Summary
Denne biokemiske oprensningsmetode med massespektrometribaseret proteomisk analyse letter den robuste karakterisering af amyloidfibrilkerner, hvilket kan fremskynde identifikationen af mål for forebyggelse af Alzheimers sygdom.
Abstract
Proteinholdige fibrillære indeslutninger er vigtige patologiske kendetegn ved flere neurodegenerative sygdomme. I de tidlige stadier af Alzheimers sygdom (AD) danner amyloid-beta-peptider protofibriller i det ekstracellulære rum, som fungerer som frø, der gradvist vokser og modnes til store amyloidplakker. På trods af denne grundlæggende forståelse er den nuværende viden om amyloid fibrilstruktur, sammensætning og aflejringsmønstre i hjernen begrænset. En stor barriere har været manglende evne til at isolere højt oprensede amyloidfibriller fra hjerneekstrakter. Affinitetsrensning og laserfangst mikrodissektionsbaserede tilgange er tidligere blevet brugt til at isolere amyloider, men er begrænset af den lille mængde materiale, der kan genvindes. Denne nye, robuste protokol beskriver den biokemiske oprensning af amyloid plaquekerner ved hjælp af natriumdodecylsulfat (SDS) opløses med saccharosedensitetsgradient ultracentrifugering og ultralydbehandling og giver meget rene fibriller fra AD-patienter og AD-model hjernevæv. Massespektrometri (MS)-baseret bottom-up proteomisk analyse af det rensede materiale repræsenterer en robust strategi til at identificere næsten alle de primære proteinkomponenter i amyloidfibriller. Tidligere proteomiske undersøgelser af proteiner i amyloid koronae har afsløret en uventet stor og funktionelt forskelligartet samling af proteiner. Især efter raffinering af oprensningsstrategien blev antallet af co-rensende proteiner reduceret med mere end 10 gange, hvilket indikerer den høje renhed af det isolerede SDS uopløselige materiale. Negativ farvning og immuno-guld elektronmikroskopi tillod bekræftelse af renheden af disse præparater. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå de rumlige og biologiske egenskaber, der bidrager til aflejringen af disse proteiner i amyloidindeslutninger. Samlet set er denne analytiske strategi godt positioneret til at øge forståelsen af amyloidbiologi.
Introduction
Amyloid er et ekstremt stabilt supramolekylært arrangement, der findes i et forskelligt panel af proteiner, hvoraf nogle fører til patologiske ændringer1. Akkumuleringen af intra- eller ekstracellulære amyloidaggregater observeres i flere neurodegenerative sygdomme2. Amyloidaggregater er heterogene og er beriget med et stort antal proteiner og lipider3. I de senere år har interessen for amyloidproteomet skabt betydelig interesse blandt grundlæggende og translationelle neurovidenskabere. Flere metoder er blevet udviklet til at udtrække og rense amyloidaggregater fra mus og post mortem humane hjernevæv. Laserfangst mikrodissektion, immunoprecipitation, decellularisering og biokemisk isolering af amyloidaggregater er almindeligt anvendte metoder til at ekstrahere og rense amyloidplakker, fibriller og oligomerer 4,5,6,7. Mange af disse undersøgelser har fokuseret på at bestemme proteinsammensætningen af disse tætpakkede fibrillære aflejringer ved hjælp af semikvantitativ MS. De tilgængelige resultater er imidlertid inkonsekvente, og det overraskende store antal co-rensende proteiner, der tidligere er rapporteret, er udfordrende at fortolke.
Den primære begrænsning i den eksisterende litteratur, der beskriver amyloidkerneproteomet i AD- og AD-musemodelhjerner, er, at det oprensede materiale indeholder et uoverskueligt antal samrensende proteiner. Det overordnede mål med denne metode er at overvinde denne begrænsning og udvikle en robust biokemisk oprensning til isolering af amyloidfibrilkerner. Denne strategi anvender en tidligere beskrevet saccharosedensitetsgradient ultracentrifugeringsbaseret biokemisk metode til isolering af SDS uopløselige berigede amyloidfraktioner fra post mortem AD humant og musehjernevæv 8,9. Denne metode bygger på den eksisterende litteratur, men går videre med ultralydbehandling og SDS-vaske for at fjerne de fleste af de løst bundne amyloidassocierede proteiner, hvilket fører til isolering af højt oprensede amyloidfibriller (figur 1). Fibrillerne renset af denne protokol overvinder flere eksisterende udfordringer, der ofte opstår i strukturelle undersøgelser af amyloidfibriller isoleret fra hjerneekstrakter. Visualisering af disse fibriller med transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekræfter integriteten og renheden af det rensede materiale (figur 2). I denne undersøgelse opløses de isolerede fibriller og fordøjes til peptider med trypsin, og etiketfri MS-analyse kan let afsløre identiteten af proteinerne, der danner fibrilkernen. Især har nogle af disse proteiner en iboende tendens til at danne supramolekylære samlinger i ikke-membranbundne organeller. Derudover er mange af de proteiner, der er identificeret i analysen af amyloid-beta (Aβ) fibriller, også forbundet med andre neurodegenerative sygdomme, hvilket tyder på, at disse proteiner kan spille en nøglerolle i flere proteinopatier.
