Summary
Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.
Abstract
As inclusões fibrilares proteináceas são marcas patológicas fundamentais de múltiplas doenças neurodegenerativas. Nos estágios iniciais da doença de Alzheimer (DA), peptídeos amilóide-beta formam protofibrilas no espaço extracelular, que agem como sementes que gradualmente crescem e amadurecem em grandes placas amiloides. Apesar dessa compreensão básica, o conhecimento atual da estrutura de fibrila amiloide, composição e padrões de deposição no cérebro é limitado. Uma grande barreira tem sido a incapacidade de isolar fibrilas amiloides altamente purificadas de extratos cerebrais. A purificação de afinidade e as abordagens baseadas em microdissecção de captura a laser foram usadas anteriormente para isolar amiloides, mas são limitadas pela pequena quantidade de material que pode ser recuperada. Este novo protocolo robusto descreve a purificação bioquímica de núcleos de placas amiloides usando solubilização de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) com ultracentrifugação de gradiente de densidade de sacarose e ultrassônicas e produz fibrilas altamente puras de pacientes com DA e tecidos cerebrais modelo AD. A análise proteômica de baixo para cima baseada em espectrometria de massa (MS) do material purificado representa uma estratégia robusta para identificar quase todos os componentes proteicos primários das fibrilas amiloides. Estudos proteômicos anteriores de proteínas na coronária amiloide revelaram uma coleção inesperadamente grande e funcionalmente diversificada de proteínas. Notavelmente, após o refino da estratégia de purificação, o número de proteínas de co-purificação foi reduzido em mais de 10 vezes, indicando a alta pureza do material isolado SDS insolúvel. A coloração negativa e a microscopia eletrônica imuno-ouro permitiram a confirmação da pureza dessas preparações. Outros estudos são necessários para compreender os atributos espaciais e biológicos que contribuem para a deposição dessas proteínas em inclusões amiloides. Em conjunto, essa estratégia analítica está bem posicionada para aumentar a compreensão da biologia amiloide.
Introduction
Amiloide é um arranjo supramolecular extremamente estável que é encontrado em um painel diversificado de proteínas, algumas das quais levam a mudanças patológicas1. O acúmulo de agregados amiloides intra ou extracelulares é observado em várias doenças neurodegenerativas2. Os agregados amiloides são heterogêneos e são enriquecidos com um grande número de proteínas e lipídios3. Nos últimos anos, o interesse pelo proteome amiloide tem gerado interesse substancial entre neurocientistas básicos e translacionais. Vários métodos foram desenvolvidos para extrair e purificar agregados amiloides de tecidos cerebrais humanos de camundongos e pós-morte. Microdisseção de captura a laser, imunoprecipitação, descelularização e isolamento bioquímico de agregados amiloides são métodos amplamente utilizados para extrair e purificar placas amiloides, fibrilas e oligômeros 4,5,6,7. Muitos desses estudos têm se concentrado em determinar a composição proteica desses depósitos fibrilares bem embalados usando em ms semi-quantitativo. No entanto, os resultados disponíveis são inconsistentes, e o número surpreendentemente grande de proteínas co-purificadoras relatadas anteriormente são desafiadores de interpretar.
A principal limitação da literatura existente descrevendo o núcleo amiloide nos cérebros modelo de camundongos AD e AD é que o material purificado contém um número incontrolável de proteínas co-purificadoras. O objetivo global deste método é superar essa limitação e desenvolver uma purificação bioquímica robusta para isolar núcleos de fibrila amiloide. Esta estratégia emprega um método bioquímico baseado em afluente de densidade de sacarose anteriormente descrito para o isolamento de frações amiloides enriquecidas insolúveis da SDS a partir de tecidos cerebrais humanos e camundongos pós-morte 8,9. Este método baseia-se na literatura existente, mas vai além com a ultrassonização e as lavagens SDS para remover a maioria das proteínas amiloides frouxamente ligadas, levando ao isolamento de fibrilas amiloides altamente purificadas (Figura 1). As fibrilas purificadas por este protocolo superam vários desafios existentes frequentemente encontrados em estudos estruturais de fibrilas amiloides isolados de extratos cerebrais. A visualização dessas fibrilas com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirma a integridade e pureza do material purificado (Figura 2). Neste estudo, as fibrilas isoladas são solubilizadas e digeridas em peptídeos com trippsina, e a análise de MS sem rótulos pode facilmente revelar a identidade das proteínas que formam o núcleo fibril. Notavelmente, algumas dessas proteínas têm uma tendência inerente à formação de conjuntos supramoleculares em organelas não ligadas à membrana. Além disso, muitas das proteínas identificadas na análise de fibrilas amilóide-beta (Aβ) também estão associadas a outras doenças neurodegenerativas, sugerindo que essas proteínas podem desempenhar um papel fundamental em múltiplas proteinopatias.
