다음 프로토콜은 1:2의 분할 속도로 NHP 엔테로이드를 포함하는 24웰 배양 플레이트 1개에 대한 것입니다.- 엔테로이드가 포함된 ECM 돔이 파손되지 않도록 주의하면서 각 웰에서 엔터로이드 배지를 제거하고 1,000μL 피펫을 사용하여 각 웰에 500μL의 얼음처럼 차가운 세포 해리 시약을 추가하고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
- 8-12x 위아래로 피펫팅하여 ECM을 수동으로 중단합니다. 12 웰의 내용물을 하나의 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
- 24웰 배양 플레이트에서 모든 용액을 수집하면 각 웰에 250μL의 세포 파쇄 시약을 추가하여 각 웰에서 모든 NHP 엔테로이드가 제거되었는지 확인하고 이 마지막 헹굼물을 기존 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.
- 실온(20°C)에서 15분 동안 40rpm으로 흔들리는 플랫폼에 놓습니다. 또는 실온에서 15분 동안 튜브를 수동으로 흔듭니다.
- 15분 후, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 펠릿만 남을 때까지 15mL 튜브에서 상청액을 제거합니다.
- 15mL 원뿔형 튜브 하나에 얼음처럼 차가운 DMEM + 광범위 항생제 8mL를 추가하여 펠릿이 충분히 파손되었는지 확인합니다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 상청액을 버린다.
- 600μL의 HOGMY를 추가하고 1,000μL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 파쇄합니다. 용액이 얼음처럼 차가워 질 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 용액이 얼음처럼 차가워지면 600μL의 얼음처럼 차가운 ECM을 추가하여 세포 펠릿을 현탁시키고 1,000μL 피펫으로 잘 혼합합니다. 1.3.2.-1.3.7단계를 반복합니다. 나머지 12 개의 우물을 위해.
- 나머지 단계는 1.2.11.-1.2.16단계를 참조하십시오.
2. 장내 단층 및 긁힘 상처 분석의 확립
- 배지 및 치료 준비
- 얼음처럼 차가워질 때까지 칼슘이나 마그네슘 없이 PBS 5mL를 식힙니다.
- 1mL의 DMEM/F100(Dulbecco의 변형 이글스 배지/영양소 햄의 혼합물 F12 + 15mM hepes 버퍼)에 1mL의 광범위 항생제(100μg/mL)를 추가하여 DMEM-F12 세척 완충액을 준비합니다. 얼음처럼 차갑게 유지하십시오.
- 1.1.1.1단계에 설명된 대로 HOGMY 100mL를 준비하고 벤치탑에서 실온으로 따뜻하게 합니다.
- 25 mL의 0.25 % 트립신-에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 37 ° C 수조에서 따뜻하게합니다.
- 용매로 칼슘이나 마그네슘이 없는 멸균 PBS를 사용하여 세포 처리를 위해 50μg/mL, 100μg/mL 및 200μg/mL 농도의 HA35를 준비합니다. HA35의 최종 희석은 용매로 HOMGY를 사용합니다.
참고: HA35는 종종 5mg/mL 이상의 농도에서 용액에서 나오기 때문에 HA35 준비에는 여러 희석이 필요할 수 있습니다.
- 장내 단층 형성
참고: 다음 절차는 엔테로이드 단층의 24웰 플레이트 하나를 생성하기에 충분한 부피를 제공합니다. 원하는 단층 수에 맞게 볼륨을 조정합니다.- 96μL의 ECM 기반 하이드로겔 BME(페놀 레드 프리)를 2-8°C의 얼음에서 밤새 해동합니다. ECM 기반 하이드로겔을 칼슘이나 마그네슘이 없는 얼음처럼 차가운 PBS에 1:50의 비율로 희석합니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰을 200μL의 얼음처럼 차가운 희석 ECM 기반 하이드로겔로 코팅합니다.
- ECM 기반 하이드로겔 코팅 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 최소 1시간 동안 인큐베이션합니다. 단층으로 향하는 3D 엔테로이드가 포함된 24웰 배양 플레이트에서 배지를 흡입하고 500μL의 세포 해리 시약/웰로 교체합니다.
