Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर का उपयोग करके अपरिपक्व छोटी आंतों की चोट और उपचार के इन विट्रो मॉडल पर हायलूरोनिक एसिड 35 केडीए का प्रभाव

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/63758
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल गैर-मानव प्राइमेट इलियम से अलग तीन-आयामी (3 डी) एंटरोइड्स से प्राप्त दो-आयामी (2 डी) मोनोलेयर पर खरोंच घाव परख स्थापित करने और करने की एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

इन विट्रो स्क्रैच घाव परख का उपयोग आमतौर पर विभिन्न प्रकार के ऊतक प्रकारों में उपकला उपचार के तंत्र और विशेषताओं की जांच के लिए किया जाता है। यहां, हम टर्मिनल इलियम के आंतों के क्रिप्ट से प्राप्त तीन-आयामी (3 डी) गैर-मानव प्राइमेट एंटरोइड्स से दो-आयामी (2 डी) मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इन एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर का उपयोग तब उपकला घाव किनारे के साथ सेल माइग्रेशन और प्रसार को बढ़ावा देने के लिए मानव दूध एचए मिमिक, हायलूरोनन 35 केडीए (एचए 35) की क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक इन विट्रो स्क्रैच घाव परख में किया गया था। मोनोलेयर को कंफ्लुएंसी में विकसित करने के बाद, उन्हें मैन्युअल रूप से खरोंच दिया गया और एचए 35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) या नियंत्रण (PBS) के साथ इलाज किया गया। लाइव-सेल इमेजिंग के लिए सुसज्जित संचारित-प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अंतर में सेल माइग्रेशन और प्रसार को चित्रित किया गया था। इमेजजे में घाव भरने के आकार प्लगइन का उपयोग करके घाव बंद करने को प्रतिशत घाव भरने के रूप में निर्धारित किया गया था। खरोंच क्षेत्र और सेल माइग्रेशन की दर और घाव बंद होने का प्रतिशत 24 घंटे से अधिक मापा गया था। एचए 35 इन विट्रो छोटे आंतों के एंटरोइड मोनोलेयर में घाव भरने में तेजी लाता है, संभवतः घाव के किनारे पर सेल प्रसार और घाव क्षेत्र में प्रवास के संयोजन के माध्यम से। इन विधियों को संभावित रूप से अपरिपक्व मानव छोटी आंत में आंतों के पुनर्जनन का पता लगाने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) अपरिपक्व शिशुओं में सबसे आम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल आपात स्थितियोंमें से एक है। रोग को गंभीर आंतों की सूजन की विशेषता है जो आंतों के परिगलन, सेप्सिस और संभावित मृत्यु के लिए तेजी से बिगड़ सकती है। यद्यपि एटियलजि स्पष्ट नहीं है, सबूत बताते हैं कि एनईसी बहुक्रियाशील है और भोजन, असामान्य जीवाणु उपनिवेशीकरण और अपरिपक्व आंतों के उपकला 2,3 की जटिल बातचीत का परिणाम है। अपरिपक्व शिशुओं ने आंतों की पारगम्यता, असामान्य जीवाणु उपनिवेशीकरण, और कम एंटरोसाइट पुनर्योजी क्षमता 4,5 में वृद्धि की है, जिससे आंतों की बाधा शिथिलता, जीवाणु स्थानांतरण और एनईसी विकास के लिए उनका जोखिम बढ़ गया है। इसलिए, आंतों के उपकला परिपक्वता में तेजी लाने और आंतों के उपकला के उत्थान या उपचार को बढ़ावा देने के लिए रणनीतियों या हस्तक्षेपों की पहचान करना इस घातक बीमारी को रोकने में महत्वपूर्ण है।

अध्ययनों से पता चला है कि मानव दूध (एचएम) अपरिपक्व शिशुओं 6,7,8,9,10,11 में एनईसी के खिलाफ सुरक्षात्मक है। मानव और पशु दोनों अध्ययनों से पता चला है कि गोजातीय-आधारित सूत्र आंतों की पारगम्यता को बढ़ाता है और आंतों के उपकला कोशिकाओं 2,12 के लिए सीधे विषाक्त है। हालांकि पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है, सबूत बताते हैं कि एचएम के सुरक्षात्मक प्रभावों को बायोएक्टिव घटकों जैसे लैक्टोफेरिन, इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए), और एचएम ऑलिगोसैकराइड्स13 के माध्यम से मध्यस्थ किया जाता है। एचएम हायलूरोनन (एचए) में भी समृद्ध है, जो डी-ग्लूकोरोनिक एसिड और एन-एसिटाइल-डी-ग्लूकोसामाइन डिसैकराइड14,15 को दोहराने के साथ एक विशिष्ट गैर-सल्फेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन है। महत्वपूर्ण रूप से, हमने दिखाया है कि मौखिक 35 केडीए एचए (एचए 35), एक एचएम एचए मिमिक, आंतों की चोट की गंभीरता को कम करता है, जीवाणु स्थानांतरण को रोकता है, और मुराइन एनईसी जैसी आंतों की चोट मॉडल16,17 में मृत्यु दर को कम करता है।

