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Neuroscience

Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63816
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Abstract

Les inclusions fibrillaires protéiques sont des caractéristiques pathologiques clés de multiples maladies neurodégénératives. Dans les premiers stades de la maladie d’Alzheimer (MA), les peptides bêta-amyloïdes forment des protofibrilles dans l’espace extracellulaire, qui agissent comme des graines qui se développent progressivement et mûrissent en grandes plaques amyloïdes. Malgré cette compréhension de base, les connaissances actuelles sur la structure, la composition et les modèles de dépôt des fibrilles amyloïdes dans le cerveau sont limitées. Une barrière majeure a été l’incapacité d’isoler les fibrilles amyloïdes hautement purifiées des extraits de cerveau. Des approches basées sur la purification par affinité et la capture laser par microdissection ont déjà été utilisées pour isoler les amyloïdes, mais sont limitées par la petite quantité de matériau qui peut être récupérée. Ce nouveau protocole robuste décrit la purification biochimique des noyaux de plaque amyloïde à l’aide de la solubilisation au dodécylsulfate de sodium (SDS) avec ultracentrifugation et ultrasons du gradient de densité de saccharose et donne des fibrilles très pures de patients atteints de MA et de tissus cérébraux modèles de DA. L’analyse protéomique ascendante basée sur la spectrométrie de masse (SEP) du matériau purifié représente une stratégie robuste pour identifier presque tous les composants protéiques primaires des fibrilles amyloïdes. Des études protéomiques antérieures sur les protéines de la couronne amyloïde ont révélé une collection de protéines étonnamment grande et fonctionnellement diversifiée. Notamment, après avoir affiné la stratégie de purification, le nombre de protéines co-purifiantes a été réduit de plus de 10 fois, ce qui indique la grande pureté du matériau insoluble isolé SDS. La coloration négative et la microscopie électronique immuno-or ont permis de confirmer la pureté de ces préparations. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les attributs spatiaux et biologiques qui contribuent au dépôt de ces protéines dans les inclusions amyloïdes. Dans l’ensemble, cette stratégie analytique est bien positionnée pour améliorer la compréhension de la biologie amyloïde.

Introduction

L’amyloïde est un arrangement supramoléculaire extrêmement stable que l’on trouve dans un panel diversifié de protéines, dont certaines conduisent à des changements pathologiques1. L’accumulation d’agrégats amyloïdes intra- ou extracellulaires est observée dans plusieurs maladies neurodégénératives2. Les agrégats amyloïdes sont hétérogènes et sont enrichis d’un grand nombre de protéines et de lipides3. Au cours des dernières années, l’intérêt pour le protéome amyloïde a suscité un intérêt considérable parmi les neuroscientifiques de base et translationnels. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire et purifier les agrégats amyloïdes des tissus cérébraux humains de souris et post-mortem. La microdissection par capture laser, l’immunoprécipitation, la décellularisation et l’isolement biochimique des agrégats amyloïdes sont des méthodes largement utilisées pour extraire et purifier les plaques amyloïdes, les fibrilles et les oligomères 4,5,6,7. Beaucoup de ces études se sont concentrées sur la détermination de la composition protéique de ces dépôts fibrillaires étroitement emballés à l’aide de la SEP semi-quantitative. Cependant, les résultats disponibles sont incohérents et le nombre étonnamment élevé de protéines co-purifiantes précédemment rapportées est difficile à interpréter.

La principale limite de la littérature existante décrivant le protéome du noyau amyloïde dans les cerveaux modèles murins AD et AD est que le matériel purifié contient un nombre ingérable de protéines co-purifiantes. L’objectif global de cette méthode est de surmonter cette limitation et de développer une purification biochimique robuste pour isoler les noyaux de fibrilles amyloïdes. Cette stratégie utilise une méthode biochimique basée sur l’ultracentrifugation du gradient de densité de saccharose décrite précédemment pour isoler les fractions amyloïdes enrichies insolubles dans le SDS à partir de tissus cérébraux humains et murins post-mortemAD 8,9. Cette méthode s’appuie sur la littérature existante, mais va plus loin avec les ultrasons et les lavages SDS pour éliminer la plupart des protéines associées à l’amyloïde faiblement liées, conduisant à l’isolement des fibrilles amyloïdes hautement purifiées (Figure 1). Les fibrilles purifiées par ce protocole surmontent plusieurs défis existants fréquemment rencontrés dans les études structurelles de fibrilles amyloïdes isolées à partir d’extraits cérébraux. La visualisation de ces fibrilles par microscopie électronique à transmission (TEM) confirme l’intégrité et la pureté du matériau purifié (Figure 2). Dans cette étude, les fibrilles isolées sont solubilisées et digérées en peptides avec de la trypsine, et l’analyse de la SEP sans étiquette peut facilement révéler l’identité des protéines formant le noyau de la fibrilure. Notamment, certaines de ces protéines ont une tendance inhérente à former des assemblages supramoléculaires dans des organites non liés à la membrane. En outre, de nombreuses protéines identifiées dans l’analyse des fibrilles bêta-amyloïdes (Aβ) sont également associées à d’autres maladies neurodégénératives, ce qui suggère que ces protéines peuvent jouer un rôle clé dans de multiples protéinopathies.

Il est peu probable que cette méthode de FDS/ultrasons modifie ou perturbe la structure des noyaux de fibrilles. Le matériau purifié convient également à un large éventail d’approches d’analyse protéomique descendante et ascendante et à d’autres stratégies d’analyse structurelle basées sur la SEP, telles que la réticulation chimique ou l’échange hydrogène-deutérium. La récupération globale à l’aide de cette méthode est relativement élevée et convient donc aux études structurelles détaillées, qui nécessitent des microgrammes à des milligrammes du matériau purifié. Le matériau purifié convient également aux études structurelles utilisant cryoEM et la microscopie à force atomique. Ce protocole, combiné au marquage isotopique stable des mammifères, peut faciliter les études par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide de la structure amyloïde10.

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Protocol

Ce protocole implique l’utilisation de tissus cérébraux humains ou vertébrés. Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles approuvées par l’Université Northwestern. Le flux de travail actuel est normalisé à l’aide d’extraits corticaux du cerveau de souris et de la région cérébrale de l’hippocampe APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F)11. Ce protocole a été optimisé pour les extraits de cerveau de souris âgées de 6 à 9 mois, et il peut purifier efficacement les amyloïdes des animaux mâles et femelles.

REMARQUE : Pour une meilleure compréhension de la procédure expérimentale globale, reportez-vous à la Figure 1 pour obtenir un schéma du flux de travail.

1. Prélèvement de tissus et purification de l’amyloïde

REMARQUE: Idéalement, les fibrilles amyloïdes devraient être isolées des régions du cerveau fraîchement disséquées. Cependant, cette méthode fonctionne également bien avec les tissus cérébraux congelés instantanément ou instantanément. Vous trouverez ci-dessous un bref aperçu des tissus cérébraux à gel instantané pour les stocker en vue d’une utilisation ultérieure.

  1. Prélèvement et stockage des tissus cérébraux : Disséquez les cerveaux de souris et récoltez rapidement les régions chargées d’amyloïde (c.-à-d. cortex et hippocampe), puis par congélation instantanée dans de l’azote liquide ou un bain d’alcool de glace carbonique.
    REMARQUE: La congélation instantanée aide à préserver les attributs structurels des constituants du tissu. Les souris sont euthanasiées par isoflurane et luxation cervicale12,13. Il est conseillé d’éviter d’utiliser du CO2 car cela peut compromettre l’intégrité du protéome cérébral.
  2. Après la dissection, coupez et stockez les tissus frais dans de petits blocs (par exemple, 5 mm x 5 mm), car cela facilite une homogénéisation plus efficace avant l’extraction amyloïde. Transférez le tissu dans le flacon cryogénique stérile, serrez son capuchon et immergez-le rapidement.
  3. Gardez les tissus congelés dans des conditions ultrafroides (c.-à-d. -80 °C ou azote liquide). Si l’extraction doit être effectuée quelques jours plus tard, stockez les tissus à -20 °C et évitez les cycles de gel et de dégel. Décongeler les tissus congelés sur de la glace humide lorsqu’ils sont prêts pour l’extraction et la purification.
    REMARQUE: Le contact direct des tissus avec l’azote liquide peut causer des dommages aux tissus et aux protéines. Notez qu’un bain d’alcool peut supprimer les marqueurs permanents des étiquettes des tubes.

2. Enrichissement des matières insolubles dans les FDS

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes sur la glace et la centrifugeuse à 4 ° C, sauf indication contraire. Les détails de tous les tampons et solutions utilisés dans ce protocole sont fournis dans le fichier supplémentaire 1. Les fabricants et les numéros de catalogue des produits chimiques et des instruments sont fournis dans le tableau des matériaux.

  1. Commencez par des régions de tissu cérébral fraîchement disséquées ou congelées (décongelées sur de la glace) placées dans un tube de 2 mL contenant 6 à 8 perles de céramique et un tampon d’homogénéisation glacé fraîchement préparé (1 mL pour 0,25 à 1 g de masse tissulaire humide).
  2. Transférer les tubes dans l’homogénéisateur du broyeur à billes et broyer le contenu des tissus à 4000 tr / min, avec deux cycles de 30 s chacun et un intervalle de 30 s entre les deux.
    REMARQUE: Alternativement, des systèmes d’agitateur ou d’homogénéisateur motorisés peuvent être utilisés pour broyer et homogénéiser les tissus.
  3. Ajouter 9 mL de tampon d’homogénéisation glacé à 1 mL d’homogénéat de tissu entier du cerveau dans des tubes de 15 mL, sceller avec des bandes de film de cire de laboratoire et faire pivoter bout à bout pendant la nuit à 4 °C pour assurer une solubilisation robuste.
    REMARQUE: Pour éliminer les gros débris cellulaires et les lipides indésirables, le lendemain matin, faites tourner les tubes à 800 x g à 4 ° C pendant 10 minutes et recueillez le surnageant dans un tube frais. Remettre en suspension la pastille restante dans 2 mL de tampon d’homogénéisation glacé, bien mélanger, tourner à nouveau pendant 10 min à 4 °C et combiner les deux surnageants.
  4. Ajouter lentement le saccharose solide à la suspension d’extrait tissulaire jusqu’à une concentration finale de 1,2 M, bien mélanger et centrifuger à 250 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
  5. Retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettre la pastille dans 2 mL de tampon d’homogénéisation contenant 1,9 M de saccharose par trituration, puis centrifugation à 125 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
    REMARQUE: Le volume du tampon peut être ajusté en fonction de la quantité de matériau récupérée à l’étape précédente. En général, 10 volumes de tampon d’homogénéisation (V/V) sont idéaux pour cette étape.
  6. Recueillez la couche solide blanche supérieure à l’aide d’une pipette, transférez-la dans un tube frais et solubilisez dans 1 mL de tampon de lavage glacé en pipetant plusieurs fois, sans introduire de bulles d’air.
  7. Outre la couche supérieure, la pastille est également enrichie en fibrilles amyloïdes. Pour un rendement plus élevé, combinez les deux fractions et procédez. Retirez soigneusement la couche aqueuse moyenne à l’aide d’une pipette et jetez-la.
  8. Centrifuger les fractions combinées à 8000 x g pendant 20 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  9. Ajouter 1 mL de tampon de digestion glacé à la pastille lavée, remettre en suspension et incuber à température ambiante (RT) pendant 3 h.
  10. Centrifuger à 8000 x g pendant 20 min à 4 °C et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
  11. Remettre en suspension et laver (comme à l’étape 2.8.) la pastille digérée deux fois dans 1 mL de tampon Tris glacé.
  12. Remettre en suspension la pastille lavée dans 1 mL de tampon de solubilisation contenant 1 % de FDS et 1,3 M de saccharose en pipetant de haut en bas. Centrifuger rapidement à 200 000 x g pendant 60 min à 4 °C.
    REMARQUE: Bien que les fibrilles amyloïdes soient très résistantes aux détergents et aux dénaturants, de très longues expositions au détergent (1% de FDS) peuvent affecter l’intégrité des fibrilles ou éliminer les protéines étroitement liées, ce qui compromettra les analyses ultérieures. Par conséquent, immédiatement après la remise en suspension des granulés, procédez à la centrifugation.
  13. Économisez la pastille et augmentez le volume du surnageant restant en ajoutant 50 mM de tampon Tris (dans un rapport de 1:0,3) pour réduire la concentration de saccharose de 1,3 à 1 M et en centrifugeant une fois de plus à 200 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
  14. Dissoudre les deux pastilles dans 100 μL de tampon Tris contenant 0,5% de FDS et pool pour la purification de l’amyloïde. Les granulés visibles sont petits et doivent apparaître opaques et blanc cassé (voir la figure 2A).

3. Purification amyloïde

REMARQUE: Mélanger les deux granulés, solubiliser par pipetage jusqu’à obtenir une solution uniforme et procéder aux étapes suivantes de purification amyloïde.

  1. Pour une solubilisation complète du matériau riche en amyloïde présent dans les granulés, soumettez le tube à un cisaillement mécanique produit par des ondes ultrasonores dans un dispositif de sonication de bain fonctionnant pendant 30 s ON et 30 s OFF à une fréquence moyenne pendant 20 cycles.
  2. Centrifugez immédiatement le matériau à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C et remettez la pastille dans 500 μL de tampon SDS Tris à 0,5 %.
  3. Répétez l’étape 3.1. et l’étape 3.2. quatre fois pour un total de cinq lavages. Le nombre de lavages peut être augmenté pour améliorer la pureté.
    REMARQUE: Les étapes de sonication et de lavage sont optimisées à 0,5% SDS car des concentrations plus élevées peuvent affecter la structure, l’intégrité ou la composition protéique des fibrilles. Il n’est pas recommandé d’augmenter la concentration de FDS à cette étape.
  4. Après la dernière étape de centrifugation, laver la pastille dans 200 μL d’eau ultra-pure et centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer tout détergent restant. La pastille lavée contenant des fibrilles amyloïdes purifiées apparaît de couleur semi-transparente et est parfois difficile à voir.
  5. Dissoudre la pastille finale contenant des fibrilles amyloïdes purifiées dans 100 μL d’eau ultrapure. Passez immédiatement à l’étape suivante pour le traitement en aval ou conservez la suspension de fibrilles à -20 °C pour une analyse plus approfondie. S’il est gelé, décongeler sur la glace avant de commencer les précipitations.

4. Précipitation du chloroforme de méthanol

REMARQUE: Si l’objectif final est d’effectuer une analyse des protéines, il est recommandé de dessaler et d’éliminer les impuretés non protéiques supplémentaires.

  1. Ajouter 400 μL de méthanol aux 100 μL purifiés de fibrilles amyloïdes dans un tube de 1,5 mL et un puits vortex.
  2. Ajouter 100 μL de chloroforme au tube et bien vortex.
  3. Ajouter 300 μL d’eau ultrapure et bien le vortex. Cela rend le mélange trouble en raison de la précipitation des protéines.
  4. Centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min à RT.
  5. Retirez soigneusement la couche aqueuse (c.-à-d. en haut) sans perturber la couche d’interface contenant le flocon de protéines.
  6. Ajouter à nouveau le même volume de méthanol et centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min à TA.
  7. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et sécher la pastille à l’air libre à RT. Évitez de trop sécher; la fraction amyloïde est difficile à redissoudre si elle est trop séchée.

5. Digestion de la trypsine

  1. Dissoudre la pastille dans 50 μL de tampon de chlorhydrate de guanidine (GuHCl). Sonicate dans un bain d’eau glacée et chauffer à 95 °C pendant 5 min, si nécessaire.
  2. Vortex à fond à RT pendant 45 min à 1 h pour le dissoudre complètement. La pastille ne sera pas visible après cette étape et la solution semble claire en apparence.
  3. Ajouter le même volume de solution tensioactive à 0,2%. Solubiliser à RT avec vortex pendant 60 min. Cette étape améliore l’activité enzymatique de la trypsine.
  4. Ajouter 1 μL de tris-2-carboxyéthylphosphine (TCEP) à partir de la solution mère de 500 mM. Incuber pendant 60 min.
  5. Ajouter 2 μL de 500 mM d’iodoacétamide (IAA) et incuber dans l’obscurité pendant 20 min.
  6. Trempez l’IAA avec 5 μL de solution TCEP pendant 15 min.
  7. Ajouter le volume requis de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 mM au tube pour réduire la concentration de guanidine à 1,5 M.
  8. Ajouter une solution de tensioactif à 1 % dans le tube (1 μL/50 μg de protéines).
  9. Ajouter la trypsine (1 μg/100 μg de protéines) et laisser le tube mélanger à 37 °C pendant la nuit.

6. Nettoyage des peptides

  1. Le lendemain matin, acidifiez la solution peptidique digérée en abaissant le pH à 2,0 en ajoutant de l’acide formique.
  2. Activez la colonne de spin C18 (n-octadécyle) dans un tube récepteur de 2 mL en ajoutant 200 μL de solution de méthanol à 50% et tournez à 1500 x g pendant 2 min à RT. Répétez l’étape d’activation.
  3. Équilibrez les lits de résine de colonne C18 en ajoutant 200 μL de tampon d’équilibrage et en filant pendant 2 min dans les mêmes conditions. Répétez cette étape.
  4. Chargez la solution peptidique acidifiée sur la colonne C18 et centrifugez à 1500 x g pendant 2 min à RT. Collectez le flux et rechargez-le une fois de plus. Jetez le deuxième flux.
  5. Lavez les peptides liés à la résine C18 avec le tampon de lavage 2x, comme fait à l’étape 6.3. Utilisez le même tampon d’équilibrage pour laver la colonne.
  6. Éluter les peptides en ajoutant 40 μL de tampon d’élution suivi d’une centrifugation à 1500 x g, pendant 2 min à RT. Répétez l’étape d’élution trois fois pour augmenter le rendement des peptides récupérés.
  7. Sécher les peptides dans un concentrateur à vide rapide en évaporant la solution aqueuse. Les granulés secs peuvent être conservés à -20 °C pendant quelques semaines avant l’analyse MS.

7. Mise en place d’un spectromètre de masse pour l’analyse peptidique

REMARQUE : Pour les paramètres MS, voir le fichier supplémentaire 1 (adapté d’une publication précédente du laboratoire)14.

  1. Avant de charger les échantillons de peptides pour l’analyse MS, dissoudre les pastilles de peptides secs dans 20 μL de tampon de chargement de l’échantillon et effectuer un micro BCA pour quantifier la concentration de peptides récupérés.
  2. Transférer les peptides dissous dans un flacon en verre et charger 3 μg (quantifiés à partir de micro BCA) de peptides dans l’échantillonneur automatique du système UPLC.
  3. Chargez les échantillons sur une colonne de piège ventilée (colonne HPLC C18, 0,075 mm x 20 mm) avec un débit de 250 nL/min.
  4. Disposer la colonne de piégeage en ligne avec une colonne analytique (0,075 μm x 500 mm) et assembler une pointe d’émetteur à la source d’ionisation par électropulvérisation (ESI) soumise à une tension de pulvérisation de 2000 V.
    REMARQUE: Dans cette étude, ESI est effectué, dans lequel la phase mobile est soumise à une ionisation haute tension dans la phase gazeuse. Le spray créé par cela est dirigé vers la chambre à vide du MS à travers un capillaire chauffé. Sous vide, la désolvation des gouttelettes et l’éjection des ions se produisent en présence de chaleur et de tension. Par la suite, les ions sont accélérés vers l’analyseur de masse en présence d’un environnement à haute tension.
  5. Analysez les échantillons avec des cycles d’acquisition de 2 h. Cette étude est réalisée à l’aide d’une acquisition dépendante des données avec le paradigme de sélection d’ions précurseurs le plus intense des 20 premiers.
    REMARQUE: Dans l’acquisition dépendante des données, un nombre limité de peptides précurseurs sont détectés dans le scan MS1 et soumis à la fragmentation pour l’analyse MS2. Cependant, l’exclusion dynamique est problématique ici car les peptides Aβ très abondants seront omis pour la fragmentation et entraîneront une sous-estimation de leur quantité.
  6. Pour la quantification absolue des peptides Aβ, exécutez les mêmes échantillons une fois de plus en utilisant la méthode MS/MS ciblée. Pour cette étude, une liste exhaustive de tous les rapports m/z pour divers peptides tryptiques Aβ possibles pour les modèles murins d’entraînement APP est préparée (voir tableau supplémentaire 1). D’autres groupes devraient préparer une liste similaire en fonction du modèle murin disponible et des peptides possibles générés à partir de la protéine d’intérêt (par exemple, Aβ pour AD).
    REMARQUE: Pour traiter l’exclusion des peptides très abondants, utilisez une approche ciblée en fournissant une liste de valeurs m/z sélectionnées correspondant aux peptides tryptiques Aβ. Cette approche aborde le problème de l’exclusion dépendante des données des peptides Aβ et peut quantifier les quantités absolues de différents monomères (Aβ38, 40 et 42 peptides) avec une haute résolution.
  7. Le spectromètre de masse génère des spectres MS des échantillons de peptides et enregistre les fichiers de données brutes dans le répertoire cible. Utilisez ce fichier pour effectuer une correspondance spectrale à l’aide d’outils statistiques et bioinformatiques bien établis. Plusieurs outils de recherche et d’analyse de bases de données en ligne et hors ligne sont disponibles.

8. Analyse des données sur la SEP

  1. Extrayez les fichiers MS1 et MS2 à l’aide de l’outil Rawconverter hors connexion (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. Effectuer l’identification, la quantification et des analyses détaillées des données sur un moteur de recherche de données MS basé sur le Web. Dans cette étude, Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) a été utilisé.
    REMARQUE: Plusieurs autres outils d’analyse de données MS en ligne et hors ligne sont disponibles et peuvent également être utilisés, tels que MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. Après avoir téléchargé les fichiers MS1 et MS2, sélectionnez une base de données de protéome de souris mise à jour. Ici, une base de données de souris mise à jour contenant des mutations supplémentaires spécifiques à App knock-in est sélectionnée pour l’identification des peptides à l’aide des algorithmes ProLuCId et SEQUEST11.
  4. Dans le système d’analyse IP2, sélectionnez les paramètres par défaut et modifiez-les en fonction des exigences expérimentales. Dans cette étude, une tolérance de masse peptidique de 50 ppm pour le précurseur et de 600 ppm pour les fragments est utilisée (voir le fichier supplémentaire 1 pour les autres paramètres utilisés dans IP2).
    REMARQUE : Les chercheurs peuvent modifier les paramètres de recherche en fonction des objectifs expérimentaux. Par exemple, pour identifier les modifications post-traductionnelles, ajouter des valeurs de modification différentielle pour divers PTM (p. ex., ubiquitination, SUMOylation, phosphorylation).

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Representative Results

Ici, une méthode détaillée pour l’isolement et la purification des fibrilles amyloïdes à l’aide d’une méthode modifiée de purification par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose est résumée (voir la figure 1). L’innovation dans cette méthode est l’inclusion d’étapes de lavage par ultrasons à l’aide d’un système de sonication au bain-marie suivi d’une solubilisation SDS, qui élimine de nombreuses protéines faiblement associées des fibrilles amyloïdes qui co-purifient avec les fibrilles très denses et propres. L’étape d’ultrasonication génère une force de cisaillement élevée et agite les fibrilles, desserrant les forces hydrophobes et libérant les protéines solubles SDS faiblement associées dans le tampon de lavage SDS. À leur tour, de petites quantités de noyaux de fibrilles amyloïdes très pures sont récupérées. Comme le montre la figure 2A, une pastille visible, qui semble initialement opaque (peut-être en raison d’impuretés), peut être vue après enrichissement; cependant, après les ultrasons et les multiples lavages SDS, la pastille devient semi-transparente et est à peine visible. La coloration rouge congolaise représentative des amyloïdes purifiées par rapport à la fraction soluble SDS documente l’enrichissement des fibrilles amyloïdes (Figure 2B). La coloration rouge Congo peut être utilisée pour confirmer le matériau amyloïde en différentes fractions et peut être visualisée à l’aide d’un microscope à champ lumineux. Comme le montre la figure 2C, la fraction soluble SDS ne tache pas avec le colorant rouge du Congo.

La structure des fibrilles purifiées avec coloration négative par microscopie électronique à transmission a confirmé la présence de fibrilles amyloïdes presque pures (Figure 2D). De plus, le marquage immunogold à l’aide d’une combinaison d’anticorps Aβ42 (6E10 et 4G8) a confirmé la présence de peptides Aβ42 (Figure 2E). Pour étudier la composition et les caractéristiques structurelles du matériau purifié, nous avons utilisé des techniques d’immunoblot pour les peptides Aβ et les signatures structurelles caractéristiques (par exemple, les fibrilles). L’analyse par points représentatifs des fractions recueillies lors de l’isolement amyloïde a montré une abondance relative de peptides et de fibrilles Aβ42 à l’aide d’anticorps anti-Aβ42 et anti-fibrilles (LOC) (Figure 3A). De même, le transfert occidental des fractions représentatives a également montré un enrichissement des fibrilles contenant de l’Aβ42 en protéines de haut poids moléculaire piégées dans les puits du gel SDS PAGE (Figure 3B). Pour comprendre la composition de ces fibrilles de haut poids moléculaire, des fractions amyloïdes purifiées ont été soumises à une analyse protéomique basée sur la SEP. Ces résultats semi-quantitatifs ont révélé la présence d’environ 250 protéines, tandis que la fraction recueillie avant les ultrasons et les lavages SDS contenait plus de 2500 protéines (Figure 3C). Cela indique l’efficacité de ces deux étapes cruciales qui sont incluses dans ce protocole de purification. Pris ensemble, plusieurs résultats indépendants indiquent la grande abondance de classes de protéines similaires dans les noyaux de fibrilles.

L’analyse des composants cellulaires de l’ontologie génique (GO) pour un ensemble de données représentatif de la SP de la figure 4 a révélé qu’un grand nombre de protéines présentes dans les noyaux de fibrilles sont associées à des organites et des complexes supramoléculaires non liés à la membrane. Cette observation est probablement due à la tendance inhérente de nombreuses protéines à s’agréger ou à co-agréger avec d’autres protéines dans des inclusions protéiques qui sont à proximité. Les forces physiques jouent un rôle crucial dans ces interactions. Les autres organites cellulaires et composants principalement représentés par ces protéines sont les mitochondries, le cytosquelette, la membrane cellulaire et la gaine de myéline. Beaucoup de ces protéines interagissent avec les peptides Aβ, les oligomères ou les protofibrilles à différents stades de la formation de l’amyloïde. Ils peuvent interagir près de la membrane plasmique, où les peptides Aβ sont libérés. L’interaction peut également se produire lorsque certaines de ces protéines sont libérées directement ou par transport vésiculeux dans l’espace extracellulaire. La sécrétion ou l’exocytose des agrégats de protéines est l’une des nombreuses stratégies que les cellules utilisent pour faire face et réduire la charge associée aux agrégats de protéines15. Cela laisse une autre opportunité où certaines des protéines intracellulaires peuvent se lier aux peptides Aβ. Le protocole fournit un cadre pour une optimisation ultérieure en fonction des objectifs expérimentaux. Par exemple, la pureté et le rendement, en modifiant le nombre de lavages par ultrasons et fdS, peuvent être affinés en conséquence.

Figure 1
Figure 1: Vue d’ensemble schématique du flux de travail pour l’isolement du noyau des fibrilles amyloïdes à partir de tissus cérébraux humains ou animaux modèles AD post-mortem. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Confirmation de l’extraction amyloïde par coloration biochimique et imagerie des fibrilles amyloïdes. (A) La pastille insoluble SDS enrichie contenant de l’amyloïde apparaît de couleur blanc cassé opaque. B) Coloration rouge Congo d’un surnageant soluble de FDS et d’une pastille insoluble de FDS contenant de l’amyloïde purifiée épongée sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm; Les lectures de BCA ont été utilisées pour normaliser la quantité de charge des protéines. Le test BCA a été effectué conformément aux instructions du fabricant. (C) Images en champ lumineux de matières solubles et amyloïdes SDS après coloration rouge Congo (barre d’échelle : 100 μm). (D) Visualisation de la fraction soluble SDS et des fibrilles amyloïdes purifiées à l’aide d’une coloration négative au microscope électronique (barre d’échelle: 100 nm). (E) Confirmation de l’abondance des peptides Aβ42 dans les fibrilles amyloïdes purifiées par microscopie électronique immunogold à l’aide d’anticorps Aβ42 (6E10 et 4G8) (barre d’échelle: 50 nm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Validation de la purification amyloïde à l’aide de l’analyse immunoblot et MS. (A) Dot blot et (B) Western blot analyse de plusieurs fractions représentatives recueillies au cours du processus de purification amyloïde à l’aide d’anticorps anti-fibrillation LOC et anti-Aβ42 ; Les lectures du test BCA ont été utilisées pour normaliser la quantité de charge des protéines. C) Nombre de protéines récupérées dans l’analyse par spectrométrie de masse sans étiquette de fractions amyloïdes enrichies et purifiées; Le micro-test BCA a été utilisé pour charger 3 μg de peptides digérés pour chaque analyse de SEP. Les tests de BCA et de micro BCA ont été effectués conformément aux instructions du fabricant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse de l’ontologie génique des protéines abondantes en fractions amyloïdes purifiées. (A) Composants cellulaires et (B) voies KEGG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Tampons et solutions, paramètres de spectrométrie de masse et paramètres de recherche ProLuCID pour l’identification des peptides. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 - Une liste représentative des rapports m/z identifiés dans la SEP pour les peptides bêta-amyloïdes de l’APP knock dans des modèles murins. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Développer une compréhension claire de la structure et de la composition amyloïdes est difficile pour les biologistes structuraux et les biochimistes en raison des complexités biologiques et des limites expérimentales dans l’extraction des fibrilles purifiées des tissus cérébraux de laMA 16,17. Les fibrilles amyloïdes sont polymorphes au niveau moléculaire, montrant une population hétérogène de longueurs et de complexités variables18,19. Pour mieux comprendre leurs caractéristiques biologiques et leur pertinence pathologique, une caractérisation exhaustive de la composition des fibrilles amyloïdes polymorphes obtenues à partir de tissus cérébraux humains post mortem et de souris AD est nécessaire20,21. Un grand sous-ensemble de protéines interagit directement avec Aβ42, tandis que d’autres peuvent avoir tendance à former de grandes structures fibrillaires ou des complexes protéiques 22,23,24. Il est plus difficile de déterminer les rôles joués par les protéines interagissant avec Aβ42 dans la formation, la stabilisation et l’élongation de l’amyloïde en ce qui concerne la pathologie de la MA. Au cours des dernières années, plusieurs études protéomiques ont élucidé les différences et les similitudes dans la composition protéique de divers arrangements supramoléculaires, organites sans membrane, corps d’inclusion et agrégats de protéines 25,26,27. Dans les premiers stades de la MA, plusieurs protéines cellulaires (p. ex., Aβ42 et la protéine tau associée aux microtubules et l’apolipoprotéine E) se replient et s’agrègent dans plusieurs régions du cerveau28,29. Les formations protéinées amyloïdogènes sont l’une des principales caractéristiques pathologiques de la MA et contribuent probablement à la pathogenèse3.

La purification des fibrilles amyloïdes du cerveau humain malade est une tâche fastidieuse et difficile et présente de multiples limites. Un inconvénient majeur des méthodes existantes est la faible pureté du matériau extrait, ce qui limite souvent leur analyse structurelle détaillée à l’aide de méthodes d’imagerie, telles que cryoEM. De même, les études RMN nécessitent quelques milligrammes de matériau purifié, qui doit également être étiqueté avec des isotopes lourds (c.-à-d. 15N)30. Les cerveaux humains post-mortem peuvent répondre à la première exigence, car le matériau de départ peut être augmenté jusqu’à quelques grammes de tissus humains; cependant, il n’est pas possible de marquer les tissus cérébraux humains avec des isotopes lourds. D’autre part, l’étiquetage des modèles murins AD avec des isotopes 15N est possible (bien que coûteux) et est maintenant de plus en plus courant31,32. Notre laboratoire a utilisé le marquage pulse-chase pour étudier la dynamique du renouvellement des protéines synaptiques pendant la maladie et le vieillissement du cerveau14. Nous avons également utilisé le marquage des isotopes lourds d’animaux entiers pour identifier les protéines à longue durée de vie et comprendre leur pertinence physiologique dans des structures biologiques élaborées33,34. Cependant, pour le cerveau de la souris, de grandes quantités de matière première sont nécessaires pour obtenir une quantité exploitable des noyaux de fibrilles. Cette méthode résout avec succès ces problèmes en améliorant le rendement et la pureté des fibrilles amyloïdes extraites en modifiant les principes d’isolement biochimique existants. Par conséquent, ce protocole robuste pour l’extraction des fibrilles amyloïdes des tissus cérébraux peut être facilement utilisé pour les études structurelles cryoEM et RMN.

Cette méthode utilise le paradigme de fractionnement subcellulaire existant basé sur le gradient de densité de saccharose et élimine les protéines co-purifiantes non spécifiques par étapes successives. Après l’élimination des débris cellulaires, de la myéline, de l’ADN et des lipides cellulaires, les pastilles insolubles SDS riches en amyloïde sont isolées. L’incorporation d’étapes supplémentaires de multiples lavages SDS couplés par ultrasons aide à réduire le nombre de composants cellulaires co-purifiants, de protéines faiblement liées et de polymorphes solubles SDS plus petits d’amyloïdes. La pastille finale est solubilisée dans de l’eau ultrapure et peut être utilisée pour de nombreuses applications, y compris des expériences d’ensemencement, des études biochimiques ou pharmacologiques et des analyses structurelles. Les fibrilles amyloïdes purifiées des tissus cérébraux de la MA sont également utilisées pour comprendre la composition protéomique et les caractéristiques structurelles des noyaux de fibrilles à l’aide de la protéomique à base de SEP. Cette analyse a confirmé la présence d’un sous-ensemble de protéines cellulaires (représentées à la figure 4) au cœur des fibrilles, ce qui peut indiquer les rôles possibles de plus d’une protéine dans la formation, l’allongement et la stabilisation des fibrilles amyloïdes sur une longue période de temps. Certaines des protéines identifiées dans cette analyse sont connues pour leur association avec plus d’un trouble neurodégénératif, par exemple, Adam22, APP, ApoE, les protéines de neurofilament de β-caténine, les protéines 14-3-3 et d’autres.

Il est possible que certaines protéines contaminantes apparaissent dans l’analyse protéomique en raison du fait que, après homogénéisation, certaines interactions injustifiées peuvent se produire entre les protéines en raison de l’hydrophobicité élevée des fibrilles amyloïdes. Certaines de ces protéines adhèrent aux noyaux et ne sont pas éliminées même après plusieurs cycles de sonication et d’étapes de lavage SDS. C’est l’une des limites de cette stratégie de purification amyloïde. Cependant, il pourrait être traité en utilisant des témoins négatifs appropriés et en effectuant des seuils statistiques efficaces dans les études protéomiques à grande échelle. Une autre limitation que nous avons rencontrée concerne la sous-estimation de l’abondance du peptide Aβ après la digestion de la trypsine. Cela a été résolu dans ce flux de travail par une stratégie d’analyse MS/MS ciblée. L’analyse GO pour les voies KEGG indique l’abondance de protéines appartenant aux voies impliquées dans de nombreuses maladies neurodégénératives, par exemple, la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et les maladies à prions. Ces protéines sont des acteurs importants dans de multiples voies pathologiques et, par conséquent, ont une implication connue dans l’initiation et la progression de la maladie. Fait intéressant, certaines de ces protéines nécessitent une analyse plus approfondie pour déterminer leur implication possible dans la pathologie de la MA et d’autres maladies neurodégénératives.

Des études futures sur le matériel amyloïde pur d’autres modèles de maladie pourraient fournir une compréhension approfondie des modèles structurels et de la composition des fibrilles centrales et pourraient aider à identifier des cibles thérapeutiques clés.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention niH R01AG061865 à R.J.V. et J.N.S. Les auteurs remercient les membres du groupe de recherche Vassar et Savas de l’Université Northwestern pour leurs discussions réfléchies. Nous remercions également sincèrement dr(s). Ansgar Seimer et Ralf Langen de l’Université de Californie du Sud pour leur contribution cruciale. Nous remercions le Dr Farida Korabova pour la préparation des échantillons et l’imagerie par microscopie électronique à coloration négative au Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm Thermo Scientific 164535 Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody Biolegend 803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody Biolegend 800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody IBL America 10323
anti-amyloid fibril LOC antibody  EMD Millipore AB2287
BCA kit Thermo Fisher Scientific 23225
Bioruptor Pico Plus Diagenode B01020001
Calcium Chloride Sigma-Aldrich  C1016
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
Complete  Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 11697498001
Dnase I Thermo Fisher Scientific EN0521
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
HyperSep C18 Cartridges Thermo Fisher Scientific 60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2  http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich I1149
K54 Tissue Homogenizing System Motor Cole Parmer Glas-Col 099C
MaxQuant https://www.maxquant.org/
Micro BCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm Thermo Scientific 164942
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter BR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin Columns Thermo Fisher Scientific 89870
Precellys 24 tissue homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer Promega V2072
RawConverter http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azide VWR 97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 74255
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002446
Speed Vaccum Concentrator Labconco 7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-2G
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific 15568025
Trypsin Gold-Mass spec grade Promega V5280
UltiMate 3000 RSLCnano System Thermo Scientific ULTIM3000RSLCNANO

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References

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
  2. Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
  3. Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
  4. Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
  5. Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
  6. Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
  7. Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
  8. Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
  9. Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
  10. Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
  11. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
  12. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  14. Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
  15. Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
  16. Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
  17. Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
  18. Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
  19. Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
  20. Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
  21. Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
  22. Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
  23. Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
  24. Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
  25. Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
  26. Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
  27. Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
  28. Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
  29. Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
  30. Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
  31. Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
  32. Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
  33. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  34. Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).

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Neurosciences Numéro 182 Amyloïde Maladie d’Alzheimer spectrométrie de masse protéomique agrégats de protéines purification des protéines biologie structurale
Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau
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Upadhyay, A., Vassar, R. J., Savas, J. N. Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain. J. Vis. Exp. (182), e63816, doi:10.3791/63816 (2022).

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