Summary
Этот протокол описывает метод установления и выполнения анализа раны царапин на двумерных (2D) монослоях, полученных из трехмерных (3D) энтероидов, выделенных из подвздошной кишки приматов нечеловеческих.
Abstract
Анализы раны с царапинами in vitro обычно используются для изучения механизмов и характеристик заживления эпителия в различных типах тканей. Здесь мы описываем протокол для генерации двумерного (2D) монослоя из трехмерных (3D) энтероидов нечеловеческих приматов, полученных из кишечных крипт терминальной подвздошной кишки. Эти монослои, полученные из энтероидов, затем использовались в анализе in vitro для проверки способности гиалуроновой кислоты 35 кДа (HA35), имитации ГК грудного молока, способствовать миграции и пролиферации клеток вдоль края эпителиальной раны. После того, как монослои были выращены до слияния, их вручную царапали и обрабатывали HA35 (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл) или контрольным (PBS). Миграция и пролиферация клеток в щель были визуализированы с помощью микроскопа с передаваемым светом, оборудованного для визуализации живых клеток. Закрытие раны было количественно определено как процент заживления ран с помощью плагина Wound Healing Size Plugin в ImageJ. Площадь царапин и скорость миграции клеток и процент закрытия раны были измерены в течение 24 ч. HA35 in vitro ускоряет заживление ран в тонкокишечных энтероидных монослоях, вероятно, за счет комбинации пролиферации клеток на краю раны и миграции в раневую область. Эти методы потенциально могут быть использованы в качестве модели для изучения кишечной регенерации в недоношенном тонком кишечнике человека.
Introduction
Некротизирующий энтероколит (НЭК) является одним из наиболее распространенных желудочно-кишечных чрезвычайных ситуаций у недоношенных детей1. Заболевание характеризуется сильным воспалением кишечника, которое может быстро ухудшиться до некроза кишечника, сепсиса и потенциально смерти. Хотя этиология неясна, данные свидетельствуют о том, что NEC является многофакторным и результатом сложного взаимодействия кормления, аномальной бактериальной колонизации и незрелого кишечного эпителия 2,3. Недоношенные дети имеют повышенную проницаемость кишечника, аномальную бактериальную колонизацию и низкую регенеративную способность энтероцитов 4,5, что увеличивает риск дисфункции кишечного барьера, бактериальной транслокации и развития NEC. Поэтому определение стратегий или вмешательств для ускорения созревания эпителия кишечника и содействия регенерации или заживлению кишечного эпителия имеет решающее значение для предотвращения этого смертельного заболевания.
Исследования показали, что грудное молоко (ГМ) защищает от НЭК у недоношенных детей 6,7,8,9,10,11. Исследования на людях и животных показали, что формула на основе крупного рогатого скота увеличивает проницаемость кишечника и напрямую токсична для эпителиальных клеток кишечника 2,12. Хотя они не полностью выяснены, данные свидетельствуют о том, что защитные эффекты HM опосредованы биологически активными компонентами, такими как лактоферрин, иммуноглобулин A (IgA) и олигосахариды HM13. HM также богат гиалуронаном (HA), уникальным несульфатированным гликозаминогликаном с повторяющейся D-глюкуроновой кислотой и N-ацетил-D-глюкозаминовыми дисахаридами14,15. Важно отметить, что мы показали, что пероральный прием 35 кДа ГК (HA35), имитирующий HM HA, ослабляет тяжесть повреждения кишечника, предотвращает бактериальную транслокацию и снижает смертность в мышиной NEC-подобной модели кишечного повреждения16,17.
Здесь дополнительно исследуется влияние HA35 на заживление и регенерацию кишечника in vitro. В настоящее время наиболее широко используемым анализом in vitro для ранирования и восстановления кишечника является анализ царапины на ране, выполняемый в монослоях клеток колоректального рака (CRC). Физиологическая значимость такой модели для кишечника недоношенных детей ограничена, поскольку восстановление ран CRC-клеток в значительной степени зависит от высокопролиферативной природы раковых клеток, а не от процессов восстановления, управляемых стволовыми клетками18. Чтобы преодолеть это ограничение, здесь описано создание 2D-модели энтероидной царапины раны, включая процедуру выделения и поддержания первичных энтероидов тонкой кишки, полученных из стволовых клеток, от недоношенных нечеловеческих приматов (NHP). Учитывая, что преждевременный НЭК чаще всего сообщается в дистальной тонкой кишке, использование первичных органоидов эпителиальных клеток в модели повреждения и восстановления кишечника обеспечивает более физиологически переводимую модель in vitro по сравнению с существующими моделями, использующими традиционные колоректальные монослои18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Центра медицинских наук Университета Оклахомы. После институционального одобрения после эвтаназии были получены образцы тонкой кишки плода от недоношенного нечеловеческого примата (NHP, 90% беременности, оливковый бабуин, Papio anubis) для отдельного исследования (Протокол No 101523-16-039-I)20.