Denne SDS / ultralydbehandlingsmetode vil sandsynligvis ikke ændre eller forstyrre strukturen af fibrilkernerne. Det rensede materiale er også velegnet til en bred vifte af top-down og bottom-up proteomiske analysemetoder og yderligere MS-baserede strukturelle analysestrategier, såsom kemisk tværbinding eller hydrogen-deuteriumudveksling. Den samlede genopretning ved hjælp af denne metode er relativt høj og er således egnet til detaljerede strukturelle undersøgelser, som kræver mikrogram til milligram af det rensede materiale. Det rensede materiale er også velegnet til strukturelle undersøgelser ved hjælp af cryoEM og atomkraftmikroskopi. Denne protokol, i kombination med den stabile isotopiske mærkning af pattedyr, kan lette solid-state nukleare magnetiske resonans (NMR) undersøgelser af amyloid struktur10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol indebærer anvendelse af humant eller hvirveldyr hjernevæv. Al forskning blev udført i overensstemmelse med de godkendte institutionelle retningslinjer fra Northwestern University. Den nuværende arbejdsgang er standardiseret ved hjælp af APP-knock in (AppNL-G-F / NL-G-F) musehjerne kortikale og hippocampale hjerneregionekstrakter11. Denne protokol er optimeret til hjerneekstrakter fra mus i 6-9 måneders alderen, og den kan effektivt rense amyloider fra både han- og hundyr.
BEMÆRK: For en bedre forståelse af den overordnede eksperimentelle procedure, se figur 1 for en skematisk oversigt over arbejdsgangen.
1. Vævshøst og amyloidrensning
BEMÆRK: Ideelt set bør amyloidfibriller isoleres fra frisk dissekerede hjerneområder. Denne metode fungerer dog også godt med snap- eller flashfrosset hjernevæv. Nedenfor er en kort oversigt over snap-frysende hjernevæv til opbevaring til brug på et senere tidspunkt.
- Høst og opbevaring af hjernevæv: Disseker musehjerner og høst hurtigt de amyloidbelastede områder (dvs. cortex og hippocampus), efterfulgt af snapfrysning i flydende nitrogen eller et tørisalkoholbad.
BEMÆRK: Snapfrysning hjælper med at bevare de strukturelle egenskaber ved vævets bestanddele. Musene aflives ved isofluran og cervikal dislokation12,13. Det tilrådes at undgå at bruge CO2, da det kan kompromittere hjernens proteomintegritet. - Efter dissektion skæres og opbevares friske væv i små blokke (f.eks. 5 mm x 5 mm), da dette letter mere effektiv homogenisering før amyloidekstraktion. Overfør vævet til det sterile kryogene hætteglas, stram hætten og nedsænk hurtigt.
- Opbevar væv frosne under ultrakolde forhold (dvs. -80 °C eller flydende nitrogen). Hvis ekstraktionen skal udføres et par dage senere, skal vævene opbevares ved -20 °C og undgå fryse- og optøningscyklusser. Optø de frosne væv på våd is, når de er klar til ekstraktion og rensning.
BEMÆRK: Direkte kontakt af vævene med flydende nitrogen kan forårsage vævs- og proteinskader. Bemærk, at et alkoholbad kan fjerne permanente markører fra rørets etiketter.
2. Berigelse af SDS uopløseligt materiale
BEMÆRK: Udfør alle trin på is og centrifuger ved 4 °C, medmindre andet er angivet. Nærmere oplysninger om alle buffere og opløsninger, der anvendes i denne protokol, findes i supplerende fil 1. Producenter og katalognumre på kemikalier og instrumenter findes i tabellen over materialer.
- Start med frisk dissekerede eller snapfrosne hjernevævsområder (optøet på is) anbragt i et 2 ml rør indeholdende 6-8 keramiske perler og frisklavet iskold homogeniseringsbuffer (1 ml til 0,25-1 g våd vævsmasse).