यहां, इन विट्रो में आंतों के उपचार और पुनर्जनन पर एचए 35 के प्रभावों की आगे जांच की जाती है। वर्तमान में, आंतों के घाव और मरम्मत के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला इन विट्रो परख कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) सेल मोनोलेयर में किया गया एक खरोंच घाव परख है। प्रीटरम शिशु आंत के लिए इस तरह के मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता सीमित है, क्योंकि सीआरसी कोशिकाओं की घाव की मरम्मत स्टेम सेल-संचालित मरम्मत प्रक्रियाओं के बजाय कैंसर कोशिकाओं की अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव प्रकृति पर बहुत अधिक निर्भर करतीहै। इस सीमा को दूर करने के लिए, एक 2 डी एंटरॉइड स्क्रैच घाव मॉडल की स्थापना, जिसमें प्रीटरम गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) से प्राथमिक स्टेम सेल-व्युत्पन्न छोटे आंतों के एंटरोइड्स को अलग करने और बनाए रखने की प्रक्रिया शामिल है, यहां वर्णित है। यह देखते हुए कि प्रीटरम एनईसी को अक्सर डिस्टल छोटी आंत में रिपोर्ट किया जाता है, आंतों की क्षति और मरम्मत के मॉडल में प्राथमिक उपकला कोशिका ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पारंपरिक कोलोरेक्टल मोनोलेयर18,19 का उपयोग करने वाले मौजूदा मॉडल की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से ट्रांसलेटेबल इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन में सभी पशु प्रक्रियाओं को ओक्लाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। संस्थागत अनुमोदन के बाद, एक अलग अध्ययन (प्रोटोकॉल # 101523-16-039-आई) 20 के लिए इच्छामृत्यु के बाद प्रीटरम गैर-मानव प्राइमेट (एनएचपी, 90% गर्भधारण, जैतून बबून, पैपियो एनुबिस) से भ्रूण की छोटी आंत सुविधा नमूने प्राप्त किए गए थे।