- 8x-12x 위아래로 피펫팅하여 ECM 기반 하이드로겔 돔을 수동으로 파괴하고 12웰의 내용물을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 12개의 빈 웰을 250μL의 세포 해리 시약으로 세척하여 모든 엔테로이드가 제거되었는지 확인하고 내용물을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 2.2.5단계를 반복합니다. 및 단계 2.2.6. 나머지 12 웰의 경우 두 번째 15mL 원추형 튜브를 사용합니다.
- 원뿔형 튜브를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 10mL의 얼음처럼 차가운 DMEM-F12 세척 버퍼를 15mL 원뿔형 튜브에 추가하고 튜브를 뒤집어 장내 펠릿을 매달아 놓습니다. 4 °C에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 37°C의 트립신-EDTA에 12 mL에 재현탁시킨다. 튜브를 37°C 수조에 10분 동안 또는 세포가 용해될 때까지 두십시오. 각 튜브에 DMEM-F12 세척 완충액 3mL를 추가하여 트립신-EDTA를 희석하고 튜브를 뒤집어 혼합한 다음 얼음 위에 놓습니다.
- 해리된 엔테로이드를 37μM 메쉬 세포 스트레이너를 통해 여과하고 내용물을 깨끗한 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 튜브를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 세포가 원심분리기에서 펠릿화되는 동안 인큐베이터에서 ECM 기반 하이드로겔 코팅 플레이트를 제거하고 코팅된 표면을 긁거나 플레이트를 완전히 건조시키지 않고 과도한 ECM 기반 하이드로겔 용액을 흡인합니다.
- 원뿔형 튜브에서 상청액을 제거하고 6mL의 HOMGY로 세포 펠릿을 재현탁합니다. ECM 기반 하이드로겔로 코팅된 24웰 플레이트의 각 웰에 결합된 12mL HOMGY 세포 현탁액 500μL를 대략 3 x 105 세포/웰의 파종 밀도로 추가합니다. 웰 내에서 세포가 고르게 분포되도록 뚜껑을 덮고 플레이트를 소용돌이칩니다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2 에서 배양하고, 단층이 >90% 컨플루언시)에 도달할 때까지 2일마다 HOMGY 배지를 교환한다.
- 단층 치료 및 스크래치 상처 분석
- 단층이 >90% 컨플루언스에 도달하면 매질을 흡입하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. HOMGY에 용해된 500μL의 HA35(50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) 또는 PBS로 세포를 24시간 동안 처리합니다.
- 24시간 후 단층의 표면을 방해하지 않도록 주의하면서 미디어를 제거합니다. 200μL 피펫 팁을 사용하여 단층이 마르지 않도록 주의하면서 각 웰에 있는 단층의 전체 표면 직경에 걸쳐 선형 스크래치를 만듭니다.
- 긁힌 단분자층을 500μL의 1x PBS로 1x 세척합니다. HOMGY에 용해된 500μL의 HA35(50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) 또는 PBS를 추가하고 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터 내의 생세포 분석 기기(재료 표)로 옮깁니다.
- 라이브 셀 분석 소프트웨어(재료 표)의 일정 아이콘에서 새 선박 추가 마법사 시작 아이콘을 클릭하고 일정에 따라 스캔할 스캔 빈도를 설정합니다. 스캔 유형에서 새 전체 웰 용기를 만들고 스캔 설정(예: 이미지 채널의 위상, 대물렌즈의 경우 4x)을 지정하고 다음을 클릭합니다.
- 제공된 목록에서 플레이트 제조업체 및 카탈로그 번호를 선택합니다. 일정 아이콘 아래에서 라이브 셀 분석 기기 내에서 플레이트를 배치할 더하기 기호를 선택합니다. 원하는 스캔 패턴을 선택한 다음 플레이트 레이아웃 페이지에서 "+"를 선택하여 플레이트 맵을 만듭니다. 나중까지 분석 연기를 선택한 다음 24시간 동안 4시간마다 스캔 일정을 설정하고 선박 마법사 요약 페이지에서 획득 설정을 확인합니다. 마지막으로 일정에 추가를 선택합니다.
- 24 분석이 완료되면 보기 아이콘 아래에서 선박 이름을 두 번 클릭하고 이미지와 동영상을 내보냅니다. 표시할 웰과 일련의 이미지를 선택하고 JPEG로 내보냅니다. 2.4단계에 따라 ImageJ21용 상처 치유 크기 플러그인을 사용하여 상처 치유율에 대한 이미지를 분석합니다. 아래.