- Overfør rørene til perlemøllehomogenisatoren, og slib vævsindholdet ved 4000 o / min med to cyklusser på 30 s hver og et interval på 30 s imellem.
BEMÆRK: Alternativt kan motoriserede omrører- eller homogenisatorsystemer bruges til at male og homogenisere vævene. - Tilsæt 9 ml iskold homogeniseringsbuffer til 1 ml hjerne helvævshomogenat i 15 ml rør, forsegl med laboratorievoksfilmstrimler, og drej ende-til-ende natten over ved 4 ° C for at sikre robust opløselighed.
BEMÆRK: For at fjerne uønsket stort cellulært affald og lipider skal du næste morgen dreje rørene ved 800 x g ved 4 ° C i 10 minutter og samle supernatanten i et frisk rør. Resuspender den resterende pellet i 2 ml iskold homogeniseringsbuffer, bland godt, drej igen i 10 minutter ved 4 ° C, og kombiner de to supernatanter. - Der tilsættes langsomt fast saccharose til vævsekstraktsuspensionen til en slutkoncentration på 1,2 M, blandes godt, og centrifugeres ved 250.000 x g i 45 minutter ved 4 °C.
- Fjern og kassér forsigtigt supernatanten ved hjælp af en pipette. Pelleten genanvendes i 2 ml homogeniseringsbuffer indeholdende 1,9 m saccharose ved triturering efterfulgt af centrifugering ved 125 000 x g i 45 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Buffervolumenet kan justeres baseret på mængden af materiale, der er genvundet fra det foregående trin. Generelt er 10 volumener homogeniseringsbuffer (V / V) ideel til dette trin. - Saml det øverste hvide faste lag ved hjælp af en pipette, overfør det til et frisk rør, og opsluller i 1 ml iskold vaskebuffer ved at pipettere op og ned flere gange uden at indføre luftbobler.
- Bortset fra det øverste lag er pelleten også beriget med amyloidfibriller. For et højere udbytte skal du kombinere de to fraktioner og fortsætte. Fjern forsigtigt det midterste vandige lag ved hjælp af en pipette og kassér.
- De kombinerede fraktioner centrifugeres ved 8000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Der tilsættes 1 ml iskold fordøjelsesbuffer til den vaskede pille, resuspenderes, og der inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 3 timer.
- Centrifuger ved 8000 x g i 20 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes med en pipette.
- Resuspender og vask (samme som trin 2.8.) den fordøjede pellet to gange i 1 ml iskold Tris-buffer.
- Den vaskede pellet genanvendes i 1 ml opløselig buffer indeholdende 1% SDS og 1,3 M saccharose ved pipettering op og ned. Centrifuger hurtigt ved 200.000 x g i 60 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Selvom amyloidfibrillerne er meget modstandsdygtige over for vaskemidler og denatureringsmidler, kan meget lange eksponeringer for vaskemidlet (1% SDS) påvirke fibrillernes integritet eller fjerne de tæt bundne proteiner, hvilket vil kompromittere efterfølgende analyser. Derfor, straks efter genoplivning af pellets, fortsæt til centrifugering. - Pelleten gemmes, og volumenet af det resterende supernatant øges ved at tilsætte 50 mM Tris-buffer (i forholdet 1:0,3) for at reducere saccharosekoncentrationen fra 1,3 til 1 M og centrifugere endnu en gang ved 200 000 x g i 45 minutter ved 4 °C.
- De to pellets opløses i 100 μL Tris-buffer indeholdende 0,5% SDS og pool til amyloidrensning. Synlige pellets er små og skal fremstå uigennemsigtige og offwhite (se figur 2A).
3. Amyloid rensning
BEMÆRK: Kombiner de to pellets, opløses ved pipettering, indtil der opnås en ensartet opløsning, og fortsæt med følgende trin i amyloidrensning.
- For fuldstændig opløseliggørelse af det amyloidrige materiale, der er til stede i pellets, skal røret udsættes for mekanisk klipning produceret af ultralydbølger i en badsonikeringsanordning, der kører i 30 s ON og 30 s OFF ved en mellemfrekvens i 20 cyklusser.
- Materialet centrifugeres straks ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 °C, og pelleten genanvendes i 500 μL 0,5 % SDS Tris-buffer.
- Gentag trin 3.1. og trin 3.2. fire gange for i alt fem vaske. Antallet af vaske kan øges for at forbedre renheden.
BEMÆRK: Sonikerings- og vasketrin optimeres ved 0,5% SDS, da højere koncentrationer kan påvirke fibrillernes struktur, integritet eller proteinsammensætning. Det anbefales ikke at øge SDS-koncentrationen på dette trin. - Efter det sidste centrifugeringstrin vaskes pelleten i 200 μL ultrarent vand og centrifugeres ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 °C for at fjerne eventuelt resterende vaskemiddel. Den vaskede pille indeholdende rensede amyloidfibriller fremstår halvgennemsigtige i farven og er undertiden vanskelig at se.
- Den endelige pellet indeholdende rensede amyloidfibriller opløses i 100 μL ultrarent vand. Fortsættes straks til næste trin til downstream-behandling, eller fibrilsuspensionen opbevares ved -20 °C til yderligere analyse. Hvis det er frosset, optø på is, inden nedbør påbegyndes.
4. Methanol chloroform udfældning
BEMÆRK: Hvis det endelige mål er at udføre proteinanalyse, anbefales det at afsalte og fjerne yderligere ikke-proteinholdige urenheder.
- Der tilsættes 400 μL methanol til de rensede 100 μL amyloidfibriller i et 1,5 ml rør og hvirvelbrønd.
- Tilsæt 100 μL chloroform til røret og hvirvelbrønden.
- Tilsæt 300 μL ultrarent vand og hvirvel grundigt. Dette gør blandingen overskyet på grund af proteinudfældning.
- Centrifuger ved 12.000 x g i 2 min ved RT.
- Fjern forsigtigt det vandige lag (dvs. toppen) uden at forstyrre grænsefladelaget, der indeholder proteinflagen.
- Tilsæt det samme volumen methanol igen og centrifuger ved 12.000 x g i 2 minutter ved RT.
- Kassér supernatanten med en pipette, og lufttør pelleten ved RT. Undgå overtørring; Amyloidfraktion er vanskelig at opløse igen, hvis den overtørres.
5. Trypsin fordøjelse
- Pelleten opløses i 50 μL guanidinhydrochlorid (GuHCl) buffer. Sonikeres i et iskoldt vandbad og opvarmes ved 95 ° C i 5 minutter, hvis det er nødvendigt.
- Vortex grundigt ved RT i 45 minutter til 1 time for at opløse det helt. Pelleten vil ikke være synlig efter dette trin, og løsningen ser klar ud i udseende.
- Tilsæt det samme volumen af 0,2% overfladeaktivt stofopløsning. Solubiliser på RT med hvirvel i 60 min. Dette trin forbedrer trypsin enzymatisk aktivitet.
- Der tilsættes 1 μL tris-2-carboxyethylphosphin (TCEP) fra 500 mM stamopløsningen. Inkuberes i 60 min.
- Tilsæt 2 μL 500 mM iodoacetamid (IAS) og inkuberes i mørke i 20 minutter.
- IAS slukkes med 5 μL TCEP-opløsning i 15 min.
- Tilsæt det krævede volumen 50 mM ammoniumbicarbonatopløsning til røret for at reducere guanidinkoncentrationen til 1,5 M.
- Der tilsættes 1% overfladeaktiv opløsning til røret (1 μL/50 μg protein).
- Der tilsættes trypsin (1 μg/100 μg protein), og røret blandes ved 37 °C natten over.
6. Oprydning af peptid
- Næste morgen syrnes den fordøjede peptidopløsning ved at sænke pH til 2,0 ved tilsætning af myresyre.
- Aktiver C18 (n-octadecyl) spinkolonnen i et 2 ml modtagerrør ved at tilsætte 200 μL 50% methanolopløsning og drej ved 1500 x g i 2 minutter ved RT. Gentag aktiveringstrinnet.
- Ligevægt C18-søjleharpiksbedene ved at tilsætte 200 μL ligevægtsbuffer og spinde i 2 minutter under de samme betingelser. Gentag dette trin.
- Læg den syrnede peptidopløsning på C18-søjlen og centrifuger ved 1500 x g i 2 minutter ved RT. Saml gennemstrømningen og genindlæs den endnu en gang. Kassér den anden gennemstrømning.
- Peptiderne bundet til C18-harpiksen vaskes med vaskebufferen 2x, som gjort i trin 6.3. Brug den samme ligevægtsbuffer til vask af søjlen.
- Eluter peptiderne ved tilsætning af 40 μL elueringsbuffer efterfulgt af centrifugering ved 1500 x g i 2 minutter ved RT. Gentag elueringstrinnet tre gange for at øge udbyttet af de genvundne peptider.
- Tør peptiderne i en hastighedsvakuumkoncentrator ved at fordampe den vandige opløsning. Tørre pellets kan gemmes ved -20 °C i et par uger før MS-analysen.
7. Opsætning af massespektrometer til peptidanalyse
BEMÆRK: For MS-parametre, se Supplerende fil 1 (tilpasset fra en tidligere publikation fra laboratoriet)14.
- Før du lægger peptidprøverne til MS-analysen, opløses de tørre peptidpellets i 20 μL prøvebelastningsbuffer og udføres mikro-BCA for at kvantificere koncentrationen af genvundne peptider.
- Overfør de opløste peptider i et hætteglas og belastning 3 μg (kvantificeret fra mikro BCA) peptider i UPLC-systemets autosampler.
- Læg prøverne på en ventileret fældesøjle (C18 HPLC-søjle, 0,075 mm x 20 mm) med en strømningshastighed på 250 nL/min.
- Fældekolonnen anbringes på linje med en analytisk søjle (0,075 μm x 500 mm), og der samles en emitterspids til elektrosprayioniseringskilden (ESI), der udsættes for en sprøjtespænding på 2000 V.
BEMÆRK: I denne undersøgelse udføres ESI, hvor den mobile fase udsættes for højspændingsionisering i gasfasen. Sprayen skabt af dette ledes til MS's vakuumkammer gennem en opvarmet kapillær. Under vakuum forekommer deopløsningen af dråber og udstødning af ioner i nærvær af varme og spænding. Derefter accelereres ionerne mod masseanalysatoren i nærværelse af et højspændingsmiljø. - Analyser prøverne med 2 timers anskaffelseskørsler. Denne undersøgelse udføres ved hjælp af dataafhængig erhvervelse med det mest intense top 20 forløberionudvælgelsesparadigme.
BEMÆRK: Ved dataafhængig erhvervelse detekteres et begrænset antal prækursorpeptider i MS1-scanningen og udsættes for fragmentering til MS2-analyse. Den dynamiske udelukkelse er imidlertid problematisk her, da meget rigelige Aβ-peptider vil blive udeladt for fragmentering og resultere i en undervurdering af deres mængde. - For absolut kvantificering af Aβ-peptider skal du køre de samme prøver en gang til ved hjælp af den målrettede MS / MS-metode. Til denne undersøgelse udarbejdes en udtømmende liste over alle m/z-forhold for forskellige mulige tryptiske Aβ-peptider til APP-knock-in-musemodellerne (se supplerende tabel 1). Andre grupper bør udarbejde en lignende liste i overensstemmelse med den tilgængelige musemodel og de mulige peptider, der genereres fra proteinet af interesse (f.eks. Aβ for AD).
BEMÆRK: For at imødegå udelukkelsen af meget rigelige peptider skal du bruge en målrettet tilgang ved at give en liste over udvalgte m / z-værdier svarende til Aβ tryptiske peptider. Denne tilgang løser problemet med dataafhængig udelukkelse af Aβ-peptider og kan kvantificere de absolutte mængder af forskellige monomerer (Aβ38, 40 og 42 peptider) med høj opløsning. - Massespektrometeret genererer MS-spektre af peptidprøverne og gemmer rådatafiler i målmappen. Brug denne fil til at udføre spektral matchning ved hjælp af veletablerede statistiske og bioinformatiske værktøjer. Flere online og offline databasesøgnings- og analyseværktøjer er tilgængelige.
8. Analyse af ms-data
- Udpak MS1- og MS2-filerne ved hjælp af offline Rawconverter-værktøjet (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Udfør identifikation, kvantificering og detaljerede analyser af dataene på en webbaseret MS-datasøgemaskine. I denne undersøgelse blev Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) anvendt.
BEMÆRK: Flere andre online og offline MS-dataanalyseværktøjer er tilgængelige og kan også bruges, såsom MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - Når du har uploadet MS1- og MS2-filerne, skal du vælge en opdateret museproteomdatabase. Her vælges en opdateret musedatabase, der indeholder yderligere App knock-in specifikke mutationer til identifikation af peptider ved hjælp af ProLuCId- og SEQUEST-algoritmer11.
- I IP2-analysesystemet skal du vælge standardparametrene og ændre dem i henhold til de eksperimentelle krav. I denne undersøgelse anvendes en peptidmassetolerance på 50 ppm for forløber og 600 ppm for fragmenter (se supplerende fil 1 for andre parametre, der anvendes i IP2).
BEMÆRK: Forskere kan ændre søgeparametrene i overensstemmelse med de eksperimentelle mål. For eksempel til identifikation af posttranslationelle modifikationer skal du tilføje differentielle modifikationsværdier for forskellige PTM'er (f.eks. ubiquitination, SUMOylation, phosphorylering).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her opsummeres en detaljeret metode til isolering og oprensning af amyloidfibriller ved anvendelse af en modificeret saccharosedensitetsgradient ultracentrifugeringsrensningsmetode (se figur 1). Innovationen i denne metode er inkluderingen af trin i ultralydbehandlingsbaseret vask ved hjælp af et vandbad sonikeringssystem efterfulgt af SDS-opløselighed, som fjerner mange løst associerede proteiner fra amyloidfibrillerne, der renser sammen med de meget tætte og rene fibriller. Ultralydbehandlingstrinnet genererer en høj forskydningskraft og omrører fibrillerne, løsner de hydrofobe kræfter og frigiver de SDS-opløselige løst associerede proteiner i SDS-vaskebufferen. Til gengæld genvindes små mængder meget rene amyloidfibrilkerner. Som vist i figur 2A kan en synlig pille, der oprindeligt forekommer uigennemsigtig (muligvis på grund af urenheder), ses efter berigelse; Men efter ultralydbehandling og flere SDS-vaske bliver pelleten halvgennemsigtig og er næppe synlig. Den repræsentative Congo røde farvning af rensede amyloider sammenlignet med den SDS-opløselige fraktion dokumenterer berigelsen af amyloidfibrillerne (figur 2B). Congo rød farvning kan bruges til at bekræfte amyloidmaterialet i forskellige fraktioner og kan visualiseres ved hjælp af et lyst feltmikroskop. Som vist i figur 2C pletter den SDS-opløselige fraktion ikke med det congorøde farvestof.
Strukturen af de rensede fibriller med negativ farvningstransmission elektronmikroskopianalyse bekræftede tilstedeværelsen af næsten rene amyloidfibriller (figur 2D). Derudover bekræftede immunogoldmærkning ved anvendelse af en kombination af Aβ42 (6E10 og 4G8) antistoffer tilstedeværelsen af Aβ42 peptider (figur 2E). For at undersøge sammensætningen og strukturelle egenskaber ved det rensede materiale brugte vi immunoblotteknikker til Aβ-peptider og kendetegnende strukturelle signaturer (f.eks. Fibriller). Repræsentativ prikpletanalyse af fraktionerne indsamlet under amyloidisolering viste en relativ overflod af Aβ42 peptider og fibriller ved anvendelse af anti-Aβ42 og anti-fibril (LOC) antistoffer (figur 3A). Tilsvarende viste western blot af de repræsentative fraktioner også berigelse af Aβ42-holdige fibriller i proteiner med høj molekylvægt fanget i brøndene i SDS PAGE-gelen (figur 3B). For at forstå sammensætningen af disse fibriller med høj molekylvægt blev rensede amyloidfraktioner udsat for MS-baseret proteomisk analyse. Disse semikvantitative resultater afslørede tilstedeværelsen af ca. 250 proteiner, mens fraktionen indsamlet før ultralydbehandling og SDS-vaske indeholdt mere end 2500 proteiner (figur 3C). Dette indikerer effektiviteten af disse to afgørende trin, der er inkluderet i denne rensningsprotokol. Samlet set indikerer flere uafhængige resultater den høje overflod af lignende proteinklasser i fibrilkerner.
Gene Ontology (GO) cellulær komponentanalyse for et repræsentativt MS-datasæt i figur 4 afslørede, at et stort antal proteiner, der er til stede i fibrilkernerne, er forbundet med ikke-membranbundne organeller og supramolekylære komplekser. Denne observation skyldes sandsynligvis den iboende tendens hos mange proteiner til at aggregere sig selv eller sammenlægge med andre proteiner i proteinholdige indeslutninger, der er i nærheden. Fysiske kræfter spiller afgørende roller i disse interaktioner. Den anden cellulære organel og komponenter, der primært er repræsenteret af disse proteiner, er mitokondrier, cytoskelet, cellemembran og myelinskede. Mange af disse proteiner interagerer med Aβ peptider, oligomerer eller protofibriller på forskellige stadier af amyloiddannelse. De kan interagere tæt på plasmamembranen, hvor Aβ peptider frigives. Interaktionen kan også ske, mens nogle af disse proteiner frigives direkte eller via vesikulær transport ind i det ekstracellulære rum. Sekretion eller exocytose af proteinaggregater er en blandt mange strategier, som celler bruger til at klare og reducere byrden forbundet med proteinaggregater15. Dette efterlader en anden mulighed, hvor nogle af de intracellulære proteiner kan binde til Aβ-peptider. Protokollen giver en ramme for yderligere optimering afhængigt af de eksperimentelle mål. For eksempel kan renheden og udbyttet ved at ændre antallet af ultralydbehandling og SDS-vaske finjusteres i overensstemmelse hermed.