1. प्रीटरम गैर-मानव प्राइमेट 3 डी आंतों के एंटरोइड्स की स्थापना

  1. मीडिया की तैयारी
    नोट: मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक के बाद क्रिप्ट अलगाव से 1 सप्ताह पहले तक मीडिया तैयार किया जा सकता है। स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 1%) का उपयोग वांछित होने पर प्राथमिक कोशिकाओं के लिए व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के स्थान पर किया जा सकता है।
    1. 50 एमएल ऑर्गेनॉइड पूरक (सामग्री की तालिका) के साथ 50 एमएल ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडियम ह्यूमन बेसल मीडियम को मिलाकर मानव ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडिया + वाई -27632 (एचओजीएमवाई) तैयार करें। व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के 200 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 100 μg / mL) (सामग्री की तालिका) और Y-27632 (10 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए)। कमरे के तापमान पर बेंचटॉप पर गर्म करें।
    2. 50 एमएल ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडियम ह्यूमन बेसल मीडियम को 50 एमएल ऑर्गेनॉइड सप्लीमेंट के साथ मिलाकर ह्यूमन ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडिया (एचओजीएम) तैयार करें। व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं (100 μg / mL) के 200 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर बेंचटॉप पर गर्म करें।
      नोट: एचओजीएम का उपयोग पहले 2-3 दिनों के बाद मीडिया को बदलते समय किया जाएगा।
    3. कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना 100 एमएल 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) को बर्फ-ठंडा होने तक ठंडा करें।
    4. कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना 1x PBS को 0.1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ जोड़कर 50 एमएल वॉश बफर तैयार करें। इसे बर्फ ठंडा होने तक ठंडा करें।
    5. डीएमईएम/एफ12 के 500 एमएल (डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम/न्यूट्रिएंट हैम का मिश्रण एफ12 + 15 एमएम एचईपीईएस बफर) में 1 एमएल ब्रॉड-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स (100 μg/mL) जोड़कर DMEM-F12 वॉश बफर तैयार करें। इसे बर्फ से ठंडा रखें।
  2. क्रिप्ट अलगाव और चढ़ाना
    नोट: एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) -आधारित हाइड्रोगेल पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रहना चाहिए। यह प्रक्रिया छह ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल गुंबदों को आबाद करने के लिए पर्याप्त ऊतक मानती है। यदि क्रिप्ट्स का एक अलग घनत्व काटा जाता है, तो गुंबद संख्या को तदनुसार बदल दिया जाना चाहिए।
    1. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर रात भर 150 μL विकास कारक कम (GFR) तहखाने झिल्ली निकालने (BME) (फिनोल लाल मुक्त) पिघलना।
    2. उपयोग से पहले न्यूनतम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से,फ्लैट-बॉटम , टिशू कल्चर-उपचारित पॉलीस्टाइनिन प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    3. एनएचपी इच्छामृत्यु और ऊतक संग्रह के बाद, एक डिस्पोजेबल पेट्री डिश में बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस का उपयोग करके मलबे के इलियम खंड को 1,000 μL पिपेट टिप के साथ फ्लश करें।
      नोट: ताजा ऊतक को जल्दी से काटा जाना चाहिए और स्वस्थ एंटरोइड्स की कटाई के लिए बर्फ-ठंडा रखा जाना चाहिए।
    4. इलियम को पूरी आंत के साथ अनुदैर्ध्य रूप से काटें, और बर्फ-ठंडे पीबीएस 3 एक्स से धोएं। ऊतक को छोटे टुकड़ों (लंबाई में लगभग 2 मिमी) में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर बाँझ कैंची के साथ 15 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस युक्त करें, जो ट्यूब के निकटतम इलल सेगमेंट के हिस्से से शुरू होता है।
    5. 5-10x ऊपर और नीचे पाइप करके क्रिप्ट को बाधित करने के लिए 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। ऊतक खंडों को ट्यूब के तल पर बसने दें, फिर सतह पर तैरने वाले को हटा दें और इसे ताजा, बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ बदलें। इस प्रक्रिया को न्यूनतम 7x-10x दोहराएं जब तक कि सतह पर तैरने वाला स्पष्ट और मलबे से मुक्त न हो जाए।
    6. एक बार स्पष्ट होने के बाद, सुपरनैटेंट को हटा दें और क्रिप्ट्स को 25 एमएल सेल पृथक्करण अभिकर्मक में फिर से निलंबित करें। ट्यूब को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 20 आरपीएम पर एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर रखें।
    7. रॉकर से ट्यूब को हटा दें, कोशिकाओं को लगभग 30 सेकंड से 1 मिनट तक बसने दें, और सुपरनैटेंट को हटा दें। बर्फ-ठंडा धो बफर के 10 एमएल जोड़ें। पिपेट को पी 1000 पिपेट के साथ ऊपर और नीचे करें ताकि आगे एकल क्रिप्ट में विघटित हो सकें।
    8. ऊतक को 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से एक नई 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें। मूल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को 10 एमएल आइस-कोल्ड वॉश बफर के साथ धोएं और 70 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि मूल ट्यूब से सभी क्रिप्ट हटा दिए गए हैं। कुल 4x कुल्ला के लिए ऊतक की इस धुलाई को दोहराएं।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर छानने वाले छान को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 600 μL HOGMY जोड़ें और 200 μL पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके गोली को बाधित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें जब तक कि घोल बर्फ-ठंडा न हो जाए।
      नोट: यदि समाधान बर्फ-ठंडा नहीं है, तो गुंबद चढ़ाए जाने पर उचित संरचना को बनाए नहीं रखेगा। ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल गुंबदों को पाइप करते समय बुलबुले पेश करने से बचें, क्योंकि बुलबुले प्लेट तल के उचित पालन को रोकेंगे।
    10. सेल पेलेट को निलंबित करने के लिए 600 μL आइस-कोल्ड ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल जोड़ें और 200 μL पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
    11. इनक्यूबेटर से 24-वेल प्लेट को निकालें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस प्लेट गर्म पर रखें। ईसीएम-आधारित हाइड्रोजेल मिश्रण का 50 μL बर्फ-ठंडा HOGMY / ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल मिश्रण 24-वेल कल्चर प्लेट (50 μL प्रति गुंबद) के 24 कुओं के केंद्र में है।
    12. एक बार चढ़ाए जाने के बाद, गुंबदों को 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस प्लेट पर गर्म बैठने दें ताकि प्लेट के निचले हिस्से का पालन किया जा सके। प्लेट को सावधानीपूर्वक उलटा करें, सुनिश्चित करें कि प्लेट के तल पर कोई संघनन जमा नहीं हुआ है, और इनक्यूबेटर में उल्टे प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।
    13. 15 मिनट के बाद, प्लेट को दाईं ओर घुमाएं और प्रत्येक कुएं में कमरे के तापमान एचओजीएमआई के 750 μL को पिपेट करें।
      नोट: पिपेट मीडिया धीरे-धीरे कुओं की साइडवॉल पर, नवगठित 3 डी ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल गुंबद को बाधित न करने के लिए सावधान रहें।
    14. एक बार जब सभी कुएं मीडिया से भर जाते हैं, तो प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और 750 μL HOGM के साथ हर 3 दिनों में मीडिया को बदलें। हर 7-10 दिनों में मार्ग प्रवेश करता है।
  3. आंतों में प्रवेश करने वाला
    नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल 1: 2 की विभाजित दर पर एनएचपी एंटरोइड युक्त एक 24-वेल कल्चर प्लेट के लिए है।
    1. प्रत्येक कुएं से एंटरॉइड मीडिया को हटा दें, सावधानी बरतें कि एंटरोइड युक्त ईसीएम गुंबद को बाधित न करें, 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में 500 μL बर्फ-ठंडा सेल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    2. मैन्युअल रूप से 8-12x ऊपर और नीचे पाइप करके ईसीएम को बाधित करें। 12 कुओं की सामग्री को एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. एक बार जब सभी समाधान 24-वेल कल्चर प्लेट से एकत्र हो जाते हैं, तो प्रत्येक कुएं में 250 μL सेल व्यवधान अभिकर्मक जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी एनएचपी एंटरोइड्स को प्रत्येक कुएं से हटा दिया गया है, इस अंतिम कुल्ला को मौजूदा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में जोड़ें।
    4. कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए 40 आरपीएम पर एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर रखें। वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों को मैन्युअल रूप से हिलाएं।
    5. 15 मिनट के बाद, सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। 15 एमएल ट्यूबों से सुपरनैटेंट को तब तक हटा दें जब तक कि केवल गोली न रह जाए।
    6. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 8 एमएल बर्फ-ठंडा डीएमईएम + ब्रॉड-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि गोली पर्याप्त रूप से बाधित है। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    7. 600 μL HOGMY जोड़ें और 1,000 μL पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके गोली को बाधित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें जब तक कि घोल बर्फ-ठंडा न हो जाए। एक बार जब घोल बर्फ ठंडा हो जाता है, तो सेल पेलेट को निलंबित करने के लिए 600 μL आइस-कोल्ड ईसीएम जोड़ें और 1,000 μL पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं। चरण 1.3.2.-1.3.7 दोहराएँ। शेष 12 कुओं के लिए।
      1. शेष चरणों के लिए, चरण 1.2.11.-1.2.16 देखें।