1. Установление недоношенных нечеловеческих приматов 3D кишечных энтероидов
- Подготовка СМИ
ПРИМЕЧАНИЕ: Носители могут быть подготовлены за 1 неделю до изоляции крипты по стандартной асептической технике. Пенициллин/стрептомицин (конечная концентрация 1%) при желании может быть использован вместо антибиотиков широкого спектра действия для первичных клеток.- Получают человеческую органоидную питательную среду + Y-27632 (HOGMY), смешивая 50 мл органоидной среды роста человеческой базальной среды с 50 мл органоидной добавки (Таблица материалов). Добавьте 200 мкл антибиотиков широкого спектра действия (конечная концентрация 100 мкг/мл) (Таблица материалов) и Y-27632 (до конечной концентрации 10 мкМ). Согреть на столешнице до комнатной температуры.
- Приготовьте органоидную питательную среду человека (HOGM), смешав 50 мл органоидной среды роста человека с 50 мл органоидной добавки. Добавьте 200 мкл антибиотиков широкого спектра действия (100 мкг/мл). Согреть на столешнице до комнатной температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: HOGM будет использоваться при смене носителя после первых 2-3 дней после прохождения. - Охладите 100 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) без кальция или магния до ледяного холода.
- Приготовьте 50 мл промывочного буфера, объединив 1x PBS без кальция или магния с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Охладите до ледяного остывания.
- Подготовьте промывочный буфер DMEM-F12, добавив 1 мл антибиотиков широкого спектра действия (100 мкг/мл) к 500 мл DMEM/F12 (модифицированная смесь Dulbecco Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mix F12 + 15 мМ HEPES буфер). Держите его ледяным.
- Изоляция и покрытие крипт
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель на основе внеклеточного матрикса (ECM) должен оставаться на льду в течение всей процедуры. Эта процедура предполагает достаточное количество ткани для заполнения шести куполов гидрогеля на основе ECM. Если собрана другая плотность склепов, номер купола должен быть изменен соответствующим образом.- Оттаивание 150 мкл экстракта базальной мембраны с пониженным фактором роста (СКФ) (BME) (без фенола красного цвета) в течение ночи на льду при 2-8 °C.
- Инкубируйте 24-луночную полистирольную пластину с плоским дном, обработанную культурой тканей, в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение как минимум 30 мин перед использованием.
- После эвтаназии NHP и сбора тканей промывайте подвздошный сегмент мусора наконечником пипетки объемом 1000 мкл, используя ледяной 1x PBS в одноразовой чашке Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие ткани должны быть собраны быстро и сохранены ледяными, чтобы собрать здоровые энтероиды. - Вырежьте подвздошную кишку продольно по всему кишечнику, и промойте ледяным PBS 3x. Измельчите ткань на мелкие фрагменты (длиной около 2 мм) стерильными ножницами над конической трубкой объемом 50 мл, содержащей 15 мл ледяного PBS, начиная с части подвздошного сегмента, ближайшей к трубке.
- Используйте серологическую пипетку объемом 10 мл, чтобы разрушить крипты, пипетируя вверх и вниз 5-10x. Дайте сегментам ткани осесть на дне трубки, затем удалите супернатант и замените его свежим, ледяным PBS. Повторяйте этот процесс минимум 7x-10x до тех пор, пока супернатант не станет чистым и свободным от мусора.
- После очистки удалите супернатант и повторно суспендируйте крипты в 25 мл реагента диссоциации клеток. Поместите трубку на качающуюся платформу при 20 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Извлеките трубку из коромысла, дайте ячейкам осесть примерно от 30 с до 1 мин и удалите супернатант. Добавьте 10 мл ледяного промывочного буфера. Пипетка вверх и вниз с пипеткой p1000 для дальнейшего разделения на одиночные крипты.