- 스크래치 상처 분석
- ImageJ 소프트웨어를 엽니다. 스크래치 상처 분석 이미지(. TIFF 또는 .JPG).
- 이미지를 24비트 RGB에서 8비트로 변경하려면 이미지 > > 8비트 유형을 선택합니다. 플러그인 > 매크로를 선택하여 상처 치유 크기 플러그인을 설치> 상처 치유 크기 플러그인 설치>.
- 스크래치가 수직이 되도록 이미지를 회전하고 상처 치유 크기 도구 플러그인을 초기화합니다.
- 대화 상자에서 스크래치 상처에 가장 잘 맞도록 플러그인 매개 변수를 선택합니다. 상처 치유 크기 옵션에 대한 매개 변수 값을 [분산 창 반경] 20, [임계값] 100, [포화 픽셀의 백분율] 백분율(0.001)으로 설정하고 [배율 설정]에 대해 [예]를 선택합니다. 확인 버튼을 클릭하여 선택을 완료합니다. 선택한 부위가 상처 부위인지 확인합니다. 위의 매개 변수는 실험실에서 실험실로 표준화가 필요할 수 있습니다.
- 2.4.2.-2.4.4단계를 반복합니다. 각 스크래치에 대한 남은 시간 포인트에 대해.
- 다음과 같이 24시간 동안 이동 또는 증식하는 세포의 스크래치 영역 상처 치유 비율을 계산합니다.
상처 치유 % =
여기서 T0 = 시간 0h에서의 % 면적 및 Tc = % 0h, 4h, 12h, 또는 24h에서의 면적.
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Representative Results
다양한 조직과 기관의 조직 복구 및 상처 치유에 대한 HA의 효과는 잘 문서화되어 있습니다. 그러나 분자량이 35kDa 인 HA가 태아 또는 신생아 소장 치유 및 재생에 미치는 구체적인 효과는 현재 알려져 있지 않습니다. 태아 또는 신생아 소장 모델에서 상처 치유를 촉진하는 HA35의 능력을 테스트하기 위해 NHP 회장 조직에서 3D 장 장내 조직을 생성하고 이 조직을 단일 세포로 추가로 해리하여 2D 장내 유래 단층을 만들었습니다(그림 1A,B). 단층은 컨플루언스로 성장시키고 P200 피펫 팁을 사용하여 수동으로 긁었습니다(그림 1B,C). 그런 다음 단층을 HA35(50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) 또는 대조군(PBS)으로 처리했습니다. 간극으로의 세포 이동 및 증식은 생세포 이미징(22)을 위해 장착된 투과광 현미경을 사용하여 총24시간 동안 4시간마다 이미징하였다. 세포 이동 속도를 측정하는 상처 봉합 속도는 상처 치유 크기 플러그인21을 사용하여 상처 치유 백분율로 ImageJ를 사용하여 정량화되었습니다(그림 2). 스크래치 면적 및 세포 이동 속도 및 상처 봉합 비율을 24 시간에 걸쳐 측정했습니다 (단계 2.4.6). 그림 3에서 볼 수 있듯이 HA35에 노출되면 용량 및 시간 의존적으로 세포 이동/증식이 자극되어 상처 봉합이 가속화되었습니다. 100 μg/mL 및 200 μg/mL에서 HA35는 4시간 및 12시간 모두에서 대조군에 비해 치유량을 ~1.5-2.5배 유의하게 증가시켰습니다(*p < 0.05).
