Summary
这种基于质谱的蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于淀粉样原纤维核心的稳健表征，这可以加速预防阿尔茨海默病的靶标的鉴定。
Abstract
蛋白纤维包涵体是多种神经退行性疾病的关键病理标志。在阿尔茨海默病（AD）的早期阶段，淀粉样蛋白-β肽在细胞外空间中形成原原原纤维，其作为种子逐渐生长并成熟为大淀粉样蛋白斑块。尽管有这种基本的了解，但目前对大脑中淀粉样原纤维结构，组成和沉积模式的了解是有限的。一个主要的障碍是无法从脑提取物中分离出高度纯化的淀粉样原纤维。基于亲和纯化和激光捕获显微切割的方法以前曾用于分离淀粉样蛋白，但受到可回收少量材料的限制。这种新颖、稳健的方案描述了使用十二烷基硫酸钠（SDS）增溶与蔗糖密度梯度超速离心和超声处理对淀粉样蛋白斑块核心的生化纯化，并从AD患者和AD模型脑组织中产生高纯度的原纤维。基于质谱（MS）的纯化材料自下而上的蛋白质组学分析代表了一种强大的策略，可以识别淀粉样原纤维的几乎所有主要蛋白质成分。以前对淀粉样蛋白冠状动脉中蛋白质的蛋白质组学研究揭示了出乎意料的大和功能多样化的蛋白质集合。值得注意的是，在提纯策略后，共纯化蛋白的数量减少了10倍以上，表明分离出的SDS不溶性物质纯度高。阴性染色和免疫金电子显微镜检查可以确认这些制剂的纯度。需要进一步的研究来了解导致这些蛋白质沉积成淀粉样蛋白内含物的空间和生物学属性。总而言之，这种分析策略可以很好地增加对淀粉样蛋白生物学的理解。
Introduction
淀粉样蛋白是一种非常稳定的超分子排列，存在于多种蛋白质组中，其中一些导致病理变化1。在几种神经退行性疾病中观察到细胞内或细胞外淀粉样蛋白聚集体的积累2。淀粉样蛋白聚集体是异质的，富含大量的蛋白质和脂质3。近年来，对淀粉样蛋白组的兴趣引起了基础和转化神经科学家的极大兴趣。已经开发出几种方法从小鼠和死后人类脑组织中提取和纯化淀粉样蛋白聚集体。激光捕获显微切割、免疫沉淀、脱细胞化和淀粉样聚集体的生化分离是提取和纯化淀粉样蛋白斑块、原纤维和低聚物4、5、6、7的广泛使用方法。其中许多研究都集中在使用半定量MS确定这些紧密堆积的纤维沉积物的蛋白质组成。然而，可用的结果是不一致的，并且先前报道的大量共纯化蛋白令人惊讶地难以解释。
描述AD和AD小鼠模型大脑中淀粉样蛋白核心蛋白质组的现有文献的主要局限性在于纯化材料含有难以管理数量的共纯化蛋白。该方法的总体目标是克服这一局限性，并开发一种用于分离淀粉样原纤维核的强大生化纯化方法。该策略采用先前描述的基于超速离心的蔗糖密度梯度超速离心的生化方法，用于从死后AD人和小鼠脑组织中分离SDS不溶性富集淀粉样蛋白级分8，9。该方法建立在现有文献的基础上，但进一步采用超声和SDS洗涤以除去大多数松散结合的淀粉样蛋白相关蛋白，从而分离出高度纯化的淀粉样原纤维（图1）。通过该协议纯化的原纤维克服了从脑提取物中分离的淀粉样原纤维的结构研究中经常遇到的几个现有挑战。用透射电子显微镜（TEM）对这些原纤维进行可视化，确认纯化材料的完整性和纯度（图2）。在这项研究中，分离的原纤维被胰蛋白酶溶解并消化成肽，无标记的MS分析可以很容易地揭示形成原纤维核心的蛋白质的身份。值得注意的是，其中一些蛋白质具有在非膜结合细胞器中形成超分子组件的固有倾向。此外，在淀粉样蛋白β（Aβ）原纤维分析中鉴定的许多蛋白质也与其他神经退行性疾病有关，这表明这些蛋白质可能在多种蛋白质病症中起关键作用。
这种SDS/超声方法不太可能改变或破坏原纤维核的结构。纯化后的材料还适用于各种自上而下和自下而上的蛋白质组学分析方法以及其他基于MS的结构分析策略，例如化学交联或氢氘交换。使用这种方法的总回收率相对较高，因此，适用于详细的结构研究，这需要微克到毫克的纯化材料。纯化后的材料也适用于使用冷冻电镜和原子力显微镜进行结构研究。该协议与哺乳动物的稳定同位素标记相结合，可以促进淀粉样蛋白结构10的固态核磁共振（NMR）研究。
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Protocol
该协议涉及使用人类或脊椎动物的脑组织。所有研究都是按照西北大学批准的机构指南进行的。目前的工作流程是使用APP敲入（应用程序NL-G-F/ NL-G-F）小鼠大脑皮质和海马脑区域提取物11标准化的。该方案已针对6-9个月大小鼠的脑提取物进行了优化，并且可以有效地纯化雄性和雌性动物的淀粉样蛋白。
注：为了更好地了解整个实验过程，请参阅 图1 的工作流程示意图。
1. 组织采集和淀粉样蛋白纯化
注意：理想情况下，淀粉样原纤维应从新鲜解剖的脑区域分离。然而，这种方法也适用于卡扣或快速冷冻的脑组织。以下是快速冷冻脑组织的简要概述，以便以后使用。
- 脑组织采集和储存：解剖小鼠大脑，快速收获含有淀粉样蛋白的区域（即皮质和海马体），然后在液氮或干冰酒精浴中快速冷冻。
注意：速冻有助于保留组织成分的结构属性。小鼠通过异氟醚和宫颈脱位12，13安乐死。建议避免使用CO2 ，因为这会损害大脑蛋白质组的完整性。 - 解剖后，切割新鲜组织并将其储存在小块（例如，5 mm x 5 mm）中，因为这有助于在淀粉样蛋白提取之前更有效地匀浆。将组织转移到无菌低温小瓶中，拧紧其盖子，然后快速浸没。
- 将组织在超冷条件下冷冻（即-80°C或液氮）。如果要在几天后进行提取，请将组织储存在-20°C，并避免冷冻和解冻循环。在准备提取和纯化时，将冷冻的组织解冻在湿冰上。
注意：组织与液氮直接接触会导致组织和蛋白质损伤。请注意，酒精浴可以从管标签上去除永久性标记。
2. SDS不溶性物质的富集
注意：除非另有说明，否则在冰上执行所有步骤并在4°C下离心。补充 文件1中提供了该协议中使用的所有缓冲液和解决方案的详细信息。化学品和仪器的制造商和目录号在 材料表中提供。
- 首先将新鲜解剖或速冻的脑组织区域（在冰上解冻）放入含有6-8个陶瓷珠和新鲜制备的冰冷均质缓冲液（1 mL用于0.25-1g湿组织团）的2mL管中。
- 将管转移到珠磨机均质机中，并以4000rpm研磨组织内容物，两个周期，每个周期30 s，间隔30 s。
注意：或者，电动搅拌器或均质器系统可用于研磨和均质组织。 - 将9 mL冰冷的均质缓冲液加入1 mL脑全组织匀浆中，在15 mL管中匀浆，用实验室蜡膜条密封，并在4°C下端到端旋转过夜，以确保稳定的溶解。
注意：为了除去不需要的大细胞碎片和脂质，第二天早上，在4°C下以800× g 旋转管10分钟，并将上清液收集在新鲜管中。将剩余的沉淀重悬于2mL冰冷的均质缓冲液中，充分混合，在4°C下再次旋转10分钟，并混合两种上清液。 - 缓慢地将固体蔗糖加入组织提取物悬浮液中至终浓度为1.2M，充分混合，并在4°C下以250，000× g 离心45分钟。
- 小心地取出并使用移液管丢弃上清液。通过研磨将沉淀重悬于含有1.9M蔗糖的2mL均质缓冲液中，然后在4°C下以125，000× g 离心45分钟。
注意：缓冲液体积可以根据从上一步中回收的材料量进行调整。通常，10体积的均质化缓冲液（V / V）是此步骤的理想选择。 - 使用移液管收集顶部的白色固体层，将其转移到新鲜管中，并通过上下移液几次溶解在1 mL冰冷洗涤缓冲液中，而不会引入气泡。
- 除了顶层外，颗粒还富含淀粉样原纤维。为了获得更高的产量，将两个馏分混合并继续。使用移液管小心地除去中间的水层并丢弃。
- 在4°C下以8000× g 离心组合馏分20分钟。 弃去上清液。
- 向洗涤的沉淀中加入1mL冰冷的消化缓冲液，重悬，并在室温（RT）下孵育3小时。
- 在4°C下以8000× g 离心20分钟，并使用移液管除去上清液。
- 在1mL冰冷的Tris缓冲液中重悬并洗涤（与步骤2.8相同）消化的沉淀两次。
- 通过上下移液将洗涤后的沉淀重悬于含有1%SDS和1.3M蔗糖的1mL增溶缓冲液中。在4°C下以200，000× g 快速离心60分钟。
注意：虽然淀粉样原纤维对洗涤剂和变性剂具有很强的抗性，但长时间接触洗涤剂（1%SDS）可能会影响原纤维的完整性或去除紧密结合的蛋白质，这将影响后续分析。因此，在重悬颗粒后，立即进行离心。 - 通过加入50mM Tris缓冲液（比例为1：0.3）来保存沉淀并增加剩余上清液的体积，以将蔗糖浓度从1.3降低到1M，并在4°C下以200，000× g 离心45分钟。
- 将两个沉淀溶解在含有0.5%SDS的100μLTris缓冲液中，并池中用于淀粉样蛋白纯化。可见的颗粒很小，应该看起来不透明和灰白色（见 图2A）。
3. 淀粉样蛋白纯化
注意：将两个沉淀混合，通过移液溶解直到获得均匀的溶液，然后继续进行淀粉样蛋白纯化的以下步骤。
- 为了完全溶解颗粒中存在的富含淀粉样蛋白的材料，在浴超声处理装置中对管子进行超声波产生的机械剪切，该设备在中程频率下运行30 s ON和30 s OFF，持续20个周期。
- 立即将材料在4°C下以20，000× g 离心30分钟，并将沉淀重悬于500μL0.5%SDS Tris缓冲液中。
- 重复步骤 3.1。和步骤 3.2.四次，共洗涤五次。可以增加洗涤次数以提高纯度。
注意：超声处理和洗涤步骤在0.5%SDS下进行了优化，因为较高的浓度可能会影响原纤维的结构，完整性或蛋白质组成。不建议在此步骤中增加 SDS 浓度。 - 在最终离心步骤之后，在200μL超纯水中洗涤沉淀，并在4°C下以20，000× g 离心30分钟以除去任何剩余的洗涤剂。含有纯化淀粉样原纤维的洗涤颗粒呈半透明，有时难以看到。
- 将含有纯化的淀粉样原纤维的最终沉淀溶解在100μL超纯水中。立即进行下一步进行下游处理，或将原纤维悬浮液保存在-20°C进行进一步分析。如果冻结，在开始沉淀之前在冰上解冻。
4. 甲醇氯仿沉淀
注意：如果最终目标是进行蛋白质分析，建议脱盐并除去其他非蛋白质杂质。
- 在1.5mL管中向纯化的100μL淀粉样原纤维中加入400μL甲醇并涡旋孔。
- 向管中加入100μL氯仿并涡旋。
- 加入300μL超纯水并彻底涡旋。由于蛋白质沉淀，这会使混合物变得浑浊。
- 在室温下以12，000× g 离心2分钟。
- 小心地除去水层（即顶部），而不会干扰含有蛋白质片的界面层。
- 再次加入相同体积的甲醇，并在室温下以12，000× g 离心2分钟。
- 使用移液管丢弃上清液，并在室温下风干沉淀，避免过度干燥;如果过干燥，淀粉样蛋白部分很难重新溶解。
5. 胰蛋白酶消化
- 将沉淀溶解在50μL盐酸胍（GuHCl）缓冲液中。如果需要，在冰冷的水浴中超声处理并在95°C下加热5分钟。
- 在室温下彻底涡旋45分钟至1小时以完全溶解。在此步骤之后，颗粒将不可见，并且溶液的外观看起来清晰。
- 加入相同体积的0.2%表面活性剂溶液。在室温下溶解，涡旋60分钟。此步骤增强了胰蛋白酶的酶活性。
- 从500mM储备溶液中加入1μL三-2-羧乙基膦（TCEP）。孵育60分钟。
- 加入2μL500mM碘乙酰胺（IAA）并在黑暗中孵育20分钟。
- 用5μL TCEP溶液淬灭IAA15分钟。
- 向管中加入所需体积的50mM碳酸氢铵溶液，将胍浓度降低至1.5M。
- 向管中加入1%表面活性剂溶液（1μL / 50μg蛋白质）。
- 加入胰蛋白酶（1微克/ 100微克蛋白质），并将管混合在37°C过夜。
6. 肽纯化
- 第二天早上，通过添加甲酸将pH值降低到2.0来酸化消化的肽溶液。
- 通过加入200μL50%甲醇溶液，在2mL接收管中激活C18（n-十八烷基）离心柱，并在室温下以1500× g 旋转2分钟。
- 通过加入200μL平衡缓冲液并在相同条件下纺丝2分钟来平衡C18柱树脂床。重复此步骤。
- 将酸化的肽溶液加载到C18柱上，并在室温下以1500× g 离心2分钟。丢弃第二个流经。
- 用洗涤缓冲液2x洗涤与C18树脂结合的肽，如步骤6.3所示。使用相同的平衡缓冲液洗涤色谱柱。
- 通过加入40μL洗脱缓冲液洗脱肽，然后在1500× g下离心2分钟。
- 通过在蒸发水溶液在快速真空浓缩器中干燥肽。在MS分析之前，可以在-20°C下保存干燥颗粒数周。
7. 设置用于肽分析的质谱仪
注意：有关 MS 参数，请参阅 补充文件 1 （改编自实验室以前的版本）14。
- 在上样用于MS分析的肽样品之前，将干燥的肽沉淀溶解在20μL样品上样缓冲液中并进行微量BCA以量化回收肽的浓度。
- 将溶解的肽转移到玻璃瓶中，并将3μg（从微BCA定量）肽上样到UPLC系统自动进样器中。
- 将样品以250 nL/min的流速将样品加载到排气式疏水塔（C18 HPLC色谱柱，0.075 mm x 20 mm）上。
- 将疏水阀柱与分析柱（0.075 μm x 500 mm）对齐，并将发射极尖端组装到电喷雾电离（ESI）源上，承受2000 V的喷涂电压。
注意：在本研究中，进行ESI，其中流动相经受高压电离进入气相。由此产生的喷雾通过加热的毛细管被引导到MS的真空室。在真空下，液滴的解溶剂化和离子的喷射发生在热和电压的存在下。此后，离子在高压环境下加速到质量分析仪。 - 通过2小时采集运行分析样品。本研究使用数据依赖性采集进行，具有最强烈的前20种前体离子选择范式。
注意：在依赖于数据的采集中，在MS1扫描中检测到有限数量的前体肽，并进行碎片化以进行MS2分析。然而，动态排除在这里是有问题的，因为高度丰富的Aβ肽将被省略用于片段化并导致低估其数量。 - 对于Aβ肽的绝对定量，使用靶向MS / MS方法再次运行相同的样品。对于本研究，制备了用于APP敲入小鼠模型的各种可能的胰蛋白酶Aβ肽的所有m / z比率的详尽列表（参见 补充表1）。其他组应根据可用的小鼠模型和从感兴趣的蛋白质（例如，Aβ for AD）产生的可能的肽来制备类似的列表。
注意：为了解决高丰度肽的排除问题，请通过提供与Aβ胰蛋白酶肽相对应的选定m / z值列表来使用靶向方法。这种方法解决了Aβ肽的数据依赖性排除问题，并且可以以高分辨率量化不同单体（Aβ38，40和42肽）的绝对量。 - 质谱仪生成肽样品的MS光谱，并将原始数据文件保存在目标目录上。使用此文件使用完善的统计和生物信息学工具执行光谱匹配。提供多种在线和离线数据库搜索和分析工具。
8. MS数据分析
- 使用脱机原始转换器工具（http://www.fields.scripps.edu/rawconv/）提取 MS1 和 MS2 文件。
- 在基于Web的MS数据搜索引擎上对数据进行识别，定量和详细分析。在这项研究中，使用了集成蛋白质组学管道 - IP2（布鲁克：http://www.integratedproteomics.com/）。
注意：其他几种在线和离线 MS 数据分析工具也可用，例如 MaxQuant （https://www.maxquant.org/）。 - 上载 MS1 和 MS2 文件后，选择更新的小鼠蛋白质组数据库。在这里，选择包含其他App敲入特异性突变的更新小鼠数据库，以使用ProLuCId和SEQUEST算法11鉴定肽。
- 在IP2分析系统中，选择默认参数，并根据实验要求进行修改。在这项研究中，前体使用50 ppm的肽质量耐受性和片段的600 ppm的肽质量耐受性（有关IP2中使用的其他参数，请参阅 补充文件1 ）。
注意：研究人员可以根据实验目标修改搜索参数。例如，为了识别翻译后修饰，添加各种PTM（例如，泛素化，SUMO酰化，磷酸化）的差异修饰值。
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Representative Results
这里，总结了使用修饰蔗糖密度梯度超速离心纯化方法分离和纯化淀粉样原纤维的详细方法（见 图1）。该方法的创新之处在于包括使用水浴超声处理系统进行基于超声波的洗涤步骤，然后进行SDS增溶，从淀粉样原纤维中除去许多松散相关的蛋白质，这些蛋白质与高度致密和干净的原纤维共纯化。超声步骤产生高剪切力并搅拌原纤维，松动疏水力并将SDS可溶性松散相关的蛋白质释放到SDS洗涤缓冲液中。反过来，少量高纯度的淀粉样原纤维核被回收。如图 2A所示，在富集后可以看到可见的沉淀，其最初看起来不透明（可能是由于杂质）;然而，在超声和多次SDS洗涤之后，颗粒变得半透明并且几乎看不见。与SDS可溶性部分相比，纯化淀粉样蛋白的代表性刚果红染色记录了淀粉样原纤维的富集（图2B）。刚果红染色可用于确认不同级分的淀粉样蛋白材料，并且可以使用明场显微镜进行可视化。如图 2C所示，SDS可溶性部分不与刚果红染料染色。
纯化的原纤维的结构与负染色透射电子显微镜分析证实了几乎纯的淀粉样原纤维的存在（图2D）。此外，使用Aβ42（6E10和4G8）抗体的组合进行免疫金标记证实了Aβ42肽的存在（图2E）。为了研究纯化材料的组成和结构特征，我们对Aβ肽和标志性结构特征（例如原纤维）使用了免疫印迹技术。对淀粉样蛋白分离过程中收集的分数进行代表性的点印迹分析显示，使用抗Aβ42和抗原纤维（LOC）抗体，Aβ42肽和原纤维的相对丰度（图3A）。同样，代表性组分的蛋白质印迹也显示含有Aβ42的原纤维富集在SDS PAGE凝胶孔中的高分子量蛋白质中（图3B）。为了了解这些高分子量原纤维的组成，纯化的淀粉样蛋白组分进行了基于MS的蛋白质组学分析。这些半定量结果显示存在约250种蛋白质，而超声和SDS洗涤前收集的分数含有2500多种蛋白质（图3C）。这表明了该纯化方案中包含的这两个关键步骤的有效性。综上所述，多个独立的结果表明，原纤维核心中相似蛋白质类别的丰度很高。
图4中一个代表性MS数据集的基因本体（GO）细胞成分分析显示，原纤维核心中存在的大量蛋白质与非膜结合细胞器和超分子复合物相关。这一观察结果可能是由于许多蛋白质的固有倾向，即自身聚集或与其他蛋白质共同聚集在邻近的蛋白质颗粒内含物中。物理力在这些相互作用中起着至关重要的作用。主要由这些蛋白质代表的其他细胞器和组分是线粒体，细胞骨架，细胞膜和髓鞘。这些蛋白质中的许多在淀粉样蛋白形成的不同阶段与Aβ肽，低聚物或原原纤维相互作用。它们可能在质膜附近相互作用，其中Aβ肽被释放。当其中一些蛋白质直接或通过水泡运输释放到细胞外空间时，相互作用也可能发生。蛋白质聚集体的分泌或胞吐作用是细胞用来应对和减少与蛋白质聚集体相关的负担的众多策略之一15.这留下了另一个机会，一些细胞内蛋白质可以与Aβ肽结合。该协议为根据实验目标进一步优化提供了一个框架。例如，通过改变超声和SDS洗涤的次数，可以相应地微调纯度和产量。
图 1：从 AD 死后人类或模型动物脑组织中分离淀粉样原纤维核心的工作流程的图表概述。
图2：使用淀粉样原纤维的生化染色和成像确认淀粉样蛋白提取 .（A）富含淀粉样蛋白的SDS不溶性颗粒呈不透明的灰白色。（B）在0.45μm硝化纤维素膜上印迹的SDS可溶性上清液和含有纯化淀粉样蛋白的SDS不溶性微丸的刚果红染色;BCA读数用于蛋白质负载量的归一化。BCA测定按照制造商的说明进行。（C） 刚果红染色后SDS可溶性和淀粉样物质的明场图像（比例尺：100μm）。（D）在电子显微镜下使用负染色（比例尺：100nm）可视化SDS可溶性部分和纯化的淀粉样原纤维。（E）使用Aβ42（6E10和4G8）抗体（比例尺：50nm）通过免疫金电子显微镜确认纯化的淀粉样原纤维中Aβ42肽丰度。 请点击此处查看此图的大图。
图3：使用免疫印迹和MS分析验证淀粉样蛋白纯化 （A）点印迹和（B）使用抗原纤维LOC和抗Aβ42抗体对淀粉样蛋白纯化过程中收集的几种代表性组分进行蛋白质印迹分析;BCA测定读数用于蛋白质负载量的归一化。（C）在富集和纯化的淀粉样蛋白级分的无标记质谱分析中回收的蛋白质数量;微BCA测定用于每次MS分析的上样3μg消化肽。BCA和微量BCA测定按照制造商的说明进行。 请点击此处查看此图的大图。
图4：纯化淀粉样蛋白级分中丰富的蛋白质的基因本体分析。 （A）细胞成分和（B）KEGG途径。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：用于鉴定肽的缓冲液和溶液，质谱参数和ProLuCID搜索参数。请按此下载此档案。
补充表1-在小鼠模型中MS运行中鉴定的用于APP敲击的淀粉样蛋白β肽的m / z比率的代表性列表。请按此下载此表格。
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Discussion
对于结构生物学家和生物化学家来说，对淀粉样蛋白结构和组成有清晰的认识是具有挑战性的，因为从AD脑组织中提取纯化的原纤维具有生物学复杂性和实验局限性16，17。淀粉样原纤维在分子水平上是多态的，显示出不同长度和复杂性的异质种群18，19。为了更好地理解它们的生物学特征和病理相关性，需要对从死后人类和AD小鼠脑组织获得的多态淀粉样原纤维的组成进行详尽的表征20，21。一大部分蛋白质直接与Aβ42相互作用，而其他蛋白质可能倾向于形成大的纤维结构或蛋白质复合物22，23，24。确定与Aβ42相互作用的蛋白质在淀粉样蛋白形成，稳定和伸长中的作用更具挑战性，因为它与AD病理学有关。近年来，一些蛋白质组学研究阐明了各种超分子排列、无膜细胞器、包涵体和蛋白质聚集体的蛋白质组成25，26，27的差异和相似之处。在AD的早期阶段，多种细胞蛋白（例如，Aβ42和微管相关的tau蛋白和载脂蛋白E）在多个脑区域28，29中错误折叠和共聚。淀粉样蛋白形成是 AD 的一个主要病理标志，可能有助于发病机制3。
从患病的人脑中纯化淀粉样原纤维是一项繁琐而具有挑战性的任务，并且具有多种局限性。现有方法的一个主要缺点是提取材料的纯度低，这通常限制了使用成像方法（例如冷冻电镜）进行详细的结构分析。同样，NMR研究需要几毫克的纯化材料，这些材料也需要用重同位素（即 15N）30标记。死后人类大脑可以满足第一个要求，因为起始材料可以增加到几克人体组织;然而，用重同位素标记人脑组织是不可能的。另一方面，用 15N同位素标记AD小鼠模型是可能的（尽管成本高昂），现在越来越普遍31，32。我们的实验室使用脉搏追逐标记来研究疾病和衰老大脑期间的突触蛋白周转动力学14。我们还使用全动物重同位素标记来鉴定长寿蛋白质，并了解它们在复杂生物结构中的生理相关性33，34。然而，对于小鼠大脑，需要大量的起始材料才能获得可加工量的原纤维核。该方法通过修改现有的生化分离原理来提高提取的淀粉样原纤维的产量和纯度，从而成功地解决了这些问题。因此，这种从脑组织中提取淀粉样原纤维的强大方案可以很容易地用于冷冻电镜和基于NMR的结构研究。
该方法利用现有的蔗糖密度梯度基亚细胞分级分离范式，并在连续步骤中去除非特异性共纯化蛋白。在去除细胞碎片，髓鞘，DNA和细胞脂质后，分离出富含淀粉样蛋白的SDS不溶性沉淀。掺入多个超声耦合SDS洗涤的附加步骤有助于减少共纯化细胞组分，松散结合的蛋白质和淀粉样蛋白的较小SDS可溶性多晶型的数量。最终的沉淀溶解在超纯水中，可用于许多应用，包括播种实验，生化或药理学研究以及结构分析。来自AD脑组织的纯化淀粉样原纤维也用于使用基于MS的蛋白质组学了解原纤维核的蛋白质组组成和结构特征。该分析证实了原纤维核心中存在细胞蛋白亚群（ 如图4所示），这可能表明多种蛋白质在淀粉样原纤维在很长一段时间内的形成，伸长和稳定中的可能作用。本分析中发现的一些蛋白质因其与多种神经退行性疾病的关联而闻名，例如Adam22，APP，ApoE，β - 连环蛋白神经丝蛋白，14-3-3蛋白质等。
蛋白质组学分析中可能会出现一些污染性蛋白质，因为在均质化之后，由于淀粉样原纤维的高疏水性，蛋白质之间可能会发生一些不必要的相互作用。其中一些蛋白质粘附在核心上，即使经过多轮超声处理和SDS洗涤步骤后也不会被去除。这是这种淀粉样蛋白纯化策略的一个局限性。然而，可以使用合适的阴性对照并在大规模蛋白质组学研究中进行有效的统计截止来解决。我们遇到的另一个限制与胰蛋白酶消化后Aβ肽丰度的低估有关。在此工作流程中，已通过有针对性的 MS/MS 分析策略解决了此问题。对KEGG通路的GO分析表明，属于许多神经退行性疾病（例如阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和朊病毒病）的途径的蛋白质丰度。这些蛋白质是多种病理通路中的重要参与者，因此已知参与疾病的发生和进展。有趣的是，其中一些蛋白质需要进一步分析，以确定它们可能参与AD和其他神经退行性疾病的病理学。
未来对来自其他疾病模型的纯淀粉样蛋白材料的研究可能会提供对核心原纤维的结构模式和组成的深入了解，并可能有助于确定关键的治疗靶点。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院授予R01AG061865给R.J.V.和J.N.S.的支持。作者感谢西北大学的瓦萨和萨瓦斯研究小组成员进行了深思熟虑的讨论。我们也衷心感谢博士。安斯加尔·塞默和拉尔夫·兰根在南加州大学为他们的重要投入。我们感谢Farida Korabova博士在西北大学高级显微镜中心进行样品制备和负染色电子显微镜成像。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
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