Summary
Denne protokol beskriver en metode til at etablere og udføre et ridsesårassay på todimensionale (2D) monolag afledt af tredimensionale (3D) enteroider isoleret fra ikke-humant primat ileum.
Abstract
In vitro ridse sår assays er almindeligt anvendt til at undersøge mekanismerne og karakteristika for epitel heling i en række vævstyper. Her beskriver vi en protokol til at generere et todimensionelt (2D) monolag fra tredimensionelle (3D) ikke-humane primatenteroider afledt af tarmkrypter i det terminale ileum. Disse enteroidafledte monolag blev derefter anvendt i et in vitro ridsesårassay for at teste evnen hos hyaluronan 35 kDa (HA35), en human mælk HA-efterligning, til at fremme cellemigration og spredning langs epitelsårkanten. Efter at monolagene var vokset til sammenløb, blev de manuelt ridset og behandlet med HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) eller kontrol (PBS). Cellemigration og spredning i hullet blev afbildet ved hjælp af et mikroskop med transmitteret lys udstyret til levende cellebilleddannelse. Sårlukning blev kvantificeret som procent sårheling ved hjælp af Wound Healing Size Plugin i ImageJ. Kradseområdet og cellemigrationshastigheden og procentdelen af sårlukning blev målt over 24 timer. HA35 in vitro fremskynder sårheling i tyndtarms enteroide monolag, sandsynligvis gennem en kombination af celleproliferation ved sårkanten og migration til sårområdet. Disse metoder kan potentielt bruges som en model til at udforske tarmregenerering i den for tidlige humane tyndtarm.
Introduction
Nekrotiserende enterocolitis (NEC) er en af de mest almindelige gastrointestinale nødsituationer hos for tidligt fødte spædbørn1. Sygdommen er karakteriseret ved alvorlig tarmbetændelse, der hurtigt kan forringes til tarmnekrose, sepsis og potentielt død. Selvom ætiologien er uklar, tyder beviser på, at NEC er multifaktoriel og resultatet af en kompleks interaktion mellem fodring, unormal bakteriel kolonisering og et umodent tarmepitel 2,3. For tidligt fødte spædbørn har øget tarmpermeabilitet, unormal bakteriel kolonisering og lav enterocytregenerativ kapacitet4,5, hvilket øger deres risiko for tarmbarrieredysfunktion, bakteriel translokation og NEC-udvikling. Derfor er identifikation af strategier eller interventioner for at fremskynde tarmens epitelmodning og fremme regenerering eller helbredelse af tarmepitelet afgørende for at forhindre denne dødelige sygdom.
Undersøgelser har vist, at modermælk (HM) beskytter mod NEC hos for tidligt fødte børn 6,7,8,9,10,11. Både humane og dyreforsøg har vist, at kvægbaseret formel øger tarmpermeabiliteten og er direkte giftig for tarmepitelceller 2,12. Selvom det ikke er fuldt belyst, tyder beviser på, at de beskyttende virkninger af HM medieres gennem bioaktive komponenter såsom lactoferrin, immunoglobulin A (IgA) og HM oligosaccharider13. HM er også rig på hyaluronan (HA), en unik ikke-sulfateret glycosaminoglycan med gentagende D-glucuronsyre og N-acetyl-D-glucosamindisaccharider14,15. Det er vigtigt, at vi har vist, at oral 35 kDa HA (HA35), en HM HA-efterligning, dæmper sværhedsgraden af tarmskade, forhindrer bakteriel translokation og reducerer dødeligheden i en murine NEC-lignende tarmskademodel16,17.
Her undersøges virkningerne af HA35 på tarmheling og regenerering in vitro yderligere. I øjeblikket er det mest anvendte in vitro-assay til tarmsår og reparation et ridsesårassay udført i kolorektal cancer (CRC) cellemonolag. Den fysiologiske relevans af en sådan model for den for tidlige spædbarnstarm er begrænset, da sårreparation af CRC-celler er stærkt afhængig af kræftcellernes stærkt proliferative karakter snarere end stamcelledrevne reparationsprocesser18. For at overvinde denne begrænsning er etableringen af en 2D enteroid ridsesårmodel, herunder proceduren for isolering og vedligeholdelse af primære stamcelleafledte tyndtarmsenteroider fra for tidlige ikke-menneskelige primater (NHP), beskrevet her. Da for tidlig NEC oftest rapporteres i den distale tyndtarm, giver brugen af primære epitelcelleorganoider i en model for tarmskader og reparation en mere fysiologisk oversættelig in vitro-model sammenlignet med eksisterende modeller, der anvender traditionelle kolorektale monolag18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev godkendt af University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Efter institutionel godkendelse blev føtale tyndtarmsprøver fra en for tidlig ikke-menneskelig primat (NHP, 90% drægtighed, olivenbavian, Papio anubis) opnået efter eutanasi til en separat undersøgelse (protokol # 101523-16-039-I)20.
1. Etablering af for tidligt 3D-enteroider af non-human primat primat
- Medieforberedelse
BEMÆRK: Medier kan tilberedes op til 1 uge før kryptisolering efter standard aseptisk teknik. Penicillin/streptomycin (endelig koncentration 1 %) kan anvendes i stedet for bredspektret antibiotika til primære celler, hvis det ønskes.- Forbered humane organoide vækstmedier + Y-27632 (HOGMY) ved at blande 50 ml organoidvækstmedium humant basalmedium med 50 ml organoidtilskud (materialetabel). Tilsæt 200 μL bredspektret antibiotika (slutkoncentration 100 μg/ml) (materialetabel) og Y-27632 (til en slutkoncentration på 10 μM). Varm på bordpladen til stuetemperatur.
- Forbered humane organoidvækstmedier (HOGM) ved at blande 50 ml organoidvækstmedium humant basalt medium med 50 ml organoidtilskud. Tilsæt 200 μL bredspektret antibiotika (100 μg/ml). Varm på bordpladen til stuetemperatur.
BEMÆRK: HOGM vil blive brugt, når du skifter medie ud over de første 2-3 dage efter passagen. - Afkøl 100 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) uden calcium eller magnesium, indtil det er iskoldt.
- Forbered 50 ml vaskebuffer ved at kombinere 1x PBS uden calcium eller magnesium med 0,1% bovin serumalbumin (BSA). Chill det indtil iskoldt.
- Forbered DMEM-F12 vaskebuffer ved at tilføje 1 ml bredspektret antibiotika (100 μg / ml) til 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Hold det iskoldt.
- Kryptisolering og plettering
BEMÆRK: Ekstracellulær matrix (ECM) -baseret hydrogel skal forblive på isen under hele proceduren. Denne procedure antager nok væv til at udfylde seks ECM-baserede hydrogelkupler. Hvis der høstes en anden tæthed af krypter, skal kuppelnummeret ændres i overensstemmelse hermed.- Optøning 150 μL vækstfaktorreduceret (GFR) kældermembranekstrakt (BME) (phenolrødfri) natten over på isen ved 2-8 °C.
- Der inkuberes en 24-brønds, fladbundet, vævskulturbehandlet polystyrenplade i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i mindst 30 minutter før brug.
- Efter NHP-eutanasi og vævsindsamling skylles ileumsegmentet af affald med en 1.000 μL pipettespids ved hjælp af iskold 1x PBS i en engangs petriskål.
BEMÆRK: Frisk væv skal høstes hurtigt og holdes iskoldt for at høste sunde enteroider. - Skær ileum i længderetningen langs hele tarmen, og vask med iskold PBS 3x. Hak vævet i små fragmenter (ca. 2 mm i længden) med steril saks over et 50 ml konisk rør indeholdende 15 ml iskold PBS, startende fra den del af ilealsegmentet, der er tættest på røret.
- Brug en 10 ml serologisk pipette til at forstyrre krypterne ved at pipettere op og ned 5-10x. Lad vævssegmenterne sætte sig til bunden af røret, fjern derefter supernatanten og udskift den med frisk, iskold PBS. Gentag denne proces mindst 7x-10x, indtil supernatanten er klar og fri for snavs.
- Når det er klart, skal du fjerne supernatanten og suspendere krypterne i 25 ml celledissociationsreagens. Placer røret på en gyngeplatform ved 20 o / min i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern røret fra vipperen, lad cellerne sætte sig i ca. 30 s til 1 min, og fjern supernatanten. Tilsæt 10 ml iskold vaskebuffer. Pipetter op og ned med en p1000-pipette for yderligere at adskille sig i enkelte krypter.
- Filtrer vævet gennem en 70 μm cellesi ind i et nyt 50 ml konisk rør. Skyl det originale 50 ml koniske rør med 10 ml iskold vaskebuffer og filtrer gennem 70 μm silen for at sikre, at alle krypterne er fjernet fra det originale rør. Gentag denne vask af væv i alt 4x skylninger.
- Filtratet centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Tilsæt 600 μL HOGMY og afbryd pelleten ved at pipettere op og ned med en 200 μL pipette. Placer røret på is, indtil opløsningen bliver iskold.
BEMÆRK: Hvis opløsningen ikke er iskold, opretholder kuplen ikke den korrekte struktur, når den er belagt. Undgå at indføre bobler, når du pipetterer ECM-baserede hydrogelkupler, da bobler forhindrer korrekt vedhæftning til pladebunden. - Tilsæt 600 μL iskold ECM-baseret hydrogel for at suspendere cellepelleten og bland godt med en 200 μL pipette.
- Fjern 24-brøndspladen fra inkubatoren, og læg den på en 37 ° C pladevarmer. Pipetter 50 μL iskold HOGMY/ECM-baseret hydrogelblanding ind i midten af 24 brønde i en 24-brønds dyrkningsplade (50 μL pr. kuppel).
- Når de er belagt, skal du lade kuplerne sidde på en 37 ° C pladevarmer i 1 minut for at tillade vedhæftning til bunden af pladen. Vend forsigtigt pladen om, sørg for, at der ikke er ophobet kondens på bunden af pladen, og anbring den omvendte plade i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Efter 15 minutter drejes pladen med højre side opad og pipetteres 750 μL HOGMY ved stuetemperatur i hver brønd.
BEMÆRK: Pipettemedier langsomt på sidevæggen af brønde, pas på ikke at forstyrre den nydannede 3D ECM-baserede hydrogelkuppel. - Når alle brøndene er fyldt med medier, skal du placere pladen i inkubatoren og skifte mediet hver 3. dag med 750 μL HOGM. Passage enteroider hver 7-10 dage.
- Intestinal enteroid passaging
BEMÆRK: Følgende protokol er for en 24-brønds kulturplade indeholdende NHP-enteroider med en splithastighed på 1: 2.- Fjern det enteroide medie fra hvert hul, pas på ikke at forstyrre ECM-kuplen indeholdende enteroider, tilsæt 500 μL iskoldcelledissociationsreagens til hver brønd ved hjælp af en 1.000 μL pipette, og inkuber ved stuetemperatur i 1 min.
- Afbryd ECM manuelt ved at pipettere op og ned 8-12x. Overfør indholdet af 12 brønde til et 15 ml konisk rør.
- Når al opløsningen er opsamlet fra 24-brønds dyrkningspladen, tilsættes 250 μL celleforstyrrelsesreagens til hver brønd for at sikre, at alle NHP-enteroider er fjernet fra hver brønd, og tilsæt denne sidste skylning til de eksisterende 15 ml koniske rør.
- Placer på en gyngeplatform ved 40 o / min i 15 minutter ved stuetemperatur (20 ° C). Alternativt kan du manuelt ryste rørene i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Efter 15 minutter centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten fra 15 ml rørene, indtil kun pelleten er tilbage.
- Tilsæt 8 ml iskold DMEM + bredspektret antibiotika til et 15 ml konisk rør, og sørg for, at pelleten er tilstrækkeligt forstyrret. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Tilsæt 600 μL HOGMY og afbryd pelleten ved at pipettere op og ned med en 1.000 μL pipette. Placer røret på is, indtil opløsningen bliver iskold. Når opløsningen er iskold, tilsættes 600 μL iskold ECM for at suspendere cellepelleten og blandes godt med en 1.000 μL pipette. Gentag trin 1.3.2.-1.3.7. for de resterende 12 brønde.
- For de resterende trin henvises til trin 1.2.11.-1.2.16.
2. Etablering af enteroid monolag og ridse sår assay
- Medie- og behandlingsforberedelse
- Afkøl 5 ml PBS uden calcium eller magnesium, indtil det er iskoldt.
- Forbered DMEM-F12 vaskebuffer ved at tilføje 1 ml bredspektret antibiotika (100 μg / ml) til 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Hold dig iskold.
- Forbered 100 ml HOGMY, som beskrevet i trin 1.1.1., og varm den på bordpladen til stuetemperatur.
- Varm 25 ml 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i et 37 °C vandbad.
- Der fremstilles 50 μg/ml, 100 μg/ml og 200 μg/ml koncentrationer af HA35 til cellebehandling ved hjælp af steril PBS uden calcium eller magnesium som opløsningsmiddel. Den endelige fortynding af HA35 vil anvende HOMGY som opløsningsmiddel.
BEMÆRK: HA35-præparatet kan kræve flere fortyndinger, da HA35 ofte kommer ud af opløsningen i en koncentration på mere end 5 mg/ml.
- Enteroid monolag dannelse
BEMÆRK: Følgende procedure giver volumener, der er tilstrækkelige til generering af en 24-brønds plade af enteroide monolag. Juster lydstyrken for det ønskede antal monolag.- Optø 96 μL ECM-baseret hydrogel BME (phenolrødfri) natten over på is ved 2-8 °C. Fortynd ECM-baseret hydrogel i iskold PBS uden calcium eller magnesium i et forhold på 1:50. Overtræk hver brønd af en 24-brønds vævskulturplade med 200 μL iskold fortyndet ECM-baseret hydrogel.
- Den ECM-baserede hydrogelovertrukne plade inkuberes i mindst 1 time ved 37 °C og 5 % CO2. Aspiratmedier fra 24-brønds kulturpladen indeholdende 3D-enteroider bestemt til monolag og erstattes med 500 μL celledissociationsreagens / brønd.
- Manuelt forstyrre ECM-baserede hydrogelkupler ved at pipettere op og ned 8x-12x og overføre indholdet af 12 brønde til et 15 ml konisk rør.
- Vask de 12 tomme brønde med 250 μL celledissociationsreagens for at sikre, at alle enteroider er fjernet, og overfør indholdet til et 15 ml konisk rør. Gentag trin 2.2.5. og trin 2.2.6. til de resterende 12 brønde ved hjælp af et andet 15 ml konisk rør.
- De koniske rør centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Tilsæt 10 ml iskold DMEM-F12 vaskebuffer til 15 ml koniske rør og suspender enteroidpillerne ved at vende rørene om. Centrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og cellepellets resuspenderes i 12 ml 37 °C Trypsin-EDTA. Rørene anbringes i et vandbad på 37 °C i 10 minutter, eller indtil cellerne ser opløselige ud. Tilsæt 3 ml DMEM-F12 vaskebuffer til hvert rør for at fortynde Trypsin-EDTA, bland ved at vende rørene og læg dem på is.
- Filtrer de dissocierede enteroider gennem en 37 μM mesh celle sil, opsamling indholdet i rene 15 ml koniske rør. Centrifuger rørene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Mens cellerne pelleterer i centrifugen, fjernes den ECM-baserede hydrogelbelagte plade fra inkubatoren og aspirerer overskydende ECM-baseret hydrogelopløsning uden at ridse den belagte overflade eller lade pladen tørre helt.
- Fjern supernatanten fra de koniske rør, og suspender cellepillerne igen med 6 ml HOMGY. Der tilsættes 500 μL af den kombinerede 12 ml HOMGY-cellesuspension i hver brønd i 24-brøndspladen belagt med ECM-baseret hydrogel ved en såtæthed på ca. 3 x 105 celler/brønd. Hvirvl pladen med låg på for at sikre en jævn fordeling af celler i brøndene.
- Pladen inkuberes ved 37 °C og 5 % CO 2, og der udveksles HOMGY-medier hver 2. dag, indtil monolagene når >90 % sammenløb.
- Monolagsbehandling og ridsesåranalyse
- Når monolagene når >90% sammenløb, skal du aspirere medier for at fjerne celler, der ikke fastgøres. Behandle celler med 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller PBS, opløst i HOMGY, i 24 timer.
- Efter 24 timer skal du fjerne mediet og være forsigtig med ikke at forstyrre overfladen af monolaget. Brug en 200 μL pipettespids til at lave en lineær ridse over monolagets fulde overfladediameter i hver brønd, og pas på ikke at lade monolag tørre.
- Vask de ridsede monolag 1x med 500 μL 1x PBS. Der tilsættes 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller PBS opløst i HOMGY, og pladen overføres til det levende celleanalyseinstrument (materialetabel) inden for en 37 °C og 5 % CO2 inkubator.
- Under ikonet Planlæg i live-celleanalysesoftwaren (Materialetabel) skal du klikke på ikonet Start Tilføj nyt fartøj og indstille scanningsfrekvensen til at scanne efter en tidsplan. Opret et nyt Whole Well-fartøj under Scanningstype, angiv scanningsindstillingerne (dvs. fase for billedkanaler og 4x for mål), og klik på Næste.
- Vælg pladeproducenten og katalognummeret på den medfølgende liste. Under ikonet Planlæg skal du vælge plussymbolet, hvor pladen skal placeres i det levende celleanalyseinstrument. Vælg det ønskede scanningsmønster, og opret derefter et pladekort ved at vælge "+" på siden Pladelayout. Vælg Udskyd analysen til senere, og angiv derefter scanningsplanen for hver 4 timer i 24 timer, og bekræft anskaffelsesindstillingerne på siden Oversigt over fartøjsguiden . Til sidst skal du vælge Føj til tidsplan.
- Når 24-analysen er fuldført, skal du dobbeltklikke på Fartøjsnavn under ikonet Vis og eksportere billeder og film. Vælg brønde og en række billeder, der skal vises og eksporteres som en JPEG. Analyser billeder for procent sårheling ved hjælp af Sårhelingsstørrelsesplugin til ImageJ21, i henhold til trin 2.4. under.
- Analyse af ridsesår
- Åbn ImageJ-software. Upload billederne af det ridsesårede assay (. TIFF eller .JPG).
- Vælg Billede > Type > 8-bit for at ændre billedet fra 24-bit RGB til 8-bit . Installer plugin'et til sårhelingsstørrelse ved at vælge Plugins > makroer > Installer > plugin til sårhelingsstørrelse.
- Drej billedet, så ridsen er lodret, og initialiser plugin'et Til sårhelingsstørrelse.
- Vælg plugin-parametrene i dialogboksen for bedst at passe til ridseviklet. Angiv værdien af parametrene for indstillinger for sårhelingsstørrelse på følgende måde: Variansvinduesradius ved 20, Tærskelværdi ved 100 og Procentdel af mættede pixel ved 0,001, og vælg Ja for Angiv global skala. Afslut valget ved at klikke på OK knap. Kontroller, om det valgte område er sårområdet. Ovenstående parametre kan kræve standardisering fra laboratorium til laboratorium.
- Trin 2.4.2.-2.4.4 gentages. for de resterende tidspoint for hver ridse.
- Beregn procentdelen af ridseområdets sårheling af migrerende eller prolifererende celler over 24 timer som følger:
% sårheling =
hvor T 0 = % areal på tidspunktet 0 h og Tc = % areal ved 0 h, 4 h, 12 h eller 24 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningerne af HA på vævsreparation og sårheling i forskellige væv og organer er veldokumenterede; Imidlertid er de specifikke virkninger af HA med en molekylvægt på 35 kDa på føtal eller neonatal tyndtarmheling og regenerering i øjeblikket ukendt. For at teste HA35's evne til at fremme sårheling i en model af fosteret eller neonatal tyndtarmen genererede vi 3D-tarmenteroider fra NHP-ilealvæv og dissocierede yderligere dette væv i enkeltceller for at skabe 2D enteroidafledte monolag (figur 1A, B). Monolagene blev dyrket til sammenløb og manuelt ridset ved hjælp af en P200 pipettespids (figur 1B, C). Monolag blev derefter behandlet med HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller kontrol (PBS). Cellemigration og spredning i hullet blev afbildet hver 4. time i alt 24 timer ved hjælp af et mikroskop med transmitteret lys udstyret til levende cellebilleddannelse22. Hastigheden af sårlukning, et mål for hastigheden af cellemigration, blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ som procent sårheling ved hjælp af Wound Healing Size Plugin21 (figur 2). Kradseområdet og cellemigrationshastigheden og procentdelen af sårlukning blev målt over 24 timer (trin 2.4.6.). Som vist i figur 3 resulterede eksponering for HA35 i en dosis- og tidsafhængig stimulering af cellemigration/-proliferation, hvilket førte til accelereret sårlukning. HA35 ved 100 μg/ml og 200 μg/ml øgede helingen signifikant med ~1,5-2,5 gange i forhold til kontrol ved både 4 timer og 12 timer (*p < 0,05).
Figur 1. Enteroid generation og enteroid-afledt monolag sårheling assay procedure. (A) Kultur af tredimensionale ikke-menneskelige primat intestinale enteroider, der anvendes til at dissociere i (B) todimensionale monolag. (C) Monolag blev dyrket til >90% sammenløb i en 24-brønds plade og derefter behandlet med hyaluronsyre 35 kDa eller fosfatbufferet saltvand i 24 timer. Monolag blev derefter ridset med en P200 pipettespids. Skala bar = 800 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Sårhelende assay billeder og analyse. Repræsentative billeder af hyaluronsyre 35 kDa (100 μg/ml, 200 μg/ml) og kontrolbehandlinger af enteroidmonolag af ikke-humane primater. Billeder blev opnået ved 0 timer, 4 timer, 12 timer, 16 timer og 24 timer efter at have udført en ridse med en P200 pipettespids. Billeder blev taget ved 4x forstørrelse med live-celle analyseinstrumentet og analyseret i ImageJ ved hjælp af Wound Healing Size Plugin. Procent sårheling blev beregnet ud fra migrerende / prolifererende celler over 24 timer. Skala bar = 800 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Virkning af hyaluronsyre 35 kDa (HA35) på sårheling i enteroid monolag. Ændring i sårheling over tid i enteroidmonolag, afhængig af HA35-behandlingskoncentration. HA35 øgede sårhelingen signifikant efter 4 timer og 12 timer ved 100 μg/ml og 200 μg/ml sammenlignet med kontrollen, men helingshastighederne konvergerede blandt behandlingerne med 24 timer. Signifikansen blev vurderet ved hjælp af Student's t-test ved *p < 0,05, præsenteret som middel ± standardfejl af middelværdien (SEM ) (n = 6 brønde pr. Behandling). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mave-tarmkanalen hos et for tidligt født barn er under kontinuerligt regenerativt pres fra gentagne eksponeringer for miljømæssige fornærmelser forbundet med dysbiose, inflammatoriske bakterielle metabolitter og toksiner og intermitterende hypoxi23,24. Desværre er tarmepitelet hos det for tidligt fødte spædbarn ikke i stand til hurtigt at etablere funktionel integritet23, hvilket resulterer i barrieredysfunktion, øget tarmpermeabilitet og i alvorlige tilfælde voldsom tarmbetændelse og NEC-udvikling.
Glycosaminoglycaner (GAG'er) er en klasse af polysaccharider, der er fremherskende i modermælk, som er potentielle bioaktive faktorer, der beskytter mod udviklingen af NEC15,16. HA er en lineær polymer af gentagne disaccharider af glucuronsyre og N-acetylglucosamin25,26 fremstillet af hyaluronansyntaser. HA kan have enten pro- eller antiinflammatoriske egenskaber afhængigt af størrelse og vævsmiljø27,28. I tarmen og tyktarmen er endogen HA til stede i det ekstracellulære rum ved siden af kryptepitelceller og driver epitelproliferation og normal tarmvækst 29,30,31. HA er også en naturlig bestanddel i HM og produceres i de højeste koncentrationer i de første uger af laktation30. Især HA renset fra HM eller kommercielt tilgængelig HA med molekylvægt ~ 35 kDa (HA 35) beskytter mod bakterieinduceret colitis ved at øge ekspressionen af det antimikrobielle β-defensin og TJ-proteinet ZO-1 i kolonepitelet in vivo og vitro25,27. Det er vigtigt at bemærke, at blandt alle de specifikke HA (4,7 kDa, 16 kDa, 28 kDa, 74 kDa) er HA35 den mest potente inducer af TJ-proteiner og antimikrobiel peptidekspression i kolonepitelet in vitro. Desuden udøver stor MW HA (~ 2.000 kDa) ingen effekt på TJ-proteinekspression, hvilket indikerer, at disse virkninger er størrelsesspecifikke32. Vi viste også, at oral administration af HA35 fremskynder tyndtarmsmodning, fremmer epitelproliferation og differentiering og beskytter mod udvikling af NEC16. Her testes HA35's evne til at fremme sårheling ved hjælp af et in vitro ridse-sårhelingsassay. Ved hjælp af de ovenfor beskrevne modeller blev det konstateret, at HA35 fremskynder sårlukning på en koncentrationsafhængig måde ved 4 timer og 12 timer efter ridse sammenlignet med kontrol, hvilket afklarer et kritisk hul i viden om virkningerne af specifikt dimensioneret HA på tarmsårheling og vævsreparation og dermed bekræfter en gavnlig rolle for HA35 i neonatal tarmsårheling. Selvom mekanismen, hvormed HA35 udøver denne effekt, er ukendt, viste forfatternes tidligere data i musehvalpe, at det mekanistiske mål for rapamycin (mTOR) kompleks 1 (mTORC1) vej blev opreguleret i ilealvæv efter HA35 behandling16. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme bidraget fra denne vej til disse observerede virkninger.
Flere in vitro-modeller er blevet brugt til at undersøge interventioner, der fremmer tarmregenerering, helbredelse og reparation. Det mest anvendte in vitro-assay til tarmsår og efterfølgende reparation er ridsesårassayet, der oftest udføres i kolorektal cancer (CRC) cellemonolag33,34. Den fysiologiske relevans af en sådan model for den for tidlige spædbarnstarm er imidlertid begrænset, da sårreparation af CRC-celler er så stærkt afhængig af kræftcellernes stærkt proliferative karakter snarere end stamcelledrevne reparationsprocesser18. Den nylige evne til at isolere og vedligeholde enteroider afledt af krypter af tarmepitel giver mulighed for at udforske et mere fysiologisk relevant tarmrespons på en lang række immune eller skadelige stimuli samt mulige terapeutiske interventioner35. Enteroider indeholder alle de differentierede epitelcelletyper, der findes i tarmsegmentet, hvorfra de er afledt, og tjener således som en effektiv model til undersøgelse af tarmbarriereskader og reparation36,37,38.
Beskrevet heri er etablering og vedligeholdelse af en in vitro enteroid model af tarmepitelskader og reparation ved hjælp af ileum fra for tidlig NHP. Denne model giver mulighed for undersøgelse af mekanistiske veje og terapeutiske interventioner involveret i epitelheling og regenerering. Et kritisk skridt i denne protokol er oprettelsen af et veldefineret hul med en lignende bredde, hvilket minimerer variationen mellem brønd og brønd. Derudover skal pipettespidsen opretholde konstant kontakt med bunden af brønden for rent at fjerne cellelaget, når monolagene ridses. Overdreven tryk bør undgås for at forhindre "løft" af sårets kanter. På samme måde skal PBS-vasketrinnet efter såring udføres forsigtigt ved hjælp af brøndens sidevæg for at undgå beskadigelse af det resterende monolag eller yderligere udvidelse af sårgabet. Endelig skal man undgå at holde pladen under 37 °C i længere perioder for at sikre, at ECM-belægningen på pladen forbliver gellignende, og at monolaget ikke forstyrres på grund af ændringer i ECM-viskositeten.
Selvom denne model har forskellige fordele i forhold til traditionel cellekultur, er den teknisk mere krævende, dyr og tidskrævende sammenlignet med det traditionelle sårhelingsassay i CRC-monolag. Desuden er konsistens i de anvendte reagenser og medier afgørende for at sikre overlevelse og korrekt vedligeholdelse af disse kulturer, ligesom vedligeholdelse af celler, reagenser og ECM ved korrekte temperaturer. Endelig er primære tarmmonolag notorisk kortvarige, så sårassayet beskrevet her skal udføres kort efter, at monolagskonfluens er opnået.
Samlet set tyder disse resultater på, at små intestinale enteroide monolag kan bruges som en ny model til at undersøge intestinal epitelregenerering gennem processerne med cellemigration og spredning efter sår. Derudover giver enteroider et meget mere fysiologisk oversætteligt væv til at studere effekter på differentieret tarmcellelevedygtighed. Sådanne modeller kan udgøre en platform til dissekering af de mekanismer, der regulerer reparation af epitel, og hjælpe med at identificere nye terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre og ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. HC er støttet af tilskud P20GM134973 fra National Institutes of Health. KB er støttet af en Children's Hospital Foundation (CHF) og Presbyterian Health Foundation (PHF) bevilling. Live-cell imaging tjenester leveret af Cancer Functional Genomics kerne blev støttet dels af National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 og National Cancer Institute Grant P30CA225520 fra National Institutes of Health, tildelt University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