2. एंटरॉइड मोनोलेयर और खरोंच घाव परख की स्थापना

  1. मीडिया और उपचार की तैयारी
    1. कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना 5 एमएल पीबीएस को बर्फ-ठंडा होने तक ठंडा करें।
    2. डीएमईएम/एफ12 के 500 एमएल (डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम/न्यूट्रिएंट हैम का मिश्रण एफ12 + 15 एमएम एचईपीईएस बफर) में 1 एमएल ब्रॉड-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स (100 μg/mL) जोड़कर DMEM-F12 वॉश बफर तैयार करें। बर्फ को ठंडा रखें।
    3. चरण 1.1.1 में वर्णित 100 एमएल एचओजीएमवाई तैयार करें, और इसे कमरे के तापमान पर बेंचटॉप पर गर्म करें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 0.25% ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 25 एमएल गर्म करें।
    5. सेल उपचार के लिए एचए 35 की 50 μg / mL, 100 μg / mL, और 200 μg / mL सांद्रता तैयार करें, एक विलायक के रूप में कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना बाँझ पीबीएस का उपयोग करें। HA35 का अंतिम कमजोर पड़ने पर विलायक के रूप में HOMGY का उपयोग किया जाएगा।
      नोट: एचए 35 तैयारी के लिए कई कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि एचए 35 अक्सर 5 मिलीग्राम / एमएल से अधिक एकाग्रता पर समाधान से बाहर आता है।
  2. एंटरॉइड मोनोलेयर गठन
    नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एंटरोइड मोनोलेयर की एक 24-वेल प्लेट की पीढ़ी के लिए पर्याप्त मात्रा प्रदान करती है। मोनोलेयर की वांछित संख्या के लिए वॉल्यूम समायोजित करें।
    1. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर रात भर ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल बीएमई (फिनोल रेड-फ्री) के 96 μL पिघलें। कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना बर्फ-ठंडे पीबीएस में 1: 50 के अनुपात में ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल को पतला करें। 200 μL बर्फ-ठंडा पतला ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल के साथ 24-अच्छी तरह से ऊतक संवर्धन प्लेट के प्रत्येक कुएं को कोट करें।
    2. ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल-लेपित प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर न्यूनतम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। 24-वेल कल्चर प्लेट से एस्पिरेटेड मीडिया जिसमें मोनोलेयर के लिए नियत 3 डी एंटरोइड होते हैं और सेल पृथक्करण अभिकर्मक / कुएं के 500 μL के साथ प्रतिस्थापित होते हैं।
    3. मैन्युअल रूप से ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल गुंबदों को 8x-12x ऊपर और नीचे पाइप करके बाधित करें और 12 कुओं की सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. 12 खाली कुओं को 250 μL सेल पृथक्करण अभिकर्मक के साथ धोएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी एंटरोइड्स को हटा दिया गया है और सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित किया गया है। चरण 2.2.5 दोहराएँ। और चरण 2.2.6. शेष 12 कुओं के लिए एक दूसरे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करके।
    5. शंक्वाकार ट्यूबों को 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 10 एमएल बर्फ-ठंडा डीएमईएम-एफ 12 वॉश बफर जोड़ें और ट्यूबों को उलटकर एंटरॉइड छर्रों को निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    6. सुपरनैटेंट को हटा दें और सेल छर्रों को 37 डिग्री सेल्सियस ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 12 एमएल में फिर से निलंबित करें। ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए रखें या जब तक कोशिकाएं घुलनशील न दिखाई दें। ट्रिप्सिन-ईडीटीए को पतला करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 3 एमएल डीएमईएम-एफ 12 वॉश बफर जोड़ें, ट्यूबों को इनवर्ट करके मिलाएं, और बर्फ पर रखें।
    7. 37 μM जाल सेल छन्नी के माध्यम से विघटित एंटरोइड्स को फ़िल्टर करें, सामग्री को साफ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में एकत्र करें। ट्यूबों को 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. जबकि कोशिकाएं सेंट्रीफ्यूज में पेलेटिंग कर रही हैं, इनक्यूबेटर से ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल-लेपित प्लेट को हटा दें और लेपित सतह को खरोंचे बिना या प्लेट को पूरी तरह से सूखने दिए बिना किसी भी अतिरिक्त ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल समाधान को एस्पिरेट करें।
    9. शंक्वाकार ट्यूबों से सुपरनैटेंट को हटा दें और 6 एमएल एचओएमजीवाई के साथ सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। लगभग 3 x 10 5 कोशिकाओं / कुएं के सीडिंग घनत्व पर ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल के साथ लेपित 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में संयुक्त 12 एमएल एचओएमजीवाई सेल सस्पेंशन का500 μL जोड़ें। कुओं के भीतर कोशिकाओं के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए एक ढक्कन के साथ प्लेट को घुमाएं।
    10. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट करें, हर 2 दिनों में एचओएमजीवाई मीडिया का आदान-प्रदान करें जब तक कि मोनोलेयर >90% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।
  3. मोनोलेयर उपचार और खरोंच घाव परख