그림 1. 엔테로이드 생성 및 엔테로이드 유래 단층 상처 치유 분석 절차. (A) (B) 2차원 단층으로 해리하는 데 사용되는 3차원 비인간 영장류 장내 장내 장내 배양. (C) 단층을 24-웰 플레이트에서 >90% 합류로 성장시킨 다음, 히알루론산 35kDa 또는 인산완충식염수로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음 단분자층을 P200 피펫 팁으로 긁었습니다. 스케일 바 = 800 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 상처 치유 분석 이미지 및 분석. 히알루론산 35kDa(100μg/mL, 200μg/mL) 및 비인간 영장류 장내 단층의 대조 치료의 대표 이미지. 이미지는 P200 피펫 팁으로 스크래치를 수행한 후 0시간, 4시간, 12시간, 16시간 및 24시간에 획득되었습니다. 이미지는 라이브 셀 분석 장비로 4배 배율로 촬영하고 상처 치유 크기 플러그인을 사용하여 ImageJ에서 분석했습니다. 상처 치유 비율은 24 시간 동안 세포 이동 / 증식으로부터 계산되었습니다. 스케일 바 = 800 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 히알루 론산 35 kDa (HA35)가 장내 단층의 상처 치유에 미치는 영향. 장내 단층에서 시간 경과에 따른 상처 치유의 변화는 HA35 치료 농도에 따라 다릅니다. HA35는 대조군과 비교할 때 100μg/mL 및 200μg/mL에서 4시간 및 12시간 후 상처 치유를 유의하게 증가시켰지만 치료 간에 치유율은 24시간까지 수렴했습니다. 유의성은 *p < 0.05에서 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가되었으며, 평균 ± 표준 오차(SEM)(치료당 n =6웰)로 제시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
조산아의 위장관은 dysbiosis, 염증성 박테리아 대사 산물 및 독소, 간헐적 저산소증과 관련된 환경 모욕에 반복적으로 노출되어 지속적인 재생 압력을 받고 있습니다23,24. 불행히도, 미숙아의 장 상피는 기능적 완전성을 빠르게 확립 할 수 없습니다23, 장벽 기능 장애, 장 투과성 증가, 심한 경우 만연한 장 염증 및 NEC 발달을 초래합니다.
글리코사미노글리칸(GAG)은 모유에 널리 퍼진 다당류의 한 종류로, NEC15,16의 발달을 방지하는 잠재적인 생리활성 인자입니다. HA는 히알루론산 합성효소에 의해 생성된 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민25,26의 반복적인 이당류의 선형 중합체이다. HA는 크기 및 조직 환경에 따라 전염증성 또는 항염증 특성을 가질 수 있다(27,28). 장 및 결장에서 내인성 HA는 음와상피세포에 인접한 세포외 공간에 존재하며 상피 증식 및 정상적인 장 성장을 유도한다 29,30,31. HA는 또한 HM의 천연 성분이며 수유첫 주 30 동안 가장 높은 농도로 생산됩니다. 특히, HM 또는 분자량 ~ 35 kDa의 상업적으로 이용 가능한 HA (HA 35)로부터 정제 된 HA는 생체 내 및 시험관 내 결장 상피에서 항균 β- 디펜신 및 TJ 단백질 ZO-1의 발현을 증가시킴으로써 박테리아 유발 대장염으로부터 보호합니다 25,27. 모든 특정 크기의 HA (4.7 kDa, 16 kDa, 28 kDa, 74 kDa) 중에서 HA35는 시험관 내 결장 상피에서 TJ 단백질 및 항균 펩타이드 발현의 가장 강력한 유도제라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 더욱이, 큰 MW HA (~ 2,000 kDa)는 TJ 단백질 발현에 영향을 미치지 않으며, 이는 이러한 효과가 크기 특이 적임을 나타냅니다32. 우리는 또한 HA35의 경구 투여가 소장 성숙을 가속화하고 상피 증식 및 분화를 촉진하며 NEC16의 발달을 예방한다는 것을 보여주었습니다. 여기서, 상처 치유를 촉진하는 HA35의 능력은 시험관내 스크래치 상처 치유 분석을 사용하여 시험된다. 위에서 설명한 모델을 사용하여 HA35는 대조군에 비해 긁힌 후 4시간 및 12시간에 농도 의존적 방식으로 상처 봉합을 가속화하는 것으로 밝혀졌으며, 특정 크기의 HA가 장 상처 치유 및 조직 복구에 미치는 영향에 대한 지식의 중요한 격차를 명확히 하여 신생아 장 상처 치유에서 HA35의 유익한 역할을 확인했습니다. HA35가 이 효과를 발휘하는 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 마우스 새끼에 대한 저자의 이전 데이터는 HA35 처리 후 회장 조직에서 라파마이신(mTOR) 복합체 1(mTORC1) 경로의 기계론적 표적이 상향조절되었음을 보여주었습니다16. 이러한 관찰 된 효과에 대한이 경로의 기여도를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
여러 시험관 내 모델이 장 재생, 치유 및 복구를 촉진하는 중재를 조사하는 데 활용되었습니다. 장 상처 및 후속 복구를 위해 가장 많이 사용되는 시험관 내 분석은 결장직장암(CRC) 세포 단층(33,34)에서 가장 일반적으로 수행되는 스크래치 상처 분석입니다. 그러나 CRC 세포의 상처 복구가 줄기 세포 구동 복구 과정18보다는 암세포의 고도로 증식 된 특성에 크게 의존하기 때문에 조산아 장에 대한 이러한 모델의 생리 학적 관련성은 제한적입니다. 장 상피의 음와에서 유래 된 장내 장형을 분리하고 유지하는 최근의 능력은 다수의 면역 또는 유해 자극에 대한보다 생리 학적으로 관련된 장 반응뿐만 아니라 가능한 치료 적 개입을 탐구 할 수있는 기회를 제공한다35. 엔테로이드는 이들이 유래된 장 분절에서 발견되는 모든 분화된 상피 세포 유형을 포함하므로 장 장벽 손상 및 복구36,37,38을 연구하는 데 효과적인 모델 역할을 합니다.
본원에 기재된 것은 조기 NHP로부터의 회장을 이용한 장 상피 손상 및 복구의 시험관내 장내 모델의 확립 및 유지이다. 이 모델은 상피 치유 및 재생과 관련된 기계 론적 경로 및 치료 적 개입의 조사를 허용합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 비슷한 너비로 잘 정의된 간격을 생성하여 우물 대 우물 변동을 최소화하는 것입니다. 또한, 단층을 긁을 때, 피펫 팁은 세포층을 깨끗하게 제거하기 위해 웰의 바닥과 일정한 접촉을 유지해야합니다. 상처 가장자리가 "들어 올려지는"것을 방지하기 위해 과도한 압력을 피해야합니다. 유사하게, 상처 후 PBS 세척 단계는 웰의 측벽을 사용하여 부드럽게 수행되어야 나머지 단층의 손상 또는 상처 갭의 추가 확대를 방지해야 합니다. 마지막으로, 플레이트의 ECM 코팅이 겔처럼 유지되고 ECM 점도 변화로 인해 단층이 파괴되지 않도록 플레이트를 장기간 37°C 미만으로 유지하지 않아야 합니다.
이 모델은 기존 세포 배양에 비해 뚜렷한 장점이 있지만 CRC 단층의 기존 상처 치유 분석에 비해 기술적으로 더 까다롭고 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 또한 사용된 시약 및 배지의 일관성은 적절한 온도에서 세포, 시약 및 ECM을 유지하는 것과 마찬가지로 이러한 배양의 생존과 적절한 유지를 보장하는 데 중요합니다. 마지막으로, 원발성 소장 단층은 수명이 짧기로 악명이 높기 때문에 여기에 설명된 상처 분석은 단층 합류가 달성된 직후에 수행되어야 합니다.
종합하면, 이러한 결과는 소장 장내 단분자층이 상처 후 세포 이동 및 증식 과정을 통해 장 상피 재생을 조사하는 새로운 모델로 사용될 수 있음을 시사합니다. 또한, 엔테로이드는 분화된 장 세포 생존력에 대한 효과를 연구하기 위해 훨씬 더 생리학적으로 번역가능한 조직을 제공한다. 이러한 모델은 상피 복구를 조절하는 메커니즘을 해부하고 신규한 치료 표적의 식별을 돕는 플랫폼을 제공할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것도없고 이해 상충도 없습니다.
Acknowledgments
이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. HC는 국립 보건원의 보조금 P20GM134973의 지원을 받습니다. KB는 어린이 병원 재단 (CHF) 및 장로교 건강 재단 (PHF) 보조금의 지원을 받고 있습니다. Cancer Functional Genomics 코어에서 제공하는 라이브 셀 이미징 서비스는 오클라호마 대학 보건 과학 센터 스티븐슨 암 센터에 수여 된 국립 보건원의 국립 일반 의학 연구소 보조금 P20GM103639 및 국립 암 연구소 보조금 P30CA225520에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
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