Summary
Denna biokemiska reningsmetod med masspektrometribaserad proteomisk analys underlättar robust karakterisering av amyloidfibrilkärnor, vilket kan påskynda identifieringen av mål för att förebygga Alzheimers sjukdom.
Abstract
Proteinhaltiga fibrillära inneslutningar är viktiga patologiska kännetecken för flera neurodegenerativa sjukdomar. I de tidiga stadierna av Alzheimers sjukdom (AD) bildar amyloid-beta-peptider protofibriller i det extracellulära utrymmet, som fungerar som frön som gradvis växer och mognar till stora amyloidplack. Trots denna grundläggande förståelse är nuvarande kunskap om amyloidfibrilstruktur, sammansättning och deponeringsmönster i hjärnan begränsad. En viktig barriär har varit oförmågan att isolera högrenade amyloidfibriller från hjärnextrakt. Affinitetsrening och laserfångande mikrodissektionsbaserade metoder har tidigare använts för att isolera amyloider men begränsas av den lilla mängd material som kan återvinnas. Detta nya, robusta protokoll beskriver den biokemiska reningen av amyloida plackkärnor med användning av natriumdodecylsulfat (SDS) solubilisering med sackarosdensitetsgradient ultracentrifugering och ultraljud och ger mycket rena fibriller från AD-patienter och AD-modell hjärnvävnader. Masspektrometri (MS) -baserad bottom-up proteomisk analys av det renade materialet representerar en robust strategi för att identifiera nästan alla primära proteinkomponenter i amyloidfibriller. Tidigare proteomiska studier av proteiner i amyloidkoronan har avslöjat en oväntat stor och funktionellt varierad samling proteiner. Särskilt, efter raffinering av reningsstrategin, reducerades antalet samrenande proteiner med mer än 10 gånger, vilket indikerar den höga renheten hos det isolerade SDS-olösliga materialet. Negativ färgning och immuno-guldelektronmikroskopi möjliggjorde bekräftelse av renheten hos dessa preparat. Ytterligare studier krävs för att förstå de rumsliga och biologiska attribut som bidrar till avsättningen av dessa proteiner till amyloidinklusioner. Sammantaget är denna analytiska strategi väl positionerad för att öka förståelsen för amyloidbiologi.
Introduction
Amyloid är ett extremt stabilt supramolekylärt arrangemang som finns i en mångsidig panel av proteiner, av vilka några leder till patologiska förändringar1. Ackumuleringen av intra- eller extracellulära amyloidaggregat observeras i flera neurodegenerativa sjukdomar2. Amyloidaggregat är heterogena och berikas med ett stort antal proteiner och lipider3. Under de senaste åren har intresset för amyloidproteomet genererat ett stort intresse bland grundläggande och translationella neuroforskare. Flera metoder har utvecklats för att extrahera och rena amyloidaggregat från mus- och obduktionsvävnader i hjärnan. Laserfångande mikrodissektion, immunoprecipitation, decellularisering och biokemisk isolering av amyloidaggregat används ofta metoder för att extrahera och rena amyloidplack, fibriller och oligomerer 4,5,6,7. Många av dessa studier har fokuserat på att bestämma proteinsammansättningen hos dessa tätt packade fibrillära avlagringar med hjälp av semikvantitativ MS. De tillgängliga resultaten är dock inkonsekventa, och det förvånansvärt stora antalet samrenande proteiner som tidigare rapporterats är utmanande att tolka.
Den primära begränsningen i den befintliga litteraturen som beskriver amyloidkärnans proteom i AD- och AD-musmodellhjärnor är att det renade materialet innehåller ett ohanterligt antal samrenande proteiner. Det övergripande målet med denna metod är att övervinna denna begränsning och utveckla en robust biokemisk rening för isolering av amyloidfibrilkärnor. Denna strategi använder en tidigare beskriven sackarosdensitetsgradient ultracentrifugeringsbaserad biokemisk metod för isolering av SDS olösliga berikade amyloidfraktioner från post mortem AD mänskliga och mus hjärnvävnader 8,9. Denna metod bygger på den befintliga litteraturen men går längre med ultraljud och SDS tvättar för att ta bort de flesta av de löst bundna amyloidassocierade proteinerna, vilket leder till isolering av högrenade amyloidfibriller (Figur 1). Fibrillerna renade av detta protokoll övervinner flera befintliga utmaningar som ofta uppstår i strukturella studier av amyloidfibriller isolerade från hjärnextrakt. Visualisering av dessa fibriller med transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekräftar det renade materialets integritet och renhet (figur 2). I denna studie solubiliseras de isolerade fibrillerna och smälts till peptider med trypsin, och etikettfri MS-analys kan lätt avslöja identiteten hos proteinerna som bildar fibrilkärnan. I synnerhet har några av dessa proteiner en inneboende tendens att bilda supramolekylära sammansättningar i icke-membranbundna organeller. Dessutom är många av de proteiner som identifierats i analysen av amyloid-beta (Aβ) fibriller också associerade med andra neurodegenerativa sjukdomar, vilket tyder på att dessa proteiner kan spela en nyckelroll i flera proteinopatier.
Denna SDS/ultraljud metod är osannolikt att ändra eller störa strukturen av fibril kärnor. Det renade materialet är också lämpligt för ett brett spektrum av top-down och bottom-up proteomiska analysmetoder och ytterligare MS-baserade strukturella analysstrategier, såsom kemisk tvärbindning eller väte-deuteriumutbyte. Den totala återvinningen med denna metod är relativt hög och är således lämplig för detaljerade strukturella studier, som kräver mikrogram till milligram av det renade materialet. Det renade materialet är också lämpligt för strukturella studier med kryoEM och atomkraftmikroskopi. Detta protokoll, i kombination med den stabila isotopmärkningen av däggdjur, kan underlätta fast-state kärnmagnetisk resonans (NMR) studier av amyloid struktur10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll innefattar användning av mänskliga eller ryggradsdjur hjärnvävnader. All forskning utfördes i enlighet med de godkända institutionella riktlinjerna från Northwestern University. Det aktuella arbetsflödet är standardiserat med hjälp av APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) mushjärna kortikala och hippocampus hjärnregion extrakt11. Detta protokoll har optimerats för hjärnextrakt från möss vid 6-9 månaders ålder, och det kan effektivt rena amyloider från både manliga och kvinnliga djur.
Obs: För en bättre förståelse av den övergripande experimentella proceduren, se figur 1 för en schematisk bild av arbetsflödet.
1. Vävnadsskörd och amyloidrening
OBS: Helst bör amyloidfibriller isoleras från nyligen dissekerade hjärnregioner. Men denna metod fungerar också bra med snap- eller blixtfrysta hjärnvävnader. Nedan följer en kort översikt över snap-frysning av hjärnvävnader för lagring för användning vid ett senare tillfälle.
- Hjärnvävnadsskörd och lagring: Dissekera mushjärnor och skörda snabbt de amyloidbelastade regionerna (dvs cortex och hippocampus), följt av snäppfrysning i flytande kväve eller ett torrisalkoholbad.
OBS: Snäppfrysning hjälper till att bevara de strukturella egenskaperna hos vävnadens beståndsdelar. Mössen avlivas genom isofluran och cervikal dislokation12,13. Det rekommenderas att undvika att använda CO2 eftersom det kan äventyra hjärnans proteomintegritet. - Efter dissektion, skär och lagra färska vävnader i små block (t.ex. 5 mm x 5 mm), eftersom detta underlättar effektivare homogenisering före amyloidextraktion. Överför vävnaden till den sterila kryogena injektionsflaskan, dra åt locket och sänk snabbt ner.
- Förvara vävnaderna frysta under ultrakoldförhållanden (dvs. -80 °C eller flytande kväve). Om extraktionen ska utföras några dagar senare, förvara vävnaderna vid -20 °C och undvik frysnings- och upptiningscykler. Tina de frysta vävnaderna på våt is när de är redo för extraktion och rening.
OBS: Direktkontakt av vävnaderna med flytande kväve kan orsaka vävnads- och proteinskador. Observera att ett alkoholbad kan ta bort permanenta markörer från röretiketterna.
2. Anrikning av olösligt material i SDS
OBS: Utför alla steg på is och centrifugera vid 4 °C, om inget annat anges. Detaljer om alla buffertar och lösningar som används i detta protokoll finns i tilläggsfil 1. Tillverkare och katalognummer av kemikalier och instrument finns i materialförteckningen.
- Börja med nydissekerade eller snäppfrusna hjärnvävnadsregioner (tinade på is) placerade i ett 2 ml rör innehållande 6-8 keramiska pärlor och nyberedd iskall homogeniseringsbuffert (1 ml för 0,25-1 g våt vävnadsmassa).