Figur 1: En diagrammatisk oversigt over arbejdsgangen for isolering af amyloid fibriller kerne fra AD post mortem humane eller model dyr hjernevæv.
Figur 2: Bekræftelse af amyloidekstraktion ved hjælp af biokemisk farvning og billeddannelse af amyloidfibriller. (A) Beriget amyloidholdig SDS uopløselig pellet forekommer uigennemsigtig offwhite i farve. B) Congorød farvning af SDS-opløselige supernatanter og SDS-uopløselige pellet indeholdende renset amyloid blottet på 0,45 μm nitrocellulosemembran BCA-aflæsninger blev anvendt til normalisering af proteinernes belastningsmængde. BCA-analyse blev udført i henhold til producentens anvisninger. (C) Bright-field billeder af SDS opløseligt og amyloid materiale efter Congo rød farvning (skala bar: 100 μm). (D) Visualisering af SDS-opløselig fraktion og rensede amyloidfibriller ved anvendelse af negativ farvning under elektronmikroskopet (skalalinje: 100 nm). (E) Bekræftelse af Aβ42 peptider overflod i rensede amyloidfibriller ved immunogold elektronmikroskopi ved anvendelse af Aβ42 (6E10 og 4G8) antistoffer (skala bar: 50 nm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering af amyloidrensning ved hjælp af immunoblot- og MS-analyse. (A) Dot blot og (B) Western blot-analyse af flere repræsentative fraktioner indsamlet under amyloidrensningsprocessen under anvendelse af anti-fibril LOC og anti-Aβ42 antistof; BCA-assayaflæsninger blev brugt til normalisering af proteinernes belastningsmængde. (C) Antal proteiner genvundet i etiketfri massespektrometrianalyse af berigede og oprensede amyloidfraktioner; mikro BCA-assay blev anvendt til indlæsning af 3 μg fordøjede peptider til hver MS-analyse. BCA- og mikro-BCA-assays blev udført i henhold til producentens anvisninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Genontologisk analyse af proteiner, der er rigelige i oprensede amyloidfraktioner. (A) Cellulære komponenter og (B) KEGG-veje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Buffere og opløsninger, massespektrometriparametre og ProLuCID-søgeparametre til identifikation af peptider. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1- En repræsentativ liste over m /z-forhold identificeret i MS-kørsel for amyloid beta-peptider af APP-banke i musemodeller. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udvikling af en klar forståelse af amyloid struktur og sammensætning er udfordrende for strukturbiologer og biokemikere på grund af de biologiske kompleksiteter og eksperimentelle begrænsninger ved ekstraktion af rensede fibriller fra AD-hjernevæv16,17. Amyloidfibriller er polymorfe på molekylært niveau og viser en heterogen population af varierende længder og kompleksiteter18,19. For bedre at forstå deres biologiske egenskaber og patologiske relevans kræves en udtømmende karakterisering af sammensætningen af polymorfe amyloidfibriller opnået fra post mortem humant og AD musehjernevæv 20,21. En stor delmængde af proteiner interagerer direkte med Aβ42, mens andre kan have en tendens til at danne store fibrillære strukturer eller proteinkomplekser 22,23,24. Det er mere udfordrende at bestemme de roller, som proteinerne, der interagerer med Aβ42 i amyloiddannelse, stabilisering og forlængelse, som det vedrører AD-patologi. I de senere år har flere proteomiske undersøgelser belyst forskellene og lighederne i proteinsammensætningen af forskellige supramolekylære arrangementer, membranløse organeller, inklusionslegemer og proteinaggregater 25,26,27. I de tidlige stadier af AD misfoldes og co-aggregeres flere cellulære proteiner (f.eks. Aβ42 og mikrotubuli-associeret tau-protein og apolipoprotein E) i flere hjerneområder28,29. Amyloidogene proteinholdige formationer er et vigtigt patologisk kendetegn ved AD og bidrager sandsynligvis til patogenese3.