- Отфильтруйте ткань через клеточный ситечко 70 мкм в новую коническую трубку объемом 50 мл. Промойте оригинальную коническую трубку объемом 50 мл с 10 мл ледяного буфера для промывки и отфильтруйте через ситечко 70 мкм, чтобы убедиться, что все крипты были удалены из оригинальной трубки. Повторите это промывание ткани в общей сложности 4x полосканий.
- Центрифугируют фильтрат при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют супернатант. Добавьте 600 мкл HOGMY и разрушайте гранулы, пипеткой вверх и вниз пипеткой 200 мкл. Поместите трубку на лед до тех пор, пока раствор не станет ледяным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор не ледяной, купол не будет поддерживать надлежащую структуру при покрытии. Избегайте введения пузырьков при пипетке гидрогелевых куполов на основе ECM, так как пузырьки будут препятствовать правильному прилипанию к дну пластины. - Добавьте 600 мкл ледяного гидрогеля на основе ECM, чтобы суспендировать гранулу ячейки и хорошо перемешать с пипеткой 200 мкл.
- Извлеките 24-луночную пластину из инкубатора и поместите ее на более теплую плиту с температурой 37 °C. Пипетка 50 мкл ледяной гидрогелевой смеси на основе HOGMY/ECM в центр 24 скважин 24-луночной культуральной плиты (50 мкл на купол).
- После покрытия дайте куполам посидеть на плите с температурой 37 °C в течение 1 минуты, чтобы обеспечить прилипание к нижней части пластины. Осторожно переверните пластину, убедитесь, что на дне пластины не накопилась конденсат, и поместите перевернутую пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
- Через 15 мин переверните пластину правой стороной вверх и пипетку по 750 мкл комнатной температуры HOGMY в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетки медленно попадают на боковину скважин, стараясь не нарушить вновь образованный гидрогельовый купол на основе 3D ECM. - После того, как все колодцы будут заполнены средой, поместите пластину в инкубатор и меняйте среду каждые 3 дня на 750 мкл HOGM. Прохождение энтероидов каждые 7-10 дней.
- Кишечное энтероидное пассажирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для одной 24-луночной культуральной пластины, содержащей энтероиды NHP со скоростью расщепления 1:2.- Удалите энтероидную среду из каждой лунки, стараясь не нарушить купол ECM, содержащий энтероиды, добавьте 500 мкл реагента диссоциации ледяных клеток в каждую лунку, используя пипетку 1000 мкл, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Вручную нарушайте ECM, пипетируя вверх и вниз 8-12x. Перенесите содержимое 12 лунок в одну коническую трубку объемом 15 мл.
- После того, как весь раствор был собран с 24-луночной культуральной пластины, добавьте 250 мкл реагента разрушения клеток в каждую лунку, чтобы убедиться, что все энтероиды NHP были удалены из каждой лунки, добавив эту последнюю промывку к существующим коническим трубкам объемом 15 мл.
- Поместите на качающуюся платформу при 40 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре (20 °C). Кроме того, вручную встряхните трубки в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Через 15 мин центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С. Удалите супернатант из пробирок объемом 15 мл до тех пор, пока не останется только гранула.
- Добавьте 8 мл ледяного DMEM + антибиотиков широкого спектра действия в одну коническую трубку объемом 15 мл, убедившись, что гранула достаточно разрушена. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
- Добавьте 600 мкл HOGMY и разрушайте гранулы, пипеткой вверх и вниз пипеткой объемом 1000 мкл. Поместите трубку на лед до тех пор, пока раствор не станет ледяным. Как только раствор станет ледяным, добавьте 600 мкл ледяного ECM, чтобы суспендировать ячейку гранулы и хорошо перемешайте с пипеткой 1000 мкл. Повторите шаги 1.3.2.-1.3.7. для остальных 12 скважин.
- Остальные этапы см. в разделах 1.2.11-1.2.16.
2. Создание энтероидного монослоя и анализа раны царапин
- Средства и подготовка к лечению
- Охладите 5 мл PBS без кальция или магния до ледяного холода.
- Подготовьте промывочный буфер DMEM-F12, добавив 1 мл антибиотиков широкого спектра действия (100 мкг/мл) к 500 мл DMEM/F12 (модифицированная смесь Dulbecco Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mix F12 + 15 мМ HEPES буфер). Держите лед холодным.