    1. एक बार जब मोनोलेयर >90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं, तो संलग्न करने में विफल होने वाली किसी भी कोशिका को हटाने के लिए मीडिया को उत्तेजित किया जाता है। 24 घंटे के लिए एचओएमजीवाई में घुले एचए 35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) या PBS के 500 μL के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    2. 24 घंटे के बाद, मोनोलेयर की सतह को बाधित न करने के लिए सावधान रहते हुए मीडिया को हटा दें। 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में मोनोलेयर के पूर्ण सतह व्यास में एक रैखिक खरोंच बनाएं, सावधान रहें कि मोनोलेयर को सूखने न दें।
    3. खरोंच वाले मोनोलेयर को 1x PBS के 500 μL के साथ 1x धोएं। एचओएमजीवाई में घुले एचए35 के 500 μL (50 μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) या PBS जोड़ें और प्लेट को 37 °C और 5% CO2 इनक्यूबेटर के भीतर लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण (सामग्री तालिका) में स्थानांतरित करें।
    4. लाइव-सेल विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) में अनुसूची आइकन के तहत, लॉन्च ऐड न्यू वेसल विज़ार्ड आइकन पर क्लिक करें और शेड्यूल पर स्कैन करने के लिए स्कैनिंग आवृत्ति सेट करें। स्कैन प्रकार के तहत एक नया होल वेल पोत बनाएं, स्कैन सेटिंग्स निर्दिष्ट करें (यानी, छवि चैनलों के लिए चरण और उद्देश्य के लिए 4x), और अगला पर क्लिक करें।
    5. प्रदान की गई सूची से प्लेट निर्माता और कैटलॉग संख्या का चयन करें। अनुसूची आइकन के तहत, प्लस प्रतीक चुनें जहां प्लेट को लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण के भीतर रखा जाएगा। वांछित स्कैन पैटर्न का चयन करें, और फिर प्लेट लेआउट पृष्ठ पर "+" का चयन करके एक प्लेट मानचित्र बनाएं। बाद तक का विश्लेषण स्थगित करें का चयन करें, और फिर 24 घंटे के लिए प्रत्येक 4 घंटे के लिए स्कैनिंग शेड्यूल सेट करें और वेसल विज़ार्ड सारांश पृष्ठ के तहत अधिग्रहण सेटिंग्स सत्यापित करें। अंत में, शेड्यूल में जोड़ें का चयन करें.
    6. एक बार 24 परख पूरी हो जाने के बाद, व्यू आइकन के तहत, वेसल नाम पर डबल-क्लिक करें, और छवियों और फिल्मों का निर्यात करें। जेपीईजी के रूप में प्रदर्शित और निर्यात करने के लिए कुओं और छवियों की एक श्रृंखला का चयन करें। चरण 2.4 के अनुसार, इमेजजे21 के लिए घाव भरने के आकार प्लगइन का उपयोग करके प्रतिशत घाव भरने के लिए छवियों का विश्लेषण करें। नीचे।
  4. खरोंच घाव विश्लेषण
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर खोलें। खरोंच घाव परख छवियों को अपलोड करें (। टीआईएफएफ या .JPG)।
    2. छवि > > 24-बिट RGB से 8-बिट में बदलने के लिए 8-बिट टाइप करें। घाव भरने आकार प्लगइन स्थापित करने के लिए मैक्रोज़ > प्लगइन्स का चयन करके घाव भरने > आकार प्लगइन स्थापित > >।
    3. छवि को घुमाएं ताकि खरोंच ऊर्ध्वाधर हो और घाव हीलिंग आकार टूल प्लगइन को प्रारंभ करें।
    4. खरोंच घाव को सर्वोत्तम रूप से फिट करने के लिए संवाद बॉक्स में प्लगइन पैरामीटर का चयन करें। घाव भरने के आकार विकल्पों के लिए मापदंडों का मान निम्नानुसार सेट करें: 20 पर विचरण विंडो त्रिज्या, 100 पर थ्रेशोल्ड मान, और 0.001 पर संतृप्त पिक्सेल का प्रतिशत, और सेट स्केल ग्लोबल के लिए हाँ चुनें। ओके बटन पर क्लिक करके चयन को अंतिम रूप दें। सत्यापित करें कि चयनित क्षेत्र घाव क्षेत्र है या नहीं. उपरोक्त मापदंडों को प्रयोगशाला से प्रयोगशाला में मानकीकरण की आवश्यकता हो सकती है।
    5. चरण 2.4.2.-2.4.4 दोहराएँ। प्रत्येक खरोंच के लिए शेष समय बिंदुओं के लिए।
    6. 24 घंटे से अधिक माइग्रेटिंग या प्रसार कोशिकाओं के खरोंच क्षेत्र घाव भरने के प्रतिशत की गणना निम्नानुसार करें:
      % घाव भरना = Equation 1
      जहां T0 = समय 0 h पर % क्षेत्रफल और Tc = % क्षेत्रफल 0 h, 4 h, 12 h, या 24 h पर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विभिन्न ऊतकों और अंगों में ऊतक की मरम्मत और घाव भरने पर एचए के प्रभाव अच्छी तरह से प्रलेखित हैं; हालांकि, भ्रूण या नवजात छोटे आंतों के उपचार और पुनर्जनन पर 35 केडीए के आणविक भार के साथ एचए के विशिष्ट प्रभाव वर्तमान में अज्ञात हैं। भ्रूण या नवजात छोटी आंत के एक मॉडल में घाव भरने को बढ़ावा देने के लिए एचए 35 की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, हमने एनएचपी इलल ऊतक से 3 डी आंतों के एंटरोइड उत्पन्न किए और 2 डी एंटरोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर बनाने के लिए इस ऊतक को एकल कोशिकाओं में अलग कर दिया (चित्रा 1 ए, बी)। मोनोलेयर को कंफ्लुएंसी के लिए उगाया गया था और पी 200 पिपेट टिप (चित्रा 1 बी, सी) का उपयोग करके मैन्युअल रूप से खरोंच किया गया था। मोनोलेयर को तब HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) या नियंत्रण (PBS) के साथ इलाज किया गया था। लाइव-सेलइमेजिंग 22 के लिए सुसज्जित संचारित-प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कुल 24 घंटे के लिए हर 4 घंटे में सेल माइग्रेशन और प्रसार को चित्रित किया गया था। घाव बंद होने की दर, सेल माइग्रेशन की गति का एक उपाय, घाव भरने के आकार प्लगइन21 (चित्रा 2) का उपयोग करके घाव भरने के प्रतिशत घाव भरने के रूप में इमेजजे का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। खरोंच क्षेत्र और सेल माइग्रेशन की दर और घाव बंद होने का प्रतिशत 24 घंटे (चरण 2.4.6.) से अधिक मापा गया था। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, एचए 35 के संपर्क में आने से सेल माइग्रेशन / प्रसार की खुराक और समय-निर्भर उत्तेजना हुई, जिससे घाव बंद हो गया। 100 μg / mL और 200 μg / mL पर HA35 ने 4 घंटे और 12 घंटे (* p < 0.05) दोनों पर नियंत्रण के सापेक्ष उपचार में ~ 1.5-2.5 गुना की वृद्धि की।