Rensningen af amyloidfibriller fra syge menneskelige hjerner er en kedelig og udfordrende opgave og har flere begrænsninger. En stor ulempe ved de eksisterende metoder er den lave renhed af ekstraheret materiale, hvilket ofte begrænser deres detaljerede strukturelle analyse ved hjælp af billeddannelsesmetoder, såsom cryoEM. Ligeledes kræver NMR-undersøgelser et par milligram renset materiale, som også skal mærkes med tunge isotoper (dvs. 15N)30. Post mortem menneskelige hjerner kan opfylde det første krav, da udgangsmaterialet kan øges op til et par gram humant væv; det er imidlertid ikke muligt at mærke humant hjernevæv med tunge isotoper. På den anden side er det muligt at mærke AD-musemodellerne med 15N isotoper (selvom det er dyrt) og er nu mere og merealmindeligt 31,32. Vores laboratorium har brugt pulsjagtmærkning til at studere den synaptiske proteinomsætningsdynamik under sygdom og aldrende hjerner14. Vi har også brugt heldyrs tunge isotopmærkning til at identificere langlivede proteiner og forstå deres fysiologiske relevans i udførlige biologiske strukturer33,34. For musehjernen kræves der imidlertid store mængder udgangsmateriale for at opnå en brugbar mængde fibrilkerner. Denne metode løser med succes disse problemer ved at forbedre udbyttet og renheden af de ekstraherede amyloidfibriller ved at ændre de eksisterende biokemiske isolationsprincipper. Derfor kan denne robuste protokol til amyloidfibriller ekstraktion fra hjernevæv let anvendes til cryoEM og NMR-baserede strukturelle undersøgelser.
Denne metode anvender det eksisterende saccharosedensitetsgradientbaserede subcellulære fraktioneringsparadigme og fjerner uspecifikke co-rensende proteiner i successive trin. Efter fjernelse af celleaffald, myelin, DNA og cellulære lipider isoleres de amyloidrige SDS-uopløselige pellets. Inkorporeringen af yderligere trin i flere ultralydbehandlingskoblet SDS-vaske hjælper med at reducere antallet af co-rensende cellulære komponenter, løst bundne proteiner og mindre SDS-opløselige polymorfer af amyloider. Den endelige pellet opløses i ultrarent vand og kan bruges til mange applikationer, herunder såningsforsøg, biokemiske eller farmakologiske undersøgelser og strukturel analyse. De rensede amyloidfibriller fra AD-hjernevæv bruges også til at forstå den proteomiske sammensætning og strukturelle egenskaber ved fibrilkerner ved hjælp af MS-baseret proteomics. Denne analyse bekræftede tilstedeværelsen af en delmængde af cellulære proteiner (repræsenteret i figur 4) i kernen af fibrillerne, hvilket kan indikere de mulige roller af mere end et protein i dannelsen, forlængelsen og stabiliseringen af amyloidfibriller over et langt forløb. Nogle af de proteiner, der er identificeret i denne analyse, er kendt for deres tilknytning til mere end en neurodegenerativ lidelse, for eksempel Adam22, APP, ApoE, β-catenin neurofilamentproteiner, 14-3-3 proteiner og andre.
Der er muligheder for, at nogle forurenende proteiner kan forekomme i proteomisk analyse på grund af det faktum, at der efter homogenisering kan ske nogle uberettigede interaktioner mellem proteiner på grund af den høje hydrofobicitet af amyloidfibriller. Nogle af disse proteiner klæber til kernerne og fjernes ikke selv efter flere runder af sonikering og SDS vasketrin. Dette er en begrænsning af denne amyloidrensningsstrategi. Det kan dog løses ved hjælp af passende negative kontroller og udførelse af effektive statistiske cutoffs i store proteomiske undersøgelser. En anden begrænsning, som vi stødte på, vedrører undervurderingen af Aβ-peptid overflod efter trypsinfordøjelse. Dette er blevet behandlet i denne arbejdsgang ved hjælp af en målrettet MS/MS-analysestrategi. GO-analyse for KEGG-veje indikerer overflod af proteiner, der tilhører veje involveret i mange neurodegenerative sygdomme, for eksempel Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Prionsygdomme. Disse proteiner er vigtige aktører i flere patologiske veje og har således kendt involvering i sygdomsinitiering og progression. Interessant nok kræver nogle af disse proteiner yderligere analyse for at bestemme deres mulige involvering i patologien af AD og andre neurodegenerative sygdomme.
Fremtidige undersøgelser af det rene amyloidmateriale fra andre sygdomsmodeller kan give en dybdegående forståelse af de strukturelle mønstre og sammensætningen af kernefibriller og kan hjælpe med at identificere vigtige terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-bevillingen R01AG061865 til R.J.V. og J.N.S. Forfatterne takker Vassar og Savas forskningsgruppemedlemmer ved Northwestern University for deres tankevækkende diskussioner. Vi takker også oprigtigt Dr (s). Ansgar Seimer og Ralf Langen ved University of South California for deres afgørende input. Vi takker Dr. Farida Korabova for prøveforberedelse og negativ farvning elektronmikroskopi billeddannelse ved Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C.
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