- Подготовьте 100 мл HOGMY, как описано на этапе 1.1.1., и нагрейте его на столе до комнатной температуры.
- Теплое 25 мл 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) на водяной бане с температурой 37 °C.
- Приготовьте концентрации 50 мкг/мл, 100 мкг/мл и 200 мкг/мл HA35 для обработки клеток, используя стерильный PBS без кальция или магния в качестве растворителя. При окончательном разбавлении HA35 в качестве растворителя будет использоваться HOMGY.
ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат HA35 может потребовать нескольких разведений, так как HA35 часто выходит из раствора в концентрации более 5 мг/мл.
- Образование энтероидного монослоя
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура обеспечивает объемы, достаточные для генерации одной 24-луночной пластины энтероидных монослоев. Отрегулируйте громкость для нужного количества монослоев.- Разморозить 96 мкл гидрогеля BME на основе ECM (без фенола красного цвета) на ночь на льду при 2-8 °C. Разбавлять гидрогель на основе ECM в ледяном PBS без кальция или магния в соотношении 1:50. Покройте каждую лунку 24-луночной пластиной для культивирования тканей 200 мкл разбавленного гидрогеля на основе ECM.
- Инкубируйте пластину с гидрогелевым покрытием на основе ECM в течение не менее 1 ч при 37 °C и 5% CO2. Аспиратные среды из 24-луночной культуральной пластины, содержащей 3D-энтероиды, предназначены для монослоев и заменяют 500 мкл реагента диссоциации клеток/лунки.
- Вручную разрушайте гидрогелевые купола на основе ECM путем пипетки вверх и вниз 8x-12x и переноса содержимого 12 скважин в коническую трубку объемом 15 мл.
- Промыть 12 пустых лунок 250 мкл реагента диссоциации клеток, чтобы убедиться, что все энтероиды были удалены, и перенесите содержимое в коническую трубку объемом 15 мл. Повторите шаг 2.2.5. и этап 2.2.6. для остальных 12 скважин используют вторую коническую трубу объемом 15 мл.
- Центрифугируйте конические трубки при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант. Добавьте 10 мл ледяного буфера для промывки DMEM-F12 в конические трубки объемом 15 мл и подвешивайте энтероидные гранулы путем инвертирования трубок. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 12 мл при 37 °C трипсина-ЭДТА. Поместите трубки в водяную баню с температурой 37 °C на 10 минут или до тех пор, пока клетки не станут растворимыми. Добавьте 3 мл промывочного буфера DMEM-F12 в каждый тюбик, чтобы разбавить трипсин-ЭДТА, перемешать, перевернув трубки, и поместить на лед.
- Фильтруйте диссоциированные энтероиды через сетчатый клеточный сетчатый сетчатый сетчатый фильтр 37 мкМ, собирая содержимое в чистые конические трубки объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Пока клетки гранулируются в центрифуге, удалите пластину с гидрогелевым покрытием на основе ECM из инкубатора и аспирируйте любой избыточный раствор гидрогеля на основе ECM, не царапая поверхность с покрытием или не давая пластине полностью высохнуть.
- Удалите супернатант из конических трубок и повторно суспендируйте гранулы клеток с 6 мл HOMGY. Добавьте 500 мкл комбинированной клеточной суспензии HOMGY объемом 12 мл в каждую скважину из 24-луночной пластины, покрытой гидрогелем на основе ECM, при плотности посева примерно 3 х 105 клеток/лунку. Закрутите пластину с крышкой, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек внутри лунок.
- Инкубируйте пластину при 37 °C и 5% CO2, обменивая среду HOMGY каждые 2 дня, пока монослои не достигнут слияния >90%.
- Однослойная обработка и анализ раны царапинами
- Как только монослои достигают слияния >90%, аспирируют среду, чтобы удалить любые клетки, которые не могут прикрепиться. Обрабатывают клетки 500 мкл HA35 (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл) или PBS, растворенным в ГОМГИ, в течение 24 ч.
- Через 24 ч удалите носитель, стараясь не нарушить поверхность монослоя. Используя наконечник пипетки объемом 200 мкл, сделайте линейную царапину по всему диаметру поверхности монослоя в каждом колодце, стараясь не дать монослоям высохнуть.
- Вымойте поцарапанные монослои 1x с 500 мкл 1x PBS. Добавьте 500 мкл HA35 (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл) или PBS, растворенного в HOMGY, и переложите пластину на прибор для анализа живых клеток (Таблица материалов) в инкубаторе с температурой 37 °C и 5% CO2 .
- Под значком «Расписание» в программном обеспечении для анализа живых клеток (Таблица материалов) нажмите на значок Launch Add New Vessel Wizard (Мастер добавления нового судна ) и установите частоту сканирования для сканирования по расписанию. Создайте новый сосуд Whole Well в разделе Scan Type, укажите параметры сканирования (т. Е. Фаза для каналов изображения и 4x для Объектива) и нажмите Далее.
- Выберите производителя пластины и каталожный номер из предоставленного списка. Под значком Расписание выберите символ плюса, в который будет помещена пластина в инструмент анализа живых клеток. Выберите нужный шаблон сканирования, а затем создайте карту пластин, выбрав «+» на странице Макет пластины. Выберите Отложить анализ до позднего времени, а затем установите расписание сканирования на каждые 4 часа в течение 24 часов и проверьте параметры сбора на странице Сводка мастера судов . Наконец, выберите Добавить в расписание.
- После завершения анализа 24 под значком Вид дважды щелкните Имя судна и экспортируйте изображения и фильмы. Выберите скважины и серию изображений для отображения и экспорта в формате JPEG. Анализируйте изображения на процент заживления ран с помощью плагина Wound Healing Size Plugin для ImageJ21, как показано на шаге 2.4. ниже.
- Анализ раны царапин
- Откройте программное обеспечение ImageJ. Загрузите изображения анализа раны царапин (. TIFF или .JPG).
- Выберите Image > Type > 8-bit , чтобы изменить изображение с 24-bit RGB на 8-bit. Установите плагин для заживления ран, выбрав плагины > макросы > установить > плагин для заживления ран.
- Поверните изображение так, чтобы царапина была вертикальной, и инициализируйте плагин Wound Healing Size Tool.
- Выберите параметры плагина в диалоговом окне, чтобы наилучшим образом соответствовать царапинам. Задайте значение параметров для параметров размера заживления ран следующим образом: Радиус окна дисперсии на 20, Пороговое значение на 100 и Процент насыщенных пикселей на 0,001, а затем выберите Да для установить глобальную шкалу. Завершите выбор, нажав на кнопку OK . Проверьте, является ли выбранная область областью раны. Вышеуказанные параметры могут потребовать стандартизации от лаборатории к лаборатории.
- Повторите шаги 2.4.2.-2.4.4. за оставшиеся точки времени для каждого скретча.
- Рассчитайте процент заживления раны в области царапин мигрирующих или пролиферирующих клеток в течение 24 ч следующим образом:
% Заживление ран =
где T0 = % площади в момент времени 0 ч и Tc = % площадь в 0 ч, 4 ч, 12 ч или 24 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Влияние ГК на восстановление тканей и заживление ран в различных тканях и органах хорошо документировано; однако специфические эффекты ГК с молекулярной массой 35 кДа на заживление и регенерацию тонкой кишки плода или новорожденного в настоящее время неизвестны. Чтобы проверить способность HA35 способствовать заживлению ран в модели тонкой кишки плода или новорожденного, мы сгенерировали 3D-энтероиды кишечника из подвздошной ткани NHP и дополнительно диссоциировали эту ткань на отдельные клетки для создания монослоев, полученных из энтероидов 2D (рисунок 1A, B). Монослои были выращены до слияния и вручную поцарапаны с помощью наконечника пипетки P200 (рисунок 1B, C). Затем монослои обрабатывали HA35 (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл) или контрольным (PBS). Миграция и пролиферация клеток в щель визуализировались каждые 4 ч в течение в общей сложности 24 ч с помощью микроскопа с передаваемым светом, оснащенного для визуализации живых клеток22. Скорость закрытия раны, мера скорости миграции клеток, была количественно определена с помощью ImageJ в процентах заживления ран с помощью плагина21 Wound Healing Size Plugin (рисунок 2). Площадь царапин и скорость миграции клеток и процент закрытия раны измеряли в течение 24 ч (этап 2.4.6.). Как показано на рисунке 3, воздействие HA35 приводило к дозо- и временной стимуляции миграции/пролиферации клеток, что приводило к ускоренному закрытию раны. HA35 при 100 мкг/мл и 200 мкг/мл значительно увеличивали заживление в ~1,5-2,5 раза по сравнению с контролем как через 4 ч, так и через 12 ч (*p < 0,05).