Figure 1
चित्र 1. एंटरॉइड पीढ़ी और एंटरोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर घाव भरने परख प्रक्रिया। (ए) त्रि-आयामी गैर-मानव प्राइमेट आंतों के एंटरोइड्स की संस्कृति (बी) दो-आयामी मोनोलेयर में विघटित होने के लिए उपयोग की जाती है। (ग) मोनोलेयर को 24-वेल प्लेट में >90% संगम के लिए उगाया गया था और फिर 24 घंटे के लिए हाइलूरोनिक एसिड 35 केडीए या फॉस्फेट-बफर्ड खारा के साथ इलाज किया गया था। मोनोलेयर को तब पी 200 पिपेट टिप के साथ खरोंच दिया गया था। स्केल बार = 800 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. घाव भरने परख छवियां और विश्लेषण। हायलूरोनिक एसिड 35 केडीए (100 μg / mL, 200 μg / mL) की प्रतिनिधि छवियां और गैर-मानव प्राइमेट एंटरॉइड मोनोलेयर के नियंत्रण उपचार। पी 200 पिपेट टिप के साथ खरोंच करने के बाद छवियां 0 घंटे, 4 घंटे, 12 घंटे, 16 घंटे और 24 घंटे पर प्राप्त की गईं। लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण के साथ छवियों को 4x आवर्धन पर लिया गया था और घाव भरने के आकार प्लगइन का उपयोग करके इमेजजे में विश्लेषण किया गया था। प्रतिशत घाव भरने की गणना 24 घंटे से अधिक माइग्रेटिंग / प्रोलिफ़ेरिंग कोशिकाओं से की गई थी। स्केल बार = 800 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. एंटरॉइड मोनोलेयर में घाव भरने पर हाइलूरोनिक एसिड 35 केडीए (एचए 35) का प्रभाव। एंटरॉइड मोनोलेयर में समय के साथ घाव भरने में परिवर्तन, एचए 35 उपचार एकाग्रता पर निर्भर करता है। एचए 35 ने नियंत्रण की तुलना में 4 घंटे और 12 घंटे के बाद घाव भरने में काफी वृद्धि की, लेकिन उपचार दर 24 घंटे तक उपचार के बीच अभिसरण हुई। महत्व का मूल्यांकन * पी < 0.05 पर छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था, जिसे औसत (एसईएम) (एन = 6 कुएं प्रति उपचार) की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक अपरिपक्व शिशु का जठरांत्र संबंधी मार्ग डिस्बिओसिस, भड़काऊ जीवाणु मेटाबोलाइट्स और विषाक्त पदार्थों और आंतरायिक हाइपोक्सिया23,24 से जुड़े पर्यावरणीय अपमान के बार-बार जोखिम से लगातार पुनर्योजी दबाव में है। दुर्भाग्य से, अपरिपक्व शिशु की आंतों का उपकला तेजी से कार्यात्मक अखंडता23 स्थापित करने में असमर्थ है, जिसके परिणामस्वरूप बाधा शिथिलता, आंतों की पारगम्यता में वृद्धि, और, गंभीर मामलों में, बड़े पैमाने पर आंतों की सूजन और एनईसी विकास होता है।

ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स (जीएजी) मानव दूध में प्रचलित पॉलीसेकेराइड का एक वर्ग है, जो एनईसी15,16 के विकास से बचाने वाले संभावित बायोएक्टिव कारक हैं। एचए ग्लुकुरोनिक एसिड और एन-एसिटाइलग्लूकोसामाइन25,26 के डिसैकराइड को दोहराने का एक रैखिक बहुलक है जो हायलूरोनन सिंथेस द्वारा निर्मित होता है। एचए में आकार और ऊतक वातावरण27,28 के आधार पर या तो समर्थक या विरोधी भड़काऊ गुण हो सकते हैं। आंत और बृहदान्त्र में, अंतर्जात एचए क्रिप्ट उपकला कोशिकाओं से सटे बाह्य अंतरिक्ष में मौजूद है और उपकला प्रसार और सामान्य आंतों के विकासको 29,30,31 चलाता है। एचए भी एचएम में एक प्राकृतिक घटक है और स्तनपान30 के पहले हफ्तों के दौरान उच्चतम सांद्रता पर उत्पादित होता है। विशेष रूप से, एचएम या आणविक भार ~ 35 केडीए (एचए 35) के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचए से शुद्ध एचए विवो और विट्रो25,27 में कोलोनिक एपिथेलियम में रोगाणुरोधी β-डेफेंसिन और टीजे प्रोटीन जेडओ -1 की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर बैक्टीरिया-प्रेरित कोलाइटिस से बचाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, सभी विशिष्ट आकार के एचए (4.7 केडीए, 16 केडीए, 28 केडीए, 74 केडीए) के बीच, एचए 35 टीजे प्रोटीन और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड अभिव्यक्ति का सबसे शक्तिशाली प्रेरक है। इसके अलावा, बड़े मेगावाट एचए (~ 2,000 केडीए) टीजे प्रोटीन अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं डालता है, यह दर्शाता है कि ये प्रभाव आकार विशिष्ट32 हैं। हमने यह भी दिखाया कि एचए 35 का मौखिक प्रशासन छोटी आंतों की परिपक्वता को तेज करता है, उपकला प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देता है, और एनईसी16 के विकास से बचाता है। यहां, घाव भरने को बढ़ावा देने के लिए एचए 35 की क्षमता का परीक्षण इन विट्रो स्क्रैच घाव भरने परख का उपयोग करके किया जाता है। ऊपर वर्णित मॉडलों का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि एचए 35 नियंत्रण की तुलना में 4 घंटे और 12 घंटे के बाद एकाग्रता-निर्भर तरीके से घाव को बंद करने में तेजी लाता है, आंतों के घाव भरने और ऊतक की मरम्मत पर विशेष रूप से आकार के एचए के प्रभावों पर ज्ञान में एक महत्वपूर्ण अंतर को स्पष्ट करता है और इस प्रकार, नवजात आंतों के घाव भरने में एचए 35 की लाभकारी भूमिका की पुष्टि करता है। यद्यपि जिस तंत्र द्वारा एचए 35 इस प्रभाव को लागू करता है, वह अज्ञात है, माउस पिल्ले में लेखकों के पिछले डेटा से पता चला है कि रैपामाइसिन (एमटीओआर) कॉम्प्लेक्स 1 (एमटीओआरसी 1) मार्ग का यांत्रिक लक्ष्य एचए 35 उपचार16 के बाद इलेल ऊतकों में अनियंत्रित था। इन देखे गए प्रभावों के लिए इस मार्ग के योगदान को निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

आंतों के पुनर्जनन, उपचार और मरम्मत को बढ़ावा देने वाले हस्तक्षेपों की जांच के लिए कई इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया गया है। आंतों के घाव और बाद की मरम्मत के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला इन विट्रो परख खरोंच घाव परख है, जो आमतौर पर कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) सेल मोनोलेयर33,34 में किया जाता है। प्रीटरम शिशु आंत के लिए इस तरह के मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता, हालांकि, सीमित है, क्योंकि सीआरसी कोशिकाओं की घाव की मरम्मत स्टेम सेल-संचालित मरम्मत प्रक्रियाओं के बजाय कैंसर कोशिकाओं की अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव प्रकृति पर बहुत अधिक निर्भर करतीहै। आंतों के उपकला के क्रिप्ट से प्राप्त एंटरोइड्स को अलग करने और बनाए रखने की हालिया क्षमता प्रतिरक्षा या हानिकारक उत्तेजनाओं की भीड़ के साथ-साथ संभावित चिकित्सीयहस्तक्षेपों के लिए अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक आंतों की प्रतिक्रिया का पता लगाने का अवसर प्रदान करती है। एंटरोइड्स में आंतों के खंड में पाए जाने वाले सभी विभेदित उपकला कोशिका प्रकार होते हैं, जिनसे वे प्राप्त होते हैं, इस प्रकार आंतों की बाधा क्षति का अध्ययन करने और36,37,38 की मरम्मत के लिए एक प्रभावी मॉडल के रूप में कार्य करते हैं।

