Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å etablere og utføre en ripesåranalyse på todimensjonale (2D) monolag avledet fra tredimensjonale (3D) enteroider isolert fra ikke-human primat ileum.
Abstract
In vitro scratch såranalyser brukes ofte til å undersøke mekanismene og egenskapene til epitelheling i en rekke vevstyper. Her beskriver vi en protokoll for å generere et todimensjonalt (2D) monolag fra tredimensjonale (3D) ikke-humane primat-enteroider avledet fra tarmkrypter i terminal ileum. Disse enteroid-avledede monolagene ble deretter brukt i en in vitro ripesåranalyse for å teste evnen til hyaluronan 35 kDa (HA35), en human melk HA-etterligning, for å fremme cellemigrasjon og spredning langs epitelsårkanten. Etter at monolagene ble dyrket til sammenløp, ble de manuelt riper og behandlet med HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) eller kontroll (PBS). Cellemigrasjon og spredning i gapet ble avbildet ved hjelp av et overført lysmikroskop utstyrt for levende celleavbildning. Sårlukking ble kvantifisert som prosent sårheling ved hjelp av Wound Healing Size Plugin i ImageJ. Ripeområdet og hastigheten på cellemigrasjon og prosentandelen av sårlukking ble målt over 24 timer. HA35 in vitro akseler sårheling i små intestinale enteroide monolag, sannsynligvis gjennom en kombinasjon av celleproliferasjon ved sårkanten og migrasjon til sårområdet. Disse metodene kan potensielt brukes som en modell for å utforske intestinal regenerering i for tidlig menneskelig tynntarm.
Introduction
Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en av de vanligste gastrointestinale nødsituasjonene hos premature spedbarn1. Sykdommen er preget av alvorlig tarmbetennelse som raskt kan forverres til tarmnekrose, sepsis og potensielt død. Selv om etiologien er uklar, tyder bevis på at NEC er multifaktoriell og resultatet av en kompleks interaksjon av fôring, unormal bakteriell kolonisering og et umodent tarmepitel 2,3. Premature spedbarn har økt intestinal permeabilitet, unormal bakteriell kolonisering og lav enterocytt regenerativ kapasitet4,5, noe som øker risikoen for tarmbarrieredysfunksjon, bakteriell translokasjon og NEC-utvikling. Derfor er identifisering av strategier eller inngrep for å akselerere tarmepitelmodning og fremme regenerering eller helbredelse av tarmepitelet avgjørende for å forhindre denne dødelige sykdommen.
Studier har vist at morsmelk (HM) er beskyttende mot NEC hos premature spedbarn 6,7,8,9,10,11. Både menneskelige og dyreforsøk har vist at storfebasert formel øker tarmpermeabiliteten og er direkte giftig for tarmepitelceller 2,12. Selv om det ikke er fullstendig belyst, tyder bevis på at de beskyttende effektene av HM er mediert gjennom bioaktive komponenter som laktoferrin, immunoglobulin A (IgA) og HM oligosakkarider13. HM er også rik på hyaluronan (HA), et unikt ikke-sulfatert glykosaminoglykan med repeterende D-glukuronsyre og N-acetyl-D-glukosamindisakkarider14,15. Det er viktig at vi har vist at oral 35 kDa HA (HA35), en HM HA-etterligning, demper alvorlighetsgraden av tarmskade, forhindrer bakteriell translokasjon og reduserer dødeligheten i en murine NEC-lignende tarmskademodell16,17.
Her undersøkes effekten av HA35 på tarmheling og regenerering in vitro videre. For tiden er den mest brukte in vitro-analysen for tarmsår og reparasjon en ripesåranalyse utført i kolorektal kreft (CRC) cellemonolag. Den fysiologiske relevansen av en slik modell for premature spedbarns tarm er begrenset, da sårreparasjon av CRC-celler er avhengig av den svært proliferative naturen til kreftceller i stedet for stamcelledrevne reparasjonsprosesser18. For å overvinne denne begrensningen er etableringen av en 2D enteroid ripesårmodell, inkludert prosedyren for å isolere og vedlikeholde primære stamcelleavledede tynntarm-enteroider fra premature ikke-menneskelige primater (NHP), beskrevet her. Gitt for tidlig NEC er oftest rapportert i distal tynntarm, gir bruk av primære epitelcelleorganoider i en modell for tarmskade og reparasjon en mer fysiologisk oversettbar in vitro-modell sammenlignet med eksisterende modeller som benytter tradisjonelle kolorektale monolag18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer i denne studien ble godkjent av University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Etter institusjonell godkjenning ble fosterets tynntarmsprøver fra en for tidlig ikke-menneskelig primat (NHP, 90% svangerskap, olivenbavian, Papio anubis) oppnådd etter eutanasi for en egen studie (protokoll # 101523-16-039-I) 20.
1. Etablering av premature ikke-humane primater 3D intestinal enteroider
- Media forberedelse
MERK: Media kan tilberedes inntil 1 uke i forkant av kryptisolering etter standard aseptisk teknikk. Penicillin/streptomycin (endelig konsentrasjon 1 %) kan brukes i stedet for bredspektret antibiotika til primærceller om ønskelig.- Forbered humane organoide vekstmedier + Y-27632 (HOGMY) ved å blande 50 ml organoid vekstmedium humant basalmedium med 50 ml organoidtilskudd (materialtabell). Tilsett 200 μL av bredspektret antibiotika (endelig konsentrasjon 100 μg / ml) (Materialtabell) og Y-27632 (til en endelig konsentrasjon på 10 μM). Varm på benken til romtemperatur.
- Forbered humane organoide vekstmedier (HOGM) ved å blande 50 ml organoid vekstmedium humant basalmedium med 50 ml organoidtilskudd. Tilsett 200 μL av de bredspektrede antibiotika (100 μg / ml). Varm på benken til romtemperatur.
MERK: HOGM vil bli brukt ved bytte av medier utover de første 2-3 dagene etter passasje. - Avkjøl 100 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) uten kalsium eller magnesium til det er iskaldt.
- Forbered 50 ml vaskebuffer ved å kombinere 1x PBS uten kalsium eller magnesium med 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Avkjøl den til iskald.
- Forbered DMEM-F12 vaskebuffer ved å tilsette 1 ml bredspektret antibiotika (100 μg / ml) til 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Hold det iskaldt.
- Kryptisolasjon og plating
MERK: Ekstracellulær matriks (ECM)-basert hydrogel må forbli på isen under hele prosedyren. Denne prosedyren forutsetter nok vev til å fylle seks ECM-baserte hydrogelkupler. Hvis en annen tetthet av krypter høstes, bør kuppelnummeret endres tilsvarende.- Tine 150 μL vekstfaktor redusert (GFR) basalmembranekstrakt (BME) (fenol rødfritt) over natten på isen ved 2-8 °C.
- Inkuber en 24-brønns, flatbunnet, vevskulturbehandlet polystyrenplate i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i minst 30 minutter før bruk.
- Etter NHP-eutanasi og vevssamling, skyll ileumsegmentet av rusk med en 1,000 μL pipettespiss ved hjelp av iskald 1x PBS i en engangs petriskål.
MERK: Ferskt vev må høstes raskt og holdes iskaldt for å høste sunne enteroider. - Klipp ileum i lengderetningen langs hele tarmen, og vask med iskald PBS 3x. Hakk vevet i små fragmenter (ca. 2 mm i lengde) med steril saks over et 50 ml konisk rør som inneholder 15 ml iskald PBS, fra den delen av ilealsegmentet som er nærmest røret.
- Bruk en 10 ml serologisk pipette for å forstyrre kryptene ved å pipettere opp og ned 5-10x. La vevssegmentene slå seg til bunnen av røret, fjern deretter supernatanten og erstatt den med frisk, iskald PBS. Gjenta denne prosessen minst 7x-10x til supernatanten er klar og fri for rusk.
- Når det er klart, fjern supernatanten og resuspender kryptene i 25 ml celledissosiasjonsreagens. Plasser røret på en gyngeplattform ved 20 o / min i 15 minutter ved romtemperatur.
- Fjern røret fra rockeren, la cellene slå seg ned i omtrent 30 s til 1 min, og fjern supernatanten. Tilsett 10 ml iskald vaskebuffer. Pipette opp og ned med en p1000 pipette for ytterligere dissosiering i enkle krypter.
- Filtrer vevet gjennom en 70 μm cellesil i et nytt 50 ml konisk rør. Skyll det originale 50 ml koniske røret med 10 ml iskald vaskebuffer og filtrer gjennom silen på 70 μm for å sikre at alle kryptene er fjernet fra det opprinnelige røret. Gjenta denne vaskingen av vev i totalt 4x skyll.
- Sentrifuge filtratet ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten. Tilsett 600 μL HOGMY og avbryt pelleten ved å pipettere opp og ned med en 200 μL pipette. Legg røret på is til løsningen blir iskald.
MERK: Hvis løsningen ikke er iskald, vil kuppelen ikke opprettholde riktig struktur når den er belagt. Unngå å introdusere bobler ved pipettering av ECM-baserte hydrogelkupler, da bobler vil forhindre riktig festing til platebunnen. - Tilsett 600 μL iskald ECM-basert hydrogel for å suspendere cellepelleten og bland godt med en 200 μL pipette.
- Fjern 24-brønnsplaten fra inkubatoren og legg den på en 37 ° C platevarmer. Pipette 50 μL iskald HOGMY/ECM-basert hydrogelblanding inn i midten av 24 brønner i en 24-brønns kulturplate (50 μL per kuppel).
- Når de er belagt, la kuplene sitte på en 37 ° C platevarmer i 1 minutt for å tillate feste seg til bunnen av platen. Vend platen forsiktig, sørg for at det ikke har samlet seg kondens på bunnen av platen, og plasser den omvendte platen i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 15 minutter dreier du platen med høyre side opp og pipetter 750 μL romtemperert HOGMY inn i hver brønn.
MERK: Pipettemedier sakte på sideveggen av brønner, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer den nydannede 3D ECM-baserte hydrogelkuppelen. - Når alle brønnene er fylt med media, plasser platen i inkubatoren og bytt media hver 3. dag med 750 μL HOGM. Passasje enteroider hver 7-10 dager.
- Intestinal enteroid passaging
MERK: Følgende protokoll er for en 24-brønns kulturplate som inneholder NHP-enteroider med en delt hastighet på 1: 2.- Fjern enteroidmediet fra hver brønn, vær forsiktig så du ikke forstyrrer ECM-kuppelen som inneholder enteroider, tilsett 500 μL iskald celledissosiasjonsreagens til hver brønn ved hjelp av en 1000 μL pipette, og inkuber ved romtemperatur i 1 min.
- Avbryt ECM manuelt ved å pipettere opp og ned 8-12x. Overfør innholdet i 12 brønner til ett 15 ml konisk rør.
- Når all løsningen er samlet inn fra 24-brønnskulturplaten, tilsett 250 μL celleforstyrrelsesreagens til hver brønn for å sikre at alle NHP-enteroider er fjernet fra hver brønn, og tilsett denne siste skyllingen til de eksisterende 15 ml koniske rørene.
- Plasser på en gyngeplattform ved 40 o / min i 15 minutter ved romtemperatur (20 ° C). Alternativt kan du riste rørene manuelt i 15 minutter ved romtemperatur.
- Etter 15 min, sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten fra 15 ml rørene til bare pelleten gjenstår.
- Tilsett 8 ml iskald DMEM + bredspektret antibiotika til ett 15 ml konisk rør, og sørg for at pelleten er tilstrekkelig forstyrret. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Tilsett 600 μL HOGMY og forstyrr pelleten ved å pipettere opp og ned med en pipette på 1000 μL. Legg røret på is til løsningen blir iskald. Når løsningen er iskald, tilsett 600 μL iskald ECM for å suspendere cellepelleten og bland godt med en pipette på 1000 μL. Gjenta trinn 1.3.2.-1.3.7. for de resterende 12 brønnene.
- For de resterende trinnene, se trinn 1.2.11.-1.2.16.
2. Etablering av enteroid monolag og ripesåranalyse
- Media og behandlingspreparater
- Avkjøl 5 ml PBS uten kalsium eller magnesium til iskaldt.
- Forbered DMEM-F12 vaskebuffer ved å tilsette 1 ml bredspektret antibiotika (100 μg / ml) til 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Hold iskaldt.
- Forbered 100 ml HOGMY, som beskrevet i trinn 1.1.1., og varm den på benken til romtemperatur.
- Varm 25 ml 0,25 % trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i et vannbad på 37 °C.
- Forbered 50 μg / ml, 100 μg / ml og 200 μg / ml konsentrasjoner av HA35 for cellebehandling, ved bruk av steril PBS uten kalsium eller magnesium som løsningsmiddel. Den endelige fortynningen av HA35 vil bruke HOMGY som oppløsningsvæske.
MERK: HA35-preparat kan kreve flere fortynninger, da HA35 ofte kommer ut av oppløsningen i en konsentrasjon større enn 5 mg / ml.
- Enteroid monolagsdannelse
MERK: Følgende prosedyre gir volumer som er tilstrekkelige for generering av en 24-brønns plate av enteroide monolag. Juster volumene for ønsket antall monolag.- Tin 96 μL ECM-basert hydrogel BME (fenol rødfri) over natten på is ved 2-8 °C. Fortynn ECM-basert hydrogel i iskald PBS uten kalsium eller magnesium i forholdet 1:50. Belegg hver brønn av en 24-brønns vevskulturplate med 200 μL iskald fortynnet ECM-basert hydrogel.
- Inkuber den ECM-baserte hydrogelbelagte platen i minst 1 time ved 37 °C og 5 % CO2. Aspirate medier fra 24-brønns kulturplaten som inneholder 3D-enteroider bestemt for monolag og erstatte med 500 μL celledissosiasjonsreagens / brønn.
- Manuelt forstyrre ECM-baserte hydrogelkupler ved pipettering opp og ned 8x-12x og overføre innholdet i 12 brønner til et 15 ml konisk rør.
- Vask de 12 tomme brønnene med 250 μL celledissosiasjonsreagens for å sikre at alle enteroider er fjernet og overfør innholdet til et 15 ml konisk rør. Gjenta trinn 2.2.5. og trinn 2.2.6. for de resterende 12 brønnene med et annet konisk rør på 15 ml.
- Sentrifuge de koniske rørene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten. Tilsett 10 ml iskald DMEM-F12 vaskebuffer til 15 ml koniske rør og heng opp enteroidpellets ved å snu rørene. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepellets i 12 ml 37 °C Trypsin-EDTA. Plasser rørene i et 37 ° C vannbad i 10 minutter eller til cellene virker løselige. Tilsett 3 ml DMEM-F12 vaskebuffer til hvert rør for å fortynne Trypsin-EDTA, bland ved å snu rørene og legg på is.
- Filtrer de dissosierte enteroider gjennom en 37 μM maskecelle sil, samle innholdet i rene 15 ml koniske rør. Sentrifuge rørene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Mens cellene pelleterer i sentrifugen, fjern den ECM-baserte hydrogelbelagte platen fra inkubatoren og aspirer overflødig ECM-basert hydrogelløsning uten å skrape den belagte overflaten eller la platen tørke helt.
- Fjern supernatanten fra de koniske rørene og resuspender cellepellets med 6 ml HOMGY. Tilsett 500 μL av den kombinerte 12 ml HOMGY-cellesuspensjonen i hver brønn i 24-brønnsplaten belagt med ECM-basert hydrogel ved en såtetthet på omtrent 3 x 105 celler / brønn. Virvle platen med et lokk på for å sikre en jevn fordeling av celler i brønnene.
- Inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO 2, og utveksle HOMGY-medier hver2 . dag til monolagene når >90% sammenløp.
- Monolagsbehandling og riper såranalyse
- Når monolagene når >90% sammenløp, aspirerer media for å fjerne celler som ikke klarer å feste seg. Behandle celler med 500 μL HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) eller PBS, oppløst i HOMGY, i 24 timer.
- Etter 24 timer, fjern mediet, vær forsiktig så du ikke forstyrrer overflaten av monolaget. Bruk en 200 μL pipettespiss, lag en lineær ripe over monolagets fulle overflatediameter i hver brønn, og vær forsiktig så du ikke lar monolag tørke.
- Vask de ripete monolagene 1x med 500 μL 1x PBS. Tilsett 500 μL HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) eller PBS oppløst i HOMGY og overfør platen til live-celleanalyseinstrumentet (Table of Materials) innen en 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
- Under Schedule-ikonet i live-celleanalyseprogramvaren (Table of Materials), klikk på ikonet Launch Add New Vessel Wizard og angi skannefrekvensen for å skanne etter en tidsplan. Opprett et nytt Whole Well-fartøy under Scan Type, spesifiser skanneinnstillingene (dvs. Phase for Image Channels og 4x for Objective), og klikk på Next.
- Velg plateprodusenten og katalognummeret fra den angitte listen. Under Tidsplan-ikonet velger du plusssymbolet der platen skal plasseres i live-celleanalyseinstrumentet. Velg ønsket skannemønster, og opprett deretter et platekart ved å velge "+" på plateoppsettsiden. Velg Utsett analyse til senere, og angi deretter skanneplanen for hver 4. time i 24 timer og kontroller innhentingsinnstillinger på siden Sammendrag av fartøyveiviser . Til slutt velger du Legg til i tidsplan.
- Når 24-analysen er fullført, dobbeltklikker du på Fartøynavn under Vis-ikonet og eksporterer bilder og filmer. Velg brønner og en serie bilder som skal vises og eksporteres som JPEG. Analyser bilder for prosent sårheling ved hjelp av Wound Healing Size Plugin for ImageJ21, i henhold til trinn 2.4. under.
- Analyse av skrapesår
- Åpne ImageJ-programvare. Last opp bildene av skrapesåranalysen (. TIFF eller .JPG).
- Velg Bilde > Skriv inn > 8-biters for å endre bildet fra 24-biters RGB til 8-biters. Installer Wound Healing Size Plugin ved å velge Plugins > Macros > Install > Wound Healing Size Plugin.
- Roter bildet slik at ripen er vertikal og initialiser plugin-modulen Wound Healing Size Tool.
- Velg plugin-parameterne i dialogboksen for å passe best mulig til ripesåret. Angi verdien for parameterne for alternativer for sårhelingsstørrelse på følgende måte: Variansvinduradius ved 20, Terskelverdi ved 100 og Prosent av mettede bildepunkter ved 0,001, og velg Ja for Angi global skalering. Fullfør valget ved å klikke på OK-knappen . Kontroller om det valgte området er sårområdet. Ovennevnte parametere kan kreve standardisering fra laboratorium til laboratorium.
- Gjenta trinn 2.4.2.-2.4.4. for de gjenværende tidspunktene for hver ripe.
- Beregn prosentandelen av sårheling i skrapeområdet av migrerende eller prolifererende celler over 24 timer som følger:
% sårtilheling =
hvor T 0 = % areal ved tidspunkt 0 t og Tc = % areal ved 0 t, 4 timer, 12 timer eller 24 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektene av HA på vevsreparasjon og sårheling i ulike vev og organer er godt dokumentert; Imidlertid er de spesifikke effektene av HA med en molekylvekt på 35 kDa på føtal eller neonatal tilheling og regenerering av tynntarm ukjent. For å teste HA35s evne til å fremme sårheling i en modell av føtal eller neonatal tynntarm, genererte vi 3D-intestinale enteroider fra NHP-ilealvev og dissosierte dette vevet ytterligere i enkeltceller for å lage 2D enteroid-avledede monolag (figur 1A, B). Monolagene ble dyrket til sammenløp og manuelt riper ved hjelp av en P200 pipettespiss (figur 1B, C). Monolag ble deretter behandlet med HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller kontroll (PBS). Cellemigrasjon og spredning i gapet ble avbildet hver 4. time i totalt 24 timer ved hjelp av et overført lysmikroskop utstyrt for levende celleavbildning22. Frekvensen av sårlukking, et mål på hastigheten på cellemigrasjon, ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ som prosent sårheling ved hjelp av Wound Healing Size Plugin21 (figur 2). Ripeområdet og hastigheten på cellemigrasjon og prosentandelen av sårlukking ble målt over 24 timer (trinn 2.4.6.). Som vist i figur 3 resulterte eksponering for HA35 i en dose- og tidsavhengig stimulering av cellemigrasjon/proliferasjon, noe som førte til akselerert sårlukking. HA35 ved 100 μg/ml og 200 μg/ml økte tilhelingen signifikant med ~1,5-2,5 ganger i forhold til kontrollen ved både 4 timer og 12 timer (*p < 0,05).
Figur 1. Enteroid generasjon og enteroid-avledet monolayer sårheling analyse prosedyre. (A) Kultur av tredimensjonale ikke-humane primat-intestinale enteroider som brukes til å dissosiere til (B) todimensjonale monolag. (C) Monolag ble dyrket til >90% sammenløp i en 24-brønns plate og deretter behandlet med hyaluronsyre 35 kDa eller fosfatbufret saltvann i 24 timer. Monolag ble deretter riper med en P200 pipettespiss. Skala bar = 800 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Sårheling analysebilder og analyse. Representative bilder av hyaluronsyre 35 kDa (100 μg/ml, 200 μg/ml) og kontrollbehandling av ikke-humane primat-enteroide monolag. Bilder ble tatt ved 0 timer, 4 timer, 12 timer, 16 timer og 24 timer etter å ha utført en ripe med en P200 pipettespiss. Bilder ble tatt ved 4x forstørrelse med live-celleanalyseinstrumentet og analysert i ImageJ ved hjelp av Wound Healing Size Plugin. Prosent sårheling ble beregnet fra migrerende / prolifererende celler over 24 timer. Skala bar = 800 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Effekt av hyaluronsyre 35 kDa (HA35) på sårheling i enteroide monolag. Endring i sårtilheling over tid i enteroide monolag, avhengig av behandlingskonsentrasjonen med HA35. HA35 økte sårtilhelingen signifikant etter 4 timer og 12 timer ved 100 μg/ml og 200 μg/ml sammenlignet med kontroll, men tilhelingsraten konvergerte mellom behandlingene med 24 timer. Signifikans ble vurdert med Student t-test ved *p < 0,05, presentert som gjennomsnitt ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM) (n = 6 brønner per behandling). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mage-tarmkanalen til et for tidlig spedbarn er under kontinuerlig regenerativt press fra gjentatte eksponeringer for miljømessige fornærmelser forbundet med dysbiose, inflammatoriske bakterielle metabolitter og toksiner, og intermitterende hypoksi23,24. Dessverre er tarmepitelet til det premature spedbarnet ikke i stand til raskt å etablere funksjonell integritet23, noe som resulterer i barrieredysfunksjon, økt intestinal permeabilitet og i alvorlige tilfeller voldsom tarmbetennelse og NEC-utvikling.
Glykosaminoglykaner (GAGs) er en klasse av polysakkarider som er utbredt i morsmelk hos mennesker, og som er potensielle bioaktive faktorer som beskytter mot utviklingen av NEC15,16. HA er en lineær polymer av repeterende disakkarider av glukuronsyre og N-acetylglukosamin25,26 produsert av hyaluronansyntaser. HA kan ha enten pro- eller antiinflammatoriske egenskaper avhengig av størrelse og vevsmiljø27,28. I tarm og tykktarm er endogen HA tilstede i det ekstracellulære rommet ved siden av kryptepitelceller og driver epitelproliferasjon og normal tarmvekst 29,30,31. HA er også en naturlig komponent i HM og produseres i høyeste konsentrasjoner i løpet av de første ukene av laktasjon30. Spesielt beskytter HA renset fra HM eller kommersielt tilgjengelig HA med molekylvekt ~ 35 kDa (HA 35) mot bakterieindusert kolitt ved å øke uttrykket av antimikrobiell β-defensin og TJ-proteinet ZO-1 i kolonepitelet in vivo og vitro25,27. Det er viktig å merke seg at blant alle spesifikke HA (4,7 kDa, 16 kDa, 28 kDa, 74 kDa), er HA35 den mest potente induktoren av TJ-proteiner og antimikrobiell peptiduttrykk i kolonepitelet in vitro. Videre utøver stor MW HA (~ 2000 kDa) ingen effekt på TJ-proteinuttrykk, noe som indikerer at disse effektene er størrelsesspesifikke32. Vi viste også at oral administrering av HA35 akseler tarmmodning, fremmer epitelproliferasjon og differensiering, og beskytter mot utvikling av NEC16. Her testes HA35s evne til å fremme sårheling ved hjelp av en in vitro sårhelingsanalyse. Ved hjelp av modellene beskrevet ovenfor ble det funnet at HA35 akseler sårlukking på en konsentrasjonsavhengig måte ved 4 timer og 12 timer etter riper sammenlignet med kontroll, og klargjør et kritisk gap i kunnskap om effekten av spesifikt størrelse HA på intestinal sårheling og vevsreparasjon og dermed bekrefter en gunstig rolle av HA35 i neonatal intestinal sårheling. Selv om mekanismen som HA35 utøver denne effekten er ukjent, viste forfatternes tidligere data i museavkom det mekanistiske målet for rapamycin (mTOR) kompleks 1 (mTORC1) -banen ble oppregulert i ilealvev etter HA35-behandling16. Ytterligere studier er nødvendig for å bestemme bidraget fra denne veien til disse observerte effektene.
Flere in vitro-modeller har blitt brukt til å undersøke intervensjoner som fremmer intestinal regenerering, helbredelse og reparasjon. Den mest brukte in vitro-analysen for tarmsår og påfølgende reparasjon er ripesåranalysen, utført oftest i kolorektal kreft (CRC) cellemonolag33,34. Den fysiologiske relevansen av en slik modell for for tidlig spedbarns tarm er imidlertid begrenset, da sårreparasjon av CRC-celler er så sterkt avhengig av kreftcellers svært proliferative natur i stedet for stamcelledrevne reparasjonsprosesser18. Den nylige evnen til å isolere og vedlikeholde enteroider avledet fra krypter av tarmepitel gir en mulighet til å utforske en mer fysiologisk relevant tarmrespons på en rekke immun- eller skadelige stimuli, samt mulige terapeutiske inngrep35. Enteroider inneholder alle de differensierte epitelcelletypene som finnes i tarmsegmentet som de er avledet fra, og fungerer dermed som en effektiv modell for å studere tarmbarriereskader og reparasjon36,37,38.
Beskrevet her er etablering og vedlikehold av en in vitro enteroid modell av tarmepitelskader og reparasjon ved bruk av ileum fra for tidlig NHP. Denne modellen tillater undersøkelse av mekanistiske veier og terapeutiske inngrep involvert i epitelhelbredelse og regenerering. Et kritisk trinn i denne protokollen er å skape et veldefinert gap med tilsvarende bredde, noe som minimerer brønn-til-brønn-variasjon. I tillegg, når du skraper monolagene, bør pipettespissen opprettholde konstant kontakt med bunnen av brønnen for å fjerne cellelaget rent. Overdreven trykk bør unngås for å forhindre "løfting" av sårets kanter. På samme måte bør PBS-vasketrinnet etter sår utføres forsiktig, ved hjelp av sideveggen på brønnen, for å unngå skade på det gjenværende monolaget eller ytterligere utvidelse av sårgapet. Til slutt må man unngå å holde platen under 37 °C i lengre perioder for å sikre at ECM-belegget på platen forblir gellignende og at monolaget ikke forstyrres på grunn av endringer i ECM-viskositeten.
Selv om denne modellen har forskjellige fordeler i forhold til tradisjonell cellekultur, er den teknisk mer krevende, dyr og tidkrevende sammenlignet med den tradisjonelle sårhelingsanalysen i CRC-monolag. Videre er konsistens i reagensene og mediene som brukes avgjørende for å sikre overlevelse og riktig vedlikehold av disse kulturene, og det samme er å opprettholde cellene, reagensene og ECM ved riktige temperaturer. Endelig er primære tynntarmmonolag notorisk kortvarige, så såranalysen beskrevet her bør utføres kort tid etter at monolagskonfluens er oppnådd.
Samlet sett tyder disse resultatene på at små intestinale enteroide monolag kan brukes som en ny modell for å undersøke tarmepitelregenerering gjennom prosessene for cellemigrasjon og spredning etter sår. I tillegg gir enteroider et mye mer fysiologisk oversettbart vev for å studere effekter på differensiert tarmcelle levedyktighet. Slike modeller kan gi en plattform for å dissekere mekanismene som regulerer epitelreparasjon og hjelp til identifisering av nye terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre og ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. HC støttes av tilskudd P20GM134973 fra National Institutes of Health. KB støttes av et Children's Hospital Foundation (CHF) og Presbyterian Health Foundation (PHF) stipend. Live-cell imaging tjenester levert av Cancer Functional Genomics kjernen ble støttet delvis av National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 og National Cancer Institute Grant P30CA225520 av National Institutes of Health, tildelt University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