- Överför rören till pärlkvarnshomogenisatorn och slipa vävnadsinnehållet vid 4000 rpm, med två cykler på 30 s vardera och ett intervall på 30 s däremellan.
OBS: Alternativt kan motoriserade omrörare eller homogenisatorsystem användas för att slipa och homogenisera vävnaderna. - Tillsätt 9 ml iskall homogeniseringsbuffert till 1 ml hjärnhomogenat i hela vävnaden i 15 ml rör, täta med laboratorievaxfilmremsor och rotera från ände till ände över natten vid 4 °C för att säkerställa robust löslighet.
OBS: För att ta bort oönskat stort cellulärt skräp och lipider, nästa morgon, snurra rören vid 800 x g vid 4 ° C i 10 minuter och samla supernatanten i ett nytt rör. Återsuspendera den återstående pelleten i 2 ml iskall homogeniseringsbuffert, blanda väl, snurra igen i 10 min vid 4 °C och kombinera de två supernatanterna. - Tillsätt långsamt fast sackaros till vävnadsextraktsuspensionen till en slutlig koncentration på 1,2 M, blanda väl och centrifugera vid 250 000 x g i 45 minuter vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett. Återsuspendera pelleten i 2 ml homogeniseringsbuffert innehållande 1,9 M sackaros genom triturering, följt av centrifugering vid 125 000 x g i 45 min vid 4 °C.
OBS: Buffertvolymen kan justeras baserat på mängden material som återvunnits från föregående steg. I allmänhet är 10 volymer homogeniseringsbuffert (V / V) idealisk för detta steg. - Samla det övre vita fasta lagret med en pipett, överför det till ett nytt rör och lösgör i 1 ml iskall tvättbuffert genom att pipettera upp och ner flera gånger utan att införa luftbubblor.
- Förutom toppskiktet är pelleten också berikad med amyloidfibriller. För ett högre utbyte, kombinera de två fraktionerna och fortsätt. Ta försiktigt bort det mellersta vattenhaltiga skiktet med en pipett och kassera.
- Centrifugera de kombinerade fraktionerna vid 8000 x g i 20 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml iskall rötningsbuffert till den tvättade pelleten, återsuspendera och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 3 timmar.
- Centrifugera vid 8000 x g i 20 min vid 4 °C och avlägsna supernatanten med pipett.
- Återsuspendera och tvätta (samma som steg 2.8) den smälta pelleten två gånger i 1 ml iskall Tris-buffert.
- Resuspendera den tvättade pelleten i 1 ml solubiliseringsbuffert innehållande 1% SDS och 1,3 M sackaros genom pipettering upp och ner. Centrifugera snabbt vid 200 000 x g i 60 minuter vid 4 °C.
OBS: Även om amyloidfibrillerna är mycket resistenta mot tvättmedel och denatureringsmedel, kan mycket långa exponeringar för tvättmedlet (1% SDS) påverka fibrillernas integritet eller ta bort de tätt bundna proteinerna, vilket kommer att äventyra efterföljande analyser. Därför, omedelbart efter att pelletsna har återsusperats, fortsätt till centrifugering. - Spara pelleten och öka volymen på den återstående supernatanten genom att tillsätta 50 mM Tris-buffert (i förhållande 1:0,3) för att minska sackaroskoncentrationen från 1,3 till 1 M och centrifugera ytterligare en gång vid 200 000 x g i 45 minuter vid 4 °C.
- Lös upp de två pelletsen i 100 μl Tris-buffert innehållande 0,5% SDS och pool för amyloidrening. Synliga pellets är små och ska se ogenomskinliga och benvita ut (se figur 2A).
3. Amyloid rening
OBS: Kombinera de två pelletsen, solubilisera genom pipettering tills du får en enhetlig lösning och fortsätt med följande steg för amyloidrening.
- För fullständig solubilisering av det amyloidrika materialet som finns i pellets, utsätta röret för mekanisk skjuvning som produceras av ultraljudsvågor i en bad ultraljudsbehandlingsanordning som körs för 30 s ON och 30 s OFF vid en medeldistansfrekvens för 20 cykler.
- Centrifugera omedelbart materialet vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 °C och återsuspendera pelleten i 500 μl 0,5 % SDS Tris-buffert.
- Upprepa steg 3.1. och steg 3.2. fyra gånger för totalt fem tvättar. Antalet tvättar kan ökas för att förbättra renheten.
OBS: Ultraljudsbehandling och tvätt steg optimeras vid 0.5% SDS som högre koncentrationer kan påverka strukturen, integritet, eller protein sammansättning av fibriller. Att öka SDS-koncentrationen i detta steg rekommenderas inte. - Efter det sista centrifugeringssteget, tvätta pelleten i 200 μL ultrarent vatten och centrifugera vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 °C för att avlägsna eventuellt återstående tvättmedel. Den tvättade pelleten som innehåller renade amyloidfibriller verkar halvtransparent i färg och är svår att se ibland.
- Lös upp den slutliga pelleten som innehåller renade amyloidfibriller i 100 μl ultrarent vatten. Fortsätt omedelbart till nästa steg för bearbetning nedströms eller spara fibrilsuspensionen vid -20 °C för vidare analys. Om det är fryst, tina på is innan du börjar nederbörd.
4. Metanolkloroformutfällning
OBS: Om det slutliga målet är att utföra proteinanalys rekommenderas att avsalta och ta bort ytterligare icke-proteinhaltiga föroreningar.
- Tillsätt 400 μL metanol till de renade 100 μL amyloidfibrillerna i ett 1,5 ml rör och virvelbrunn.
- Tillsätt 100 μL kloroform till röret och virvelbrunnen.
- Tillsätt 300 μL ultrarent vatten och virvel noggrant. Detta gör blandningen grumlig på grund av proteinutfällning.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 2 min vid RT.
- Ta försiktigt bort det vattenhaltiga skiktet (dvs. toppen) utan att störa gränssnittsskiktet som innehåller proteinflingan.
- Tillsätt samma volym metanol igen och centrifugera vid 12 000 x g i 2 min vid RUMSTEMPERATUR.
- Kassera supernatanten med en pipett och lufttorka pelleten vid RT. amyloidfraktion är svår att lösa om den övertorkas.
5. Trypsin matsmältning
- Lös upp pelleten i 50 μl guanidinhydrokloridbuffert (GuHCl). Ultraljudsbehandling i ett iskallt vattenbad och värm vid 95 °C i 5 minuter, om det behövs.
- Vortex noggrant vid RT i 45 min till 1 h för att lösa upp det helt. Pelleten kommer inte att synas efter detta steg, och lösningen ser tydlig ut i utseende.
- Tillsätt samma volym 0,2% ytaktiv lösning. Solubilize på RT med virvel i 60 min. Detta steg förbättrar trypsin enzymatisk aktivitet.
- Tillsätt 1 μl tris-2-karboxyetylfosfin (TCEP) från 500 mM stamlösning. Inkubera i 60 min.
- Tillsätt 2 μL 500 mM jodacetamid (IAA) och inkubera i mörker i 20 minuter.
- Släck IAA med 5 μl TCEP-lösning i 15 minuter.
- Tillsätt den erforderliga volymen 50 mM ammoniumbikarbonatlösning till röret för att minska guanidinkoncentrationen till 1,5 M.
- Tillsätt 1% ytaktiv lösning till röret (1 μl/50 μg protein).
- Tillsätt trypsin (1 μg/100 μg protein) och låt tuben blandas vid 37 °C över natten.
6. Rengöring av peptid
- Nästa morgon surgör den smälta peptidlösningen genom att sänka pH till 2,0 genom tillsats av myrsyra.
- Aktivera C18 (n-oktadecyl) spinnkolonnen i ett 2 ml mottagarrör genom att tillsätta 200 μl 50% metanollösning och snurra vid 1500 x g i 2 minuter vid RT.
- Balansera C18-kolonnhartsbäddarna genom att tillsätta 200 μL jämviktsbuffert och snurra i 2 minuter med samma förhållanden. Upprepa detta steg.
- Ladda den surgjorda peptidlösningen på C18-kolonnen och centrifugera vid 1500 x g i 2 minuter vid RT. Kassera den andra genomströmningen.
- Tvätta peptiderna bundna till C18-hartset med tvättbufferten 2x, som görs i steg 6.3. Använd samma jämviktsbuffert för att tvätta kolonnen.
- Eluera peptiderna genom att tillsätta 40 μL elueringsbuffert följt av centrifugering vid 1500 x g, i 2 min vid RT. Upprepa elueringssteget tre gånger för att öka utbytet av de återvunna peptiderna.
- Torka peptiderna i en hastighetsvakuumkoncentrator genom att förånga den vattenhaltiga lösningen. Torra pellets kan sparas vid -20 °C i några veckor före MS-analysen.
7. Ställa in masspektrometer för peptidanalys
OBS: För MS-parametrar, se kompletterande fil 1 (anpassad från en tidigare publikation från labbet)14.
- Innan peptidproverna laddas för MS-analysen, lös upp de torra peptidpelletsen i 20 μL provbelastningsbuffert och utför mikro BCA för att kvantifiera koncentrationen av återvunna peptider.
- Överför de upplösta peptiderna i en injektionsflaska av glas och ladda 3 μg (kvantifierat från mikro BCA) peptider till UPLC-systemets autosampler.
- Ladda proverna på en ventilerad fällkolonn (C18 HPLC-kolonn, 0,075 mm x 20 mm) med en flödeshastighet på 250 ml/min.
- Ordna fällkolonnen i linje med en analyskolonn (0,075 μm x 500 mm) och montera en emitterspets på källan för elektrosprayjonisering (ESI) som utsätts för en sprutspänning på 2000 V.
OBS: I denna studie utförs ESI, där den mobila fasen utsätts för högspänningsjonisering in i gasfasen. Sprayen som skapas av detta riktas mot MS: s vakuumkammare genom en uppvärmd kapillär. Under vakuum sker de-solvationen av droppar och utstötning av joner i närvaro av värme och spänning. Därefter accelereras jonerna mot massanalysatorn i närvaro av en högspänningsmiljö. - Analysera proverna med 2 timmars förvärvskörningar. Denna studie utförs med hjälp av databeroende förvärv med det mest intensiva topp 20-prekursorjonvalsparadigmet.
OBS: Vid databeroende förvärv detekteras ett begränsat antal prekursorpeptider i MS1-skanningen och utsätts för fragmentering för MS2-analys. Den dynamiska uteslutningen är dock problematisk här eftersom mycket rikliga Aβ-peptider kommer att utelämnas för fragmentering och resultera i en underskattning av deras kvantitet. - För absolut kvantifiering av Aβ-peptider, kör samma prover en gång till med den riktade MS / MS-metoden. För denna studie utarbetas en uttömmande lista över alla m/z-förhållanden för olika möjliga tryptiska Aβ-peptider för APP-knock-in-musmodellerna (se tilläggstabell 1). Andra grupper bör utarbeta en liknande lista i enlighet med den tillgängliga musmodellen och de möjliga peptider som genereras från proteinet av intresse (t.ex. Aβ för AD).
OBS: För att ta itu med uteslutningen av mycket rikliga peptider, använd en riktad metod genom att tillhandahålla en lista över utvalda m / z-värden motsvarande Aβ-tryptiska peptider. Detta tillvägagångssätt adresserar problemet med databeroende uteslutning av Aβ-peptider och kan kvantifiera de absoluta kvantiteterna av olika monomerer (Aβ38, 40 och 42 peptider) med hög upplösning. - Masspektrometern genererar MS-spektra av peptidproverna och sparar rådatafiler i målkatalogen. Använd den här filen för att utföra spektralmatchning med väletablerade statistiska och bioinformatiska verktyg. Flera databassöknings- och analysverktyg online och offline finns tillgängliga.
8. Analys av uppgifter från medlemsstaterna
- Extrahera MS1- och MS2-filerna med offline Rawconverter-verktyget (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Utföra identifiering, kvantifiering och detaljerade analyser av data på en webbaserad MS-datasökmotor. I denna studie användes Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
OBS: Flera andra online och offline MS-dataanalysverktyg finns tillgängliga och kan också användas, till exempel MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - När du har laddat upp MS1- och MS2-filerna väljer du en uppdaterad musproteomdatabas. Här väljs en uppdaterad musdatabas som innehåller ytterligare App-knock-in-specifika mutationer för identifiering av peptider med hjälp av ProLuCId- och SEQUEST-algoritmer11.
- I IP2-analyssystemet väljer du standardparametrarna och ändrar dem enligt experimentkraven. I denna studie används en peptidmasstolerans på 50 ppm för prekursor och 600 ppm för fragment (se tilläggsfil 1 för andra parametrar som används i IP2).
OBS: Forskare kan ändra sökparametrarna i enlighet med de experimentella målen. Till exempel, för att identifiera post-translationella modifieringar, lägg till differentiella modifieringsvärden för olika PTM (t.ex. ubiquitination, SUMOylering, fosforylering).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här sammanfattas en detaljerad metod för isolering och rening av amyloidfibriller med användning av en modifierad ultracentrifugeringsmetod för sackarosdensitetsgradient (se figur 1). Innovationen i denna metod är införandet av steg av ultraljudsbaserad tvätt med hjälp av ett vattenbad ultraljudsbehandlingssystem följt av SDS-solubilisering, som tar bort många löst associerade proteiner från amyloidfibrillerna som samrenar med de mycket täta och rena fibrillerna. Ultraljudssteget genererar en hög skjuvningskraft och agiterar fibrillerna, lossar de hydrofoba krafterna och frigör SDS lösliga löst associerade proteiner i SDS-tvättbufferten. I sin tur återvinns små mängder mycket rena amyloidfibrilkärnor. Som visas i figur 2A kan en synlig pellet, som initialt verkar ogenomskinlig (möjligen på grund av föroreningar), ses efter anrikning; men efter ultraljud och flera SDS-tvättar blir pelleten halvtransparent och är knappast synlig. Den representativa kongoröda färgningen av renade amyloider jämfört med den lösliga SDS-fraktionen dokumenterar anrikningen av amyloidfibrillerna (figur 2B). Kongoröd färgning kan användas för att bekräfta amyloidmaterialet i olika fraktioner och kan visualiseras med hjälp av ett ljust fältmikroskop. Som visas i figur 2C färgar inte den SDS-lösliga fraktionen med Kongo-rött färgämne.
Strukturen hos de renade fibrillerna med negativ färgningsöverföringselektronmikroskopianalys bekräftade närvaron av nästan rena amyloidfibriller (figur 2D). Dessutom bekräftade immunogoldmärkning med användning av en kombination av Aβ42 (6E10 och 4G8) antikroppar närvaron av Aβ42-peptider (figur 2E). För att undersöka sammansättningen och strukturella egenskaper hos det renade materialet använde vi immunoblottekniker för Aβ-peptider och kännetecknande strukturella signaturer (t.ex. fibriller). Representativ punktfläckanalys av fraktionerna som samlats in under amyloidisolering visade en relativ förekomst av Aβ42-peptider och fibriller med användning av anti-Aβ42- och anti-fibril -antikroppar (LOC) (figur 3A). På liknande sätt visade den västra fläcken av de representativa fraktionerna också anrikning av Aβ42-innehållande fibriller i proteiner med hög molekylvikt som fångats i brunnarna i SDS PAGE-gelén (figur 3B). För att förstå sammansättningen av dessa fibriller med hög molekylvikt utsattes renade amyloidfraktioner för MS-baserad proteomisk analys. Dessa semikvantitativa resultat avslöjade närvaron av cirka 250 proteiner, medan fraktionen som samlades in före ultraljud och SDS-tvättar innehöll mer än 2500 proteiner (Figur 3C). Detta indikerar effektiviteten av dessa två viktiga steg som ingår i detta reningsprotokoll. Sammantaget indikerar flera oberoende resultat den höga förekomsten av liknande proteinklasser i fibrilkärnor.
Genontologi (GO) cellulär komponentanalys för en representativ MS-dataset i figur 4 avslöjade att ett stort antal proteiner som finns i fibrilkärnorna är associerade med icke-membranbundna organeller och supramolekylära komplex. Denna observation beror sannolikt på den inneboende tendensen hos många proteiner att aggregera sig själva eller samaggregat med andra proteiner i proteinhaltiga inneslutningar som ligger i närheten. Fysiska krafter spelar avgörande roller i dessa interaktioner. Den andra cellulära organellen och komponenterna som primärt representeras av dessa proteiner är mitokondrier, cytoskelett, cellmembran och myelinhölje. Många av dessa proteiner interagerar med Aβ-peptider, oligomerer eller protofibriller vid olika stadier av amyloidbildning. De kan interagera nära plasmamembranet, där Aβ-peptider frigörs. Interaktionen kan också ske medan vissa av dessa proteiner frigörs direkt eller via vesikulär transport till det extracellulära utrymmet. Utsöndring eller exocytos av proteinaggregat är en bland många strategier som celler använder för att klara och minska bördan i samband med proteinaggregat15. Detta lämnar ytterligare en möjlighet där några av de intracellulära proteinerna kan binda till Aβ-peptider. Protokollet ger ett ramverk för ytterligare optimering beroende på de experimentella målen. Till exempel kan renheten och avkastningen, genom att ändra antalet ultraljud och SDS-tvättar, finjusteras i enlighet därmed.
Figur 1: En diagrammatisk översikt över arbetsflödet för isolering av amyloidfibriller från AD post mortem mänskliga eller modelldjur hjärnvävnader.
Figur 2: Bekräftelse av amyloidextraktion med biokemisk färgning och avbildning av amyloidfibriller. B) Kongoröd färgning av SDS-löslig supernatant och SDS-olöslig pellet innehållande renad amyloid blottad på 0,45 μm nitrocellulosamembran. BCA-avläsningar användes för normalisering av proteinernas laddningsmängd. BCA-analys utfördes enligt tillverkarens instruktioner. (C) Ljusfältsbilder av SDS-lösligt och amyloidmaterial efter kongoröd färgning (skalstreck: 100 μm). (D) Visualisering av SDS-löslig fraktion och renade amyloidfibriller med negativ färgning under elektronmikroskopet (skalstreck: 100 nm). (E) Bekräftelse av Aβ42-peptiders förekomst i renade amyloidfibriller genom immunogoldelektronmikroskopi med användning av Aβ42 -antikroppar (6E10 och 4G8) (skalstång: 50 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Validering av amyloidrening med immunoblot- och MS-analys. BCA-analysavläsningar användes för normalisering av proteinernas laddningsmängd. C) Antal proteiner som återvunnits i etikettfri masspektrometrianalys av anrikade och renade amyloidfraktioner. micro BCA-analys användes för att ladda 3 μg smälta peptider för varje MS-analys. BCA- och mikro BCA-analyser utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Genontologisk analys av proteiner som finns rikligt i renade amyloidfraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Buffertar och lösningar, masspektrometriparametrar och ProLuCID-sökparametrar för identifiering av peptider. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1 - En representativ lista över m / z-förhållanden som identifierats i MS-körning för amyloid beta-peptider av APP-knock i musmodeller. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att utveckla en tydlig förståelse för amyloidstruktur och sammansättning är utmanande för strukturbiologer och biokemister på grund av de biologiska komplexiteterna och experimentella begränsningarna vid extraktion av renade fibriller från AD-hjärnvävnader16,17. Amyloidfibriller är polymorfa på molekylär nivå och visar en heterogen population av varierande längd och komplexitet18,19. För att bättre förstå deras biologiska egenskaper och patologiska relevans krävs en uttömmande karakterisering av sammansättningen av polymorfa amyloidfibriller erhållna från post mortem mänskliga och AD-mus hjärnvävnader20,21. En stor delmängd av proteiner interagerar direkt med Aβ42, medan andra kan ha en tendens att bilda stora fibrillära strukturer eller proteinkomplex 22,23,24. Det är mer utmanande att bestämma de roller som spelas av proteinerna som interagerar med Aβ42 i amyloidbildning, stabilisering och förlängning när det gäller AD-patologi. Under de senaste åren har flera proteomiska studier belyst skillnaderna och likheterna i proteinkompositionen hos olika supramolekylära arrangemang, membranlösa organeller, inkluderingskroppar och proteinaggregat 25,26,27. I de tidiga stadierna av AD, flera cellulära proteiner (t.ex. Aβ42 och mikrotubuli-associerat tau-protein och apolipoprotein E) felveckas och sam aggregeras i flera hjärnregioner28,29. Amyloidogena proteinhaltiga formationer är ett viktigt patologiskt kännetecken för AD och bidrar sannolikt till patogenes3.