यहां वर्णित आंतों के उपकला क्षति के इन विट्रो एंटरॉइड मॉडल की स्थापना और रखरखाव और प्रीटरम एनएचपी से इलियम का उपयोग करके मरम्मत है। यह मॉडल उपकला उपचार और पुनर्जनन में शामिल यांत्रिक मार्गों और चिकित्सीय हस्तक्षेपों की जांच के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एक समान चौड़ाई के साथ एक अच्छी तरह से परिभाषित अंतर का निर्माण है, जो अच्छी तरह से भिन्नता को कम करता है। इसके अलावा, मोनोलेयर को खरोंचते समय, पिपेट टिप को सेल परत को साफ करने के लिए कुएं के तल के साथ निरंतर संपर्क बनाए रखना चाहिए। घाव के किनारों के "उठाने" को रोकने के लिए अत्यधिक दबाव से बचा जाना चाहिए। इसी तरह, घाव के बाद पीबीएस धोने के चरण को कुएं के साइडवॉल का उपयोग करके धीरे से किया जाना चाहिए, ताकि शेष मोनोलेयर को नुकसान या घाव के अंतर के अतिरिक्त चौड़ीकरण से बचा जा सके। अंत में, प्लेट को विस्तारित अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखने से बचना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्लेट पर ईसीएम कोटिंग जेल जैसी बनी रहे और ईसीएम चिपचिपाहट परिवर्तनों के कारण मोनोलेयर बाधित न हो।

हालांकि इस मॉडल में पारंपरिक सेल संस्कृति पर अलग-अलग फायदे हैं, लेकिन यह सीआरसी मोनोलेयर में पारंपरिक घाव भरने वाली परख की तुलना में तकनीकी रूप से अधिक मांग, महंगा और समय लेने वाला है। इसके अलावा, उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों और मीडिया में स्थिरता इन संस्कृतियों के अस्तित्व और उचित रखरखाव को सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण है, जैसा कि उचित तापमान पर कोशिकाओं, अभिकर्मकों और ईसीएम को बनाए रखना है। अंत में, प्राथमिक छोटे आंतों के मोनोलेयर कुख्यात रूप से अल्पकालिक होते हैं, इसलिए यहां वर्णित घाव परख को मोनोलेयर कंफ्लुएंसी प्राप्त होने के तुरंत बाद आयोजित किया जाना चाहिए।

एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि छोटे आंतों के एंटरोइड मोनोलेयर का उपयोग घाव के बाद सेल माइग्रेशन और प्रसार की प्रक्रियाओं के माध्यम से आंतों के उपकला पुनर्जनन की जांच के लिए एक नए मॉडल के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, एंटरोइड्स विभेदित आंतों की कोशिका व्यवहार्यता पर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए बहुत अधिक शारीरिक रूप से ट्रांसलेटेबल ऊतक प्रदान करते हैं। इस तरह के मॉडल उपकला मरम्मत को विनियमित करने वाले तंत्र को विच्छेदित करने और नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान में सहायता करने के लिए एक मंच प्रदान कर सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। उच्च न्यायालय को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान पी 20 जीएम 134973 द्वारा समर्थित किया गया है। केबी को बच्चों के अस्पताल फाउंडेशन (सीएचएफ) और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन (पीएचएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। कैंसर फंक्शनल जीनोमिक्स कोर द्वारा प्रदान की गई लाइव-सेल इमेजिंग सेवाओं को आंशिक रूप से नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज ग्रांट पी 20जीएम 103639 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट ग्रांट पी 30सीए 225520 द्वारा समर्थित किया गया था, जो ओक्लाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र स्टीफेंसन कैंसर सेंटर विश्वविद्यालय को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological Pipet Fisher Scientific 13-675-49
100x21mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 172931
15 mL Conical tube VWR 89039-666
24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate Corning 3524
37 µM Reversible Cell Strainer STEMCELL Technologies 27215
50 mL Conical tube VWR 89039-658
70 µm Sterile Cell Strainers Fisher Scientific FB22-363-548
Albumin, Bovine (BSA) VWR 0332-100G
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 100-0485
ImageJ NIH imagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument Sartorius 4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module Sartorius 9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010 This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free Corning 356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate ThermoFisher Scientific 136101
PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Primocin Invivogen ant-pm-1 This is broad-spectrum antibiotics
Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K Lifecore Biomedical HA20K-1
TC20 Automated Cell Counter Company: Bio-Rad 1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin Fisher Scientific MT25053CI
Y-27632 STEMCELL Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
  2. Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
  3. Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
  4. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  5. Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
  6. He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
  7. Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
  8. Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
  9. vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
  10. Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
  11. Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
  12. Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
  13. Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
  14. Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
  15. Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
  16. Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
  17. Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
  18. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  19. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
  20. Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
  21. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
  22. Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
  23. de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
  24. Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
  25. Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
  26. Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
  27. Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
  28. Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
  29. Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
  30. Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
  31. Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
  32. Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
  33. Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
  34. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  35. Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
  36. Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
  37. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  38. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).

Tags

चिकित्सा अंक 185
एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर का उपयोग करके अपरिपक्व छोटी आंतों की चोट और उपचार के <em>इन विट्रो</em> मॉडल पर हायलूरोनिक एसिड 35 केडीए का प्रभाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, A., Burge, K., Eckert, J.,… More

Wilson, A., Burge, K., Eckert, J., Chaaban, H. Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers. J. Vis. Exp. (185), e63758, doi:10.3791/63758 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter