Summary
Ce protocole décrit une méthode pour établir et effectuer un essai de plaie par égratignures sur des monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes tridimensionnels (3D) isolés de l’iléon de primates non humains.
Abstract
Les tests in vitro sur les rayures sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les caractéristiques de la cicatrisation épithéliale dans divers types de tissus. Ici, nous décrivons un protocole pour générer une monocouche bidimensionnelle (2D) à partir d’entéroïdes de primates non humains tridimensionnels (3D) dérivés des cryptes intestinales de l’iléon terminal. Ces monocouches dérivées d’entéroïdes ont ensuite été utilisées dans un essai in vitro sur des rayures pour tester la capacité de l’hyaluronane 35 kDa (HA35), un imitateur HA du lait humain, à favoriser la migration et la prolifération cellulaires le long du bord de la plaie épithéliale. Une fois que les monocouches ont été cultivées jusqu’à la confluence, elles ont été grattées manuellement et traitées avec HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou témoin (PBS). La migration et la prolifération des cellules dans l’espace ont été imagées à l’aide d’un microscope à lumière transmise équipé pour l’imagerie de cellules vivantes. La fermeture des plaies a été quantifiée en pourcentage de cicatrisation à l’aide du plug-in Wound Healing Size dans ImageJ. La zone de rayure, le taux de migration cellulaire et le pourcentage de fermeture de la plaie ont été mesurés sur 24 heures. HA35 in vitro accélère la cicatrisation des plaies dans les monocouches entéroïdes de l’intestin grêle, probablement par une combinaison de prolifération cellulaire au bord de la plaie et de migration vers la zone de la plaie. Ces méthodes peuvent potentiellement être utilisées comme modèle pour explorer la régénération intestinale dans l’intestin grêle humain prématuré.
Introduction
L’entérocolite nécrosante (ECN) est l’une des urgences gastro-intestinales les plus courantes chez les nouveau-nés prématurés1. La maladie se caractérise par une inflammation intestinale sévère qui peut rapidement se détériorer en nécrose intestinale, septicémie et potentiellement la mort. Bien que l’étiologie ne soit pas claire, les preuves suggèrent que l’ECN est multifactorielle et le résultat d’une interaction complexe de l’alimentation, d’une colonisation bactérienne anormale et d’un épithélium intestinal immature 2,3. Les nouveau-nés prématurés ont une perméabilité intestinale accrue, une colonisation bactérienne anormale et une faible capacité de régénération des entérocytes4,5, ce qui augmente leur risque de dysfonctionnement de la barrière intestinale, de translocation bactérienne et de développement d’ECN. Par conséquent, l’identification de stratégies ou d’interventions pour accélérer la maturation épithéliale intestinale et promouvoir la régénération ou la guérison de l’épithélium intestinal est essentielle pour prévenir cette maladie mortelle.
Des études ont démontré que le lait maternel (HM) protège contre l’ECN chez les nouveau-nés prématurés 6,7,8,9,10,11. Des études humaines et animales ont montré que les préparations à base de bovins augmentent la perméabilité intestinale et sont directement toxiques pour les cellules épithéliales intestinales 2,12. Bien qu’elles ne soient pas entièrement élucidées, les preuves suggèrent que les effets protecteurs de la HM sont médiés par des composants bioactifs tels que la lactoferrine, l’immunoglobuline A (IgA) et les oligosaccharides HM13. HM est également riche en hyaluronane (HA), un glycosaminoglycane uniquement non sulfaté avec de l’acide D-glucuronique répétitif et des disaccharides N-acétyl-D-glucosamine14,15. Fait important, nous avons montré que l’HA oral de 35 kDa (HA35), un imitateur de HM HA, atténue la gravité des lésions intestinales, empêche la translocation bactérienne et diminue la mortalité dans un modèle de lésion intestinale murine de type NEC16,17.
Ici, les effets de HA35 sur la guérison intestinale et la régénération in vitro sont étudiés plus avant. Actuellement, le test in vitro le plus largement utilisé pour les lésions intestinales et la réparation est un test de plaie par égratignure effectué dans les monocouches de cellules du cancer colorectal (CCR). La pertinence physiologique d’un tel modèle pour l’intestin prématuré du nourrisson est limitée, car la réparation des plaies des cellules du CCR repose fortement sur la nature hautement proliférative des cellules cancéreuses plutôt que sur les processus de réparation induits par les cellules souches18. Pour surmonter cette limitation, l’établissement d’un modèle 2D de plaies entéroïdes égratignables, y compris la procédure d’isolement et de maintien des entéroïdes intestinaux grêles dérivés de cellules souches primaires provenant de primates prématurés non humains (PNH), est décrit ici. Étant donné que l’ECN prématurée est le plus souvent signalée dans l’intestin grêle distal, l’utilisation d’organoïdes de cellules épithéliales primaires dans un modèle de lésions et de réparations intestinales fournit un modèle in vitro plus physiologiquement traduisible par rapport aux modèles existants utilisant des monocouches colorectales traditionnelles18,19.
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Protocol
Toutes les procédures animales de cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma. À la suite de l’approbation institutionnelle, des échantillons de commodité de l’intestin grêle fœtal provenant d’un primate prématuré non humain (PSN, gestation à 90 %, babouin olive, Papio anubis) ont été prélevés après l’euthanasie pour une étude distincte (Protocole #101523-16-039-I)20.
1. Établissement d’entéroïdes intestinaux 3D chez les primates non humains prématurés
- Préparation des médias
REMARQUE: Les milieux peuvent être préparés jusqu’à 1 semaine avant l’isolement de la crypte en suivant la technique aseptique standard. La pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %) peut être utilisée à la place des antibiotiques à large spectre pour les cellules primaires si désiré.- Préparer le milieu de croissance organoïde humain + Y-27632 (HOGMY) en mélangeant 50 mL de milieu de croissance organoïde basal humain avec 50 mL de supplément organoïde (Tableau des matériaux). Ajouter 200 μL d’antibiotiques à large spectre (concentration finale de 100 μg/mL) (Table des matières) et Y-27632 (jusqu’à une concentration finale de 10 μM). Chaud sur la paillasse à température ambiante.
- Préparer le milieu de croissance organoïde humain (HOGM) en mélangeant 50 mL de milieu de croissance organoïde basal humain avec 50 mL de supplément organoïde. Ajouter 200 μL d’antibiotiques à large spectre (100 μg/mL). Chaud sur la paillasse à température ambiante.
REMARQUE: HOGM sera utilisé lors du changement de support au-delà des 2-3 premiers jours après le passage. - Refroidir 100 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium jusqu’à ce qu’elle soit glacée.
- Préparer 50 ml de tampon de lavage en combinant 1x PBS sans calcium ni magnésium avec 0,1% d’albumine sérique bovine (BSA). Refroidissez-le jusqu’à ce qu’il soit glacé.
- Préparer le tampon de lavage DMEM-F12 en ajoutant 1 mL d’antibiotiques à large spectre (100 μg/mL) à 500 mL de DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Jam’s Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Gardez-le glacé.
- Isolation et placage de cryptes
REMARQUE: L’hydrogel à base de matrice extracellulaire (ECM) doit rester sur la glace pendant toute la procédure. Cette procédure suppose suffisamment de tissu pour remplir six dômes d’hydrogel à base d’ECM. Si une densité différente de cryptes est récoltée, le numéro du dôme doit être modifié en conséquence.- Décongeler 150 μL d’extrait membranaire basal (BME) (sans phénol) à facteur de croissance réduit (DFG) pendant la nuit sur la glace à une température de 2 à 8 °C.
- Incuber une plaque de polystyrène à fond plat de 24 puits, traitée par culture tissulaire dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
- Après l’euthanasie des PSN et le prélèvement de tissus, rincer le segment iléon des débris avec un embout de pipette de 1 000 μL en utilisant 1x PBS glacé dans une boîte de Petri jetable.
REMARQUE : Les tissus frais doivent être récoltés rapidement et conservés au froid glacé pour récolter des entéroïdes sains. - Couper l’iléon longitudinalement le long de tout l’intestin et laver avec du PBS glacé 3x. Hacher le tissu en petits fragments (environ 2 mm de longueur) avec des ciseaux stériles sur un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de PBS glacé, en partant de la partie du segment iléal la plus proche du tube.
- Utilisez une pipette sérologique de 10 ml pour perturber les cryptes en pipetant de haut en bas 5-10x. Laissez les segments de tissu se déposer au fond du tube, puis retirez le surnageant et remplacez-le par du PBS frais et glacé. Répétez ce processus au moins 7x-10x jusqu’à ce que le surnageant soit clair et exempt de débris.
- Une fois clair, retirer le surnageant et remettre les cryptes en suspension dans 25 mL de réactif de dissociation cellulaire. Placez le tube sur une plate-forme à bascule à 20 tr / min pendant 15 min à température ambiante.
- Retirez le tube de la bascule, laissez les cellules se déposer pendant environ 30 s à 1 min et retirez le surnageant. Ajouter 10 ml de tampon de lavage glacé. Pipette de haut en bas avec une pipette p1000 pour se dissocier davantage en cryptes uniques.
- Filtrer le tissu à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL. Rincez le tube conique original de 50 ml avec 10 ml de tampon de lavage à froid glacé et filtrez à travers la passoire de 70 μm pour vous assurer que toutes les cryptes ont été retirées du tube d’origine. Répétez ce lavage des mouchoirs pour un total de 4x rinçages.
- Centrifuger le filtrat à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 600 μL de HOGMY et perturber la pastille en pipetant de haut en bas avec une pipette de 200 μL. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce que la solution devienne glacée.
REMARQUE: Si la solution n’est pas glacée, le dôme ne conservera pas la structure appropriée lorsqu’il est plaqué. Évitez d’introduire des bulles lors du pipetage des dômes d’hydrogel à base d’ECM, car les bulles empêcheront une bonne adhérence au fond de la plaque. - Ajouter 600 μL d’hydrogel glacé à base d’ECM pour suspendre la pastille de cellule et bien mélanger avec une pipette de 200 μL.
- Retirez la plaque à 24 puits de l’incubateur et placez-la sur un chauffe-plaques à 37 °C. Pipeter 50 μL de mélange d’hydrogel glacé à base de HOGMY/ECM au centre de 24 puits d’une plaque de culture de 24 puits (50 μL par dôme).
- Une fois plaqués, laisser reposer les dômes sur une plaque chauffante à 37 °C pendant 1 min pour permettre l’adhérence au fond de la plaque. Retourner soigneusement la plaque, s’assurer qu’aucune condensation ne s’est accumulée au fond de la plaque et placer la plaque inversée dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- Après 15 min, tournez la plaque vers le haut et pipeter 750 μL de HOGMY à température ambiante dans chaque puits.
REMARQUE: Pipette fluide lentement sur la paroi latérale des puits, en veillant à ne pas perturber le dôme d’hydrogel 3D à base d’ECM nouvellement formé. - Une fois que tous les puits ont été remplis de média, placez la plaque dans l’incubateur et changez le média tous les 3 jours avec 750 μL de HOGM. Passage entéroïdes tous les 7-10 jours.
- Passage entéroïde intestinal
REMARQUE : Le protocole suivant s’applique à une plaque de culture de 24 puits contenant des entéroïdes de PSN à un taux fractionné de 1:2.- Retirer le milieu entéroïde de chaque puits, en prenant soin de ne pas perturber le dôme ECM contenant des entéroïdes, ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire glacée à chaque puits à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et incuber à température ambiante pendant 1 min.
- Perturbez manuellement l’ECM en tuyant de haut en bas de 8 à 12x. Transférer le contenu de 12 puits dans un tube conique de 15 mL.
- Une fois que toute la solution a été recueillie dans la plaque de culture de 24 puits, ajouter 250 μL de réactif de perturbation cellulaire à chaque puits pour s’assurer que tous les entéroïdes de PSN ont été retirés de chaque puits, en ajoutant ce dernier rinçage aux tubes coniques existants de 15 mL.
- Placer sur une plate-forme à bascule à 40 tr/min pendant 15 min à température ambiante (20 °C). Sinon, agiter manuellement les tubes pendant 15 minutes à température ambiante.
- Après 15 min, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant des tubes de 15 ml jusqu’à ce qu’il ne reste que la pastille.
- Ajouter 8 mL de DMEM glacé + antibiotiques à large spectre à un tube conique de 15 mL, en vous assurant que la pastille est suffisamment perturbée. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
- Ajouter 600 μL de HOGMY et perturber la pastille en pipetant de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce que la solution devienne glacée. Une fois que la solution est glacée, ajoutez 600 μL d’ECM glacé pour suspendre la pastille de cellule et bien mélanger avec une pipette de 1 000 μL. Répétez les étapes 1.3.2.-1.3.7. pour les 12 puits restants.
- Pour les étapes restantes, reportez-vous aux étapes 1.2.11.-1.2.16.
2. Mise en place d’un essai de monocouche entéroïde et de plaie par rayure
- Milieu et préparation du traitement
- Refroidir 5 mL de PBS sans calcium ni magnésium jusqu’à ce qu’ils soient glacés.
- Préparer le tampon de lavage DMEM-F12 en ajoutant 1 mL d’antibiotiques à large spectre (100 μg/mL) à 500 mL de DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Jam’s Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Gardez la glace froide.
- Préparez 100 ml de HOGMY, tel que décrit à l’étape 1.1.1., et réchauffez-le sur la paillasse à température ambiante.
- Réchauffer 25 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % dans un bain-marie à 37 °C.
- Préparer des concentrations de 50 μg/mL, 100 μg/mL et 200 μg/mL d’HA35 pour le traitement cellulaire, en utilisant du PBS stérile sans calcium ni magnésium comme solvant. La dilution finale de HA35 utilisera HOMGY comme solvant.
REMARQUE: La préparation de HA35 peut nécessiter plusieurs dilutions, car HA35 sort souvent de la solution à une concentration supérieure à 5 mg / mL.
- Formation de monocouches entéroïdes
REMARQUE : La procédure suivante fournit des volumes suffisants pour la génération d’une plaque de monocouches entéroïdes à 24 puits. Ajustez les volumes pour le nombre souhaité de monocouches.- Décongeler 96 μL d’hydrogel BME (phénol sans rouge) à base d’ECM pendant une nuit sur la glace à une température de 2 à 8 °C. Diluer l’hydrogel à base d’ECM dans du PBS glacé sans calcium ni magnésium dans un rapport de 1:50. Enduisez chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits de 200 μL d’hydrogel dilué à base d’ECM glacé.
- Incuber la plaque enrobée d’hydrogel à base d’ECM pendant au moins 1 h à 37 °C et 5 % de CO2. Aspirer le milieu de la plaque de culture de 24 puits contenant les entéroïdes 3D destinés aux monocouches et les remplacer par 500 μL de réactif/puits de dissociation cellulaire.
- Perturbez manuellement les dômes d’hydrogel à base d’ECM en tuytant de haut en bas 8x-12x et transférez le contenu de 12 puits dans un tube conique de 15 mL.
- Lavez les 12 puits vides avec 250 μL de réactif de dissociation cellulaire pour vous assurer que tous les entéroïdes ont été éliminés et transférez le contenu dans un tube conique de 15 mL. Répétez l’étape 2.2.5. et l’étape 2.2.6. pour les 12 puits restants en utilisant un deuxième tube conique de 15 mL.
- Centrifuger les tubes coniques à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Ajouter 10 mL de tampon de lavage DMEM-F12 glacé à des tubes coniques de 15 mL et suspendre les pastilles entéroïdes en retournant les tubes. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 12 mL de trypsine-EDTA à 37 °C. Placer les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules semblent solubles. Ajouter 3 mL de tampon de lavage DMEM-F12 à chaque tube pour diluer la trypsine-EDTA, mélanger en retournant les tubes et placer sur de la glace.
- Filtrer les entéroïdes dissociés à travers une crépine à cellules maillées de 37 μM, en recueillant le contenu dans des tubes coniques propres de 15 mL. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Pendant que les cellules s’enrobent dans la centrifugeuse, retirez la plaque enduite d’hydrogel à base d’ECM de l’incubateur et aspirez tout excès de solution d’hydrogel à base d’ECM sans rayer la surface revêtue ou laisser la plaque sécher complètement.
- Retirer le surnageant des tubes coniques et remettre en suspension les pastilles cellulaires avec 6 mL de HOMGY. Ajouter 500 μL de la suspension cellulaire combinée de 12 mL HOMGY dans chaque puits de la plaque de 24 puits recouverte d’hydrogel à base d’ECM à une densité d’ensemencement d’environ 3 x 105 cellules/puits. Faites tourner la plaque avec un couvercle pour assurer une répartition uniforme des cellules dans les puits.
- Incuber la plaque à 37 °C et 5% de CO 2, en échangeant les milieux HOMGY tous les2 jours jusqu’à ce que les monocouches atteignent >90% de confluence.
- Traitement monocouche et dosage des plaies par égratignures
- Une fois que les monocouches atteignent >90% de confluence, aspirez le milieu pour éliminer toutes les cellules qui ne parviennent pas à se fixer. Traiter les cellules avec 500 μL de HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou de PBS, dissous dans HOMGY, pendant 24 h.
- Après 24 h, retirez le support en veillant à ne pas perturber la surface de la monocouche. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, effectuez un grattage linéaire sur tout le diamètre de surface de la monocouche dans chaque puits, en prenant soin de ne pas laisser sécher les monocouches.
- Lavez les monocouches rayées 1x avec 500 μL de 1x PBS. Ajouter 500 μL de HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou de PBS dissous dans HOMGY et transférer la plaque dans l’instrument d’analyse des cellules vivantes (Tableau des matériaux) dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 .
- Sous l’icône Calendrier dans le logiciel d’analyse de cellules sous tension (Table des matériaux), cliquez sur l’icône Assistant Lancer l’ajout d’un nouveau navire et réglez la fréquence de balayage pour numériser selon un calendrier. Créez un nouveau vaisseau Puits entier sous Type de numérisation, spécifiez les paramètres de numérisation (c.-à-d. Phase pour les canaux d’image et 4x pour Objectif), puis cliquez sur Suivant.
- Sélectionnez le fabricant de la plaque et le numéro de catalogue dans la liste fournie. Sous l’icône Calendrier , choisissez le symbole plus où la plaque sera placée dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes. Sélectionnez le modèle de numérisation souhaité, puis créez une carte de plaque en sélectionnant « + » sur la page Disposition de la plaque. Sélectionnez Reporter l’analyse à plus tard, puis définissez le calendrier d’analyse toutes les 4 heures pendant 24 heures et vérifiez les paramètres d’acquisition sous la page Résumé de l’assistant de navire . Enfin, sélectionnez Ajouter à la planification.
- Une fois le test 24 terminé, sous l’icône Affichage, double-cliquez sur Nom du navire et exportez des images et des films. Sélectionnez des puits et une série d’images à afficher et à exporter au format JPEG. Analysez les images pour le pourcentage de cicatrisation des plaies à l’aide du plug-in Wound Healing Size pour ImageJ21, conformément à l’étape 2.4. sous.
- Analyse des rayures
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Téléchargez les images du test de plaie par égratignures (. TIFF ou .JPG).
- Sélectionnez Image > Type > 8 bits pour modifier l’image de RVB 24 bits en 8 bits. Installez le plugin Wound Healing Size en sélectionnant Plugins > Macros > Install > Wound Healing Size Plugin.
- Faites pivoter l’image de sorte que la rayure soit verticale et initialisez le plug-in Wound Healing Size Tool.
- Sélectionnez les paramètres du plug-in dans la boîte de dialogue pour s’adapter au mieux à la plaie de rayure. Définissez la valeur des paramètres pour les options de taille de cicatrisation des plaies comme suit : Rayon de la fenêtre de variance à 20, Valeur de seuil à 100 et Pourcentage de pixels saturés à 0,001, puis choisissez Oui pour Définir l’échelle globale. Finalisez la sélection en cliquant sur le bouton OK. Vérifiez si la zone sélectionnée est la zone de la plaie. Les paramètres ci-dessus peuvent nécessiter une normalisation d’un laboratoire à l’autre.
- Répétez les étapes 2.4.2.-2.4.4. pour les points de temps restants pour chaque égratignure.
- Calculer le pourcentage de cicatrisation des cellules migrantes ou proliférantes sur 24 heures comme suit :
% de cicatrisation =
où T 0 = % Surface au temps 0 h et Tc = % Superficie à 0 h, 4 h, 12 h ou 24 h.
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Representative Results
Les effets de l’AH sur la réparation tissulaire et la cicatrisation des plaies dans divers tissus et organes sont bien documentés; cependant, les effets spécifiques de l’HA d’un poids moléculaire de 35 kDa sur la cicatrisation et la régénération de l’intestin grêle fœtal ou néonatal sont actuellement inconnus. Pour tester la capacité de HA35 à favoriser la cicatrisation des plaies dans un modèle de l’intestin grêle fœtal ou néonatal, nous avons généré des entéroïdes intestinaux 3D à partir du tissu iléal NHP et dissocié davantage ce tissu en cellules uniques pour créer des monocouches dérivées de entéroïdes 2D (Figure 1A,B). Les monocouches ont été cultivées jusqu’à confluence et grattées manuellement à l’aide d’une pointe de pipette P200 (Figure 1B,C). Les monocouches ont ensuite été traitées avec HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou témoin (PBS). La migration et la prolifération des cellules dans la brèche ont été imagées toutes les 4 heures pendant un total de 24 heures à l’aide d’un microscope à lumière transmise équipé pour l’imagerie de cellules vivantes22. Le taux de fermeture des plaies, une mesure de la vitesse de migration cellulaire, a été quantifié à l’aide d’ImageJ comme pourcentage de cicatrisation à l’aide du plug-in Wound Healing Size21 (Figure 2). La surface de rayure et le taux de migration cellulaire ainsi que le pourcentage de fermeture de la plaie ont été mesurés sur 24 heures (étape 2.4.6.). Comme le montre la figure 3, l’exposition à HA35 a entraîné une stimulation dépendante de la dose et du temps de la migration/prolifération cellulaire, entraînant une fermeture accélérée de la plaie. HA35 à 100 μg/mL et 200 μg/mL ont significativement augmenté la cicatrisation de ~1,5 à 2,5 fois par rapport au témoin à 4 h et 12 h (*p < 0,05).
Graphique 1. Génération d’entéroïdes et procédure de cicatrisation des plaies monocouches dérivées d’entéroïdes. (A) Culture d’entéroïdes intestinaux tridimensionnels non humains de primates utilisés pour se dissocier en (B) monocouches bidimensionnelles. (C) Les monocouches ont été cultivées jusqu’à >90% de confluence dans une plaque de 24 puits, puis traitées avec de l’acide hyaluronique 35 kDa ou une solution saline tamponnée au phosphate pendant 24 heures. Les monocouches ont ensuite été rayées avec une pointe de pipette P200. Barre d’échelle = 800 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Images et analyses de tests de cicatrisation. Images représentatives de l’acide hyaluronique 35 kDa (100 μg/mL, 200 μg/mL) et des traitements témoins des monocouches entéroïdes de primates non humains. Les images ont été obtenues à 0 h, 4 h, 12 h, 16 h et 24 h après avoir effectué un scratch avec une pointe de pipette P200. Les images ont été prises à un grossissement 4x avec l’instrument d’analyse de cellules vivantes et analysées dans ImageJ à l’aide du plugin Wound Healing Size. Le pourcentage de cicatrisation a été calculé à partir de cellules migrantes/proliférantes sur 24 heures. Barre d’échelle = 800 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa (HA35) sur la cicatrisation des plaies dans les monocouches entéroïdes. Changement dans la cicatrisation des plaies au fil du temps dans les monocouches entéroïdes, en fonction de la concentration du traitement HA35. HA35 a significativement augmenté la cicatrisation après 4 h et 12 h à 100 μg/mL et 200 μg/mL par rapport au groupe témoin, mais les taux de cicatrisation ont convergé entre les traitements en 24 h. La signification a été évaluée à l’aide du test t de Student à *p < 0,05, présenté comme une moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM) (n = 6 puits par traitement). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le tractus gastro-intestinal d’un nouveau-né prématuré est soumis à une pression régénératrice continue due à des expositions répétées à des agressions environnementales associées à la dysbiose, aux métabolites bactériens inflammatoires et aux toxines, et à l’hypoxie intermittente23,24. Malheureusement, l’épithélium intestinal du nouveau-né prématuré est incapable d’établir rapidement l’intégrité fonctionnelle23, ce qui entraîne un dysfonctionnement de la barrière, une perméabilité intestinale accrue et, dans les cas graves, une inflammation intestinale généralisée et le développement d’une CNE.
Les glycosaminoglycanes (GAG) sont une classe de polysaccharides répandus dans le lait maternel, qui sont des facteurs bioactifs potentiels protégeant contre le développement de NEC15,16. HA est un polymère linéaire de disaccharides répétitifs d’acide glucuronique et de N-acétylglucosamine25,26 produits par les hyaluronanes synthases. L’AH peut avoir des propriétés pro- ou anti-inflammatoires selon la taille et l’environnement tissulaire27,28. Dans l’intestin et le côlon, l’AH endogène est présent dans l’espace extracellulaire adjacent aux cellules épithéliales cryptiques et entraîne la prolifération épithéliale et la croissance intestinale normale 29,30,31. L’AH est également un composant naturel de l’HM et est produit aux concentrations les plus élevées au cours des premières semaines de lactation30. Notamment, l’AH purifié à partir de HM ou l’AH disponible dans le commerce de poids moléculaire ~35 kDa (HA 35) protègent contre la colite induite par les bactéries en augmentant l’expression de la β-défensine antimicrobienne et de la protéine TJ ZO-1 dans l’épithélium colique in vivo et in vitro25,27. Il est important de noter que, parmi tous les HA de taille spécifique (4,7 kDa, 16 kDa, 28 kDa, 74 kDa), HA35 est l’inducteur le plus puissant des protéines TJ et de l’expression peptidique antimicrobienne dans l’épithélium colique in vitro. De plus, un HA MW important (~2 000 kDa) n’exerce aucun effet sur l’expression de la protéine TJ, ce qui indique que ces effets sont spécifiques à la taille32. Nous avons également montré que l’administration orale de HA35 accélère la maturation de l’intestin grêle, favorise la prolifération et la différenciation épithéliales et protège contre le développement de NEC16. Ici, la capacité de HA35 à favoriser la cicatrisation des plaies est testée à l’aide d’un test in vitro de cicatrisation des rayures. En utilisant les modèles décrits ci-dessus, il a été constaté que HA35 accélère la fermeture de la plaie d’une manière dépendante de la concentration à 4 h et 12 h après l’égratignure par rapport au contrôle, clarifiant une lacune critique dans les connaissances sur les effets de l’AH de taille spécifique sur la cicatrisation des plaies intestinales et la réparation des tissus et, par conséquent, confirmant un rôle bénéfique de HA35 dans la cicatrisation des plaies intestinales néonatales. Bien que le mécanisme par lequel HA35 exerce cet effet soit inconnu, les données antérieures des auteurs chez les bébés souris ont montré que la cible mécaniste de la voie du complexe 1 de la rapamycine (mTOR) (mTORC1) était régulée à la hausse dans les tissus iléaux après le traitement HA3516. D’autres études sont nécessaires pour déterminer la contribution de cette voie à ces effets observés.
Plusieurs modèles in vitro ont été utilisés pour étudier les interventions favorisant la régénération, la guérison et la réparation intestinales. Le test in vitro le plus utilisé pour les lésions intestinales et la réparation ultérieure est le test de la plaie par égratignure, effectué le plus souvent dans les monocouches de cellules du cancer colorectal (CCR)33,34. La pertinence physiologique d’un tel modèle pour l’intestin prématuré du nourrisson est toutefois limitée, car la réparation des plaies des cellules CCR repose fortement sur la nature hautement proliférative des cellules cancéreuses plutôt que sur les processus de réparation induits par les cellules souches18. La capacité récente d’isoler et de maintenir des entéroïdes dérivés de cryptes de l’épithélium intestinal offre l’occasion d’explorer une réponse intestinale plus pertinente physiologiquement à une multitude de stimuli immunitaires ou nocifs, ainsi que d’éventuelles interventions thérapeutiques35. Les entéroïdes contiennent tous les types de cellules épithéliales différenciées trouvées dans le segment intestinal dont elles sont dérivées, servant ainsi de modèle efficace pour étudier les dommages et la réparation de la barrière intestinale36,37,38.
Le présent document décrit l’établissement et le maintien d’un modèle entéroïde in vitro de lésions épithéliales intestinales et de réparation à l’aide d’iléon provenant de PSN prématurés. Ce modèle permet d’étudier les voies mécanistes et les interventions thérapeutiques impliquées dans la guérison et la régénération épithéliales. Une étape critique de ce protocole est la création d’un espace bien défini avec une largeur similaire, minimisant la variation d’un puits à l’autre. De plus, lors du grattage des monocouches, l’extrémité de la pipette doit maintenir un contact constant avec le fond du puits pour éliminer proprement la couche cellulaire. Une pression excessive doit être évitée pour éviter de « soulever » les bords de la plaie. De même, l’étape de lavage PBS post-blessure doit être effectuée doucement, en utilisant la paroi latérale du puits, pour éviter d’endommager la monocouche restante ou d’élargir davantage l’espace de la plaie. Enfin, il faut éviter de maintenir la plaque en dessous de 37 °C pendant de longues périodes pour s’assurer que le revêtement ECM sur la plaque reste semblable à un gel et que la monocouche n’est pas perturbée par des changements de viscosité ECM.
Bien que ce modèle présente des avantages distincts par rapport à la culture cellulaire traditionnelle, il est techniquement plus exigeant, coûteux et prend beaucoup de temps que le test traditionnel de cicatrisation des plaies dans les monocouches CRC. De plus, l’uniformité des réactifs et des milieux utilisés est essentielle pour assurer la survie et le bon entretien de ces cultures, tout comme le maintien des cellules, des réactifs et de la MEC à des températures appropriées. Enfin, les monocouches primaires de l’intestin grêle sont notoirement de courte durée, de sorte que le test de plaie décrit ici doit être effectué peu de temps après l’atteinte de la confluence monocouche.
Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les monocouches entéroïdes de l’intestin grêle peuvent être utilisées comme nouveau modèle pour étudier la régénération épithéliale intestinale par les processus de migration et de prolifération cellulaires après une blessure. De plus, les entéroïdes fournissent un tissu beaucoup plus physiologiquement traduisible pour étudier les effets sur la viabilité différenciée des cellules intestinales. De tels modèles peuvent fournir une plate-forme pour disséquer les mécanismes régulant la réparation épithéliale et aider à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. SC est soutenu par la subvention P20GM134973 des National Institutes of Health. KB est soutenu par une subvention de la Fondation de l’hôpital pour enfants (CHF) et de la Presbyterian Health Foundation (PHF). Les services d’imagerie de cellules vivantes fournis par le noyau de la génomique fonctionnelle du cancer ont été soutenus en partie par la subvention P20GM103639 du National Institute of General Medical Sciences et la subvention P30CA225520 du National Institutes of Health, attribuée au Stephenson Cancer Center de l’Université de l’Oklahoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
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