Rening av amyloidfibriller från sjuka mänskliga hjärnor är en tråkig och utmanande uppgift och har flera begränsningar. En stor nackdel med de befintliga metoderna är den låga renheten hos extraherat material, vilket ofta begränsar deras detaljerade strukturella analys med hjälp av avbildningsmetoder, såsom kryoEM. På samma sätt kräver NMR-studier några milligram renat material, som också måste märkas med tunga isotoper (dvs. 15N)30. Post-mortem mänskliga hjärnor kan uppfylla det första kravet, eftersom utgångsmaterialet kan ökas upp till några gram mänskliga vävnader; det är dock inte möjligt att märka mänskliga hjärnvävnader med tunga isotoper. Å andra sidan är det möjligt att märka AD-musmodellerna med 15N isotoper (även om det är dyrt) och blir nu allt vanligare31,32. Vårt laboratorium har använt pulsjaktmärkning för att studera den synaptiska proteinomsättningsdynamiken under sjukdom och åldrande hjärnor14. Vi har också använt märkning av tunga isotoper för hela djur för att identifiera långlivade proteiner och förstå deras fysiologiska relevans i utarbetade biologiska strukturer33,34. För mushjärnan krävs dock stora mängder utgångsmaterial för att få en fungerande mängd av fibrilkärnorna. Denna metod hanterar framgångsrikt dessa problem genom att förbättra utbytet och renheten hos de extraherade amyloidfibrillerna genom att modifiera de befintliga biokemiska isoleringsprinciperna. Därför kan detta robusta protokoll för extraktion av amyloidfibriller från hjärnvävnader lätt användas för kryoEM- och NMR-baserade strukturstudier.
Denna metod använder det befintliga sackarosdensitetsgradientbaserade subcellulära fraktioneringsparadigmet och tar bort ospecifika samrenande proteiner i successiva steg. Efter avlägsnande av cellskräp, myelin, DNA och cellulära lipider isoleras de amyloidrika SDS-olösliga pelletsen. Införlivandet av ytterligare steg av flera ultraljud kopplade SDS tvättar hjälper till att minska antalet samrenande cellulära komponenter, löst bundna proteiner, och mindre SDS lösliga polymorfer av amyloider. Den slutliga pelleten solubiliseras i ultrarent vatten och kan användas för många applikationer, inklusive såddexperiment, biokemiska eller farmakologiska studier och strukturell analys. De renade amyloidfibrillerna från AD-hjärnvävnader används också för att förstå den proteomiska sammansättningen och strukturella egenskaperna hos fibrilkärnor med hjälp av MS-baserad proteomik. Denna analys bekräftade närvaron av en delmängd cellulära proteiner (representerad i figur 4) i fibrillernas kärna, vilket kan indikera de möjliga rollerna för mer än ett protein i bildandet, förlängningen och stabiliseringen av amyloidfibriller under en lång tid. Några av de proteiner som identifieras i denna analys är kända för sin koppling till mer än en neurodegenerativ sjukdom, till exempel Adam22, APP, ApoE, β-catenin neurofilamentproteiner, 14-3-3 proteiner och andra.
Det finns möjligheter att vissa förorenande proteiner kan förekomma i proteomisk analys på grund av det faktum att efter homogenisering kan vissa obefogade interaktioner hända mellan proteiner på grund av den höga hydrofobiciteten hos amyloidfibriller. Några av dessa proteiner håller sig till kärnorna och tas inte bort även efter flera omgångar av ultraljudsbehandling och SDS tvätt steg. Detta är en begränsning av denna amyloidreningsstrategi. Det kan dock åtgärdas med hjälp av lämpliga negativa kontroller och genom att utföra effektiva statistiska avgränsningar i storskaliga proteomiska studier. En annan begränsning som vi stötte på avser underskattningen av Aβ-peptidöverflödet efter trypsinsmältning. Detta har åtgärdats i detta arbetsflöde genom en riktad MS/MS-analysstrategi. GO-analys för KEGG-vägar indikerar överflödet av proteiner som tillhör vägar som är involverade i många neurodegenerativa sjukdomar, till exempel Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Prion-sjukdomar. Dessa proteiner är viktiga aktörer i flera patologiska vägar och har därmed känt engagemang i sjukdomsinitiering och progression. Intressant nog kräver några av dessa proteiner ytterligare analys för att bestämma deras möjliga engagemang i patologin hos AD och andra neurodegenerativa sjukdomar.
Framtida studier av det rena amyloidmaterialet från andra sjukdomsmodeller kan ge en fördjupad förståelse för de strukturella mönstren och sammansättningen av kärnfibriller och kan hjälpa till att identifiera viktiga terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidraget R01AG061865 till R.J.V. och J.N.S. Författarna tackar Vassar och Savas forskargruppsmedlemmar vid Northwestern University för deras tankeväckande diskussioner. Vi tackar också uppriktigt Dr (s). Ansgar Seimer och Ralf Langen vid University of South California för deras avgörande insats. Vi tackar Dr Farida Korabova för provberedning och negativ färgning av elektronmikroskopi vid Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C.
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