Este método SDS/ultrasonicação é improvável de alterar ou interromper a estrutura dos núcleos fibril. O material purificado também é adequado para uma ampla gama de abordagens de análise proteômica de cima para baixo e de baixo para cima e estratégias adicionais de análise estrutural baseada em MS, como crosslinking químico ou troca de deutério de hidrogênio. A recuperação geral usando este método é relativamente alta e, portanto, é adequada para estudos estruturais detalhados, que requerem microgramas a miligramas do material purificado. O material purificado também é adequado para estudos estruturais utilizando crioEM e microscopia de força atômica. Este protocolo, em combinação com a rotulagem isotópica estável de mamíferos, pode facilitar estudos de ressonância magnética nuclear de estado sólido (RMN) da estrutura amiloide10.
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Protocol
Este protocolo envolve o uso de tecidos cerebrais humanos ou vertebrados. Toda a pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais aprovadas da Universidade northwestern. O fluxo de trabalho atual é padronizado usando o cérebro do cérebro do cérebro do rato (AppNL-G-F/NL-G-F) extrai11. Este protocolo foi otimizado para extratos cerebrais de camundongos aos 6-9 meses de idade, e pode efetivamente purificar amiloides de animais machos e fêmeas.
NOTA: Para uma melhor compreensão do procedimento experimental global, consulte a Figura 1 para um esquema do fluxo de trabalho.
1. Colheita de tecidos e purificação amiloide
NOTA: Idealmente, as fibrilas amiloides devem ser isoladas de regiões cerebrais recém-dissecadas. No entanto, este método também funciona bem com tecidos cerebrais instantâneos ou congelados. Abaixo está um breve esboço de tecidos cerebrais com congelamento de estalos para armazenamento para uso posteriormente.
- Colheita e armazenamento de tecidos cerebrais: Disseque cérebros de camundongos e colmeça rapidamente as regiões carregadas de amiloide (ou seja, córtex e hipocampo), seguido de congelamento de snap em nitrogênio líquido ou um banho seco de álcool no gelo.
NOTA: O congelamento de espetos ajuda a preservar os atributos estruturais dos constituintes do tecido. Os camundongos são eutanizados por isoflurano e luxação cervical 12,13. É aconselhável evitar o uso de CO2, uma vez que pode comprometer a integridade do proteome cerebral. - Pós-dissecção, corte e armazene tecidos frescos em blocos pequenos (por exemplo, 5 mm x 5 mm), pois isso facilita a homogeneização mais eficiente antes da extração amiloide. Transfira o tecido para o frasco criogênico estéril, aperte sua tampa e submersa rapidamente.
- Mantenha os tecidos congelados em condições ultracold (ou seja, -80 °C ou nitrogênio líquido). Se a extração for realizada alguns dias depois, armazene os tecidos a -20 °C e evite ciclos de congelamento e degelo. Descongele os tecidos congelados no gelo molhado quando estiver pronto para extração e purificação.
NOTA: O contato direto dos tecidos com nitrogênio líquido pode causar danos teciduais e proteicos. Note que um banho de álcool pode remover marcadores permanentes das etiquetas do tubo.
2. Enriquecimento de material insolúvel da SDS
NOTA: Realize todos os passos no gelo e centrífuga a 4 °C, a menos que seja indicado o contrário. Os detalhes de todos os buffers e soluções utilizados neste protocolo são fornecidos no Arquivo Suplementar 1. Os fabricantes e o catálogo de números de produtos químicos e instrumentos são fornecidos na Tabela de Materiais.
- Comece com regiões de tecido cerebral recém-dissecadas ou congeladas (descongeladas no gelo) colocadas em um tubo de 2 mL contendo contas de cerâmica de 6-8 e tampão de homogeneização gelada recém-preparado (1 mL para 0,25-1 g de massa de tecido molhado).
- Transfira os tubos para o homogeneizador do moinho de contas e triture o conteúdo tecidual a 4000 rpm, com dois ciclos de 30 s cada e um intervalo de 30 s no meio.
NOTA: Alternativamente, sistemas de agitador ou homogeneizador motorizados podem ser usados para moer e homogeneizar os tecidos. - Adicione 9 mL de tampão de homogeneização gelada ao 1 mL de tecido inteiro do cérebro homogeneizar em tubos de 15 mL, selar com tiras de filme de cera de laboratório e girar de ponta a ponta durante a noite a 4 °C para garantir solubilização robusta.
NOTA: Para remover detritos celulares grandes e lipídios indesejados, na manhã seguinte, gire os tubos a 800 x g a 4 °C por 10 min e colete o sobrenante em um tubo fresco. Resuspend a pelota restante em 2 mL de tampão de homogeneização gelada, misture bem, gire novamente por 10 min a 4 °C, e combine as duas supernantes. - Adicione lentamente sacarose sólida à suspensão do extrato do tecido a uma concentração final de 1,2 M, misture bem e centrífuga a 250.000 x g por 45 min a 4 °C.
- Remova cuidadosamente e descarte o sobrenatante usando uma pipeta. Resuspenha a pelota em 2 mL de tampão de homogeneização contendo 1,9 M de sacarose por trituração, seguida de centrifugação a 125.000 x g para 45 min a 4 °C.
NOTA: O volume do buffer pode ser ajustado com base na quantidade de material recuperado da etapa anterior. Em geral, 10 volumes de tampão de homogeneização (V/V) é ideal para esta etapa. - Colete a camada sólida branca superior usando uma pipeta, transfira-a para um tubo fresco e solubilize em 1 mL de tampão de lavagem gelada, pipetando para cima e para baixo várias vezes, sem introduzir bolhas de ar.
- Além da camada superior, a pelota também é enriquecida com fibrilas amiloides. Para um rendimento maior, combine as duas frações e prossiga. Remova cuidadosamente a camada aquosa média usando uma pipeta e descarte.
- Centrifugar as frações combinadas a 8000 x g por 20 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Adicione 1 mL de tampão de digestão gelada à pelota lavada, resuspend e incubar à temperatura ambiente (RT) por 3h.
- Centrifugar a 8000 x g por 20 min a 4 °C e remover o supernatante usando uma pipeta.
- Resuspend e lavagem (mesmo que passo 2.8.) a pelota digerida duas vezes em 1 mL de tampão Tris gelado.
- Resuspenha a pelota lavada em 1 mL de tampão de solubilização contendo 1% SDS e 1,3 M de sacarose por tubulação para cima e para baixo. Centrifugar rapidamente a 200.000 x g para 60 min a 4 °C.
NOTA: Embora as fibrilas amiloides sejam altamente resistentes a detergentes e desnatantes, exposições muito longas ao detergente (1% SDS) podem afetar a integridade das fibrilas ou remover as proteínas firmemente ligadas, o que comprometerá análises subsequentes. Portanto, imediatamente após o ressusususundo as pelotas, proceda à centrifugação. - Economize a pelota e aumente o volume do restante do supernadante adicionando 50 mM Tris buffer (em razão 1:0.3) para reduzir a concentração de sacarose de 1,3 para 1 M e centrífugas mais uma vez a 200.000 x g por 45 min a 4 °C.
- Dissolva as duas pelotas em 100 μL de tampão Tris contendo SDS de 0,5% e piscina para purificação amiloide. As pelotas visíveis são pequenas e devem parecer opacas e off-white (ver Figura 2A).
3. Purificação amiloide
NOTA: Combine as duas pelotas, solubilize por pipetação até obter uma solução uniforme e proceda com as seguintes etapas de purificação amiloide.
- Para a solubilização completa do material rico em amiloide presente em pelotas, sujeito o tubo a cisalhamento mecânico produzido por ondas de ultrassom em um dispositivo de sônica de banho que funciona para 30 s ON e 30 s OFF em uma frequência de médio alcance para 20 ciclos.
- Imediatamente centrifugar o material a 20.000 x g por 30 min a 4 °C e resuspensar a pelota em 500 μL de 0,5% de tampão SDS Tris.
- Repita o passo 3.1. e passo 3.2. quatro vezes para um total de cinco lavagens. O número de lavagens pode ser aumentado para melhorar a pureza.
NOTA: As etapas de sônica e lavagem são otimizadas a 0,5% de SDS, pois concentrações mais elevadas podem afetar a estrutura, integridade ou composição proteica das fibrilas. Não é recomendado aumentar a concentração de SDS nesta etapa. - Após a etapa final de centrifugação, lave a pelota em 200 μL de água ultra-pura e centrífuga a 20.000 x g por 30 min a 4 °C para remover qualquer detergente restante. A pelota lavada contendo fibrilas amiloides purificadas parece semi-transparente em cores e é difícil de ver às vezes.
- Dissolva a pelota final contendo fibrilas amiloides purificadas em 100 μL de água ultrapura. Proceda imediatamente para o processamento a jusante ou salve a suspensão da fibrila a -20 °C para análise posterior. Se congelado, descongele no gelo antes de iniciar a precipitação.
4. Precipitação de clorofórmio de metanol
NOTA: Se o objetivo final é realizar a análise proteica, recomenda-se desalar e remover impurezas não proteináceas adicionais.
- Adicione 400 μL de metanol aos 100 μL purificados de fibrilas amiloides em um tubo de 1,5 mL e bem vórtice.
- Adicione 100 μL de clorofórmio ao tubo e ao vórtice bem.
- Adicione 300 μL de água ultrauso e vórtice completamente. Isso torna a mistura nublada devido à precipitação proteica.
- Centrifugar a 12.000 x g por 2 min no RT.
- Remova cuidadosamente a camada aquosa (ou seja, topo) sem perturbar a camada de interface que contém o floco de proteína.
- Adicione o mesmo volume de metanol novamente e centrífuga a 12.000 x g por 2 min no RT.
- Descarte o supernatante usando uma pipeta e seque a pelota no RT. Evite a secagem excessiva; fração amiloide é difícil de ressolar se sobre-seca.
5. Digestão de trippsina
- Dissolva a pelota em 50 μL de tampão de cloridrato de guanidina (GuHCl). Sonicate em um banho de água gelada e aqueça a 95 °C por 5 min, se necessário.
- Vórtice completamente em RT por 45 min a 1 h para dissolver completamente. A pelota não será visível após esta etapa, e a solução parece clara na aparência.
- Adicione o mesmo volume de solução surfactante de 0,2%. Solubilize na RT com vórtice por 60 min. Esta etapa melhora a atividade enzimática de trypsin.
- Adicione 1 μL de tris-2-carboxilfosphine (TCEP) da solução de estoque de 500 mM. Incubar por 60 min.
- Adicione 2 μL de iodoacetamida de 500 mM (IAA) e incuba no escuro por 20 minutos.
- Sacie o IAA com 5 μL de solução TCEP por 15 min.
- Adicione o volume necessário de 50 mM solução de bicarbonato de amônio ao tubo para reduzir a concentração de guanidina para 1,5 M.
- Adicione 1% de solução surfactante ao tubo (1 μL/50 μg de proteína).
- Adicione trippsina (1 μg/100 μg de proteína) e deixe o tubo se misturando a 37 °C durante a noite.
6. Limpeza de peptídeos
- Na manhã seguinte, acidifice a solução de peptídeo digerido baixando o pH para 2,0 adicionando ácido fórmico.
- Ative a coluna de giro C18 (n-octadecyl) em um tubo receptor de 2 mL adicionando 200 μL de solução de metanol de 50% e gire a 1500 x g por 2 min na RT. Repita a etapa de ativação.
- Equilibre os leitos de resina da coluna C18 adicionando 200 μL de tampão de equilíbrio e girando por 2 min com as mesmas condições. Repita este passo.
- Carregue a solução de peptídeo acidificado na coluna C18 e centrífuga a 1500 x g por 2 min na RT. Coleça o fluxo e recarregue-o mais uma vez. Descarte o segundo fluxo.
- Lave os peptídeos ligados à resina C18 com o tampão de lavagem 2x, como feito na Etapa 6.3. Use o mesmo tampão de equilíbrio para lavar a coluna.
- Elute os peptídeos adicionando 40 μL de tampão de eluição seguido de centrifugação a 1500 x g, por 2 min em RT. Repita o passo de eluição três vezes para aumentar o rendimento dos peptídeos recuperados.
- Seque os peptídeos em um concentrador de vácuo de velocidade evaporando a solução aquosa. Pelotas secas podem ser salvas a -20 °C por algumas semanas antes da análise de MS.
7. Configuração de espectrômetro de massa para análise de peptídeos
NOTA: Para parâmetros ms, consulte Arquivo Suplementar 1 (adaptado de uma publicação anterior do laboratório)14.
- Antes de carregar as amostras de peptídeos para a análise de MS, dissolva as pelotas de peptídeos secos em 20 μL de tampão de carga de amostra e realize micro BCA para quantificar a concentração de peptídeos recuperados.
- Transfira os peptídeos dissolvidos em um frasco de vidro e carregue 3 μg (quantificado a partir de micro BCA) de peptídeos para o autosampler do sistema UPLC.
- Carregue as amostras em uma coluna de armadilha ventilada (coluna HPLC C18, 0,075 mm x 20 mm) com uma taxa de fluxo de 250 nL/min.
- Organize a coluna de armadilha em linha com uma coluna analítica (0,075 μm x 500 mm) e monte uma ponta de emissor para a fonte de ionização de eletrospray (ESI) submetida a uma tensão de pulverização de 2000 V.
NOTA: Neste estudo, é realizado o ESI, no qual a fase móvel é submetida à ionização de alta tensão na fase do gás. O spray criado por isso é direcionado para a câmara de vácuo do MS através de um capilar aquecido. Enquanto sob vácuo, a desolação das gotículas e a ejeção de íons ocorre na presença de calor e tensão. Depois disso, os íons são acelerados em direção ao analisador de massa na presença de um ambiente de alta tensão. - Analise as amostras com corridas de aquisição de 2 h. Este estudo é realizado utilizando-se aquisição dependente de dados com o paradigma de seleção de íons precursores mais intenso.
NOTA: Na aquisição dependente de dados, um número limitado de peptídeos precursores são detectados na varredura MS1 e submetidos à fragmentação para análise de MS2. No entanto, a exclusão dinâmica é problemática aqui, uma vez que peptídeos Aβ altamente abundantes serão omitidos para fragmentação e resultarão em uma subestimação de sua quantidade. - Para quantificação absoluta dos peptídeos Aβ, execute as mesmas amostras mais uma vez usando o método MS/MS direcionado. Para este estudo, é preparada uma lista exaustiva de todas as proporções de m/z para vários peptídeos Aβ aβ possíveis para os modelos de mouse knock-in APP (ver Tabela Suplementar 1). Outros grupos devem preparar uma lista semelhante de acordo com o modelo de mouse disponível e os possíveis peptídeos gerados a partir da proteína de interesse (por exemplo, Aβ para AD).
NOTA: Para abordar a exclusão de peptídeos altamente abundantes, use uma abordagem direcionada fornecendo uma lista de valores selecionados m/z correspondentes aos peptídeos tripptic aβ. Esta abordagem aborda o problema da exclusão dependente de dados dos peptídeos Aβ e pode quantificar as quantidades absolutas de diferentes monômeros (Aβ38, 40 e 42 peptídeos) com alta resolução. - O espectrômetro de massa gera espectros ms das amostras de peptídeos e salva arquivos de dados brutos no diretório de destino. Use este arquivo para executar a correspondência espectral usando ferramentas estatísticas e bioinformáticas bem estabelecidas. Várias ferramentas de pesquisa e análise de banco de dados on-line e off-line estão disponíveis.
8. Análise de dados de MS
- Extrair os arquivos MS1 e MS2 usando a ferramenta Rawconverter offline (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Realize a identificação, quantificação e análises detalhadas dos dados em um mecanismo de pesquisa de dados MS baseado na Web. Neste estudo, utilizou-se Pipeline Integrado de Proteômica - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
NOTA: Várias outras ferramentas de análise de dados MS on-line e off-line estão disponíveis e também podem ser usadas, como o MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - Depois de carregar os arquivos MS1 e MS2, selecione um banco de dados proteome de mouse atualizado. Aqui, um banco de dados de mouse atualizado contendo mutações específicas adicionais do App knock-in é selecionado para a identificação de peptídeos usando algoritmos ProLuCId e SEQUEST11.
- No sistema de análise IP2, selecione os parâmetros padrão e modifique-os de acordo com os requisitos experimentais. Neste estudo, é utilizada uma tolerância de massa de peptídeo de 50 ppm para precursor e 600 ppm para fragmentos (consulte o Arquivo Suplementar 1 para outros parâmetros utilizados em IP2).
NOTA: Os pesquisadores podem modificar os parâmetros de pesquisa de acordo com os objetivos experimentais. Por exemplo, para identificar modificações pós-translacionais, adicione valores de modificação diferencial para vários PTMs (por exemplo, ubiquização, SUMOylation, fosforilação).
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Representative Results
Aqui, um método detalhado para o isolamento e purificação de fibrilas amiloides usando um método de purificação de ultracentrifugação de densidade de sacarose modificada é resumido (ver Figura 1). A inovação neste método é a inclusão de etapas de lavagem à base de ultrassonificação utilizando um sistema de sônica de banho de água seguido pela solubilização do SDS, que remove muitas proteínas vagamente associadas das fibrilas amiloides que co-purificam com as fibrilas altamente densas e limpas. A etapa de ultrassônica gera uma alta força de cisalhamento e agita as fibrilas, afrouxando as forças hidrofóbicas e liberando as proteínas solúveis SDS livremente associadas ao tampão de lavagem SDS. Por sua vez, pequenas quantidades de núcleos de fibril amiloides altamente puros são recuperados. Como mostrado na Figura 2A, uma pelota visível, que inicialmente parece opaca (possivelmente devido a impurezas), pode ser vista após o enriquecimento; no entanto, após a ultrassonização e múltiplas lavagens de SDS, a pelota fica semi-transparente e dificilmente é visível. A representação do Congo mancha vermelha de amiloides purificados em comparação com a fração solúvel da SDS documenta o enriquecimento das fibrilas amiloides (Figura 2B). A coloração vermelha do Congo pode ser usada para confirmar o material amiloide em diferentes frações e pode ser visualizada usando um microscópio de campo brilhante. Como mostrado na Figura 2C, a fração solúvel da SDS não mancha com o corante vermelho congolês.
A estrutura das fibrilas purificadas com análise de microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa confirmou a presença de fibrilas amiloides quase puras (Figura 2D). Além disso, a rotulagem de imunogold usando uma combinação de anticorpos Aβ42 (6E10 e 4G8) confirmou a presença de peptídeos Aβ42 (Figura 2E). Para investigar a composição e características estruturais do material purificado, utilizamos técnicas de imunoblot para peptídeos Aβ e assinaturas estruturais marcantes (por exemplo, fibrilas). A análise representativa das manchas de ponto das frações coletadas durante o isolamento amiloide mostrou uma abundância relativa de peptídeos e fibrilas Aβ42 usando anticorpos anti-Aβ42 e anti-fibril (LOC) (Figura 3A). Da mesma forma, a mancha ocidental das frações representativas também mostrou enriquecimento de fibrilas contendo Aβ42 em proteínas de alto peso molecular presas nos poços do gel de PÁGINA da SDS (Figura 3B). Para entender a composição dessas fibrilas de alto peso molecular, frações amiloides purificadas foram submetidas à análise proteômica baseada em MS. Esses resultados semi-quantitativos revelaram a presença de aproximadamente 250 proteínas, enquanto a fração coletada antes da ultrassonização e das lavagens SDS continha mais de 2500 proteínas (Figura 3C). Isso indica a eficácia dessas duas etapas cruciais que estão incluídas neste protocolo de purificação. Juntos, vários resultados independentes indicam a alta abundância de classes de proteínas semelhantes em núcleos fibril.
A análise de componentes celulares gene ontology (GO) para um conjunto de dados representativo de MS na Figura 4 revelou que um grande número de proteínas presentes nos núcleos de fibril estão associados a complexos organela e supramoleculares não ligados à membrana. Essa observação deve-se provavelmente à tendência inerente de muitas proteínas de agregar-se ou co-agregar com outras proteínas em inclusões proteináceas que estão próximas. As forças físicas desempenham papéis cruciais nessas interações. As outras organelas celulares e componentes representados principalmente por essas proteínas são mitocôndrias, citoesqueleto, membrana celular e baiato de mielina. Muitas dessas proteínas interagem com peptídeos aβ, oligômeros ou protofibrils em diferentes estágios da formação amiloide. Eles podem interagir perto da membrana plasmática, onde peptídeos Aβ são liberados. A interação também pode acontecer enquanto algumas dessas proteínas são liberadas diretamente ou via transporte vesicular para o espaço extracelular. A secreção ou exocitese de agregados proteicos é uma entre muitas estratégias que as células usam para lidar e reduzir a carga associada aos agregados proteicos15. Isso deixa outra oportunidade onde algumas das proteínas intracelulares podem se ligar aos peptídeos Aβ. O protocolo fornece uma estrutura para maior otimização dependendo das metas experimentais. Por exemplo, a pureza e o rendimento, alterando o número de lavagens de ultrassônicas e SDS, podem ser ajustados de acordo.
Figura 1: Uma visão geral diagramática do fluxo de trabalho para isolamento do núcleo de fibrilas amiloides a partir de tecidos cerebrais humanos ou animais modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A confirmação da extração amiloide utilizando manchas bioquímicas e imagens de fibrilas amiloides. (A) Adoóide enriquecida que contém SDS é uma pelota insolúvel opaca. (B) Mancha vermelha do Congo de supernante solúvel SDS e pellet insolúvel da SDS contendo amiloide purificado manchado em 0,45 μm de membrana nitrocelulose; Foram utilizadas leituras de BCA para normalização da quantidade de carga das proteínas. O ensaio BCA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. (C) Imagens de campo brilhante de material solúvel e amiloide SDS após a coloração vermelha do Congo (barra de escala: 100 μm). (D) Visualização da fração solúvel de SDS e fibrilas amiloides purificadas usando manchas negativas sob o microscópio eletrônico (barra de escala: 100 nm). (E) Confirmação da abundância de peptídeos Aβ42 em fibrilas amiloides purificadas por microscopia eletrônica de imuno-ouro usando anticorpos Aβ42 (6E10 e 4G8) (barra de escala: 50 nm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação da purificação amiloide utilizando análise de imunoblot e MS. (A) Análise de manchas ocidentais e (B) Análise de manchas ocidentais de várias frações representativas coletadas durante o processo de purificação amiloide utilizando anticorpo antifibril LOC e anticorpo anti-Aβ42; Foram utilizadas leituras de ensaios BCA para a normalização da quantidade de carga das proteínas. (C) Número de proteínas recuperadas na análise de espectrometria de massa sem rótulos de frações amiloides enriquecidas e purificadas; o ensaio micro BCA foi utilizado para o carregamento de 3 μg de peptídeos digeridos para cada análise de MS. Os ensaios BCA e micro BCA foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da ontologia genética de proteínas abundantes em frações amiloides purificadas. (A) Componentes celulares e (B) caminhos KEGG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Buffers e soluções, parâmetros de espectrometria de massa e parâmetros de pesquisa ProLuCID para identificação de peptídeos. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Tabela suplementar 1- Uma lista representativa das razões m/z identificadas em MS executa para peptídeos beta amiloides de batedor de APP em modelos de mouse. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Desenvolver uma compreensão clara da estrutura e composição amiloide é um desafio para biólogos e bioquímicos estruturais devido às complexidades biológicas e limitações experimentais na extração de fibrilas purificadas dos tecidos cerebrais da AD16,17. Fibrilas amiloides são polimórficas a nível molecular, mostrando uma população heterogênea de comprimentos e complexidades variados18,19. Para entender melhor suas características biológicas e relevância patológica,é necessária uma caracterização exaustiva da composição de fibrilas amiloides polimórficas obtidas a partir de tecidos cerebrais humanos pós-morte e camundongos AD. Um grande subconjunto de proteínas interage diretamente com Aβ42, enquanto outros podem ter uma tendência a formar grandes estruturas fibrilares ou complexos proteicos 22,23,24. É mais desafiador determinar os papéis desempenhados pelas proteínas interagindo com Aβ42 na formação amiloide, estabilização e alongamento no que se refere à patologia da DA. Nos últimos anos, diversos estudos proteômicos têm elucidado as diferenças e semelhanças na composição proteica de vários arranjos supramoleculares, organelas sem membrana, corpos de inclusão e agregados proteicos 25,26,27. Nos estágios iniciais do DA, várias proteínas celulares (por exemplo, proteína tau associada a Aβ42 e microtúbula e apolipoproteína E) se desdobram e co-agregam em múltiplas regiões cerebrais28,29. As formações proteináceas amiloidgênicas são uma das principais marcas patológicas da DA e provavelmente contribuem para a patogênese3.