Рисунок 1. Энтероидная генерация и процедура заживления ран энтероидного происхождения. (A) Культура трехмерных энтероидов кишечника приматов, используемых для диссоциации на (B) двумерные монослои. (C) Монослои выращивали до >90% слияния в 24-луночной пластине, а затем обрабатывали гиалуроновой кислотой 35 кДа или фосфатно-буферным физиологическим раствором в течение 24 ч. Затем монослои были поцарапаны наконечником пипетки P200. Шкала = 800 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Анализ и анализ заживления ран. Репрезентативные изображения гиалуроновой кислоты 35 кДа (100 мкг/мл, 200 мкг/мл) и контрольные методы лечения энтероидных монослоев нечеловеческих приматов. Изображения были получены через 0 ч, 4 ч, 12 ч, 16 ч и 24 ч после выполнения царапины наконечником пипетки P200. Изображения были сделаны с 4-кратным увеличением с помощью инструмента анализа живых клеток и проанализированы в ImageJ с использованием плагина Wound Healing Size Plugin. Процент заживления ран был рассчитан из мигрирующих/пролиферирующих клеток в течение 24 ч. Шкала = 800 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Влияние гиалуроновой кислоты 35 кДа (HA35) на заживление ран в энтероидных монослоях. Изменение заживления ран с течением времени в энтероидных монослоях, зависящее от концентрации лечения HA35. HA35 значительно увеличивал заживление ран через 4 ч и 12 ч при 100 мкг/мл и 200 мкг/мл по сравнению с контролем, но показатели заживления сошлись среди методов лечения на 24 ч. Значимость оценивали с помощью t-теста Студента при *p < 0,05, представленного как среднее ± стандартной погрешности среднего (SEM) (n = 6 лунок на обработку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Желудочно-кишечный тракт недоношенного ребенка находится под постоянным регенеративным давлением от повторного воздействия экологических оскорблений, связанных с дисбактериозом, воспалительными бактериальными метаболитами и токсинами и прерывистой гипоксией23,24. К сожалению, кишечный эпителий недоношенного ребенка не может быстро установить функциональную целостность23, что приводит к барьерной дисфункции, повышенной кишечной проницаемости, а в тяжелых случаях кишечному воспалению кишечника и развитию НЭК.
Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой класс полисахаридов, распространенных в грудном молоке, которые являются потенциальными биологически активными факторами, защищающими от развития NEC15,16. ГК представляет собой линейный полимер повторяющихся дисахаридов глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамин25,26, продуцируемых гиалуроновыми синтазами. ГК может обладать как про-, так и противовоспалительными свойствами в зависимости от размера и тканевой среды27,28. В кишечнике и толстой кишке эндогенная ГК присутствует во внеклеточном пространстве, прилегающем к криптоэпителиальным клеткам, и стимулирует эпителиальную пролиферацию и нормальный рост кишечника 29,30,31. ГК также является природным компонентом в ГМ и производится в самых высоких концентрациях в течение первых недель лактации30. Примечательно, что ГК, очищенная от HM или коммерчески доступная ГК с молекулярной массой ~ 35 кДа (HA 35), защищает от вызванного бактериями колита, увеличивая экспрессию антимикробного β-дефензина и белка TJ ZO-1 в эпителии толстой кишки in vivo и vitro25,27. Важно отметить, что среди всех ГК определенного размера (4,7 кДа, 16 кДа, 28 кДа, 74 кДа) HA35 является наиболее мощным индуктором белков TJ и антимикробной пептидной экспрессии в эпителии толстой кишки in vitro. Кроме того, большой MW HA (~ 2000 кДа) не оказывает никакого влияния на экспрессию белка TJ, что указывает на то, что эти эффекты специфичны для размера32. Мы также показали, что пероральное введение HA35 ускоряет созревание тонкого кишечника, способствует пролиферации и дифференцировке эпителия и защищает от развития NEC16. Здесь способность HA35 способствовать заживлению ран проверяется с использованием анализа заживления ран in vitro. Используя модели, описанные выше, было обнаружено, что HA35 ускоряет закрытие раны в зависимости от концентрации через 4 ч и 12 ч после царапины по сравнению с контролем, проясняя критический пробел в знаниях о влиянии ГК конкретного размера на заживление ран кишечника и восстановление тканей и, таким образом, подтверждая благотворную роль HA35 в заживлении ран кишечника новорожденных. Хотя механизм, с помощью которого HA35 оказывает этот эффект, неизвестен, предыдущие данные авторов у детенышей мышей показали, что механистическая мишень пути комплекса рапамицина (mTOR) 1 (mTORC1) была повышена в тканях подвздошной кишки после лечения HA3516. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить вклад этого пути в эти наблюдаемые эффекты.