A purificação de fibrilas amiloides de cérebros humanos doentes é uma tarefa tediosa e desafiadora e tem múltiplas limitações. Uma grande desvantagem dos métodos existentes é a baixa pureza do material extraído, que muitas vezes restringe sua análise estrutural detalhada usando métodos de imagem, como o crioEM. Da mesma forma, os estudos de RMN requerem alguns miligramas de material purificado, que também precisa ser rotulado com isótopos pesados (ou seja, 15N)30. Cérebros humanos pós-morte podem atender ao primeiro requisito, pois o material inicial pode ser aumentado até alguns gramas de tecidos humanos; no entanto, rotular tecidos cerebrais humanos com isótopos pesados não é possível. Por outro lado, rotular os modelos de mouse AD com isótopos de 15N é possível (embora caro) e agora é cada vez mais comum31,32. Nosso laboratório usou rotulagem de perseguição de pulso para estudar a dinâmica de volume de negócios de proteínas sinápticas durante a doença e o envelhecimento cerebral14. Também usamos a rotulagem de isótopos pesados de animais inteiros para identificar proteínas de longa duração e entender sua relevância fisiológica em estruturas biológicas elaboradas33,34. No entanto, para o cérebro do camundongo, grandes quantidades de material inicial são necessárias para obter uma quantidade viável dos núcleos de fibrila. Este método aborda com sucesso essas questões, melhorando o rendimento e a pureza das fibrilas amiloides extraídas modificando os princípios de isolamento bioquímico existentes. Portanto, este protocolo robusto para extração de fibrilas amiloides a partir de tecidos cerebrais pode ser facilmente utilizado para estudos estruturais baseados em crioEM e NMR.
Este método utiliza o paradigma de fracionamento subcelular baseado em gradiente de densidade de sacarose existente e remove proteínas de co-purificação inespecíficas em etapas sucessivas. Após a remoção de detritos celulares, mielina, DNA e lipídios celulares, as pelotas insolúveis da SDS ricas em amiloide são isoladas. A incorporação de etapas adicionais de múltiplas lavagens SDS acopladas ajuda a reduzir o número de componentes celulares co-purificadores, proteínas frouxamente ligadas e polimorfos solúveis de SDS menores de amiloides. A pelota final é solubilizada em água ultrauso e pode ser usada para muitas aplicações, incluindo experimentos de semeadura, estudos bioquímicos ou farmacológicos e análise estrutural. As fibrilas amiloides purificadas dos tecidos cerebrais da DA também são usadas para entender a composição proteômica e características estruturais dos núcleos fibril usando proteômica baseada em MS. Esta análise confirmou a presença de um subconjunto de proteínas celulares (representadas na Figura 4) no núcleo das fibrilas, o que pode indicar os possíveis papéis de mais de uma proteína na formação, alongamento e estabilização de fibrilas amiloides ao longo de um longo curso de tempo. Algumas das proteínas identificadas nesta análise são conhecidas por sua associação com mais de uma doença neurodegenerativa, por exemplo, Adam22, APP, ApoE, proteínas de neurofilamento β-cateina, 14-3-3 proteínas, entre outras.
Existem possibilidades de que algumas proteínas contaminantes possam aparecer na análise proteômica devido ao fato de que, após a homogeneização, algumas interações injustificadas podem acontecer entre as proteínas devido à alta hidrofobiidade das fibrilas amiloides. Algumas dessas proteínas grudam nos núcleos e não são removidas mesmo após várias rodadas de sônica e etapas de lavagem de SDS. Esta é uma limitação dessa estratégia de purificação amiloide. No entanto, poderia ser abordado usando controles negativos adequados e realizando cortes estatísticos eficazes em estudos proteômicos em larga escala. Outra limitação que encontramos diz respeito à subestimação da abundância de peptídeos de Aβ após a digestão da trippsina. Isso foi abordado neste fluxo de trabalho por uma estratégia de análise de MS/MS direcionada. A análise de GO para as vias KEGG indica a abundância de proteínas pertencentes a caminhos envolvidos em muitas doenças neurodegenerativas, por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ELA) e doenças de Prion. Essas proteínas são atores importantes em múltiplas vias patológicas e, portanto, têm conhecido o envolvimento na iniciação e progressão da doença. Curiosamente, algumas dessas proteínas requerem análises mais aprofundadas para determinar seu possível envolvimento na patologia da DA e outras doenças neurodegenerativas.
Estudos futuros sobre o material amiloide puro de outros modelos de doenças podem fornecer uma compreensão aprofundada dos padrões estruturais e composição das fibrilas do núcleo e podem ajudar na identificação dos principais alvos terapêuticos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R01AG061865 a R.J.V. e J.N.S. Os autores agradecem a Vassar e aos membros do grupo de pesquisa Savas na Universidade Northwestern por suas discussões pensativas. Também agradecemos sinceramente ao Dr.s. Ansgar Seimer e Ralf Langen na Universidade do Sul da Califórnia por sua contribuição crucial. Agradecemos ao Dr. Farida Korabova pela preparação da amostra e imagens de microscopia eletrônica de coloração negativa no Centro de Microscopia Avançada da Universidade northwestern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
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