Несколько моделей in vitro были использованы для исследования вмешательств, способствующих регенерации кишечника, заживлению и восстановлению. Наиболее используемым анализом in vitro для ран кишечника и последующего восстановления является анализ царапины раны, выполняемый чаще всего в монослоях клеток колоректального рака (CRC)33,34. Физиологическая значимость такой модели для кишечника недоношенных детей, однако, ограничена, поскольку восстановление ран CRC-клеток в значительной степени зависит от высокопролиферативной природы раковых клеток, а не от процессов восстановления, управляемых стволовыми клетками18. Недавняя способность выделять и поддерживать энтероиды, полученные из крипт кишечного эпителия, дает возможность исследовать более физиологически значимый ответ кишечника на множество иммунных или вредных раздражителей, а также возможные терапевтические вмешательства35. Энтероиды содержат все дифференцированные типы эпителиальных клеток, обнаруженные в сегменте кишечника, из которого они получены, тем самым служа эффективной моделью для изучения повреждения кишечного барьера и восстановления 36,37,38.
В настоящем описании описаны создание и поддержание in vitro энтероидной модели повреждения и восстановления эпителия кишечника с использованием подвздошной кишки от недоношенного NHP. Эта модель позволяет исследовать механистические пути и терапевтические вмешательства, участвующие в заживлении и регенерации эпителия. Критическим шагом в этом протоколе является создание четко определенного разрыва с аналогичной шириной, сводя к минимуму вариации от скважины к скважине. Кроме того, при расчесывании монослоев наконечник пипетки должен поддерживать постоянный контакт со дном колодца для чистого удаления клеточного слоя. Следует избегать чрезмерного давления, чтобы предотвратить «подъем» краев раны. Аналогичным образом, этап промывки PBS после ранения следует выполнять осторожно, используя боковину колодца, чтобы избежать повреждения оставшегося монослоя или дополнительного расширения раневой щели. Наконец, следует избегать удержания пластины ниже 37 ° C в течение длительных периодов времени, чтобы гарантировать, что покрытие ECM на пластине остается гелеобразным, а монослой не нарушается из-за изменений вязкости ECM.
Хотя эта модель имеет явные преимущества перед традиционной клеточной культурой, она технически более требовательна, дорога и трудоемка по сравнению с традиционным анализом заживления ран в монослоях CRC. Кроме того, консистенция в используемых реагентах и средах имеет решающее значение для обеспечения выживания и надлежащего поддержания этих культур, как и поддержание клеток, реагентов и ECM при надлежащих температурах. Наконец, первичные монослои тонкой кишки, как известно, недолговечны, поэтому анализ раны, описанный здесь, следует проводить вскоре после достижения однослойного слияния.
Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что тонкокишечные энтероидные монослои могут быть использованы в качестве новой модели для исследования регенерации эпителия кишечника через процессы миграции и пролиферации клеток после ранения. Кроме того, энтероиды обеспечивают гораздо более физиологически транслируемую ткань для изучения влияния на дифференцированную жизнеспособность клеток кишечника. Такие модели могут обеспечить платформу для препарирования механизмов, регулирующих восстановление эпителия, и помочь в идентификации новых терапевтических мишеней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать и нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. HC поддерживается грантом P20GM134973 от Национальных институтов здравоохранения. KB поддерживается грантом Фонда детских больниц (CHF) и Фонда пресвитерианского здравоохранения (PHF). Услуги визуализации живых клеток, предоставляемые ядром функциональной геномики рака, были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук P20GM103639 и грантом Национального института рака P30CA225520 Национальных институтов здравоохранения, присужденным Онкологическому центру Стивенсона Университета Оклахомы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
